Krooninen sairaus

tiivistelmä

Edenneen munasarjasyövän liittyy platinapohjaisen kemoterapian. Kuitenkin chemoresistance on merkittävä este. Syövän kantasoluja (CSCS) uskotaan olevan yksi syy chemoresistance, mutta taustalla olevan mekanismin edelleen heikko. Äskettäin ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT) on raportoitu edistää CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että mitoosi estäjä, eribulin mesylaatti (eribulin), tehokkaasti esti kasvun platina-resistenttejä munasarjasyövän solulinjoissa. Eribulin herkät solut osoittivat suurempaa tehokkuutta pallo muodostumista, mikä viittaa siihen, että nämä solut hallussaan parannetun CSC kaltainen fenotyyppi. Lisäksi nämä solut ilmensivät korkeampi hTERT, ja suppressio hTERT ilmentymisen siRNA alensivat herkkyys eribulin, viittaa siihen, että hTERT voi olla kohde eribulin. Itse asiassa huomasimme, että eribulin suoraan inhiboi RNA-riippuvaisen RNA-polymeraasin (RdRp) -aktiivisuus, muttei telomeraasiaktiivisuuden hTERT

vitro

. Ehdotamme, että eribulin kohdistuu RdRp aktiivisuutta hTERT ja se voi olla tehokas terapeuttinen vaihtoehto CSCS. Lisäksi hTERT voi olla hyödyllinen biomerkkiaine ennustaa kliinistä vastauksia eribulin.

Citation: Yamaguchi S, Maida Y, Yasukawa M, Kato T, Yoshida M, Masutomi K (2014) Eribulin Mesylate Tavoitteet Human Telomerase käänteistranskriptaasia in munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 9 (11): e112438. doi: 10,1371 /journal.pone.0112438

Editor: Taro Yamashita, Kanazawa University, Japani

vastaanotettu: 19 elokuu 2014; Hyväksytty: 06 lokakuu 2014; Julkaistu: 06 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Yamaguchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Grant Aid for Scientific Research (26462544) (SY) Japanista Society for Promotion of Science (http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/), rahoitusohjelma Next Generation maailman johtava Tutkijat (NEXT-ohjelma) (KM) Japanista Society for Promotion of Science (http: //www .jsps.go.jp /englanti /e-jisedai /), Mitsubishi Foundation (KM) (https://www.mitsubishi-zaidan.jp/en/), The Uehara Memorial Foundation (KM) (http: //www.ueharazaidan.or.jp/), ja National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto (26-A-5) (KM) (https://www.ncc.go.jp/jp/about/rinri/Kaihatsu /). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin kaikista naistentautien maligniteettien väittäen noin 150000 ihmishenkiä vuosittain maailmanlaajuisesti. Suurin osa munasarjojen syöpiä diagnosoidaan jo edenneet pitkälle, ja platinapohjaisen kemoterapian on standardi ensilinjan hoitoon pitkälle munasarjasyöpä potilaille. Kuitenkin chemoresistance on merkittävä este hoidossa munasarjasyöpä.

seroosit adenokarsinooma (SAC), yleisin munasarjasyöpä, yleensä reagoi hyvin alkuperäiseen platinapohjaiseen kemoterapiaan, vaikka se toistuu ja lopulta kehittää huumeiden vastus. Clear cell carcinoma (CCC), toiseksi yleisin Japanissa, on usein resistentti alkuperäiseen platinapohjaiseen kemoterapiaan [1]. Riippumatta siitä, onko vastus on hankittu tai ensisijainen, lupaavia hoitostrategioita on tarpeen poistaa chemoresistance ja parantaa ennustetta munasarjasyöpä potilaille.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat viitanneet siihen, että syövän kantasoluja (CSCS) ovat, ainakin osa, joka vastaa chemoresistance monissa syöpien kuten munasarjasyövän [tarkistettava [2]]. CSCS ovat alapopulaatio kasvainsoluja, jotka on ominaista kyky uusiutua ja kyky erilaistua erityisissä solutyypeissä. Syntyminen CSCS tapahtuu ainakin osittain seurauksena epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), prosessi välttämättömiä alkion kehityksen, joka indusoituu aikana syövän etenemiseen ja ratkaisevia syövän etäpesäkkeiden. CSCS hallussaan itseuudistumisen ominaisuus normaalien kantasolujen ja vastaavien signalointireitteihin säädellä itse uusimisen CSCS ja normaalit kantasolujen [3]. Yksi tällainen reittiin kuuluu telomeraasin käänteistranskriptaasin (TERT), nopeutta rajoittavaa katalyyttinen alayksikkö telomeraasin, joka on ilmaistu suurin syöpien. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että TERT säätelee kantasolujen piirteitä on telomeeripituuden riippumattomalla tavalla. Esimerkiksi TERT aktivoi lepotilassa orvaskeden kantasolujen

vivo

tavalla riippumaton luontainen RNA komponentti telomeraasin entsyymin kiksi tert [4]. Lisäksi yhdessä kytkentä Sakkaroosi NonFermentable (SWI-SNF) kompleksi proteiini brahma liittyvä geeni 1 (BRG1), tert toimii transkription säätelijä Wnt /β-kateniinin signalointireitin, edistää itseuudistumiseen ja leviämisen aikana kehittäminen [5]. Viime aikoina kertynyt näyttöä siitä, että TERT toimii myös CSCS ja edistää EMT ja CSC kaltaisia ​​piirteitä. Erityisesti yli-ilmentyminen ihmisen TERT (hTERT) johtaa parannetun palloja muodostavan kapasiteetin lisääntyneen ekspression EMT /CSC markkereita, ja lisääntynyt

vivo

tumorigeneesin aiheuttama hTERT vuorovaikutuksessa β- kateniinin ja tehostamalla sen transkriptioaktiviteettia [6]. Toisaalta, suppressio hTERT ilmentymisen johtaa vähentyneeseen palloja muodostavan kapasiteetin ja vähentynyttä ilmentymistä CSC markkerin CD44 [7]. Tämä toiminto hTERT edistämisessä EMT ja CSC kaltaiset piirteet näyttää olevan riippumaton sen telomeraasiaktiivisuuden [6]. Todellakin, olemme raportoineet, että hTERT kompleksissa BRG1 ja nucleolar GTP-sitovaa proteiinia nucleostemin (NS) (TBN kompleksi) osallistuu ylläpito CSCS. Lisäksi olemme havainneet, että yli-ilmentyminen TBN monimutkainen parantaa tuumorigeenisyyteen ja ilmaus EMT /CSC merkkiaineita käytettäessä hTERT riippuvaisella tavalla mutta telomeeripituuden riippumattomalla tavalla [8]. Tarkka telomeraasia riippumattomia mekanismeja, joilla TBN monimutkainen säätelee CSCS jäävät hämäräksi. Yksi mahdollinen mekanismi on kautta RNA-riippuvaisen RNA-polymeraasin (RdRp) aktiivisuus hTERT [9]. RdRp indusoi RNA-interferenssi tuotannon kautta kaksijuosteisen RNA: t Yksijuosteisista mallia RNA: t ja säätelee kokoonpano heterochromatin ja mitoosi eteneminen [10]. Samanlainen RdRPs vuonna malliorganismit huomasimme, että RdRp toiminta TBN monimutkaisia ​​ovat korkeat mitoosi soluissa, ja tukahduttaminen TBN kompleksilukuvastauksia mitoosi pidätys [11].

Vastatakseen chemoresistance, terapeuttisia strategioita kohdistaminen EMT ja CSCS yhä herättää huomiota. Viime aikoina, koska eribulin mesylaatti (eribulin) on raportoitu estävän etäpesäkkeiden kääntämällä EMT [12], me arveltu, että eribulin voi kohdistaa CSCS. Eribulin on ei-taksaanin estäjä mikrotubulusdynamiikan [13], joka indusoi peruuttamattomia mitoosi salpaus johtaa pysyviä inaktivoitumisen Bcl-2 ja myöhemmin apoptoosin [14]. Yhdysvalloissa, eribulin on hyväksytty metastasoituneen rintasyövän jälkeen vähintään kaksi hoitoja mukaan lukien antrasykliiniä ja taksaania. Lisäksi eribulin on hyväksytty hoitoon käyttökelvottoman tai toistuvien rintasyöpä Japanissa.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että eribulin tehokkaasti esti kasvun platina-resistenttien munasarjasyöpäsoluja. Eribulin-herkkien solujen osoitti parannettu CSC-ominaisuuksiltaan ja korkean hTERT ilme. Suppressio hTERT ilmaisun alensivat herkkyys eribulin. Lisäksi eribulin esti RdRp aktiivisuutta hTERT

vitro

, jotka osoittavat, että hTERT on välittömänä kohteena eribulin.

Tulokset

Eribulin inhiboi sisplatiinin vastustuskykyisten munasarjan adenokarsinooma solulinjoja

Neljätoista munasarjan adenokarsinooman solulinjoja tutkittiin herkkyys sisplatiinin [cis-diamminedichloroplatinum (II)], joista kuusi SAC solulinjoissa (PEO1, PEO4, PEO14, PEO23, OVKATE, ja OVSAHO), kuusi CCC solulinjoja (RMG-I, ES-2, OVISE, OVMANA, OVTOKO, ja TOV21G), ja kaksi erilaistumaton /luokkiin adenokarsinooma solulinjoja (OVCAR-3 ja A2780) (taulukko S1). Kuten kuviossa 1A on esitetty, OVKATE, RMG-I, PEO4, ja PEO23 solut olivat erityisen resistenttejä sisplatiinille, oletettavasti kautta eri mekanismeilla. OVKATE solut on aikaisemmin raportoitu olevan resistenttejä platinaa aineita, joilla on kohonnut ilmentyminen glutationi-S-transferaasin, joka on lääkeresistenssimarkkeria [15]. RMG-I-solut ovat resistenttejä myös sisplatiinia, johon kuuluu solunulkoinen signaali säädelty kinaasi (ERK) reitin [16]. PEO4 ja PEO23 solut olivat peräisin samoista potilaista kuin PEO1 ja PEO14 solut, vastaavasti, sen jälkeen, kun kehittäminen kliinisen chemoresistance, ja ovat näin ollen platina kestävät [17]. BRCA2-mutaatio on havaittu edistää platinaa resistenssin PEO4 soluihin [18].

Soluja käsiteltiin sisplatiinin tai eribulin 72 tuntia, ja sitten solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksissä. (A) keskimääräinen IC

50-arvot sisplatiinin (uM). (B) keskimääräinen IC

50-arvot eribulin (nM). Eribulin-herkkä (Eribulin S) solulinjat on esitetty avoimet pylväät, ja eribulin-resistenttejä (Eribulin R) solulinjat on esitetty umpinaiset pylväät. Virhepalkit edustavat SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

seulottiin useita tunnettuja syövän yhdisteiden kasvun inhibition platina kestävät munasarjasyövän solulinjoissa. Olemme havainneet, että eribulin, mitoottisen estäjä, joka estää mikrotubulusdynamiikan [13], inhiboi kasvua RMG-I, PEO23, ja PEO4 solut (kuvio 1 B). Silmiinpistävän, eribulin ei ollut yhtä tehokas joissakin sisplatiinin herkkiä solulinjoja kuten OVTOKO, PEO14, ja TOV21G (kuvio 1A ja 1 B). Lisätietoja luonnehdinta, määrittelimme kahdeksan solulinjoissa IC

50 100 nM eribulin kuin ”eribulin herkkiä” (Eribulin S) ja kuusi solulinjoissa IC

50 100 nmol eribulin kuten ”eribulin kestävä” (Eribulin R).

Eribulin-herkkiä solulinjoja on korkeampi palloja muodostavan kapasiteetin

CSCS uskotaan olevan vastuussa chemoresistance, ja CSCS on raportoitu edistää sisplatiinin vastus useiden syöpätyyppien [19]. Lisäksi viime aikoina on raportoitu, että eribulin kääntää EMT [12], fenotyypin, joka on erittäin liittyvät CSCS. Siksi me tutkimme, eribulin-herkkien solujen hallussaan parannettu CSC kaltainen fenotyyppi. Koska pallo muodostava kapasiteetti on CSC kaltainen ominaisuus, suoritimme pallo muodostumisen määritykset seerumittomissa olosuhteissa, ja totesi, että eribulin herkät solulinjat osoittivat korkea pallo muodostumisen hyötysuhde (kuvio 2A ja 2B). Pallo muodostuminen tehokkuus Eribulin S solulinjoissa oli merkitsevästi korkeampi kuin Eribulin R solulinjojen (kuvio 2C, p = 0,0013), mikä viittaa siihen, että eribulin-herkkien solulinjojen hallussaan parannettu CSC-ominaisuuksiltaan.

(A ) Sphere muodostuminen tehokkuus (SFE) kunkin solulinjan osoitettiin per 1000 solua. Eribulin S solulinjoja on esitetty avoimet pylväät, ja Eribulin R solut on esitetty umpinaiset pylväät. Kukin koe suoritettiin vähintään kolme kertaa, ja keskiarvot ± SD on ilmoitettu. (B) morfologia tumorspheres seerumittomissa olosuhteissa. Edustavia kuvia pallojen muodostama A2780, RMG-I, ES-2, OVSAHO, TOV21G, ja OVTOKO solut näkyvät. Mittakaava = 50 pm. (C) keskimääräinen SFE Eribulin S solulinjojen (n = 8) ja Eribulin R solulinjoja (n = 6) on esitetty (A). Virhe palkit osoittavat SD. (D) taso BRG1 ja NS-proteiinin ilmentymistä havaittiin immunoblottauksella. GAPDH ilme näkyi latauskontrollina. (E) Signaalit (D) on määrällisesti ImageJ ohjelmistoja ja normalisoitiin GAPDH signaalia. Keskiarvot suhteellisen ekspressiotason ± SD on ilmoitettu.

Koska olemme hiljattain osoittaneet, että NS yhdessä hTERT ja BRG1 ylläpitää CSCS [8], ja me ja muut ovat myös osoittaneet, että NS on hyödyllinen CSC merkki [20] – [22], tutkimme ilmaus BRG1 ja NS in Eribulin S ja Eribulin R solulinjoissa. Proteiinin ekspressiotaso BRG1 oli merkitsevästi korkeampi Eribulin S solulinjoissa (kuvio 2D ja 2E, p = 0,0189), mutta vain vaatimaton taipumus korkeampi NS Eribulin S solulinjoissa havaittiin (kuvio 2D ja 2E, p = 0,1216). Emme havainneet eroa ilmentymistason CD133 tai CD44 (kuva S1), solun pinnan markkereita hiljaista joissakin CSCS [23].

Eribulin S-solut ilmentävät korkeampaa hTERT-proteiinin

yli-ilmentyminen hTERT johtaa parannetun palloja muodostavan kapasiteetin mahalaukun syöpäsoluissa [6]. Toisaalta, suppressio hTERT ilmentymisen tuloksena on vähentynyt palloja muodostavan kapasiteetin rintasyöpäsoluissa [7]. Niinpä määritettiin onko munasarjasyöpä soluja korkeamman palloja muodostavan kapasiteetin ilmaista korkeampi hTERT. Havaitsimme taipumus solulinjoissa korkean palloja muodostavan tehokkuutta, kuten RMG-I, PEO23, ja A2780, ilmaista suhteellisen korkeita hTERT-proteiinin, kun taas solulinjat, joilla on alhainen palloja muodostavan tehokkuutta, kuten TOV21G, OVTOKO, ja OVMANA, ilmaistuna alhainen hTERT-proteiinin, kuten on osoitettu entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) (kuvio 3A). Korkeaa hTERT ilmentymisen RMG-I solut voidaan osuus vahvistuksella-of-function mutaation (-124 G A) hTERT promoottorialue (taulukko S1 ja kuvio S2). Tämä syöpää erityinen mutaatio oli äskettäin raportoitu melanooman ja useita muiden syöpien [24] – [27], joka luo uusia sitovia motiiveja E-kaksikymmentäkuusi /kolmen komponentin kompleksin tekijöitä (ETS /TCF) ja lisää siten voimistunut hTERT transkriptio [24], [25].

(A) taso hTERT-proteiinin ilmentyminen määritettiin ELISA: lla (osoitettu ng /ml). Eribulin S solulinjoja on esitetty avoimet pylväät, ja Eribulin R solut on esitetty umpinaiset pylväät. Kukin koe suoritettiin vähintään kolme kertaa, ja keskiarvot ± SD on ilmoitettu. (B) keskimääräinen hTERT taso Eribulin S solulinjojen (n = 8) ja Eribulin R solulinjoissa (n = 6) on esitetty (A). Virhe palkit osoittavat SD.

Huomasimme, että Eribulin S solulinjat ilmensivät korkeampia tasoja hTERT-proteiinin kuin Eribulin R solulinjoissa (kuvio 3B, p = 0,008).

Suppression hTERT ilmaisun tuloksia laski herkkyys eribulin

korrelaatio hTERT ilmaisun ja eribulin herkkyys sai meidät olettaa, että eribulin inhiboi munasarjasyöpäsoluja eston kautta hTERT. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me tutki tukahduttaminen hTERT ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja johtaa laski herkkyys eribulin. Kaksi itsenäistä hTERT-spesifisiä siRNA: ita tuotiin A2780 soluihin, ja herkkyys eribulin verrattiin soluihin, jotka ilmentävät ohjaus siRNA. Kuten odotettua, solut, jotka ilmentävät hTERT siRNA: t osoittivat vähentynyt herkkyys eribulin (kuvio 4A). TERT siRNA1 osoitti taipumusta vahvempi suppressio hTERT ilmaisun kuin TERT siRNA2 osoituksena ELISA: lla (kuvio 4B). Tämä havainto saattaa selittää, miksi solut, jotka ilmentävät TERT siRNA1 näyttivät olevan vähemmän herkkä eribulin kuin ilmentävät TERT siRNA2 (kuvio 4A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin ES-2-soluissa (kuvio 4C ja 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että hTERT voi olla suora kohde eribulin.

(A) A2780 soluissa, jotka ilmentävät ohjaus siRNA (avoimet pylväät), TERT siRNA1 (umpinaiset pylväät), tai tert siRNA2 (varjostetut pylväät) käsiteltiin eribulin 72 h, ja sitten solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksissä. * P 0,05 vs. soluja, jotka ilmentävät ohjaus siRNA. (B) taso hTERT-proteiinin ilmentymisen A2780 soluissa, jotka ilmentävät ohjaus siRNA (avoimet pylväät), TERT siRNA1 (umpinaiset pylväät), tai tert siRNA2 (varjostetut pylväät) määritettiin ELISA: lla (osoitettu ng /ml). (C ja D) kuvatut kokeet (A ja B) suoritettiin samalla tavalla käyttäen ES-2 solut, jotka ilmentävät ohjaus siRNA (avoimet pylväät), TERT siRNA1 (umpinaiset pylväät), tai tert siRNA2 (varjostetut pylväät). * P 0,05 vs. soluja, jotka ilmentävät ohjaus siRNA.

Eribulin estää RdRp aktiivisuutta hTERT

vitro

Yleisesti uskotaan että mitään vaikutusta hTERT tukahduttaminen välittävät telomere lyhentäminen. Koska kuitenkin havaittu vähentynyt herkkyys eribulin suhteellisen lyhyessä ajassa (kuvio 4, 96 h transfektion jälkeen siRNA vastaan ​​hTERT), me arveltu, että tämä vaikutus on riippumaton telomere kunnossapidon hTERT. Lisäksi toiminta hTERT edistämisessä EMT ja CSC kaltaisia ​​piirteitä on riippumaton sen telomeraasiaktiivisuuden [6]. Yhdessä tuoreessa raportissa osoittaa, että hTERT on RdRp aktiivisuus riippumaton telomere huolto [9], me tutkimme, eribulin suoraan suunnattu hTERT-RdRp aktiivisuutta. Seurasimme estävää vaikutusta eribulin on hTERT-RdRp aktiivisuus käyttämällä

vitro

RdRp määritys [11], ja totesi, että eribulin esti hTERT-RdRp aktiviteetti

vitro

pitoisuutena 50 uM (kuvio 5A). Saman pitoisuuden eribulin ei estänyt telomeraasiaktiivisuus hTERT, kuten on esitetty telomeerisesti toista vahvistusta protokolla (TRAP) määritys (kuvio 5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikutukset eribulin on hTERT eivät välittyvät telomeraasiaktiivisuutta, mutta kautta RdRp aktiivisuutta. Mielenkiintoista on, että toinen mitoosi estäjä, paklitakseli, edustava taksaani, ei estänyt RdRp aktiivisuutta (kuvio 5C), viittaa siihen, että eribulin on erityinen estävä vaikutus hTERT-RdRp aktiivisuutta.

(A) RdRp aktiivisuutta hTERT immuunijärjestelmän kompleksit valmistettiin HeLa-soluista pidätettiin mitoosi vaiheessa määritettiin ilman tai 10 ja 50 uM eribulin. (B) Telomeraasiaktiivisuus HeLa solu-uutteissa määritettiin ilman tai 10 ja 50 uM eribulin. (C) RdRp aktiivisuutta hTERT immuunikompleksien määritettiin ilman tai 10 ja 100 uM paklitakselin (PTX).

Keskustelu

joukossa gynekologiset syövät, munasarjasyöpä on johtava syy kuolema. Erityisesti vastustuskyky perinteisille platinapohjaiseen kemoterapiaan on ollut este parantamiseen ennusteet munasarjasyöpä potilaille, ja uusia hoitostrategioita tarvitaan pikaisesti. Tässä olemme huomanneet, että eribulin oli tehokas kasvun inhiboimiseksi platina-resistenttien munasarjasyöpäsoluja. Vaikutukset eribulin korreloivat hTERT ekspressiotasoja (kuvio 3), ja suppressio hTERT ilmentymisen alensivat herkkyys eribulin (kuvio 4), mikä viittaa siihen, että hTERT voisi olla kohde eribulin näissä soluissa. Todellakin, eribulin esti RdRp aktiivisuutta, mutta ei käänteiskopioijaentsyymin aktiivisuutta hTERT

vitro

(kuva 5).

CSCS ja hTERT

CSCS ajatellaan olevan mukana chemoresistance, ja useat polkuja on todettu edistetään tai ylläpitäminen CSCS. Me ja muut ovat osoittaneet, että hTERT tärkeä rooli edistäminen ja ylläpitäminen CSCS telomeerin huoltovapaa riippumattomat tavat [6] – [8]. Eribulin tehokkaasti inhiboi kasvun platina-resistenttien solujen (kuvio 1). Eribulin-herkkien solujen oli korkeampi hTERT ilmentymistä (kuvio 3) ja suurempi palloja muodostavan kapasiteetin (kuvio 2), mikä viittaa siihen, että nämä solut ovat parantaneet CSC-ominaisuuksiltaan, mahdollisesti johtuen korkea hTERT-proteiinin. Johdonmukaisesti eribulin-herkkien solujen oli korkeampi BRG1 ilmentymistä (kuvio 2), toinen komponentti TBN kompleksin, joka ylläpitää CSCS. Emme havainneet merkittävää eroa ilmaus CD133 tai CD44 (kuva S1). Vaikka CD133 ja CD44 arvellaan olevan osoitus CSCS joissakin syöpätyyppien, se on vielä selvittämättä, mitä markkereita soveltuvat CSCS munasarjojen syöpiä [23].

Koska telomere ylläpito telomeraasin on välttämätön ääretön pahanlaatuisten solujen uudiskasvun, on pyritty kehittämään syövän vastaisia ​​terapeuttisia kohdistaminen telomeraasia. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että TERT soittaa toiminnallisten roolien jälkeen telomere huoltoa. Itse asiassa, toiminnon TERT aktivoida normaalit levossa kantasoluja tai CSC kaltaisia ​​piirteitä on osoitettu olevan riippumaton sen telomeraasiaktiivisuuden [4], [6], [28]. Olemme myös havainneet, että TBN monimutkainen ylläpitää CSCS on telomeeripituuden riippumattomalla tavalla [8]. On mahdollista, että tämä telomeraasia riippumaton mekanismi välittyy RdRp toimintaa TERT, koska TBN Monimutkainen itsessään vastaa RdRp toimintaa ja osallistuu heterochromatin sääntelyn ja mitoosi eteneminen [11]. Me spekuloida, että RdRp aktiivisuutta hTERT on mukana geeniekspression heterochromatin sääntelyn syöpäsoluissa, ja se voisi olla uusi syövän vastaista terapeuttinen kohde. Olipa RdRp aktiivisuus on edellytys hTERT toiminto edistämisessä CSCS on vielä määrittämättä.

Eribulin ja hTERT

Eribulin sitoutuu mikrotubulusten plus päättyy ja estää niiden kasvun vaihe mikrotubulusdynamiikan [29] . Äskettäin eribulin osoitettiin käänteinen EMT, jonka vähen- tämisessä transformoiva kasvutekijä-β (TGF-β) indusoidun Smad fosforylaatio [12]. Smad proteiinit sitoutuvat mikrotubulusten ilman TGF-β: n ja TGF-β laukaisee irtaantuu mikrotubuluksiin ja fosforylaatio Smad proteiinien [30]. Yoshida

et al.

Arveltu, että eribulin estää Smad fosforylaation mahdollisesti tukahduttamalla Smad irtaantuu mikrotubuleiksi [12]. Koska olemme hiljattain osoittaneet, että hTERT paikantuu mitoottisiin karat ja sentromeerien mitoosin aikana [11], on myös mahdollista, että eribulin estää hTERT toimintoja häiritsemällä vuorovaikutusta hTERT ja mikrotubulusten. Eribulin parantaa eloonjäämisaste metastasoituneen rintasyövän, joka oli ennen antrasykliiniä ja taksaania kemoterapian [31]. Taksaanin lääkeaine, paklitakseli, ei inhiboinut RdRp aktiivisuutta hTERT (kuvio 5C), joka tarjoaa yhden mahdollisista molekyylitason perustan eri kliinisten tulosten taksaaneja ja eribulin. Tarkkaa mekanismia, jolla eribulin inhiboi hTERT-toiminto on vielä ymmärretä.

hTERT biomarkkerina

On tärkeää tunnistaa biomarkkereita ennustaa vastauksia syöpähoitoihin. Määrittämällä hTERT tasojen kliinisistä näytteistä, potilaat, jotka ovat todennäköisesti vastaamaan hyvin eribulin voidaan tunnistaa ennen kuin he saavat kemoterapiaa. Erityisesti ELISA pystyisi mittaamaan hTERT tasolle kliinisessä käytössä.

Yhteenvetona olemme huomanneet, että eribulin estää RdRp aktiivisuutta hTERT, joka voi myötävaikuttaa chemoresistance munasarjasyövän ylläpitämällä CSCS. Eribulin esti kasvua munasarjasyöpäsoluja korkea hTERT ilmaisun ja vahva platinaa vastus, mikä viittaa siihen, se voi olla lupaava terapeuttinen aine solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä. Lisäksi hTERT voi olla hyödyllinen biomerkkiaine ennustaa kliinistä vastauksia eribulin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

RMG-I [32], OVMANA [33], OVTOKO [34], OVISE [34], OVSAHO [33], ja OVKATE [33]-solut on saatu japanilaisen Collection of Research Bioresources Cell Bank. OVCAR-3 solujen [35] saatiin RIKEN Bioresource keskus. PEO1, PEO4, PEO14, PEO23 [17], ja A2780 [36] solut hankittiin European Collection of Cell Cultures, ja TOV21G [37] ja ES-2 [38]-solut hankittiin American Type Culture Collection. RMG-I-soluja viljeltiin Hamin F12 -alustassa, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, ES-2 solut McCoyn 5a väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, TOV21G solut MCDB105 /Medium 199 (01:01), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, ja HeLa-soluja Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. Kaikki muut solulinjat (A2780, OVCAR-3, OVMANA, OVTOKO, OVISE, OVSAHO, OVKATE, PEO1, PEO4, PEO14, ja PEO23) viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja 1 mM natriumpyruvaattia ( Gibco, Grand Island, NY, USA).

yhdisteet

Sisplatiini ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), paklitakseli ostettiin Wako (Osaka, Japani), ja eribulin (Halaven) hankittiin Eisai Co., Ltd (Tsukuba, Japani).

MTT-määritystä

Solut (5,000-10,000 per kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille ja sitten sisplatiinia tai eribulin 24 tunnin kuluttua. 72 h hoidon MTT proliferaatiomäärityksellä (Cell Proliferation Kit I MTT, Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) suoritettiin valmistajan protokollan. Lyhyesti, 10 ui MTT-leimausreagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, jota seurasi 4 tunnin inkuboinnin jälkeen. Sitten 100 ui liukenemisen liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan, jota seurasi yli yön inkuboinnin jälkeen. Reaktiotuote kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 570 ja 690 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Vienton 808, BioTek, Winooski, VT, USA). Solujen elinkelpoisuus määritettiin vertaamalla käsittelemättömiin soluihin.

Sphere muodostumista määrityksessä

Single-solut ympättiin 96-kuoppaisille ultra low kiinnityslevyt (Corning Inc, Corning, NY, USA) 100- 1000 solua /100 ui kunkin kaivon alusta. Soluja kasvatettiin seerumivapaassa DMEM /F12-väliaineessa (Gibco), jota oli täydennetty 20 ng /ml emäksistä fibroblastikasvutekijää (Wako), 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (Wako) ja B27 täydentää (Gibco). Viljelmät täydennettiin 25 ui tuoretta väliainetta joka 3-4 päivä, ja pallojen lukumäärä laskettiin päivinä 7 ja 14. mikroskooppinen kuvat saatiin kanssa CKX41 käänteismikroskoo- ja DP21 digitaalikamera (Olympus, Tokio, Japani).

immunoblottauksella

Solut hajotettiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA), joka sisälsi 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI (pH 7,4) ja 150 mM NaCl. Sonikoinnin jälkeen ja sentrifugoinnin lysaatit proteiineja (20 ug) altistettiin SDS-PAGE: 7,5% poly-akryyliamidigeelejä, jota seurasi immunoblot-analyysi. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-BRG1 (lahja tri Tsutomu Ohta, National Cancer Center, Japani), anti-NS (A300-600A; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA), anti-GAPDH (3H12; Medical Biological Laboratories (MBL), Nagoya, Japani), anti-CD133 (W6B3C1, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa) ja anti-CD44 (2C5; R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.

CD133 ja CD44 ilmaisun Eribulin S ja Eribulin R munasarjasyöpäsoluja. (A) taso CD133 ja CD44-proteiinin ilmentymistä havaittiin immunoblottauksella. Koska data saatiin samassa kokeessa kuin kuviossa 2 paneeli D, GAPDH geeli oli identtinen kuvan 2 paneeli D. (B) signaaleja (A) on määrällisesti ImageJ ohjelmistoja ja normalisoitiin GAPDH signaalia. Keskiarvot suhteellisen ekspressiotason ± SD on ilmoitettu.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0112438.s001

(TIF)

Kuva S2.

ES-2 ja RMG-I soluilla hTERT-promootterin mutaatioita. HTERT-promootterin sekvensoitiin kussakin solulinjassa. ES-2-solut satama -138 /-139 GG AA-mutaatio kuten aiemmin on kuvattu [27], ja RMG-I-solujen satama -124 G Mutaatio. Villityypin sekvenssit vastaavat alueita OVKATE ja OVSAHO solut esitetään kontrolleina.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0112438.s002

(TIF)

Taulukko S1.

Munasarjasyöpä solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0112438.s003

(DOCX) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Tsutomu Ohta lahjasta anti-BRG1 vasta-tri Koichi Ichimura teknisen tuen kanssa promoottori mutaation analyysi, ja MBL heidän avustaan ​​perustamisesta ELISA kit hTERT havaitsemiseen.