Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

rooli Quercetin munasarjasyövän hoidossa edelleen kiistanalainen, ja mekanismi on tuntematon. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia terapeuttisia vaikutuksia Quercetin yhdistelmänä sisplatiinin ja muiden antineoplastisia lääkkeitä munasarjasyöpäsoluja sekä

in vitro

ja

in vivo

yhdessä molekyyli- vaikutusmekanismi.

Methods

Quercetin käsittely eri pitoisuuksilla tutkittiin yhdessä sisplatiini, taksolin, pirarubisiini ja 5-Fu ihmisen epiteelin munasarjasyövän C13 * ja SKOV3- soluja. CCK8 määritys ja anneksiini V määrityksessä olivat solujen elinkelpoisuutta ja apoptoosin analyysi, immunofluoresenssimäärityksellä, DCFDA värjäys ja reaaliaikainen PCR käytettiin reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) aiheuttaman vahingon havaitseminen ja endogeenisen antioksidantin entsyymien ilme. Kateenkorvattomiin BALB /c-nu nude-hiiriin injektoitiin C13 * solujen saamiseksi ksenograftimallia varten

in vivo

tutkimuksissa. Immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin arvioimaan ROS aiheuttaman vahingon ja SOD1 aktiivisuus ksenograftikasvaimissa.

Tulokset

Toisin kuin pro-apoptoottinen vaikutus suuren pitoisuuden (40 pM-100 uM) Quercetin, pieninä pitoisuuksina (5 uM-30 uM) quercetin johti vaihtelevalla vaimennus sytotoksisuuden sisplatiinihoitoon yhdistettynä Cisplatin. Samanlaisia ​​antiapoptooppinen vaikutuksia ei havaittu, kun Quercetin yhdistettiin muiden syöpälääkkeiden: Taxol, pirarubisiini ja 5-fluorourasiilin (5-Fu). Pieninä pitoisuuksina Kversetiini havaittiin tukahduttaa ROS aiheuttama vamma, vähentää solunsisäisiä ROS tasolla ja lisätä endogeenisen antioksidantin entsyymien, mikä viittaa siihen, ROS-välitteisen mekanismi lieventävien antineoplastisten lääkkeiden. Ksenogeenisissä mallissa Quercetin johti merkittävään alentumiseen terapeuttista tehoa sisplatiinia yhdessä parantamaan endogeenisen antioksidantti-entsyymin ilmaisua ja vähentää ROS aiheuttamaa vahinkoa vierassiirrekokeissa kasvainkudoksessa.

Johtopäätös

Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Quercetin pieninä pitoisuuksina lieventää terapeuttisia vaikutuksia sisplatiinin ja muiden antineoplastisia lääkkeitä munasarjasyöpäsoluja vähentämällä ROS vaurioita. Quercetin lisäravinteen aikana munasarjasyövän hoito voi vaikuttaa haitallisesti hoitovasteen.

Citation: Li N, Sun C, Zhou B, Xing H, Ma D, Chen G, et al. (2014) Alhainen pitoisuus Quercetin antagonisoi sytotoksiset vaikutukset antineoplastisten Drugs in munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (7): e100314. doi: 10,1371 /journal.pone.0100314

Editor: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Biotekniikan keskus, Intia

vastaanotettu 11 joulukuuta 2013 mennessä; Hyväksytty: 26 toukokuu 2014; Julkaistu: 07 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Basic Research Program of China (973 Program, 2009CB521808); National Nature ja Science Foundation of China (81230038, 81272859, 81025011, 81090414, 81000979, 81101962); Nature ja Science Foundation of Hubei (2011CBD542); Fundamental Research Varat Central yliopistot (HUST: 2012TS058). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on yleisin invasiivisia maligniteetti naisen sukuelinten Yhdysvalloissa, oli arviolta 22240 tapauksia diagnosoidaan vuosittain. Noin 14030 naista kuolee vuosittain munasarjasyöpä, joka edustaa yleisin kuolinsyy naisten gynekologinen pahanlaatuinen kasvain [1]. Platina lääkkeet, kuten sisplatiini ja karboplatiini, ovat ensilinjan kemoterapeuttisten aineiden varten munasarjasyövän hoitoon. Vaikka useimmat potilaat näyttää kemosensitiivisyys kun hoidon aloittamista, hankittu lääkeresistenssi on tullut merkittävä este syövän hoidossa. Tekijöitä, jotka saattavat tehostaa tai estää syövän vastaisen vaikutuksen antineoplastisten lääkkeiden näyttävät olevan tärkeitä hoidossa munasarjasyöpä.

Kversetiini (3,3 ’, 4’, 5,7-pentahydroxyflavone, Quer) kuuluu luokkaan flavonoidi yhdisteitä, ja on erilaisia ​​vihanneksia, hedelmiä, siemeniä, pähkinöitä, teetä, ja punaviiniä [2]. Se on merkittävä flavonoidi ihmisten ruokavaliossa, joiden arvioitu päivittäinen ravinnon saanti 25 mg Yhdysvalloissa [3]. Kuten todistettu antioksidantti, Quercetin on suositeltavaa ottaa suun kautta syövän ehkäisyyn ja terveydenhuollon [4]. Viime vuosina useat tutkimukset ovat havainneet, että Kversetiini voi toimia mahdollisena syöpälääkettä lisäämällä toksisuus Sisplatiini hoidon hepatooma HA22T /VGH ja munasarjasyövän A2780-soluja [5] – [7]. On kuitenkin olemassa tutkimuksesta osoitti, että toisin kuin korkeat pitoisuudet flavonoidi laski solujen selviytymisen ja kannattavuuden, pieninä pitoisuuksina lisääntyi yhteensä antioksidanttien syöpäsolujen ja estää solukuoleman johtuen sytotoksisten lääkkeiden, kuten sisplatiini ja 5-Fu keuhkosyövän A549 ja peräsuolen syöpä HCT116-soluissa [8], [9]. Rooli Quercetin munasarjasyövän hoidossa on kiistanalainen, ja vaikutusmekanismia ei tunneta.

Sisplatiini ja muiden syöpälääkkeiden lisäävän solunsisäisen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), jotka voivat vaikuttaa niiden terapeuttista vaikutusta . Antioksidantit kuten C-vitamiini täydentää voi heikentää antineoplastisia lääkkeitä, jotka lisäävät ROS [10]. Kversetiini tiedetään vähentävän solunsisäisten ROS tasoja erilaisissa solutyypeissä edistämällä solunsisäisten ROS-puhdistusjärjestelmä, joka sisältää moduloivaa myrkkyjä entsyymit, kuten superoksididismutaasi 1 (SOD1) ja katalaasin (CAT). Se sai meidät kyseenalaistamaan että onko Quercetin voisi myös kumota sytotoksisille vaikutuksille antineoplastisten lääkkeiden lisääntynyt ROS. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia vaikutukset Quercetin yhdistelmänä sisplatiinin ja muiden antineoplastisia lääkkeitä munasarjasyöpäsoluja sekä

in vitro

ja

in vivo

yhdessä molekyylimekanismin toiminnan.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals että National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Tongji Medical College, Huazhong tiede ja teknologia (Luvan numero: S292). Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimysten.

Kemikaalit ja reagenssit

Quercetin ( 99%), cis-Diammineplatinum (II) dikloridia (sisplatiini), Taxol (paklitakseli) oli Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), liuotettuna DMSO: hon, jaettiin osiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Pirarubisiini (Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Kiina) ja 5-fluorourasiilin (5-Fu) (Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co Ltd., Kiina) liuotettiin normaaliin suolaliuokseen.

Soluviljely

ihmisen munasarjan epiteelin syövän solulinja C13 * [11] on sisplatiini kestävä klooni ov2008 solulinja, joka on peräisin ihmisen munasarjasyövän. Tämä C13 * solulinja oli lahja prof Rakesh Ottawan Regional Cancer Center, Ottawa, Kanada [3]. SKOV3 munasarjasyövän solulinja saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Munasarjasyöpä soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Solujen elinkelpoisuus

Solujen elinkelpoisuus mitattiin CCK8 määritys (solujen laskenta kit-8, Dojindo Molecular Technologies, Tokio, Japani). Solut valmistettiin 96-kuoppaisille soluviljelylevyille, jonka solutiheys 5 x 10

3 solua /kuoppa ja käsiteltiin kversetiini /anti-neoplastisten lääkeaineiden (sisplatiini, taksoli, pirarubisiini ja 5-Fu) tai vehikkeliä (DMSO sama laimennus nopeudella kuin lääkkeet) 37 ° C: ssa 48 tuntia. Yksisolukerros pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 1,2 mM CaCl

2 ja 0,7 mM MgCl

2, sitten 1:10 laimennettua CCK8 liuos RPMI 1640 lisättiin soluihin ja inkuboitiin 2 h 37 ° C: ssa. Tulokset mitattiin mikrolevylukijalla 450 nm: ssä ja ilmaistaan ​​prosentteina verrokkiarvoista (saatu soluille vehikkeliä).

anneksiini V /PI-värjäys

Solut trypsinoitiin ja pestiin seerumia sisältävää alustaa. Näytteet (5 x 10

5 solua) sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 400 x g: ssä ja supernatantti heitettiin pois. Sitten solut värjättiin käyttämällä anneksiini V-FICT /PI apoptoosin Kit (Keygen Biotech, Nanjing) mukaisesti valmistajan ohjeita. Määrä apoptoottisten solujen havaittiin ja analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä.

mittaus ROS

ROS havaittiin käyttäen reaktiivisia happiradikaaleja Assay Kit (Beyotime, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen, kun molekyylikoettimena 5- (ja-6) -chloromethyl-2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA) diffundoituu soluihin ja on erottautuvat solunsisäisesti de-esteröimällä, sen jälkeen reaktiolla peroksidien tuottaa fluoresoivia 5-kloorimetyyli- 2 ’, 7’-dikloorifluoreskiiniliuoksella (DCF). Lyhyesti, hoidon jälkeen, solut kerättiin sentrifugoimalla, suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 10 umol /l DCFH-DA, inkuboitiin 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa, pestiin PBS: llä ylimääräisen väriaineen poistamiseksi, ja sitten niitä inkuboitiin RPMI-alustassa 37 ° C: ssa 10 min, Fluoresenssi tuloksia saatiin käyttäen FL-1-kanava Becton Dickinson FACSCalibur, ja analysoitiin käyttäen CellQuest-ohjelmistoa. Solujen prosenttiosuus näytetään lisääntynyt väriaineen ottoa käytettiin vastaamaan lisäystä ROS tasoilla.

immunofluoresenssimäärityksellä

Lyhyesti, C13 * solut ympättiin 24-kuoppaisille soluviljelylevyille, joka sisältää steriiliä lasi dia solun tiheydellä 2 x 10

4 solua /kuoppa. Sen jälkeen käsiteltiin eri lääkkeitä 48 tuntia, solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kun oli salvattu 1% rasvatonta maitoa 2 h, vuohen anti-8-OHdG-pitoisuuksiin ja hiiren anti-γH2AX vasta-aineita (Millipore) lisättiin dioja vastaavasti. Seuraavat 4 h inkuboinnin jälkeen levyt pestiin 3 kertaa 0,5% PBS-Tween 20: tä (PBST) ja fluoreseiini-CY3-konjugoidulla sekundaarisella hiiren anti-vuohi-vasta-aineella ja FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich) lisättiin laimennus 1:100. Soluja inkuboitiin 45 min 37 ° C: ssa. Lopuksi solut pestiin kuten edellä on kuvattu, ja tutkittiin fluoresenssimikroskopian (Olympus, Tokio, Japani). Viisi satunnainen suuri teho kenttä kuvat otettiin kunkin ryhmän, Image J ohjelmisto käytettiin laskemiseen numerot erittäin positiivisia värjättyjen solujen.

Reaaliaikainen RT-PCR (RT-PCR) B

C13 *-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille soluviljelylevyille tiheydellä 5 x 10

5 solua /kuoppa, ja käsiteltiin Kversetiini ja sisplatiinia 48 tunnin ajan. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen, Kiina). Komplementaarinen DNA syntetisoitiin mukaisesti valmistajan protokollan (Toyobo, Japani). Reaaliaikainen PCR-monistaminen suoritettiin ABI PRISM 7500 cycler kanssa SYBR reagenssilla (Toyobo, Japani). Terminen kierrätysolosuhteita asetettiin ohjeissa annetuista mukana cycler, ja hehkutus lämpötila on 60 ° C. Käytetyt oligonukleotidit monistamiseksi superoksididismutaasi 1 (SOD1), endonukleaasi G (ENDOG), sytokromi c: n (cyto-c), glutationiperoksidaasi (GPX), katalaasin (CAT) ja irrotus proteiini 2 (UCP2) (taulukko S1) suunniteltiin käyttäen Primer 5.0 ja syntetisoi Invitrogen. Määrällinen normalisoituminen cDNA tehtiin käyttämällä taloudenhoito geeni glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) sisäisenä kontrollina määrittää yhtenäisyyden mallin RNA kaikille yksilöitä. Kunkin näytteen ilmentymistä mielenkiinnon kohteena olevan geenin on peräisin suhde niiden ilmaisun GAPDH ilmentymisen käyttäen seuraavaa kaavaa: suhteellinen ekspressio = 2- (ACt näyte-ACt-ohjattu), ACt = Ct-geeni-Ct GAPDH.

in vivo

ksenografti tutkimukset

in vivo

arvioinnissa Quercetin suoritettiin käyttäen ksenograftimallia ihmisen C13 * soluja. Kateenkorvattomiin BALB /c-nu nude-hiiriin (4-6 viikon ikäisiä, saatu Beijing HFK biotieteiden yritys, Peking, Kiina) pidettiin tietyssä patogeenittomassa huoneen sisällä eläimen tilat Laboratory Animal Center of University of Tongji Medical College . Eläinten annettiin totuttautua uuteen ympäristöön yhden viikon ajan ennen käyttöä. C13 *-solut (2 x 10

6) suspensoitiin uudelleen PBS: ään väliaineessa Matrigelillä tyvikalvon matriisin (BD Biosciences, Bedford, MA) kanssa 1:01 suhde (kokonaistilavuus 100 ui), sitten injektoidaan subkutaani- kylkiin nude-hiirten (päivä 0). Vuodesta 10. päivänä injektion, hiiret satunnaistettiin 4 hoitoryhmään (n = 8 kussakin ryhmässä) ja intraperitoneaalisesti (ip) normaalilla suolaliuoksella (NS), Quercetin (20 mg /painokilo päivittäin), sisplatiinia ( 4 mg /kg kehon painoa, joka neljäs päivä), ja yhdistetyt Kversetiini ja sisplatiinia käsittelystä (käyttäen edellä annokset) 21 peräkkäisenä päivänä. Ruumiinpaino ja syöpäkasvain mitattiin 5 päivän välein. Kasvaimen tilavuus määritettiin käyttäen paksuus ja lasketaan kaavan (leveys

2 x pituus) /2. Hiiret tapettiin murtamalla niska nukutuksessa kolmen viikon kuluttua hoidon (päivä 30).

immunohistokemiallinen analyysi

Immunohistochemical tutkimukset suoritettiin ksenograftikasvaimissa jälkeen ne poistettiin paljaisiin hiiriin. Kasvaimet kiinnitettiin 40 mg /ml paraformaldehydi, parafiiniin upotettuja ja leikataan 4 um leikesarjojen. Seuraavaksi endogeenisen peroksi- pysäytettiin ja leikkeitä pestiin huolellisesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kolme kertaa. Kohdat blokattiin 2% vuohen seerumia ja kanin seerumin vastaavasti PBS: ssä 37 ° C: n lämpötilassa 45 minuuttia, sitten inkuboitiin hiiren anti-SOD1-vasta-ainetta (1:500 laimennus, Abcam) ja vuohen anti-8-OHdG-pitoisuuksiin-vasta-ainetta (1 :800 laimennus, Millipore) yön yli 4 ° C: ssa. Sen jälkeen leikkeitä inkuboitiin vuohen anti-hiiri ja hiiren anti-vuohi-piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineet erikseen ja avidiini-biotiini-kompleksin ja sen jälkeen diaminobentsidiiniä (Vector ABC, Burlingame, CA, USA). Upotus 2% ammoniakin vesiliuosta, hematoksyliinia käytettiin counterstaining. Leikkeitä inkuboitiin kanin ja vuohen IgG seerumissa vastaavasti negatiivisina kontrolleina.

Positiivinen 8-OHdG-pitoisuuksiin värjäytyminen oli pääasiassa tumissa ja positiivinen ilmaus SOD1 oli lähinnä sytoplasma kuvio sekä tuumorisoluissa pikemminkin kuin stroomasoluissa . Koska intensiteetti 8-OHdG-pitoisuuksiin ja SOD1 värjäämällä kussakin jaksossa oli pääosin homogeeninen, immunoreaktiivisuus näytteissä oli puolittain määrällisesti arvioitava seuraavin perustein: vahva positiivinen (kertoimeksi 3), voimakas värjäytyminen intensiteetti ( 90% syöpäsoluja); kohtalainen positiivinen (pisteytettiin 2), kohtalainen värjäyksen intensiteetti ( 50-89% positiivisten solujen); heikko positiivinen (pisteytettiin 1), heikkoa värjäytymistä intensiteetti ( 10-49% positiivisten solujen); poissa (pisteytettiin 0), ei värjäystä intensiteetti ja mitään positiivista tai muutaman positiivisia soluja [12], [13]. Värjäytymisintensiteettiä ja osa kunkin osan värjättyä laskettiin viisi satunnaisia ​​suuren tehon kenttä kuvaa kunkin ryhmän kahden ulkopuolisen tutkijat.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS19.0. Erot kahden ryhmän verrattiin Studentin

t

testiä. Tilastolliset erot enemmän kuin kaksi ryhmää määritettiin yksisuuntaisella ANOVA jälkeen postitse hoc pareittain vertailuissa.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Quercetin pieninä pitoisuuksina edistää selviytymistä munasarjasyöpä C13 * solujen sisplatiinia

platinapohjaisen kemoterapian on tärkein hoito hoidossa munasarjasyöpä. Voit selvittää mahdollinen rooli Quercetin voi olla Sisplatiini vastarintaa munasarjasyövän, C13 * solut altistettiin eri pitoisuuksia Quercetin, sisplatiini, tai näiden kahden yhdistelmä. IC 50 Sisplatiinin käsiteltyjen C13 * soluista oli noin 80 pM (IC 50 = 78,8 uM, 95% CI: 72,9-85,1 uM) (kuvio S1A). Kun C13 * soluja käsiteltiin 80 uM sisplatiinia yhdessä kasvavien annosten Quercetin, huomasimme, että sytotoksisuus sisplatiinia aleni kun yhdistetään kanssa pieninä pitoisuuksina Quercetin (5 uM 30 uM), kun taas suhteellinen runsaasti Quercetin (100 uM) kasvoi Sisplatiini sytotoksisuutta (Fig. 1A). Määrittämään antagonistinen vaikutus tai herkistymistä huumeiden yhdistelmästä, laskimme yhdistelmän indeksi (CI) huumeiden perustuu Chou ja Talalay lause [14]. Tulokset osoittivat, että alhaiset pitoisuudet Kversetiini antagonisoi sytotoksisia vaikutuksia sisplatiinin C13 * soluissa, kun taas suuret pitoisuudet Kversetiini on additiivinen vaikutus sisplatiinin (taulukko S2). Teimme myös yhdistettynä kokeiluja sarja erilaisia ​​sisplatiinin pitoisuuksien plus kiinteä pitoisuuksia Quercetin (20 uM), joka osoitti, että pieniä pitoisuuksia Quercetin kasvoi C13 * solun resistentiksi sisplatiinin vaihtelevasti (kuva S2). Faasikontrasti- kuvaa C13 * käsiteltyjen solujen ajoneuvon hallinnan, sisplatiini, tai niiden yhdistelmiä, kversetiini (20 uM, 80 uM) kanssa sisplatiinia (80 uM) on esitetty kuviossa. 1B.

(A), Cell elinkelpoisuus, jotka altistuvat eri pitoisuuksia Kversetiini yksinään tai yhdessä 80 uM sisplatiinia 48 tunnin ajan mitattiin CCK8 määrityksessä ja ilmaistaan ​​prosentteina kontrolliarvoista. *

P

= 0,039, #

P

= 0,009,

P

= 0,027,%

P

= 0.010, ANOVA testi sen jälkeen postitse hoc pareittain vertailuissa. (B), vaihe-kontrastin kuvia C13 * käsiteltyjen solujen ajoneuvon ohjaus (DMSO samalla laimennusnopeuden kuin lääkkeet), sisplatiini, tai yhdistelmä Quercetin (20 uM, 80 uM) kanssa sisplatiinia (80 uM). (C, D), Cell apoptoosin eri hoitoryhmään havaittiin ja analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena (N = 3 per koe). Ryhmä Sisplatiini yhdistettynä Quercetin käsittely VS. ryhmä sisplatiinihoitoon, **

P

= 0,033, ***

P

= 0,043, ANOVA testi seurasi post hoc pareittain vertailuissa.

Edelleen määrällisesti apoptoottisen vaikutusten Kversetiini ja sisplatiinia käsittelyn C13 * solut värjättiin anneksiini-V-FITC ja PI, ja tämän jälkeen analysoitiin virtaussytometrialla solujen apoptoosin. Selviä vähennykset apoptoottisten lukumäärissä havaittiin solujen sisplatiinia ja 20 uM Quercetin kuin Sisplatiini yksinään (Fig. 1 C, 1D). Mittasuhteet anneksiini V-värjätään solut olivat korkeammat Cisplatin-käsitellyissä soluissa kuin solujen käsiteltiin vielä 20 uM Quercetin.

Jotta yleistää johtopäätökset, toteutimme CCK8 määrityksissä SKOV3, yleisesti käytetty munasarjasyövän solulinja. Tulokset osoittivat, että alhaiset pitoisuudet Kversetiini vähennetään sytotoksisia vaikutuksia sisplatiinin SKOV3- soluissa (kuvio S3).

Kversetiini vaimennetaan hoidon vaikutuksia eri antineoplastisten lääkkeiden munasarjasyöpäsoluja

tutkia Kversetiini vaimentavat syövän vaikutukset muiden antineoplastisten lääkkeiden, käsittelimme C13 solua kolmen muun antineoplastisen lääkkeet, joita käytetään yleisesti munasarjasyövän hoitoon, 5-Fu, Taxol, ja pirarubisiini. C13 * soluja käsiteltiin sarjan kasvavia annoksia Kversetiini ja kiinteän 5-Fu (5 uM), taksoli (3 uM) ja pirarubisiini (3 nM) on suunnilleen pitoisuuksien IC50 (kuvio S1). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin sisplatiini, hoitoon käytetään näitä lääkkeitä yhdessä Quercetin johti enemmän solussa vastus kuin hoito antineoplastisten lääkeaineiden yksinään (Fig. 2) Kun pitoisuus 20 uM, Quercetin osoitti selvää antiapoptoottinen vaikutuksia vastaan nämä kolme lääkettä. Kversetiiniä osoitti matalan pitoisuuden erityisiä suojaava vaikutus munasarjasyöpä soluissa, joita käsiteltiin 5-Fu (Fig. 2A), joka on samanlainen kuin tulokset, jotka saatiin Cisplatin. Yhdessä Taxol tai pirarubisiini, kuitenkin, Kversetiini yllä edistävä vaikutus solujen survial vastaan ​​syöpälääkkeiden jopa suhteellisen suurina pitoisuuksina (80 gM, 100 uM) (Fig. 2B, 2C).

(A~C ), Cell elinkelpoisuus Quercetin yhdistelmänä 5-Fu, Taxol ja pirarubisiini mitattiin CCK8 määritys ja ilmaistiin prosenttiosuutena kontrolliarvoihin. N = 3 koetta kohti. Ryhmä Sisplatiini yhdistettynä Quercetin 20 uM käsittelyä VS. Ryhmä sisplatiinihoitoon, *

P

= 0,048, **

P

= 0,040, ***

P

= 0,032, Studentin t-testi.

Quercetin vähensi oksidatiivisen loukkaantumisen munasarjasyöpäsoluja aiheuttama Sisplatiini

Tutkimme mekanismi, jonka Quercetin heikennetty sytotoksisille vaikutuksille sisplatiinia. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin [15], monet antineoplastisia lääkkeitä kuten sisplatiini, lisäävän solunsisäisen ROS, jotka edistävät niiden terapeuttista vaikutusta. Me epäilivät Quercetin voi muuttaa ROS liittyvä aiheuttamaa vahinkoa näitä lääkkeitä. Ekspression 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG-pitoisuuksiin), merkki oksidatiivisen DNA stressiä ja on useimmin havaittu ja tutkittu DNA vaurion [16], arvioitiin immunefluorescence määrityksessä. Olemme myös mitattava taso koko sytotoksisten vahingon havaitseminen γH2AX, yhteinen merkkiaine DNA-vaurioita. Tulokset osoittivat, että fluoresenssivoimakkuudet sekä γH2AX ja 8-OHdG-pitoisuuksiin oli paljon pienempi hoitoryhmässä 80 uM sisplatiinia yhdistettynä alhainen pitoisuus Quercetin (20 uM) kuin ryhmä 80 uM sisplatiinia yksin. Toisin kuin tämä, 80 uM sisplatiinia, joilla on korkea konsentraatio (60 uM, 100 uM) Kversetiini lisääntynyt intensiteetti fluoresenssin (Fig. 3A, 3B). Counting positiivisten solujen Image J ohjelmisto osoitti, että yhdistelmä hoito Quercetin (20 uM) oli selvempää vähennystä 8-OHdG-pitoisuuksiin kuin γH2AX verrattuna Sisplatiini hoito yksinään (36.40% ja 19,33% vastaavasti) (Fig. 3B) . Se osoitti, että pieniä pitoisuuksia Quercetin vähensi oksidatiivisen loukkaantumisen munasarjasyöpäsoluja aiheuttamia Cisplatin.

(A), 8-OHdG-pitoisuuksiin ja H2AX ilmaisun C13 * käsitellyissä soluissa Quercetin yhdistettynä Sisplatiini havaittiin immunofluoresenssimenetelmällä määritys. (B), numerot on erittäin positiivisia värjätään solut viisi random suuritehoisia aloilla laskettiin Image J ja ilmaistiin prosenttiosuutena Cisplatin ryhmän arvoja. Ryhmä Sisplatiini yhdistettynä Quercetin 20 uM käsittelyä VS. Ryhmä sisplatiinihoitoon, N = 3. *

P

= 0,004, #

P

= 0,001, Studentin t-testi.

Quercetin alennettu ROS taso munasarjasyöpäsoluja meneillään sisplatiinihoitoon

Voit selvittää Quercetin vähensi ROS vahingon vähentämällä solunsisäisten ROS, reaktiivisen hapen Assay Kit havaitsemiseen käytettiin solunsisäisten ROS tasoilla C13 * solujen eri hoitoryhmissä. Verrattuna soluihin, käsiteltiin ajoneuvon hallintaan tai sisplatiini yksin, hoidon lisäksi 20 uM Kversetiiniä johtaa vähenemiseen solunsisäisiä tasoja ROS (Fig. 4A, 4C). Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että Quercetin (20 uM) käsittely antoi selvä väheneminen ROS tasolla (keskiarvo 70,4) verrattuna kontrolliryhmään (keskiarvo 99,05) (

P

0,001) (Kuva. 4B, 4D ). Yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa, altistuminen sisplatiini aiheutti munasarjasyövän C13 * solujen kerääntyä solunsisäiseen ROS, joiden keskimääräinen ROS tasolle 123,5. Hoidon ryhmässä sisplatiinia yhdessä Kversetiini, tämä arvo laskettiin 83,38 (Fig. 4D), jopa alhaisempi kuin vehikkelikontrolliryhmän (99,05) (

P

0,001) (Fig. 4B).

solunsisäiset ROS tasoilla C13 * solujen eri hoitoryhmään havaittiin reaktiivisia happiradikaaleja Pitoisuus virtaussytometriaa käyttämällä. (A, B) ROS tasot C13 * solujen hoitaa ajoneuvon hallintaan tai 20 uM Quercetin 24 tuntia. (C, D) ROS-tasot C13 solua käsiteltiin 80 uM sisplatiinia kanssa tai ilman 20 uM Kversetiini 24 tuntia. N = 3. *

P

0,001, #

P

0,001, Studentin t-testi.

Quercetin lisäsi endogeenistä antioksidanttientsyymejä in munasarjasyöpäsoluja

edellä esitetyt tulokset osoittivat, että Quercetin voisi vähentää solunsisäisiä ROS munasarjasyöpäsolujen, joten pyrimme määrittämään vaikutusmekanismi. Tärkein antioksidantti solujen rakenneosia vastaan ​​ROS ovat endogeenisiä antioksidanttientsyymejä, kuten superoksididismutaasi 1 (SOD1), endonukleaasi G (ENDOG), sytokromi c (cyto-c), glutationiperoksidaasi (GPX), katalaasin (CAT), ja irrotus proteiini 2 (UCP2). Mittasimme endogeenistä antioksidantti entsyymien reaaliaikainen PCR. Verrattuna soluihin käsitelty ajoneuvon hallintaan tai sisplatiini yksin, hoito yhdistetään Sisplatiini 20 uM Quercetin lukemiin eriasteista kasvusta ilmentymisen SOD1, ENDOG, cyto-c, GPX, CAT ja UCP2 (Fig. 5A~F).

(A~F), Expression of antioksidanttientsyymejä C13 * solujen havaittiin reaaliaikaisella PCR: llä. N = 3.

Quercetin edistänyt munasarjasyöpää kasvua sisplatiinihoitoon

in vivo

Käytimme C13 * soluja tuottamaan ksenograftikasvaimina atyymisissä nude BALB /c -nu hiiret onko Quercetin voisi lieventämään kemoterapiaa

in vivo

. Kuten odotettua, sisplatiinihoidolle yksinään vähensi kasvaimen kasvua verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin hiiriin. Käsittely Quercetin yksin hieman tukahdutti kasvaimen kasvua verrattuna normaaliin keittosuolaliuokseen (kasvain tilavuudet 111,75 mm

3 ja 120,51 mm

3 vastaavasti) (P = 0,015). Kasvaimet hiirille on sisplatiinia yhdistelmänä Quercetin oli noin 1,8 kertaa suurempi päivänä 30 kuin sisplatiinia yksinään (

P

0,001; Fig. 6A, 6B). Vertaamalla keskipainon kasvainten poistettiin hiiristä, huomasimme, että kasvaimia hoidettiin yhdistelmällä Kversetiiniä ja sisplatiinia (72,53 ± 7,33 mg) olivat huomattavasti painavampi kuin sisplatiinia yksinään (41,47 ± 6,72 mg),

P

0,001 (Fig. 4D). Edelleen, yhdistelmä sisplatiinin ja kversetiini, esiintyi syövän edistävä vaikutus verrattuna kontrolliryhmään, mitataan sekä kasvaimen koon ja kasvaimen paino (Fig. 6C).

Hiiret injektoitiin NS, 20 /kg Quercetin, 4 mg /kg sisplatiini tai Quercetin sisplatiinin, ip. C13 * cell ksenografteja (2 x 10

6) ympättiin oikeaan kylkeen naisen kateenkorvattomien nude nu /nu hiirille. Tuumoritilavuudet määritettiin paksuus ja lasketaan kaavan (leveys2 x pituus) /2. (A), kasvain muodostumista hiirillä sisplatiinin hoitoryhmissä ja yhdistettynä Quercetin ryhmään. (B), keskimääräinen suhteellinen kasvaimen kasvua analysoidaan kasvaimen volyymit 8 hiirtä per koeryhmä ** Sisplatiini plus Quercetin VS. Sisplatiini,

P

0,001; * Quercetin VS. Ohjaus,

P

= 0,015, ANOVA testi seurasi post hoc pareittain vertailuissa; (C), keskiarvo kasvain painot kunkin ryhmän. #Cisplatin Yhdistettynä Quercetin VS. Sisplatiini,

P

0,001, ANOVA testi seurasi post hoc pareittain vertailuissa; (D), immunohistokemiallinen analyysi 8-OHdG-pitoisuuksiin ja SOD1 ksenograftikasvaimissa poistettu nude-hiirissä. (E), kvantifiointi data erojen ilmaisun SOD-1 ja 8-OHdG-pitoisuuksiin, *: P 0,001, **: P 0,001, ANOVA testi seurasi post hoc pareittain vertailuissa.

Quercetin parantaa endogeenistä antioksidantti-entsyymin SOD1 munasarjasyövän solujen

in vivo

, ja esti ROS aiheuttamaa vahinkoa

jotta vahvistaa suojaava vaikutus hapettavaa vahinkoa Quercetin in vivo immunohistokemiallinen analyysit suoritettiin kasvaimet poistettiin nude-hiirissä ksenograftimallissa. 8-OHdG-pitoisuuksiin, merkkiaine oksidatiivisen DNA stressin, sijaitsi pääasiassa syövän solun tumassa. Kasvaimissa käsitelty vehical tai Quercetin yksin, 8-OHdG-pitoisuuksiin värjäys osoitti heikkoa intensiteetti tulokset 0,4 ja 0,6 vastaavasti. Ryhmässä sisplatiinia yksin, lähes kaikki syöpäsolut näy erittäin vahva 8-OHdG-pitoisuuksiin värjäys pisteet 2.8. Kuten odotettua, hiiret ryhmä hoitaa sisplatiinia yhdistelmänä Kversetiiniä oli huomattavasti alempi 8-OHdG-pitoisuuksiin värjäytymistä (pisteet 1,6) kasvaimissa kuin yksi sisplatiinia yksinään (Fig. 6D-E).

DNA korjaus entsyymit kertymisen ehkäisemiseksi vaurioitunut DNA ja antioksidantit suojaavat soluja vapaiden radikaalien. Havaitsimme SOD1 lauseke, joka on kriittinen endogeeninen antioksidantti entsyymi sietää oksidatiivisen stressin, selvittää, jos Quercetin vaikuttaa aktiivisuuteen endogeenisen antioksidantti-entsyymin. Positiivinen ilmaus SOD1 oli lähinnä sytoplasma kuvio munasarjasyöpäsoluja sijaan stroomasoluissa. Antioksidantti-entsyymin SOD1 oli erittäin yli-ilmentyy tuumoreissa käsitelty Quercetin tai Sisplatiini plus Quercetin (pisteet 2,0 ja 2,6) kuin kasvaimia vehikkeliä tai Sisplatiini yksin (pisteet 1,2 ja 0,6 vastaavasti) (Fig. 6D-E). Tulokset osoittivat, että Quercetin parantaa endogeenisen antioksidantti-entsyymin SOD1 ilmentymistä munasarjasyöpäsoluja

in vivo

, ja esti ROS aiheuttamaa vahinkoa.

Keskustelu

Koska klassista flavonoidiyhdisteen Quercetin on yleensä suositeltavaa ottaa suun kautta päivittäin yleisen terveydenhuollon ja syövän ehkäisyyn. Staedler

et al.

Havaittu, että Quercetin pitoisuuksissa 5 uM ja 10 uM voisi lisätä tehoa 100gM doksorubisiinin rintasyövän soluissa in vitro [17], [18], kun taas muut tutkijat tulivat erilaisiin päätelmiin [8], [9]. Samuel

et al.

[8] ilmoitti, että peräsuolen ja eturauhasen syöpäsolujen, terapeuttisia vaikutuksia lääkeaineen yhdistelmänä Quercetin vaikutti tehokasta annosta ja p53 tilan solujen (yhdistelmä 5- Fu jopa 6 uM Quercetin edistetään cologenic hengissä p53 null soluissa samalla 50pM Quercetin toiminut päinvastainen rooli p53 villityypin soluja). Tässä tutkimuksessa Quercetin suurina pitoisuuksina, joko yksin tai yhdistettynä Cisplatin näkyvissä antineoplastisten vaikutuksia munasarjasyövän C13 * soluja, kun taas alhainen pitoisuus (5 uM-30 uM) Quercetin näytti antagonisoida sytotoksisia vaikutuksia antineoplastisten lääkeaineiden mukaan lukien sisplatiini, 5-Fu, Taxol, ja pirarubisiini. Olemme myös tutkineet mekanismi anti-apoptoottisen vaikutuksen Kversetiini yhdistettynä sisplatiinin kanssa.