Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpä kantasolut ovat populaation kypsymättömiä kasvainsolujen useimmissa kiinteitä kasvaimia. Heidän erikoinen ominaisuudet tekevät niistä ihanteellisia malleja tutkimiseen lääkeresistenssin ja herkkyys. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko syöpä kantasolut eristäminen ja in vitro herkkyyden määritys ovat mahdollisia kliinisessä ympäristössä.

Methods

Syöpä kantasolut eristettiin effusions tai tuoretta syöpäkudoksessa 23 potilasta joka edistyi tavanomaisen hoidon jälkeen epäonnistumisen. Erityiset viljelyolosuhteet valittu epäkypsiä kasvainsoluja, jotka ilmentävät merkkiaineita stemness. Nämä solut altistettiin in vitro kemoterapeuttisia ja kohdennettuja tekijöille.

Tulokset

Syöpä kantasolut poimittiin maksametastaaseista 6 tapauksessa (25%), keuhkojen kyhmyt 2 (8%), imusolmukemetastaaseja 3 (12,5%) ja keuhkopussin /vatsakalvon /sydänpussinesteen 13 (54%). Syöpä kantasolut onnistuneesti eristettiin 15 potilaalla (63%), joista 14 keuhkosyöpä (93,3%). Herkkyys määritys onnistuneesti suoritettiin 7 potilaalla (30,4%), mediaani 15 huumeiden /yhdistelmät testattu (vaihteluväli 5-28) ja mediaani vaaditaan tuloksia 51 päivää (vaihteluväli 37-95).

Johtopäätös

lähestymistapaa käytetään STELLA tutkimuksessa annettiin eristäminen syövän kantasoluja johdonmukaisesti potilaiden osuus. Alhainen prosenttiosuus tapauksista kattaa kokonaisuudessaan menettely ja pitkän ajan mediaanin tulosten saavuttaminen korostaa tarvetta tehokkaamman menettelyn.

Trial Rekisteröinti

ClinalTrials.gov NCT01483001

lainaus: D’Arcangelo M, Todaro M, Salvini J, Benfante A, Colorito ML, D’Incecco A, et al. (2015) Cancer Kantasolut Herkkyys Assay (STELLA) potilailla, joilla Advanced Lung ja peräsuolen syövän: Esitutkimus. PLoS ONE 10 (5): e0125037. doi: 10,1371 /journal.pone.0125037

Academic Editor: Xiaoan Liu, The First Affiliated Hospital Nanjing Medical University, Kiina

vastaanotettu: 06 elokuu 2014; Hyväksytty: 10 maaliskuu 2015; Julkaistu: 08 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 D’Arcangelo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukevat tiedot tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tuettu Italian Association for Cancer Research (AIRC 5×1000) ja MatildeTodaro, Giorgio Stassi ja Federico Cappuzzo, jonka Fondazione Ricerca Traslazionale (ForRT) Federico Cappuzzo ja Istituto Toscano Tumori Federico Cappuzzo ja Armida D’Incecco. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Syöpä on toiseksi yleisin kuolinsyy jälkeen sydän- ja verisuonisairauksien maailmanlaajuisesti ja keuhko-, rinta-, ja peräsuolen kasvaimet ovat kolme suurta pelaajaa. Rintojen (BC) ja keuhkosyövän (LC) on johtava syy syövän kuolemaan naisten ja miesten vastaavasti, kun taas peräsuolen syöpä (CRC) kattaa noin 10% kaikista syövän esiintymisen ja kuolleisuus [1]. Kirurginen resektio ja adjuvanttihoito voi parantaa alkuvaiheessa ensisijainen kasvaimia. Toisaalta, etäpesäkkeitä on useimmiten parantumaton, koska sen systeemisen luonteen ja kestävyys terapeuttisia aineita. Itse asiassa yli 90% syöpään liittyvien kuolemien voidaan lukea uusiutumiseen /uusiutumisen eikä ensisijainen vaurioita [2,3]. Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, hoitotuloksia on huomattavasti parantunut ansiosta ymmärtää paremmin syövän biologian, käyttöönotto uusien kohdennettujen /kemoterapia-aineiden ja, mikä tärkeintä, valinta potilaiden perustuu biomarkkerit tai kasvaimen perustuvissa määrityksissä. Vaikka tämä uusi lähestymistapa osoittautui sopimattomaksi parantaa metastasoivaa tautia sairastavaa potilasta [4-7]. Tämä kliininen todellisuus korostaa tarvetta arvioida uusia lähestymistapoja syövän potilaiden ja kehittää uusia kliinisiä välineitä valinta paras hoitovaihtoehto potilaan.

Viime vuosina pieni alapopulaatio erilaistumattoman syöpäsolut varren kaltaisia ​​piirteitä tunnistettiin kasvaimiin ja nimettiin syövän kantasolut (CSC) tai kasvain aloittamista soluja. Ne näyttävät vastaavan syövän aloittamista, ravintoa, eteneminen ja kestävyys antineoplastiset lääkkeet [8]. Tämän hypoteesin, CSC peräisin muutosta normaalin kantasoluja. Itse asiassa, koska niiden kestävyys, kantasoluja kertyy useita mutaatioita, jotka ovat välttämättömiä karsinogeneesiin. Tätä hypoteesia tukevat, normaalit kantasolujen ja CSC osuus useita tärkeitä ominaisuuksia, kuten:

(a) B itseuudistumisen,

(b)

eriyttäminen,

(c) B aktiivinen telomeraasi ilme,

(d) B-aktivointi anti-apoptoottisia reittejä,

(e) B lisääntynyt kalvo transporter toimintaa ja

(f) B kyky siirtää ja etäispesäkkeitä [9] . Lisäksi syövät yleensä näyttää laaja fenotyypin, toiminnalliset ja molekyylien heterogeenisyys jotka voidaan helposti selittää CSC teorian [10-12]. Kaksi mallia on ehdotettu valaista valikoituja ominaisuuksia syöpäsolujen sisällä kasvain: 1) klonaalisen evoluutiomalli, ja 2) CSC mallia. Vaikka entinen pääperiaatetta että kaikki solut syöpä on potentiaalia aiheuttaa uusia kasvaimia, jälkimmäinen viittaa siihen, että vain syöpäsolut kara kaltaisia ​​piirteitä voi ylläpitää kasvain taudin alkamisen ja etenemisen [13-16]. Kokeellista näyttöä eri kasvaimia tukee vahvasti CSC hypoteesia. Tärkeys CSC kasvain aloittamista on vakiinnuttanut leukemiassa ja äskettäin raportoitu erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, kuten rinta-, paksusuoli-, aivo-, eturauhas-, munasarja-, keuhkosyöpä ja melanooma [17-24]. Ryhmämme on aiemmin tunnistettu ja karakterisoitu CD133

+ kasvainsolujen alaryhmässä jolla on itseuudistumiseen ja monilinjainen erilaistuminen kapasiteetin aivan kuten normaali kantasolujen [25]. Tämä pieni alapopulaation CSC säilyttää kasvaimia aiheuttavasta kapasiteetista, kun istutetaan immuuni-hiirillä [25,26]. Tuloksena ksenografteissa ovat histologisesti ja molecularly samanlainen vanhempien kasvain, josta ne ovat peräisin [27]. Tämä kiehtova ominaisuus tekee CSC hyvä malli tutkimiseen biologian ja herkkyys kasvainten yksittäisten potilaiden syöpälääkkeet.

CSC näyttää high ekspressiotasot ATP-sitova kasetti (ABC) kuljettajat, anti-apoptoottiset tekijät ja aktiivinen DNA-korjaus kapasiteetti, jotka tekevät niistä erityisen vastustuskykyisiä huumeiden ja myrkkyjen [28-30]. Lisäksi ilmeinen kasvain debulk saatu kemoterapiaa osallistuu CSC altaan rikastamisen, mikä lisää riskiä sairastua vastustuskykyisempiä fenotyypit [31]. Tämä kollektiivinen näyttöä siitä, että yhteinen tehottomuudesta tavanomaisten hoitomuotojen kantasolujen populaatio saattaa osittain selittää syövän vastustuskyvyn saatavilla hoitoja. Näin ollen tietäen spektri herkkyydestä CSC ala- populaation yksilön kasvain ja kohdentamalla valikoivasti tämän alaryhmän voisi tarjota merkittävää parannusta hoitotulosten.

Kun otetaan huomioon nykyinen puute tietyille tekijöille kohdistaminen CSC ja aiemmin raportoitu havaintoja, teimme mahdollisille ei-satunnaistettu tutkimus (STELLA tutkimus, ClinicalTrials.gov: NCT01483001) arvioida, ovatko eristämiseen ja testaus CSC laajaa kirjoa vastaan ​​antineoplastisten aineiden on toteutettavissa kliinisessä ympäristössä. Lisäksi tutkimuksessa pyrittiin määrittämään, jos tällainen lähestymistapa saattaisi tunnistaa lääkkeitä

in vitro

tehoavan CSC peräisin potilaan, mikä tarjoaa uusia personoituja hoitovaihtoehtoja. Tutkimus osoitti, että testaus CSC kemosensitiivisyys on toteutettavissa hoitopaikassa, vaikka tehokkaamman

in vitro

Tarvitaan menetelmä.

Methods

Kelpoisuus, rekrytointi ja seuranta

protokolla tälle kokeelle ja tukevat TRENDI tarkistuslista ovat saatavilla olevat tiedot; katso S1 pöytäkirja ja S1 TREND tarkistuslista.

Stella tutkimus oli prospektiivinen, ei-satunnaistettu, avoin, tutkimukseen, jossa tutkitaan intervention toteutettavuutta CSC eristäminen ja kemosensitiivisyys määritys klinikalla (S1 Protocol). Tutkimuksen hyväksyi ”eettinen Review Board for Investigation of Drugs” Civil sairaalan Livorno. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ennen tutkimukseen. Potilaat, jotka seurattiin tai tarkoitettuja lääketieteellisen onkologian osasto sairaalan Livornon ja jotka täyttääkö otettiin tutkimukseen. Sopivilla potilailla oli vahvistanut Sytologisten tai histologisia diagnoosi metastaattisen keuhko-, rinta- tai kolorektaalisyövän; esikäsitelty standardin hoitojen ja ilman ylimääräisiä standardi hoitovaihtoehtoja; joiden toteuttaminen asema 100% mukaan Karnofsky pisteet; riittävät hematologisten, munuaisten ja maksan toimintaa. Tärkeimmät ole tukikelpoinen kriteereinä olivat kyvyttömyys saada tuoretta kasvainkudoksen tai neoplastisen nestekertymä soveltuvat CSC louhinta ja liitännäissairauksia mahdollisesti häiritsee tutkimus. Kliiniset ominaisuudet potilaiden sekä molekyyli- piirteitä kasvainten (jos saatavilla) kerättiin ja rekisteröity sähköisen tietokannan, Department of Medical Syöpätautien Civil sairaalan Livorno. Kaksi potilasta oli alun perin diagnosoitu CRC ja mukana tutkimuksessa, mutta patologian tarkistus osoitti eri histologian (haimasyövän ja ohutsuolen adenokarsinooma), mikä edustaa poikkeamana tutkimussuunnitelman.

päätavoite tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida, onko mahdollista toteuttaa herkkyyden määrityksen CSC kliinisessä ympäristössä, ottaen huomioon potilaiden osuus, joille oli mahdollista suorittaa määritys ja aikaa saada herkkyyttä tuloksia. Toissijainen päätepisteet olivat tunnistamiseen LC, CRC ja BC kantasolujen ja arvioimaan niiden

in vitro

herkkyys syöpälääkkeitä. Jälkimmäinen ilmaistiin kuolleisuus eli prosenttiosuus kuolleet solut jälkeen kemosensitiivisyys määrityksessä.

Potilaat otettiin yli kaksi kuukautta aikaa (6 joulukuu

th 2011-31 tammikuu

st, 2012), ja seurattiin kunnes kuolema tai potilaan kieltäytyminen (joulukuu 2011-joulukuu 2013) säännöllisin väliajoin kliinisen tarpeen mukaan ja lausunnon kliinikon. Puhelinhaastattelut tehtiin tapauksessa potilas ei voinut osallistua avohoitokäyntien.

Tissue Collection, eristäminen ja kulttuuri syöpäsolujen

Neoplastiset effuusio (jos olemassa) tai kasvain kudoksen primaarinen syöpä tai alkaen helpoimmin metastaattista sivusto saatiin kaikista soveltuvista potilaista jälkeen tietoisen suostumuksen allekirjoittamisen Civil sairaalan Livorno. Tuoreet näytteet toimitetaan yön yli huoneenlämpötilassa Cellular and Molecular patofysiologia laboratorio yliopiston Palermo, Italia. Kasvaimen näytteet intensiivisesti pestiin PBS-liuosta ja inkuboitiin yön yli Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, GIBCO), jota oli täydennetty penisilliinillä (500 U /ml, GIBCO), streptomysiiniä (500 ug /ml, GIBCO) ja amfoterisiini B: tä (1,25 ug /ml , GIBCO) mikrobikontaminaation välttämiseksi. Kasvainnäytteet entsymaattisesti kollagenaasilla ja hyaluronidaasia, ja ravisteltiin mekaanisesti 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Vaihtoehtoisesti, neoplastiset effuusiot erotettiin sentrifugoimalla (1200 rpm, 10 min, 4 ° C). Kerätyt solut viljeltiin kantasolujen seerumittomassa väliaineessa, jota oli täydennetty epidermaalisen kasvutekijän (EGF, 20 ng /ml, Sigma-Aldrich) ja emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF, 10 ng /ml, Sigma-Aldrich) ja maljattiin ultra-low kiinnityslevy (Corning), kuten aiemmin on kuvattu [25]. Nämä olosuhteet suosivat kasvua voimakkaasti kasvaimia aiheuttavasta kantasolujen kaltaisia ​​soluja, kun taas negatiivisesti valitsemalla vähemmän kasvaimia synnyttäviä eriytetty kasvainsoluja, kuten aiemmin osoitti mukaan Eramo et al [24]. Elossa kypsymättömiä kasvainsolut hitaasti lisääntyvät ja muodostavat solun aloilla. Sphere peräisin olevat solut laajennettiin mekaanisesti ja /tai entsymaattiset dissosiaation ja uudelleen pinnoitettu täysin tuoretta kantasolujen väliaine. Soluviljelmät pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa.

tutkimusprotokolla mukana

in vivo

kokeita, joita ei ole suoritettu, koska kaikkia käytettävissä soluja käytettiin varten kemosensitiivisyys testit vaivaa testaus niin paljon huumeita kuin mahdollista ja siten tunnistaa mahdollinen hoito potilaalle.

Immunofluoresenssikoe luonnehdinta pallojen

Sphere johdettuja soluja osoittautuneet CSC by immunofluoresenssimenetelmällä luonnehdintaa stemness kalvon markkereita. Lyhyesti, kasvain palloset mekaanisesti ja entsymaattisesti hajotetaan saamiseksi yksittäisiksi soluiksi. Solut kiinnitettiin ja läpäiseviksi kuin aiemmin raportoitu [25]. Cytospin-solut pestiin PBS: llä ja altistettiin yön yli 4 ° C: ssa vasta-aineita CD133 (AC133, hiiren IgG

1, Miltenyi), CD166 (hiiren lgG1, R 50% (taulukko 3).

Potilaille hoito

tutkimuksessa ei miettiä potilaiden hoitoon ja sen päätepisteitä ei sisältynyt onko

in vitro

tulokset korreloivat kliinisen vasteen. Ei kuitenkaan voimassa hoitovaihtoehto oli käytettävissä näillä potilailla ja mahdollisuuksien tarjosimme heille käsittely yhdellä testatun huumeita. Valittu hoito oli aina se, jolla on korkein

in vitro

kuolleisuus. Koska ei ole tunnustettu cut-off-arvo

in vitro

tulos määritellään kliininen herkkyys /vastus, sitä ei voida sulkea pois, että hoito on alhainen

in vitro

kuolleisuuden voi tuottaa kliininen vaste ja, siksi valitun hoito voinut olla alhainen kuolleisuus. Kuten taulukosta 3, joukossa 7 aiheita joille herkkyyden määritys oli saatavilla vain 3 saivat käsittelyä, joka perustuu koetuloksiin. Korkeimmat kuolleisuus havaittiin

in vitro

oli 10% vuonna 2 näistä potilaista ja sairauden edetessä pian hoidon aloittamisen. Ensimmäinen potilas oli koskaan tupakoitsija nainen metastaattinen keuhkoadenokarsinooma ilman molekyylien kuljettajan poikkeamaa. Hän sai oksaliplatiinia ja paklitakselin, mutta tauti eteni jälkeen vain kaksi kierrosta. Toinen potilas oli entinen tupakoitsija mies

KRAS

mutatoitunut kehittynyt adenokarsinooma keuhkojen. Hän sai yhdistelmää karboplatiinin ja pemetreksediä ja hänen sairautensa eteni pian. Toisaalta, on nuori mies metastaattinen

EGFR

mutatoitunut adenokarsinooma keuhkojen

in vitro

testi osoitti solun kuolleisuus on 40% oksaliplatiinia ja paklitakseli. Potilas sai 5 sykliä edellä mainittujen kemoterapeuttisten lääkeaineiden, saavuttaa stabilointi taudin. Huolimatta edullinen vaikutus, kun otetaan huomioon, että potilas oli jo saanut 7 riviä hoidon, lääkäri päätti lopettaa hoito suurentunut toksisuuden. Toinen 4 potilasta, joille herkkyys Testi suoritettiin eivät saaneet hoitoa, koska he kuoli ennen tulosten saamista. Kaiken kaikkiaan nämä empiirisiä tulokset tuntuvat osoittavan, että korkeampia

in vitro

herkkyys voisi kääntää parempaan kliiniseen tulokseen.

Keskustelu

Kertyvät todisteet tukevat olemassaolosta CSCS ihmisen kasvaimissa. Nämä solut on kapasiteettia itse uudistaa ja erilaistua kypsiksi syöpäsoluja. Ne näyttävät ajaa kasvaimen aloittamista, etenemistä, ja etäpesäkkeitä. Koska niiden korkea kestävyys syöpälääkkeiden, niiden uskotaan merkittävästi edistää relapsi kemoterapiaa ja edustaa houkutteleva terapeuttinen kohde mahdollisesti saavutettava pitkäaikainen terapeuttinen vastauksia. Siksi tunnustamista aktiivisin huumeita CSC subpopulaatio on potentiaalia tunnistaa paras hoito valinta yksittäisen potilaan tai uusia hoitovaihtoehtoja potilaille etenevät asiaankuuluvien hoitojen.

Aiemmat tutkimukset ovat jo kuvanneet eristäminen menettely CSC. Stella Tutkimus on ensimmäinen ennakoiva tutkimus, jossa arvioidaan sovellettavuus tämän menettelyn hoitopaikassa, jonka tarkoituksena on testata

in vitro

herkkyyden CSC ja mahdollisesti tunnistaa uusia hoitovaihtoehtoja potilaalle. Ottaen huomioon, että toteutettavuutta ensisijainen päätepiste Tutkimuksen rajallinen määrä henkilöitä oli kirjoilla, valtaosa diagnoosi LC, yleisin tauti tarkoitetun meidän Institution. Tutkimus osoitti, että menettely oli mahdollista 65% tapauksista, mikä johtaa Chemo-herkkyyttä tuloksen kolmasosalla potilaista mediaani 51 päivää. Kaiken kaikkiaan tämä alustava kokemus antoi meille erittäin tärkeät tiedot.

Ensinnäkin Kasvainimplan- näytekokoelmatodistuksesta oli kriittinen onnistumisen kannalta eristäminen menettelyn jälkeen neoplastisia effusions olivat taitavia tätä tarkoitusta varten. Tämä on myös merkityksellinen näkökohta kliinisessä käytännössä, koska nestekertymä keräys on suhteellisen helppoa ja usein tarvitaan oire hallinta, se on pieni riski, ja se on yleisesti hyvin vastaan ​​potilaita. Mielestämme näytteen tyyppi, onko se oli raikas biopsiakudoksesta tai neoplastisen nestekertymä, oli tekijä, joka pääasiassa vaikuttanut pieni osa potilaista hyötyy testin. Muut tekijät, kuten tyypin viljelyalustan, on saattanut olla vähäinen vaikutus.

mediaani välillä näytteiden keräämistä ja herkkyyden määrityksen tulokset oli 51 päivää. Tämä on suhteellisen pitkä aika metastasoineeseen syöpäpotilaille, miksi alle 50%: lla, jolle Herkkyystestiä oli saatavilla saanut hoitoa, joka perustuu sen tuloksiin. Olipa sekunnin kuluessa riittää edelleen muuttamaan kasvaimen solubiologian ja niiden herkkyys huumeita ei tiedetä tällä hetkellä ei ole tieteellistä näyttöä tästä. Voidaan lyhentää tämän ajan kuluessa, perustuen STELLA kokemuksen meneillään kliininen tutkimus (LUCAS) käyttää erilaista määritystä (Tecan Infinite F500 jälkeen Cell Titer-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys, Promega). Tällä menetelmällä voidaan määrittää elävien solujen lukumäärän perusteella määrällistä luminoiva signaali, joka on verrannollinen ATP; se vaatii pienemmän määrän soluja ja tuottaa käytännöllisiä tuloksia vain 7 päivää siitä biopsia. Tämä saattaa auttaa saavuttamaan tuloksia lyhyemmässä ajassa ja testata enemmän lääkkeitä potilaille, joilla on hidas

in vitro

kasvuun CSC. Lisäksi se tuottaa kvantitatiivisia tuloksia, poistaa huonompi tarkkuus edellisen semikvantitatiivista menetelmällä. Tämä uusi lähestymistapa voisi myös parantaa potilaiden prosenttiosuus, joissa kemosensitiivisyys Testi voidaan suorittaa. Itse Stella tutkia herkkyyden määritys suoritettiin vain 7 tapauksessa lähinnä köyhien

in vitro

solujen kasvua.

Tutkimuksessamme CSC osoitti korkea resistenssi tällä hetkellä saatavilla lääkkeitä, mukaan lukien tavanomaisen kemoterapian aineet ja kohdennettuja hoitomuotojen, jossa vain yksi tapaus osoittaa kuolleisuus yli 50%. Tämä ei ole odottamatonta ottaen huomioon korkea vastus CSC yleisesti käytössä antituumoriaineista korostaen kiireesti tehokkaampia lääkkeitä erityisesti tätä solupopulaation.

Yhteenvetona lähestymistapaa käytetään STELLA tutkimuksessa annettiin CSC eristettynä johdonmukainen potilaiden osuus. Alhainen prosenttiosuus tapauksista kattaa kokonaisuudessaan menettely kemosensitiivisyys määrityksen ja pitkän ajan mediaanin saamiseksi tulokset kokonaisuudessaan korostaa tarvetta tehokkaamman menettelyn. Tällaisessa näkökulmasta käynnissä LUCAS tutkimus selventää mahdollinen kliininen vaikutuksia hoitojen kohdennettu CSCS.

tukeminen Information

S1 Protocol. Tutkimussuunnitelma, informaatio letter yleislääkäreiden ja tietoisen suostumuksen muodossa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125037.s001

(PDF) B S1 TREND tarkistuslista. TREND tarkistuslista.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0125037.s002

(PDF) B