Krooninen sairaus

tiivistelmä

Double minuutin kromosomit sytogeneettinen ilmenemismuotoja geenimonistuman usein nähty syöpäsoluissa. Geenit monistettu kaksinkertaista minuutin kromosomien sisältävät onkogeenien ja monilääkeresistenttien geenejä. Nämä geenit koodaavat proteiineja, jotka edistävät syövän muodostumista, syövän eteneminen ja resistenssin kehittyminen lääkkeille, joita käytetään syövän hoidossa. Kaksinkertaisen minuutti ja kromosomit geenit monistettiin niistä, on tehokas tapa vähentää pahanlaatuisen syövän soluja. Olemme tutkineet tehokkuutta syöpälääkkeen, gemsitabiini, menetyksestä kaksinkertainen minuutin kromosomien päässä munasarjasyövän solulinja UACC-1598. Gemsitabiini pystyy lukumäärän vähentämiseksi kaksinkertainen minuutin kromosomien soluihin 7500X pienempi pitoisuus kuin yleisesti käytetty syöpälääke hydroksiurea. Monistettujen geenien läsnä kaksinkertainen minuutti kromosomit pienenevät DNA-tasolla, kun gemsitabiinihoidon. Gemsitabiini pienelläkin nanomolaariseen pitoisuus, kykenee aiheuttamaan DNA-vaurioita. Selektiivinen sisällyttäminen kaksinkertaisen minuutin chromatin ja γ-H2AX signaaleja mikrotumia antaa vahva yhteys DNA-vaurioita ja menetys kaksinkertainen minuutin kromosomien gemsitabiinia käsitellyistä soluista. Solut gemsitabiiniryhmässä osoitti myös vähentynyt solujen kasvua, pesäkkeiden muodostumista, ja hyökkäystä. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että gemsitabiini on tehokas vähentämään kaksinkertainen minuutti kromosomia ja tämä vaikuttaa biologiaan munasarjasyöpäsoluja.

Citation: Yu L, Zhao Y, Quan C, Ji W, Zhu J, Huang Y, et ai. (2013) Gemsitabiini Poistaa Double hetken kromosomit Human munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 8 (8): e71988. doi: 10,1371 /journal.pone.0071988

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu 17. maaliskuuta 2013 Hyväksytty: 05 heinäkuu 2013; Julkaistu: 22 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat International Science Teknologia yhteistyöohjelma Kiinan (2013DFA31610 SF), Program for Changjiang Tutkijat ja Innovative Research Team yliopiston (IRT1230 ja YJ), National Natural Science Foundation of China (31000626 ja 31271347 WS, 81201761 ja LY), ja uusi Century tukiohjelma Erinomainen Scholar, opetusministeriö Kiinan (NCET-10-0149 WS, NCET-11-0954 YY). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Geenimonistus on eräänlaista perimän epävakaisuuden, joka on usein nähty syöpiä, ja se voi ilmentyä sytogeneettisesti kuin homogeenisesti värjäystä alueita (HSRs) tai kahden minuutin kromosomeja (DMS) [1], [2], [3 ], [4]. DMS on autonomisesti replikoituva, acentric, ja atelometric rengasmainen DNA vaihtelee sadoista kiloemäksen muutaman megabases kokoisia [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Metafaasissa leviää värjätään DNA: ta sitovan väriaine, DMS voidaan nähdä mikroskoopilla yhtenä tai pareittain minuutin kromatiinin paljon pienempi kuin kromosomeja.

kromosomin ajoneuvon liitetyt perimän DNA-sekvenssit, DMS myötävaikuttaa syövän muodostumisen ja etenemisen sillä onkogeenit ja monilääkeresistenssin geenit ovat usein läsnä monistetut sekvenssit ja proteiinit ne koodaavat ovat usein yli-ilmentynyt [11]. Esimerkkejä geeneistä monistettiin DMS sisältävät

MYCN

neuroblastoomakasvaimissa [12],

C-MYC

in koolonkarsinoomasoluissa [13],

EGFR

glioomis- [14], ja

eIF-5A2

in munasarjasyöpäsoluja [15], ja jotka kaikki kun menetti kautta DMS edistää käänteinen syövän fenotyypin [12], [13], [14], [16]. Poistaminen amplifikaatioita onkogeenien DMS on myös osoitettu aiheuttavan apoptoottisen solukuoleman, solujen erilaistumista ja solujen vanhenemista [13], [17], [18].

Useat tutkimukset ovat edistäneet ymmärrystä mekanismi menetys DMS syöpäsoluista. Menetys DMS on osoitettu monissa syöpäsolulinjoissa [12], [13], [17], [19], [20], [21], [22]. Ei-tappavia pieninä pitoisuuksina hydroksiurean (HU) on ensin todettu lisäävän menetys DMS hiiren solut, jotka sisältävät monistetun DHFR [23], ja myöhemmin sen havaittiin sama vaikutus nisäkkään syöpäsoluissa [13], [24] . Menetys DMS alhainen pitoisuudet HU voivat lisätä lääkeaineen herkkyys [24] ja vähentää tuumorigeenisyyden syöpäsolulinjojen [13]. Tärkeintä on, menetys DMS vaikuttivat niiden loukkuun osaksi mikrotumia (MN) [13] ja tämän loukkuun voidaan parantaa pieniä pitoisuuksia HU [25], [26].

On kaksi mallia MN muodostuminen: orastava /nucleation interfaasivaiheessa ja postmitoottisia muodostumisen [27]. Rajoitetusti näyttöä olemassa osuus HU MN muodostumista orastava /ydintymis [25]. Yksityiskohtainen tutkimus osoittaa HU voi aiheuttaa MN muodostumisen kautta postmitoottisia malli [28]. Tässä mallissa, HU indusoi irtoaminen DMS mitoosi kromosomeja niin, että aggregaatteja DMS muodostuvat jälkeen mitoosia seuraavassa G1 vaiheeseen solusyklin. Sen jälkeen kun solut tulevat S-vaiheeseen, DMS aggregaatit ympäröi lamiinivektori proteiinin tuottamiseksi replikoituvaan sytoplasmisen MN [28]. Molekyylimekanismi HU MN muodostumista on tutkittu intensiivisesti paksusuolen syövän soluissa, jotka sisältävät DMS [26]. Pieninä pitoisuuksina HU aiheuttaa DNA-vaurioita solun tumassa S-vaiheessa, havaittavissa kuin γ-H2AX pesäkkeitä, mutta signaalit eivät merkittävästi päällekkäisiä DMS chromatin. Koska vahingot on korjattu ja solujen edetessä solusykliä, useimmat γ-H2AX signaalit menetetään metafaasissa kun mitään signaalia, jotka jäävät päällekkäisiä DMS chromatin. DMS γ-H2AX signaali havaittiin irrota Anaphase kromosomeista ja muodostavat MN seuraavassa G1 vaiheessa [26].

HU on inhibiittori, joka estää spesifisesti Ribonukleotidireduktaasin (RNR). RNR on tärkeä entsyymi, jota tarvitaan

de novo

synteesiä deoksiribonukleosiditrifosfaatteja (dNTP: tä) soluissa muuntamalla ribonukleotideja deoksiribonukleotideiksi [29], [30], [31]. Ribonukleotidireduktaasin koodaa kaksi geeniä

RRM1

ja

RRM2

, joka vastaa suurten R1 ja pieniä R2 alayksikön entsyymi vastaavasti. HU on tärkeä estäjä tämän entsyymin, spesifisesti inhiboimaan R2 alayksikköön. RNR ei ole ainoastaan ​​tärkeää säilyttää dNTP tarvittavien tarvikkeiden DNA: n replikaatioon, vaan myös tärkeä rooli ylläpitää genomin eheys [32].

Gemsitabiini (2 ’, 2’-difluorodeoxycytidine, GEM) on uudempi syöpälääkettä ja se estää R1 alayksikköä RNR. Siinä on kaksi toiminnallisia ominaisuuksia. Yksi on suora vuorovaikutus R1 alayksikköä RNR mikä alentaa RNR toiminta ja siten vähentää dNTP taso soluissa. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että

RRM1

ekspressiotaso määrittää GEM herkkyyttä tai resistenssiä [33], [34], [35], [36], [37]. Koska GEM on deoksisytidiinin analoginen toinen ominaisuus GEM on, että se voidaan muuttaa solun entsyymien tuottamiseksi cFcCTP (2 ’, 2′-difluorodeoxycytidine-5’-triphsophate), joka voidaan sisällyttää vasta monistaa DNA: ta ketjun päättymisen [38]. GEM hoidetaan erilaisia ​​syöpiä, kuten ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), haimasyöpä, virtsarakon syöpä, rintasyöpä, ja munasarjasyöpä [39], [40], [41], [42], [43] .

Munasarjasyöpä on yksi johtavista gynekologiset syöpäsairauksia. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet hoidossa tämä syöpä, yli puolet edenneen taudin potilaista kehittää vastustuskykyä hoidon kokemusta toistumisen tauti, ja lopulta kuolee näistä ominaisuuksista [44]. Standardi munasarjasyövän hoitoon on leikkaus seuraa karboplatiini ja paklitakseli terapia, mutta monet potilaat kehittävät uusiutuva sairaus resistenssi platina hoito [45]. Kun hyväksyntää käytön GEM hoidossa munasarjojen syöpien Euroopassa, Yhdysvalloissa ja muissa maissa viime vuosina, GEM on tulossa lupaava uusi lääke munasarjojen syöpien. Äskettäin GEM on osoitettu olevan tehokas hoidettaessa munasarjojen syöpien erityisesti platina kestävät alaluokka, joita käytetään joko yksinään tai yhdessä muiden lääkkeiden kanssa [1], [40], [44], [45], [46].

DMS havaittiin olevan läsnä ensisijainen munasarjasyövän näytteitä ja vesivatsoja munasarjasyöpä potilaiden ja vahvistetaan munasarjasyövän solulinjoissa [15], [47], [48], [49], [50] . Eräs tutkimus on todennut, että potilaiden taajuus munasarjasyövän DMS on peräti 88% [51]. Eräs tutkimus on todennut, että munasarjasyövän potilailla, joita hoidetaan pieniä pitoisuuksia HU määrä DMS väheni syöpäsoluissa näistä potilaista [52]. Vaikka HU voidaan ottaa suun kautta tai injektiona laskimoon, se on heikko estäjä RNR joiden puoliintumisaika on vain 3,4 tuntia ennen eliminoituu munuaisten kautta [53]. Tässä tutkimuksessa olemme selvitettävä, GEM voi valikoivasti vähentää tiettyjä geeni monistuksia kautta DMS, mekanismeja DMS lasku, ja mitä arvoa sillä on hoidossa munasarjasyöpä. GEM voisi vähentää määrää DMS munasarjan syöpäsolujen sekä geenit monistettiin erityisistä DMS pitoisuutena 7500X pienempi kuin HU. Lisäämällä GEM määrä MN lisääntynyt, ja geenit kuljetetaan DMS valikoivasti sisällytetään näihin MN. Jopa pieninä pitoisuuksina GEM voi aiheuttaa DNA-vaurioita soluissa, ja nämä vaurioituneet DNA myös valikoivasti sisällytetty MN. Ehdotamme, että GEM voi aiheuttaa DNA-vaurioita DMS, joka silloin, kun ei ole korjattu, valikoivasti sisällytetään MN ja hävisi soluista. Tämä puolestaan ​​vaikuttaa biologiaa syöpäsoluihin, niin että solut osoittavat vähentynyt kasvu, vähentynyt pesäkkeiden muodostumista, ja laski invaasio.

Materiaalit ja menetelmät

1. Cell Lines ja viljelyolosuhteet

munasarjasyövän solulinja UACC-1598 oli ystävällinen lahjoitus tri Xin-Yuan Guan (University of Hong Kong) [15]. UACC-1598-4 solulinja oli klooni UACC-1598 valittiin stabiilin ylläpidon suuren määrän DMS. Se teki Sarjalaimennosten menetelmällä. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) media (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja siirrostettiin joka 2-3 päivä, kun ne kasvoivat konfluentteja.

2. Lääkehoito ja Growth Analysis

HU ja GEM ostettiin Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, USA) ja Lilly France (Ranska) vastaavasti ja laadittu valmistajan suositusten. HU kantaliuos tehtiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja GEM kantaliuos tehtiin 0,9% NaCl. Pitoisuudet HU kokeissa käytettävien olivat 100 ja 150 uM Seuraavat julkaistut pitoisuuksia [23], [24], [26]. Pitoisuudet GEM käytettiin 10 ja 20 nM, joka oli eri laimennoksia sen puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) solulinjoissa tässä tutkimuksessa käytetyt. Pitoisuus gemsitabiinin Tässä tutkimuksessa käytettiin oli 3-6 kertaa pienempi kuin tavallinen

in vivo

annos annetaan potilaille (Lilly Ranska). Pitoisuudet 10 ja 20 nM GEM vastaa 0,01 IC

50 ja 0,02 IC

50 GEM vuonna UACC-1598-4 solulinjassa. Sama pitoisuudet vastaavat 0,032 ja 0,064 IC

50 GEM vuonna UACC-1598 solulinja. Solut siirrostettiin joka 2-3 päivä ja tuoretta yhdisteet lisättiin. IC

50 GEM laskettiin CellTiter 96 AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit Promega (Madison, WI, USA) seuraten valmistajan protokollaa.

3. MTS, Colony Formation, ja Invasion Analyysit

Lyhyesti, solujen biologisia määrityksiä suoritettiin seuraavasti. MTS-määritys, 2000 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppaisilla levyillä. Solut joko annetaan kasvaa median yksin tai jotka sisälsivät 150 uM HU tai 20 nM GEM. OD Kunkin luettiin joka päivä seuraavan CellTiter 96 AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit protokollia ja piirretään. Pesäkkeiden muodostuminen, 2000 solua siirrostettiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevyllä joko läsnä tai poissa ollessa yhdisteitä. Solujen annettiin kasvaa 14 päivää, ennen kuin se pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), etanoli kiinnitys, ja Giemsa-värjäyksellä. Kuvia otettiin kustakin kuopasta ja pesäkkeet käsin laskettiin ImageJ ohjelmisto. Kolme rinnakkaista tehtiin kullekin tilalle. Solujen invaasiota, kuusikymmentätuhatta solut ympättiin BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), ja sen annettiin tunkeutua läpi Matrigel kalvon. 72 tunnin jälkeen, solujen määrä, joka tunkeutuu kalvon läpi laskettiin. Kolme rinnakkaista tehtiin kullekin yhdisteen kunnossa.

4. Metafaasissa Levitä

Soluja käsiteltiin Kolkisiinia (Sigma) 1,5 h, trypsinoitiin ja pestiin PBS: ssä ennen valmistamiseksi metafaasissa leviää. Soluja ensimmäistä paisui 9 ml: ssa esilämmitettyä 0,075 M KCI 14 min, 37 ° C: ssa. Turpoamisen jälkeen, soluja esi-kiinnitettiin 1 ml juuri valmistettua fiksatiiviliuosta (seos 3 metanoli: 1 etikkahappoa) ja sentrifugoitiin välittömästi. Solut fiksattiin ja sentrifugoitiin kahdesti 10 ml: n fiksatiiviliuosta. Solupelletit viimeisen sentrifugoinnin suspensoitiin uudelleen 0,5 ml: aan kiinnitysainetta, ja pieni määrä otettiin Pasteur-pipetillä ja pudotetaan puhdas objektilaseille. Mitoosi kromosomit havaittiin värjäämällä diat Giemsa ja valokuvattiin Olympus BX41 mikroskoopilla (Olympus America Inc., Melville, NY, USA) liitetty JVC TK-C75U värivideokameran (JVC, Japani) on 1000 kertaa suurennettu. Määrä DMS läsnä jokaisessa solussa laskettiin käsin. Solujen lukumäärä laskettiin vaihtelee 60 ja 100 jokaisesta näytteestä.

5. Eristäminen Genomisen DNA: n ja Real-time PCR

Solut pelletoitiin ja genominen DNA valmistettiin kanssa QIAamp DNA veren Mini Kit (QIAGEN, Saksa), kuten valmistaja on kuvannut. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Esisekoite Ex Taq II mix (TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd., Kiina) LightCycler® 480 (Roche Applied Science, Saksa) Real-Time PCR tunnistusjärjestelmä. Monistaminen taso

MYCN

,

EIF5A2

, ja

MCL1

havaittiin, ja

ACTB

toimi sisäisen valvonnan. Keskiarvo ± keskihajonta (SD) on kolme toistoa piirrettiin kunkin lajin vertailuja hoitoa ja valvontaa soluja. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat:

EIF5A2

, 5′-TACTTGGCAGAGATTAAACAGG-3 ’(F), 5′-CAAAGTATTTGCACCTTGAAG-3’ (R);

MYCN

, 5′-ACCACAAGGCCCTCAGTAC-3 ’(F), 5′-GCAACGGCATTCTCTCAG-3’ (R);

MCL1

, 5′-CTGGAGATTATCTCTCGGTAC-3 ’(F), 5′-CTGACTCGTTTCGGTTTC-3’ (R);

ACTB

, 5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3 ’(F), 5′-AAGCAAATAGAACCTGCAGAG-3’ (R).

6. Fluoresoiva

in situ

hybridisaatio (FISH) B

Metaphase leviää ensin valmistettiin edellä kuvatulla tavalla ja FISH suoritettiin sen jälkeen seuraavaa protokollaa. Bakteerien keinotekoinen kromosomi (BAC) klooni RP11-654K19 varten

EIF5A2

, BAC klooni RP11-355H10 varten

MYCN

, ja BAC klooni RP11-54A4 varten

MCL1

valittiin FISH leimatut syaniini 3 (Cy3), fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), tai syaniini 5 (Cy5). Sitten lasit vastavärjättiin 4, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) ja valokuvat otettiin Leica DM5000B mikroskoopilla (Leica, Saksa) on 1000 kertaa suurennettu. Solujen lukumäärä analysoitiin vaihtelee 180-280 jokaisesta näytteestä.

täynnä signaali solun tumassa havaitsimme on asetettu 100%. Solut ryhmiteltiin 3 ryhmään analysointia varten signaalijakautumasta: Ryhmä 1 sisältää solujen 30% signaali, ryhmä 2 sisältää soluja 30-60% signaali, ja ryhmä 3 sisältää solut 60% signaali. Asteen signaalin kvantifioidaan MetaMorph ohjelmistoa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), joka analysoi suhteellinen pinta-ala signaalin alueen solun tumassa. Mikrotumatestin (MN) määritellään miksi tahansa DAPI värjättyä alueella himmeämpi kuin DAPI värjätään tumaan ja jonka pinta-ala on pienempi kuin yksi kolmasosa solun tumassa. Solut, joissa on kaksi tai useampia mikrotumia ei laskettu poistaa esineitä. Solut myös ryhmitelty perustuu MN tila: Ryhmä A sisältää soluja ilman MN, ryhmä B sisältää soluja MN mutta MN ei sisällä signaalia, ja ryhmä C kuuluvat solujen signaali sisältävien MN.

7. Immunofluoresenssilla

Solut ympättiin coverslip kuuden-kuoppalevyille ja käsitelty eri yhdisteiden ilmoitetaan kertaa ennen suorittamista immunofluoresenssimenetelmällä. Lyhyesti, solut peitinlaseil- pestiin 3 x 10 minuuttia PBS: ssä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja rehydratoitiin 3 x 10 minuuttia PBS: llä. Solut tehtiin läpäiseviksi ja estetty KCM puskurissa (120 mM KCI, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 2% naudan seerumialbumiinia ja 10% rasvatonta maitojauhetta) ja 6 tuntia 4 ° C: ssa ja inkuboitiin anti-fosfo-H2AX (Ser139) vasta-aine (klooni JBW301, Millipore, Billerica, MA, USA) laimennettiin KCM puskuriin (1:500) yön yli 4 ° C: ssa. Sitten solut pestiin 3 x 10 minuuttia PBS: ssä, inkuboitiin CF555 vuohen anti-hiiri-IgG (H + L) (Biotium, Hayward, CA, USA) laimennettiin KCM puskuriin (1:1000) 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa, ja pestiin jälleen kolme kertaa 10 min PBS: llä. DNA visualisoitiin counterstaining solut DAPI ja kiinnitetty dioja. Kuvat saatiin käyttäen Leica DM5000B mikroskoopilla. Analysoida määrin DNA-vaurion soluissa, soluja ryhmitelty niiden γ-H2AX signaalit riippumatta MN tilan. Solut ryhmiteltiin viiteen luokkaan sisältäen ei signaalia, 30% signaali, 30-60% signaali, 60% signaali, ja koko signaalia MetaMorph ohjelmisto. Pisteytys MN soluissa vapautuu yhdisteitä, solut jakaa neljään ryhmään: Ryhmä 1 sisältää soluja ilman MN, ryhmä 2 sisältää solut MN ja MN ei sisällä signaalia, ryhmä 3 sisältää solujen signaali sisältävien MN, Group 4 sisältää solut 1 tai 2 voimakas signaali täplät solun tumassa kehän lähelle ytimen.

8. Tilastollinen analyysi

tilastollista merkittävyyttä DMS data ja reaaliaikainen PCR tiedot analysoitiin käyttämällä paritonta t-testiä lukuun ottamatta DMS tietojen UACC-1598-4, joka laskettiin varianssianalyysi (

ANOVA

) seurasi Dunnettin monivertailu kokeen. Tilastollinen merkitys FISH, γ-H2AX signaali vs. ei signaalia tietoja ja MN Aineisto analysoitiin

Fisherin testiä

. Merkitys MTS ja pesäkkeen muodostumista tiedot laskettiin

ANOVA

. Tilastollinen merkitys soluinvaasiota laskettiin

Chi-Square-testin

. Tilastollinen merkitys kaikki tiedot merkitään seuraavasti: * tarkoittaa

P

arvo 0,01 0,05, ** tarkoittaa

P

arvo on 0,001 0,01, ja *** tarkoittaa

P

arvo 0,001.

Tulokset

1. GEM Vähentää määrä DMS munasarjasyöpäsolulinjassa Line UACC-1598 ja Clone UACC-1598-4

UACC-1598 on munasarjasyöpäsolu rivi koostuu geenimonistuman muodossa DMS. UACC-1598-4 luotiin Sarjalaimennosten menetelmän kylvämällä ja eristämällä yksittäinen soluja emosolulinjassa UACC-1598 ja valmistautuu metafaasissa leviää lukumäärän määrittämiseksi DMS klooni sisältää. Tämä klooni havaittiin kasvu määrä DMS verrattuna emo-solulinja (kuvio 1A). Vaikka UACC-1598 solulinja sisälsi keskimäärin 34.61 DMS solua kohti, UACC-1598-4 oli keskimäärin 76,16 DMS solua kohden, joka on enemmän kuin kaksinkertainen arvo emosolulinjassa. Ero määrä DMS UACC-1598 ja klooni UACC-1598-4 todettiin olevan tilastollisesti merkitsevä, joiden

P

arvo 0,001.

. Edustavia kuvia metafaasissa leviämisen UACC-1598 ja UACC-1598-4 soluihin. Nuolet osoittavat DMS. Lukumäärä DMS kussakin metafaasissa solussa laskettiin ja piirrettiin. *** Osoittaa

P

0,001. B. Metaphase levitteet valmistettiin soluja kasvatettiin läsnä pieninä pitoisuuksina joko HU tai GEM varten 1 viikko tai 2 viikkoa. Lukumäärä DMS kussakin metafaasissa solussa laskettiin. Punaiset viivat edustavat keskiarvoa ja mustat viivat edustavat SEM. * Tarkoittaa

P

arvo 0,01 0,05 ** tarkoittaa

P

arvo on 0,001 0,01.

testattiin ensin, onko ero useita DMS välillä UACC-1598 ja UACC-1598-4 vaikuttaa herkkyys GEM. Hyödynsimme MTS laskentatapana IC

50 GEM kahdessa solulinjoissa ja totesi, että kyseessä on erilainen. IC

50 GEM oli 310 nM UACC-1598 ja 970 nM UACC1598-4 (data esitetty), ja ero johtuu todennäköisesti enemmän DMS voidaan kohdentaa ja eliminoitu UACC1598-4. Koska UACC1598-4 klooni valittiin sen sukupolven ja ylläpito useita DMS, ensin käyttää tätä solulinjaa onko GEM voi aiheuttaa menetyksiä DMS koska olemme arveltu, että se voisi olla helpompi havaita eroa useita DMS. Solujen annettiin kasvaa väliaineessa, joka sisälsi 10 nM (0,01 x IC

50) GEM kaksi viikkoa ennen metafaasissa leviää valmistettiin. Meidän koe osoitti, että lisäämällä pieniä pitoisuuksia GEM voi vähentää määrää DMS UACC-1598-4 munasarjasyöpäsoluja, samanlainen lisäys HU (kuvio S1A). Keskimäärin DMS laski 76,16-25,23 150 uM HU. Lisäksi keskimäärin DMS putosi 48.99 10 nM GEM.

Sitten määritetään, onko GEM voi vähentää määrää DMS vanhempien UACC-1598 solulinja. Solujen annettiin kasvaa väliaineessa, joka sisälsi 10 nM (0,032 × IC

50) ja 20 nM (0,064 × IC

50) GEM ennen metafaasivaiheeseen leviää valmistettiin. Huomasimme, että GEM 10 nM ei ollut tehokas tässä solulinjassa. Kun inkubointi UACC-1598-solujen 20 nM GEM, havaitsimme tilastollisesti merkittävä väheneminen DMS sekä 1 viikon ja 2 viikon kuluttua soluja jatkuvasti kasvatettiin väliaineessa, joka sisälsi GEM (kuvio 1 B). Keskimäärin DMS laski 37,00-24,83 1 viikon kasvun läsnä GEM, ja se laski 31,84-21,59 2 viikon kuluttua kasvun GEM. Koska HU liuotettiin DMSO: iin, me eliminoitu vaikutus DMSO kokeissa vertaamalla HU käsiteltyjen solujen DMSO käsitellyissä soluissa. Keskimäärin DMS laski 29,37 soluissa kasvatettu väliaineessa, joka sisälsi DMSO 20.77 soluissa kasvatettu väliaineessa, joka sisälsi 150 uM HU 2 viikkoa. Myös verrattuna kontrollisolujen DMSO käsitellyissä soluissa ja havainneet, että ero näiden kahden välillä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että DMSO pitoisuutena käytimme ajoneuvon HU ei merkittävästi vaikuttaa kokeellisia tuloksia. Lisäksi meillä on myös havaittu, että GEM on tehokas vähentämään DMS muista solulinjoista sekä (tuloksia ei ole esitetty). Siksi käytetään HU pitoisuutena 150 uM ja GEM pitoisuutena 20 nM kaikille seuraavilla kokeilla.

2. GEM välittää menetys DMS Amplified Genes

EIF5A2

ja

MCL1

Kun olemme havainneet, että GEM voi vähentää määrää DMS sekä UACC-1598 ja UACC-1598- 4, seuraava kysymys kysyimme, onko geenit monistettiin DMS on myös vähentynyt. On tunnettua, että onkogeenien

EIF5A2

ja

MYCN

ovat kaksi geeniä, monistettiin UACC-1598 [15], [16], ja

MCL1

havaittiin myös monistettavan tässä solulinjassa (julkaisematon data). Ensin todettuaan näiden kolmen geenin analysoimme ovat läsnä DMS FISH kokeissa (kuvio 2A). Sitten erotetaan soluja kasvatettiin HU tai GEM 3 ryhmään mukaan tasolle

EIF5A2, MYCN,

ja

MCL1

signaalit (kuvio 2B). Ryhmä 1 sisältää solujen 30% signaali, joka vastaa solut vähemmän signaaleja

EIF5A2

,

MYCN

, ja

MCL1

, ja on osoitus soluista vähemmän määrä DMS; ryhmä 2 sisältää soluja 30-60% signaali; ja ryhmä 3 sisältää solut 60% signaali, joka on merkki solujen enemmän DMS. Solujen prosenttiosuus kussakin ryhmässä piirrettiin. Solujen prosenttiosuus ryhmän 3, joka sisältää soluja, joilla on yli 60% signaaleja, väheni, kun läsnä on joko HU (11%: sta 6%) tai GEM (16%: sta 7%). Lisäksi, solujen prosenttiosuus ryhmän 2 väheni 33%: sta 24%: HU käsiteltyjä soluja ja 37%: sta 25%: in GEM käsitellyissä soluissa. Toisin lasku prosentteina solujen ryhmässä 2 ja 3, solujen prosenttiosuus ryhmän 1 nousi 14-21% käsitellyissä soluissa HU (56%: sta 70%) tai GEM (47%: sta 68% ). Kasvu solujen prosenttiosuus ryhmässä 1. HU tai GEM käsitellyt solut osoittavat solut ovat alkaneet menettää DMS. Lisäksi vahvistimme ryhmät 2 ja 3 yhdeksi suuri ryhmä, ja tilastollinen analyysi osoitti, että havaitut erot DMSO ja HU tai valvontaa ja GEM käsiteltyjä soluja on tilastollisesti merkitsevä (kuvio 2B). Nämä tulokset osoittavat, että signaali monistettujen geenien

MYCN

,

EIF5A2

, ja

MCL1

DMS UACC-1598 solut vähenivät läsnä sekä HU ja GEM . Samanlainen tulos nähtiin GEM analysoitaessa

MYCN

ja

EIF5A2

in UACC-1598-4-solujen (kuvio S1B).

. Geenit

EIF5A2

,

MYCN

, ja

MCL1

ovat läsnä DMS UACC-1598-soluissa. Metaphase leviäminen UACC-1598-solujen havaittiin DNA koettimella

EIF5A2

,

MYCN

, ja

MCL1.

Varten päällekkäinen kuvia,

EIF5A2

ja

MCL1

signaalit näkyvät punaisina, ja

MYCN

signaali näkyy vihreällä. Päällekkäin

EIF5A2 Twitter /

MYCN

ja

MCL1 Twitter /

MYCN

näkyvät keltaisina. B. Edustavia kuvia

EIF5A2 Twitter /

MYCN

ja

MCL1 Twitter /

MYCN

FISH signaaleja interfaasivaiheessa soluissa UACC-1598 ja miten yksittäiset solut erotellaan eri ryhmiin.

MYCN

signaali näkyy vihreällä,

EIF5A2

ja

MCL1

näkyy punaisena, ja päällekkäisyys näkyy keltaisena. Solujen prosenttiosuus ryhmissä 1, 2, ja 3 perustuu

EIF5A2 Twitter /

MYCN

ja

MCL1 Twitter /

MYCN

FISH signaaleja. Tilastollinen analyysi osoitti eroja solujen ryhmiin 1 ja 2/3 kontrolliin verrattuna soluihin. * Tarkoittaa

P

arvo 0,01 0,05 ** tarkoittaa

P

arvo on 0,001 0,01.

Lisäksi olemme vahvistaneet tuloksia suorittamalla tosiaikaisen PCR analysoida monistamisen

EIF5A2, MYCN,

ja

MCL1

soluissa kasvatettu läsnä HU tai GEM (kuvio 3). Nähtiin tilastollisesti merkitsevä lasku monistuminen

EIF5A2

ja

MCL1

geenejä, kun soluja kasvatettiin, kun läsnä on joko HU tai GEM. Soluille käsitelty HU, lasku suhteellinen DNA: n monistuksen taso 1.151 ± +0,213-+0,658 ± 0,092 havaittiin

EIF5A2

, ja lasku vahvistus taso on 0,860 ± 0,122-0,422 ± 0,106 havaittiin

MCL1

. Soluille käsitelty GEM, laskua vahvistus taso 0,930 ± 0,094-0,383 ± 0,005 havaittiin

EIF5A2

, ja lasku vahvistus taso 1,242 ± 0,343-0,388 ± 0,048 havaittiin

MCL1

. Emme kuitenkaan ei havaittu tilastollisesti merkittävää laskua monistamiseen

MYCN

joko HU tai GEM käsiteltyihin soluihin. Samanlaisia ​​tuloksia hankittiin myös UACC-1598-4 soluihin, joskin hämäriä muutos

MCL1

(kuvio S1C).

vahvistus taso geenien

EIF5A2

,

MCL1

, ja

MYCN

analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Vahvistustasoa Kunkin geenin yhdiste käsitellyissä soluissa verrataan ohjaamaan soluihin (DMSO HU käsitelty, ja Ctrl. GEM käsitelty), ja keskimääräinen suhteellinen vahvistus tasolla ± SD piirretään. * Tarkoittaa

P

arvo 0,01 0,05 ** tarkoittaa

P

arvo on 0,001 0,01, *** tarkoittaa

P

0,001.

3. Loukkuun DMS Amplified geenien Mikrotumat

Yksi tapa, jolla DMS arvellaan poistettava soluista on sisällytetään osaksi mikrotumia. Jossa monistettujen geenien koettimina, havaitsimme jotkut solut MN sisältävät koettimia, kun taas toiset ovat MN ei sisällä koettimia (Kuva 4). Olemme määritetty prosenttiosuus MN muodostumista käsitellyissä soluissa HU tai GEM, ja havaittiin myös, ovatko nämä mikrotumia sisälsivät

EIF5A2, MYCN

ja

MCL1

signaalit (taulukko 1). Ajoneuvo DMSO käsitellyt solut on MN muodostuminen taajuudella 13,87 x 10

-2 taas HU käsitellyistä soluista on MN muodostuminen taajuudella 30.61 x 10

-2, mikä osoittaa, HU on tehokas indusoimaan MN muodostumista. Lisäksi GEM on myös tehokas indusoimaan MN muodostumista. Soluja käsiteltiin 20 nM GEM on MN muodostuminen taajuudella 21.82 x 10

-2 verrattuna 13,98 x 10

-2 hallinnassa soluissa. Kun tarkastellaan

EIF5A2, MYCN,

ja

MCL

signaaleja MN, me myös havaitsimme taajuus MN, joka sisältää

EIF5A2, MYCN,

ja

MCL

signaaleja, on nimetty MN (

EIF5A2

+

MYCN

+

MCL +

) tai MN (+) lyhyiden, sillä solujen HU ja GEM hoito ryhmiä. 2,57 ja 1,81-kertainen nousu MN (+) esiintymistiheys havaittiin HU ja GEM käsiteltyjen solujen vastaavasti. Yhdessä meidän FISH tulokset viittaavat siihen, että DMS monistettujen geenien

EIF5A2, MYCN,

ja

MCL

menetetään soluista käsitelty joko HU tai GEM olemalla valikoivasti vangita MN. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin UACC-1598-4 soluissa (taulukko S1).

jätti kaksi paneelit ovat edustavia kuvia soluista osoittaa MN katvealueita ja oikea kahta paneelia edustavaa kuvaa solujen osoittaa MN

EIF5A2 Twitter /

MYCN

tai

MCL1 Twitter /

MYCN

signaali.

MYCN

signaali näkyy vihreällä,

EIF5A2

ja

MCL1

näkyvät punaisina, ja päällekkäisyys näkyy keltaisena. Nuolet osoittavat MN.

4. Alhainen pitoisuudet GEM aiheuttaa DNA-vaurioita soluissa Samanlaisia ​​pieniä pitoisuuksia HU

Pieniä pitoisuuksia HU on todettu aiheuttavan DNA-vaurioita havaittavissa kuin γ-H2AX pesäkkeitä soluissa. Me määrittää, onko GEM voi myös aiheuttaa DNA-vaurioita. Käsittelimme UACC-1598 solujen HU tai GEM 24 tuntia ja suoritetaan immunofluoresenssimenetelmällä määrittää määrän γ-H2AX pesäkkeitä yksittäisissä soluissa.