Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tyrosiinikinaasit ajaa leviämisen ja eloonjäämisen monien ihmisen syöpien. Näin profilointi globaali tila tyrosiinifosforylaation kasvain on omiaan antamaan runsaasti tietoa, jota voidaan käyttää luokitella kasvaimista ennustetta ja ennustamiseen. Kuitenkin kattava analyysi tyrosiinifosforylaation suuria määriä ihmisen syövän yksilöitä on teknisesti haastavaa nykyisillä menetelmillä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käytimme phosphoproteomic menetelmää kutsutaan SH2 profilointi luonnehtia maailmanlaajuiseen tila fosfotyrosiinin (pTyr) signalointi ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Tämä menetelmä määrällisesti fosforyloidun sitoutumiskohtia SH2 verkkotunnuksia, joita käytetään solujen vastata muutoksiin pTyr aikana signalointi. Solut voitiin ryhmitellä perustuu SH2 sitovia malleja, joitakin klustereiden korreloi EGF-reseptorin (EGFR) tai K-RAS mutaatiostatus. Sitovat erityisiä SH2-domeenia, näkyvimmin RAS polku aktivaattorit Grb2 ja SHCA, korreloi EGFR-mutaatio ja herkkyys EGFR estäjä erlotinibi. SH2 sitova kuviot heijastuu myös MET aktivointi ja voisi tunnistaa solut ohjaavat useat kinaasit. PTyr vasteita solujen kinasoitua estäjiä esittänyt näytön erillisten mekanismien esto.

Johtopäätökset /merkitys

Tämä tutkimus havainnollistaa potentiaalia modulaarisen proteiinin alan ja sen proteomic sitovat profiileja kuten voimakas molekyylidiagnoositekniikoiden työkalut kasvain luokitusta ja biomarkkereiden tunnistamiseen.

Citation: Machida K, Eschrich S, Li J, Bai Y, Koomen J, Mayer BJ, et al. (2010) tunnusomaiset tyrosiinifosforylaatiolle Signaling in Lung Cancer käyttäminen SH2 Profilointi. PLoS ONE 5 (10): e13470. doi: 10,1371 /journal.pone.0013470

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 toukokuu 2010; Hyväksytty 23 syyskuuta 2010 Julkaistu: 19 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Machida et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ osittain rahoittaa avustuksin National Functional Genomics Center (https://nfgc.moffitt.org/nfgc_Site.aspx?spid=E395859332944CBF8AFBDED2CE39B74A) (W81XWH-08-2-0101), National Institutes of Health (http: //grants.nih.gov/grants/oer.htm) (P50-CA119997, R33-CA107785, ja RC1-CA146843) ja CT Breast Health Initiative, Inc. (https://ctbhi.org/). Tämä työ on tuettu osittain avustusta National Institutes of Health (P30CA076292) muuttamisesta Molecular Biology Core ja bioinformatiikan Core Tilat H. Lee Moffitt Cancer Center Tutkimuslaitos. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

reseptori ja ei-reseptorityrosiinikinaaseihin säätelevät monia toimintoja tärkeää syövän, kuten solujen lisääntymisen, selviytyminen, invaasio /etäpesäke, ja angiogeneesi [1]. Nämä viestintäproteiinit siis ovat tärkeä luokka lääkekohteita hoitoon syövän, ja lukuisat tyrosiinikinaasiestäjät (TKI) kehitteillä olevia tai käytetään nykyään klinikalla. Keuhkosyöpä vastaa yli 160000 kuolemantapausta vuodessa Yhdysvalloissa [2], joten on tehokas perusteita tunnistaa avaintekijöitä keuhkosyöpään voidaan terapeuttisesti hyväksi. Aktiivisuus kasvutekijän reseptorin (EGFR) on usein koholla keuhkosyöpää, ja EGFR kautta TKI erlotinibin voi ulottua eloonjäämistä potilailla, joilla on edennyt keuhkosyöpä refraktaarisia kemoterapiaa [3]. Sen lisäksi, että EGFR, useita muita tyrosiinikinaaseja on ehdotettu terapeuttisia kohteita keuhkosyöpä, mukaan lukien MET, insuliinin kaltainen kasvutekijä-reseptorit (IGFR), SRC kinaasit, fibroblastikasvutekijä-reseptoreihin (FGFR), verihiutaleperäisen kasvutekijän reseptorit (PDGFR), anaplastinen lymfooma kinaasi (ALK), ja EPH reseptorit [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12] .

keskeinen kysymys TKI hoitoa keuhkosyöpä on joka potilaat hyötyvät näistä lääkkeistä, koska kustannukset on merkittävä ja monet saavat mitään hyötyä hoidosta. Tärkeä läpimurto oli löytö aktivoivat somaattisten mutaatioiden EGFR jotka parantavat reseptorin signalointi ja ennustaa herkkyyttä TKI kohdistaminen EGFR, kuten erlotinibi ja gefitinibin [13], [14], [15]. Vuonna keuhkosyöpäpotilaita kätkeminen näistä mutaatioista, Hoitovaste EGFR TKI voi olla korkea ja selviytyminen on parempi kuin mitä havaittiin sytostaattien [16]. Kuitenkin joillakin potilailla ilman EGFR-mutaatio voi hyötyä EGFR: n estäjien, ja markkereita, kuten EGFR geenimonistuksen, autokriinisen TGFa tuotanto- tai geeniekspressioprofiilien on ehdotettu tunnistaa nämä potilaat [17], [18], [19]. Lisäksi resistenssimekanismit kuten MET vahvistus tai toissijainen mutaatioita EGFR voi nopeasti johtaa lääkeresistenssi [20], [21], [22]. Lopuksi, jotkut kasvainsolut todennäköisesti ajaa useita tyrosiinikinaaseja, ja menetelmiä tunnistaa ja luokitella näitä tarvitaan [23].

proteomiikan strategioita (joka tutkii globaali malleja proteiinin ilmentymisen tai fosforylaatio) ovat myös käytetyt luokitella kasvainten [24]. Massaspektrometria (MS) yhdistettynä antifosfotyrosiinivasta-aineita tunnistettiin eri mallien tyrosiinikinaasin signaloinnin keuhko- syöpäsoluja ja kasvaimia, ja tämä lähestymistapa pystyi tunnistamaan soluja vetämänä onkogeeninen EGFR, PDGFR, ja ALK [4]. Muut tutkimukset käyttävät samaa lähestymistapaa löytyy malleja tyrosiinifosforylaation liittyy mutantti EGFR signalointi [25], [26]. Kaiken kaikkiaan tämä työ todistaa periaate, että maailmanlaajuinen tyrosiinifosforylaatiota kuvioita voi antaa hyödyllistä tietoa kasvaimen luokittelua. Kuitenkin nykyinen MS menetelmät vaativat suhteellisen suuria määriä näytettä ja kvantifiointiin fosforyloidun sivustoja on haastavaa, joten uusia phosphoproteomic strategioita tarvitaan.

Olemme kehittäneet vaihtoehtoisen phosphoproteomic menetelmää, jota kutsutaan SH2 profilointi, joka täydentää MS lähestymistavat [27], [28]. SH2 profilointi on erittäin herkkä ja suoritusteho on suhteellisen korkea, joten se on ihanteellinen profilointi fosfotyrosiiniseerumi (pTyr) signalointi syöpäsoluissa. Käsitteellisen pohjan SH2 profilointi on käyttää solun oma pTyr signaali vastauksena laitteen kuulustella tilan pTyr signalointi. Kun reseptori tyrosiinikinaasin (RTK) aktivointi, lisääntyviin tyrosiinifosforylaatio luo sitoutumiskohdat modulaarinen pTyr-spesifinen sitoutuminen alueilla; se on relocalization solunsisäisten efektorien sisältävien pTyr sitojadomeenien näitä fosforyloituu sivustoja, jotka on keskeinen vaihe signaalinsiirto [29]. Ylivoimaisesti runsain pTyr sitova moduuli ihmisillä on Src Homologia 2 tai SH2 domain [30]. On 120 SH2-domeenia koodaa ihmisen genomin, ja kukin SH2 domain sitoo ainutlaatuisen kirjon tyrosiinifosforyloituu sivustoja [28], [31]. Koska SH2 verkkotunnukset ovat mitä solu käyttää vastaamaan tai ”lukea” muuttuu tyrosiinifosforylaatiossa aikana signalointia, sitoutumisen laajuus eri SH2 verkkotunnuksia voi tarjota runsaasti tietoa mekanismeista ja tilan pTyr signalointi.

Voit testata, jos tämä lähestymistapa on hyödyllinen kuvaavat ja luokiteltaessa monimutkaisia ​​kasvaintyypeissä kuten keuhkosyöpä, jossa useat tyrosiinikinaaseiksi ajaa alavirran signalointia ja ylläpitää kasvaimen kasvua, haimme SH2 profilointi keuhkosyöpää solulinjoja. Huomaamme, että pTyr kuviot voivat liittyä tunnetun ominaisuuksia solujen kuten EGFR-mutaatio tila ja herkkyys EGFR TKI. Tuloksemme viittaavat siihen, että SH2 profilointi aikaan uusia oivalluksia pTyr signalointi, jotka ovat todennäköisesti hyödyllisiä ennustaminen ja ennusteen keuhkosyöpään.

Tulokset

SH2 profilointi tunnistaa osajoukkoja keuhkosyövän solulinjoja

Valitsimme ryhmä 22 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat tunnettujen EGFR ja K-RAS mutaatiostatus ja yliherkkiä EGFR TKI erlotinibi (Suppl. taulukko S1). Yleisenä strategia tutkimuksemme on esitetty kuvassa. 1. Solulysaatit valmistettiin aktiivisesti kasvavia soluja viljeltiin seerumittomassa täydennetty väliaine. Kaksi lähestymistapaa generoimaan SH2 profiileja käytettiin, käänteisfaasi proteiinijärjestelmäksi ja pitkälle Western blotting [28]. Ensimmäisessä menetelmässä, useita proteiini näytteet (solulysaateista) on havaittavissa taulukot kohdakkain kuoppiin 96-kuoppaisen kammion laite. Kukin kuoppa täytetään sitten liuoksella, joka sisälsi eri GST-SH2 domain koetin, ja inkuboinnin ja pesun jälkeen, sitoutunut koetin on määrällisesti kunkin täplän. Sitoutumisen määrä riippuu määrä ja affiniteetti tyrosiinifosforyloituu proteiinin sivustoja näytteessä. Tämä lähestymistapa, jota kutsutte ”ruusuke” määrityksessä, on mahdollista profiloida kokonaismäärässä sitovat lähes kaikki SH2 verkkotunnuksia genomissa (94 SH2 domain antureista ja yksi PTB domain edustaa 90 erilliset proteiinit) käyttäen minimaalisia määriä proteiinia näyte.

Ihmisen keuhkosyövän solulinjat (Suppl. Taulukko S1) viljeltiin kun läsnä tai poissa ollessa tyrosiinikinaasin estäjät erlotinibi tai dasatinibille. Cell proteiinit uutettiin ja analysoitiin ruusukkeen ja kaukaa Western blottaus käyttämällä erilaisia ​​SH2 domain koettimien (Suppl. Taulukko S3). Bioinformatiikka- analysointi määrällisten tietojen käytettiin luokitteluun ja biologisten merkkiaineiden seulonta.

tutkimiseksi sukulaisuuden eri keuhkosyövän solulinjat, kvantitatiivinen SH2 sitovat arvot tehtiin ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi analyysi (katso menetelmät). Tulokset esitetään lämpöä kartan muodossa kuvassa. 2A ja raaka kuvadata näytetään Suppl. Kuva. S1. Data alhainen signaali /tausta heitettiin pois; tiedot jäljellä 70 koettimet olivat mediaani-keskitetty klusterointi; punainen osoittaa korkeampi kuin mediaani sitova, vihreä alhaisemmat. Käsitellyt tiedot löytyvät Suppl. Taulukko S2. Tiedot voidaan myös käyttämällä web-pohjainen katseluohjelma (https://proteome.moffitt.org/sh2/). Tässä analyysissä solulinjoja kätkeminen mutantti EGFR klusterin yhteen kolme erillistä alaryhmiä, kun taas kaksi suurta klustereita (neljän ja kahdeksan solulinjoilla) koostuvat kokonaan linjat villityypin (wt) EGFR. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SH2 profilointi voi tunnistaa osajoukkoja keuhkosyövän soluja, ja että tällaiset klusterit näyttävät liittyvän EGFR-mutaatio aseman.

(A) Ruusuke tiedot ryhmitellään SH2 domain ja solulinjaa. Jokainen rivi edustaa yhtä SH2 verkkotunnuksen ja kukin sarake edustaa yhtä solulinjaa. Biologiset ominaisuudet (EGFR mutaatio, K-RAS mutaatio, erlotinibi herkkyys) on esitetty yllä musta ja valkoinen. Sillä erlotinibin herkkyys, positiivinen /herkkä: IC

50 10 nM; Väli- /kohtalaisen herkkä: 10-1000 nM; negatiivinen /tunteeton: 1000 nM. (B) Far-Western data ryhmitellään SH2 verkkotunnuskohtaista bin ja solulinjan. Jokainen rivi edustaa yksittäistä MW bin (20 bins /kaista) tietylle SH2 verkkotunnuksen ja kukin sarake edustaa yhtä solulinjaa.

Toinen SH2 profilointi lähestymistapa käyttää pitkälle Western blottauksella saada yksityiskohtaisempaa tietoa suhteellinen runsaus ja näennäinen molekyylipaino (MW) fosfopro- jotka sitoutuvat eri SH2 domain antureista. Proteiini näytteet erotetaan koon perusteella geelielektroforeesin avulla ja siirrettiin kalvoille, jotka sitten leimattua SH2-domeenia. SH2 sitovia proteiineja paljastuvat bändejä, ja näennäinen MW Näiden kaistat voivat antaa vihjeitä henkilöllisyytensä. Olemme kehittäneet ohjelmistotyökaluja, joiden avulla SH2 sitovia tietoja pitkälle Western blotit voidaan mitata in ”astiat” by näennäinen MW, esim. 20 roskakorit kaistaa kohti. Tiedot kuhunkin lokeroon (joka vastaa fosfopro- tietyn MW, jotka sitoutuvat SH2 koetin) voidaan sitten käyttää luokitus perustuu näytteitä. Niinpä sen sijaan, että vain yksi arvo kunkin näytteen ja SH2 domain, kuten ruusuke määrityksessä, kvantitatiivinen pitkälle Western blottauksella tarjoaa vähintään 20 eri datapistettä, suuresti kasvattanut eroon näytteiden välillä.

Far-Western blotit keuhkosyövän solulinjoja seulottiin 36 SH2 tai PTB domeeneja, sekä anti-pTyr vasta-aine. Raaka kuvadatan löytyy Suppl. Elokuva S1 ja määrälliset tiedot Suppl. Taulukko S2. Kun määrälliset tulokset alistettiin hierarkkinen klusterointi, näytteet ryhmittyneet 3 eri luokkaan, sekä kaksi harha (Fig. 2B). Yksi näistä (cluster 3) koostuu kokonaan solujen paino EGFR ja on erittäin runsaasti solujen aktivoimiseksi K-RAS mutaatioita. Sen sijaan, klusterit 1 ja 2 on rikastunut sellaisten solujen EGFR mutaatioita; kussakin näistä klustereista, solujen paino ja mutantti EGFR ovat eriytyneet. Näin kvantitatiivinen pitkälle Western blottauksella näyttää antamaan lisätietoja tyrosiinikinaasin signalointi tila, jota voidaan käyttää toiminnallisesti luokitella soluihin perusteella RTK aktivoinnin tilan. Kaiken klusterointi tulokset Rosette ja laajalle Länsi määritykset ovat samankaltaisia ​​mutta eivät identtisiä, kuten alla.

sidonta joukko SH2 verkkotunnuksia on parannettu -solut aktivoivat EGFR mutaatioita

seuraavaksi kysytään sitovat minkään yksittäisen SH2 verkkotunnuksen antureista oli erittäin liittyy aktivoivia EGFR mutaatioita. Vuodesta ruusuke sitoutumiskokeissa tunnistimme 7 antureista, joiden sitoutuminen korreloi tilastollisesti merkitsevä muodin EGFR-mutaatio asema: Grb2, SHCA (PTB), Grap2, Brk, Txk, CblB ja CblA (Fig. 3A) (katso Suppl. Taulukko S3 SH2 verkkotunnuksia ja vastaavia proteiineja). Olemme panos nämä verkkotunnuksia PPI Spider, työkalu tulkinnassa Proteomiikan tietojen yhteydessä tunnettujen proteiini- proteiini vuorovaikutuksen verkkoja. Tämä analyysi osoitti, että viisi näistä proteiineista (SHCA, Grb2, CblA, CblB, ja Brk) on raportoitu sitoutuvan suoraan EGFR, kun Grap2 on mahdollisesti liittyy EGFR kautta SHCA (Fig. 3B). Se, että sitoutumiskohdat Grb2 ja SHCA (ja tiivis Grb2 suhteellinen Grap2) liittyvät läheisesti EGFR-mutaatio on erityisen kiehtova, koska lisääntynyt sitoutuminen näiden SH2-domeenia olisivat voimakkaasti ennakoitiin johtavan aktivoitumiseen RAS signalointireitin kautta rekrytointi RAS aktivaattori Sos [32], [33].

(A) SH2 verkkotunnuksia, joiden sitoutuminen on merkittävästi korreloi EGFR-mutaatio (q 0,1). Bar tontti SH2 signaalin mutantti ja villityypin EGFR solulinjoja esitetään keskiarvoa standardeilla virhepoikkeamilla. ”SH2 domain” käytetään luvut kaikille antureista, myös PTB verkkotunnuksia ja anti-pTyr vasta-aine. (B) proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen karttaa EGFR (harmaa ympyrä) ja proteiinien SH2 verkkotunnuksia, joiden sitoutuminen on merkittävästi korreloi EGFR-mutaatio (valkoiset ympyrät). Viivat osoittavat raportoitu suoran sitoutumisen vuorovaikutusta. (C) Far-Western domain-specific bändejä korreloi merkitsevästi EGFR-mutaatio. Värilliset laatikot osoittavat tulokset tilastollista merkittävyyttä Mann-Whitneyn testi erot (q 0,1) kesken 22 solulinjat kuvassa 2B. Nuoli osoittaa bin vastaa EGFR perheenjäseniä. Numerot vieressä laatikot osoittavat näennäinen MW, esim. ”291,0” = MW välillä 256-291 kDa.

Samanlainen analyysi tehtiin käyttämällä tietoja pitkälle Western blottauksella. Huomasimme, että useita erityisiä bändejä kaukaa Western blotit korreloivat merkitsevästi EGFR-mutaatio (Fig. 3C). Tässä se on mielenkiintoista pohtia, vanteet, joiden sitoutumisen taipumus kasvaa EGFR mutanttisoluja (punainen) verrattuna niihin, jotka sitovat yleensä pienenee EGFR mutanttisoluja (vihreä). Toteamme, että anturien ennustettu (perusteella tunnetun signaloinnin aktiivisuus) liittyvän stimulaation RAS reitin (Grb2 ja Shc), lisääntynyt sitoutuminen molekyylipainon alue, joka sisältää fosforyloidun EGFR perheenjäsenet (MW194, nuoli) on nähty EGFR mutanttisoluista. Tämä todennäköisesti heijastaa lisääntynyt sitoutuminen näiden efektorien epätavallisen aktivoitu EGFR verrattuna wt reseptoriin. Tämä pätee myös SH2-domeenia muiden tunnettujen positiivisten efektorien EGFR signaloinnin, mukaan lukien Vav2, PI-3-kinaasin (PI3K; P85B), ja PLCγ Plcg1).

Toisin kuin EGFR-mutaatio, ei havaittu olevan yksittäisen SH2-domeenia, joiden sitoutuminen korreloi voimakkaasti RAS mutaatio aseman ruusukkeen tai pitkälle Western blottauksella. Tästä huolimatta huomasimme mielenkiintoinen näennäinen korrelaatio ryhmittely perustuu maailmanlaajuiseen SH2 profiilit ja K-RAS mutaatiostatus. Tämä käy ilmi erityisesti, kun kyseessä on laaja-Western-blottauksella (kuvio. 2B), jossa kaksi suurta klusterit koostuvat kokonaan solujen wt K-RAS, kun taas kolmas suuri klusteri (ryhmä 3) koostuu lähes yksinomaan solujen paino EGFR mutta mutantti K-RAS. Meitä on hämmästyttänyt ulkonäkö H1299 vuonna klusterin # 3, kuten K-RAS on wt näissä soluissa. Kuitenkin tarkempi tarkastelu sekvenssin paljastivat, että K-RAS suhteessa N-RAS on mutatoitunut H1299 (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/), mutta ei mitään muita solun rivit tässä tutkimuksessa käytetyt. Näin perustuva ennuste SH2 profilointia, että H1299 solut ovat todennäköisesti satama aktivoitu RAS, olivat osoituksena, voimakkaasti validoida biologista merkitystä tämän lähestymistavan. Tämä klusterin RAS mutanttien (6 6 solulinjojen kätkeminen RAS mutaatio) on erittäin epätodennäköistä tapahtuneen sattumalta (p = 0,001, permutaatio testi, n = 100000). Nämä tulokset osoittavat, että tyrosiinifosforylaatiota kuvioita voidaan Saharan luokitella soluiksi RAS mutaatiostatus. Puute korrelaatio yksittäisten SH2 domain antureista ja RAS mutaatio (vastakohtana korrelaatio perustuu maailmanlaajuiseen tyrosiinifosforylaation profiilin) ​​voi heijastaa sitä, että RAS toiminnot alavirtaan tyrosiinikinaasien. Testaamme parhaillaan malli, joka konstitutiivinen Ras toiminta johtaa aktivoitumiseen palautetta polkuja, jotka laajasti downregulate tyrosiinikinaasi signaloinnin.

joukko SH2 koettimien korreloi herkkyys keuhkosyöpään solujen EGFR-TKI

Me seuraavaksi määrittää, jos SH2 verkkotunnuksen sitoutuminen korreloi herkkyys keuhkosyövän solulinjat erlotinibille, pienimolekyylinen EGFR estäjä. Tällaiset domeenit voivat toimia pohjana ennakoivan biomarkkereiden tunnistamiseen kasvaimet reagoivat todennäköisesti TKI-terapialle. SH2 profilointitiedot tutkittiin mahdollinen korrelaatio IC

50 erlotinibi kunkin solulinjan (IC

50 määritettiin tämän tutkimuksen samoissa käytetyt viljelyolosuhteet SH2 profilointiin). Huomasimme, että sitoutuminen 13 antureista vastaa 12 proteiineihin korreloivat tilastollisesti merkitsevästi muodin erlotinibin IC

50 (Fig. 4A). Näitä ovat Grb2 (esitetty kuviossa. 4B), SHCA, SHCA (PTB), p85B, Cis1, Arg, Eat2, Plcg1, Ptk70 /SRM, Fes, Lnk, Tem6, ja Btk. Verkko analyysi vahvistaa raportit suoran vuorovaikutuksen EGFR ja Grb2, SHCA, p85B, Cis1, Arg, Plcg1, Fes, ja Btk (Fig. 4C). Kaiken kaikkiaan tulokset ovat yhdenmukaisia ​​mallia, jossa erlotinibi herkkyys liittyy erityisen voimakasta signaloinnin aktivoituu EGFR tunnettuihin core loppupään -efektiboksejamme lukien MAPK (Grb2 ja SHCA), PI3K /Akt (p85B), ja PLCγ (PLCg1) polkuja.

SH2 alueen signaalin käsittelemättömissä soluissa verrattiin ln IC

50 erlotinibi. (A) Verkkotunnukset merkittävästi korreloi ln IC

50. Negatiivinen korrelaatio, sitä suurempi SH2 sitova soluissa herkempiä (alempi IC

50) erlotinibille. (B) sirontakuvaajaan Grb2 SH2 verkkotunnuksen sitova vs. ln (IC

50) erlotinibi. (C) proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen kartan EGFR ja proteiinien SH2 verkkotunnuksia, joiden sitoutuminen on merkittävästi korreloi erlotinibin herkkyys. Viivat osoittavat raportoitu suoran sitoutumisen vuorovaikutusta. (D) Heatmap edustavat korrelaation jokaisen domain-specific bin erlotinibille herkkyyttä. Pearsonin korrelaatio laskettiin jokaiselle domain-specific bin poikki 22 solulinjat ja ln (IC

50) vastaavan solulinjan. Jokainen heatmap sijainti edustaa korrelaatiokerroin että bin; vihreä valo osoittaa yhä SH2 signaali pienentyessä IC

50-arvot (suurempi herkkyys); Punainen osoittaa yhä SH2 signaali yhä IC

50-arvot (katso väripalkki). Nuoli osoittaa MW bin sisältäviä EGRF proteiineja. (E) Luettelo 46 verkkotunnuskohtaista moduulilaatikot | korrelaatiokerroin | 0,5.

Far-Western-blottaus tunnistetaan myös bändejä, jotka korreloivat erlotinibin herkkyys (Fig. 4D 50% korkeimman arvon immunoblottaus anti-MET pY1334 /1335; väli, 25-50%; negatiivinen, 25%. Katkaisu pTyr MW194: positiivinen, 25% korkeimman arvon immunoblottauksella anti-pTyr; väli, 10-25%; negatiivinen, 10%.

Sitten liittyviä MET ja EGFR aktivointi tilassa SH2 profiloinnin tuloksia. Merkillistä, ilman valvontaa klusterointi sekä ruusukkeen ja pitkälle Western data paljasti, että useimmat solulinjat vahvojen MET aktivointi klusteri on selvä, tiivis ryhmä (Fig. 5B 0,01, q 0,1). Bar tontti SH2 signaalin korkean ja matalan MET fosforylaatio. Mean ja keskivirheet esitetään. Tätä analyysiä varten ”Low” sisältää sekä väli- ja matala /negatiivinen luokat (Fig. 5). (B) Far-Western domain-specific bändejä korreloi MET fosforylaatiota. Värilliset laatikot osoittavat tilastollista merkittävyyttä Mann-Whitneyn testi erot (q 0,1). (C) H1648-solut altistettiin valvoa (DMSO), 1000 nM erlotinibi (E), 1000 nM PHA665752 (P), tai niiden yhdistelmä (E + P) 3 tuntia ja analysoitiin immunoblottauksella. Lysaatit käsittelemättömien H820 solut toimivat kontrollina p-MET. Anti-β-aktiini käytettiin varmistamaan yhtä suuri kuormitus. (D) Solujen elinkelpoisuus ja H1648-solut altistettiin 60 nM erlotinibi (E), 300 nM PHA665752 (P), tai niiden yhdistelmä (E + P).

Se, että H1648-solulinja ryhmitelty tiukasti kanssa H820 solulinjan, joka oli aiemmin todettu aktivoivan EGFR-mutaatio yhdessä MET vahvistus [20], ehdotti, että H1648 solut voivat olla samanlainen H820, että loppupään signalointi johtui sekä EGFR ja MET. Tämän testaamiseksi me altistuvat H1648 solut estäjiä EGFR (erlotinibin), MET (PHA665752) [36], tai yhdistelmä ja tutkittiin loppupään Akt ja ERK aktivointi (Fig. 6C). Havaitsimme vaatimaton vähennykset fosforyloidun Akt ja ERK vastauksena joko -estäjä yksin, mutta vahva esto päälle dual EGFR ja MET esto. Vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen peilattu signalointi vasteet, kuten molempia aineita johti parantuneeseen solujen kasvun esto (Fig. 6D). Siten globaali pTyr kuvioita, määritettiin SH2 profilointia, ennustaa MET aktivointi ja voi ennustaa vastaus MET TKI näissä solulinjoissa.

häiritsemisestä globaalin pTyr profiilien TKI

seuraavaa käyttöä SH2 verkkotunnuksen profilointi tutkia muutoksia globaalissa tyrosiinifosforylaa- soluissa altistuvat TKI. Odotuksemme oli, että muutokset SH2 sitovia malleja voitaisiin korreloida biologisia vasteita estäjiä, ja että koettimia mikä sitoutuminen väheni voimakkaasti TKI-esti solut olivat todennäköisesti edustamaan avain väyliä TKI toimintaa. Neljä keuhkosyövän solulinjat (H292, H441, H358 ja HCC827) on lyhyesti altistuvat erlotinibille, estäjä EGFR, tai dasatinibi, joka on SRC-estäjä, joka estää useiden tyrosiini ja seriini /treoniinikinaaseja [37], [38], [39]. Nämä solulinjat eroavat suuresti niiden vastauksia näihin TKI. Vuonna HCC827 soluja aktivoimalla EGFR mutaatio, molemmat inhibiittorit apoptoosin; in H358 ja H292-soluissa kanssa p- EGFR kumpikin aine aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen; ja H441-solujen kanssa p- EGFR ovat kestäviä sekä aineet ([9] ja tietoja ei ole esitetty). Rosette ja pitkälle Länsi SH2 profilointi tehtiin kaikille neljälle solulinjojen sekä käsitellyn ja käsittelemättömän ryhmissä.

ruusuke sitova tiedot (log

2-kertaiseksi muutoksia käsiteltyjen versus käsittelemättömien ryhmien) saatiin näkyviin vesiputous tontteja ranking muutokset SH2 sitovia (Fig. 7A, Suppl. Fig. S4A). Vuonna HCC827, erlotinibi aiheutti täydellisen romahduksen pTyr signalointi, kuten huomattavasti laskea SH2 sitoutumisen noudatetaan lähes kaikille antureista. Merkittävimmät vähennykset sitova tapahtunut varten Grb2, Grap2, Vav2, ja Vav1 SH2 verkkotunnuksia. Suurin piirtein samanlaiset havaittiin muutoksia upon dasatinibihoidon hoitoa, mikä viittaa päällekkäisyys mekanismi, mutta kertamuutoksia olivat vähemmän useimpien antureista, johdonmukainen sen tehottomampia vaikutukset EGFR fosforylaatioon [9]. Samanlaisia ​​HCC827, sitovat lähes kaikkien SH2 verkkotunnuksen antureista heikkeni merkittävästi TKI-käsiteltyjen H358-soluissa, ja siellä oli vielä suurempi samankaltaisuus vastausten erlotinibille ja dasatinibin. Vuonna H441, joka on resistentti TKI, erlotinibi ja dasatinibi herättää samanlainen yleinen kuvioita muutoksen H358. Kuitenkin lasku SH2 sitoutuminen pyöristetty H441 verrattuna H358 ja HCC827, ja sitoutuminen suurempi määrä SH2-domeenia suurenee sekä estäjien verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Lopuksi H292 osoitti vähiten dramaattisia muutoksia SH2 domain sitova, ja yleisen mallin vasteen TKI hoitoon tässä solulinjassa oli hyvin erilainen kuin muut kolme. Lisäksi erlotinibi ja dasatinibiryhmän profiilit olivat erilaisia ​​kuin muilla testatuilla solulinjoilla. Samat näytteet analysoitiin myös kaukaa Western blottaus käyttämällä rajoitettua joukkoa SH2 koettimia (Suppl. Fig. S4b).