Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

perustaa, luonnehtivat ja valaista mahdollisia mekanismeja hankitun bleomysiinin (BLM) vastus käytetään ihmisen syöpäsolujen linjat. Seitsemän BLM-resistenttejä solulinjoja perustettiin altistamalla Kasvavat BLM pitoisuudet aikana 16-24 kuukautta. IC

50-arvot ja solujen kaksinkertaistumisaikaa kvantifioitiin käyttäen reaaliaikaista sytotoksisuusanalyysin. COMET ja γ-H2AX määrityksissä, solusyklin analyysi, ja apoptoosin arviointi tutki tarkemmin mekanismeja BLM resistenssin näissä solulinjoissa.

Tulokset

Verrattuna vanhempien solulinjojen, reaaliaikainen -sytotoksisuusmäärityksiä paljasti 7-49 kertaisen lisäyksen IC

50 ja keskimääräinen kaksinkertaistaa aika kasvoi 147% (vaihteluväli 64% -352 %) in BLM kestävä sub-klooneja (p 0,05 molemmille). Korkeammat huolto BLM pitoisuudet liittyy korkeampi IC

50 ja nousi kaksinkertaistumisaikaa (p 0,05). Vähensi merkitsevästi DNA-vaurioita (COMET ja γ-H2AX määritykset), G2 /M pidätys, ja apoptoosin (p 0,05 kunkin lajin vertailu) seuraavan suuren annoksen akuutin BLM altistumisen havaittiin kestävä sub-klooneja, verrattuna niiden BLM- herkkä vanhempien kollegansa. Kolme viikkoa BLM-vapaan viljelyn johti osittaiseen paluuta BLM herkkyyttä 3/7 BLM kestävät sub-klooneja (p 0,05).

Johtopäätös

Bleomycin resistenssi voi liittyä alentunut DNA-vaurioita bleomysiinin jälkeen altistuksen, mikä vähentää G2 /M pidätys, ja vähensi apoptoosin.

Citation: Wang Q, Cui K, Espin-Garcia O, Cheng D, Qiu X, Chen Z, et al. (2013) Kestävyys Bleomycin syöpäsolulinjoissa luonnehtii Pitkäaikainen kaksinkertaistaminen Time, Alennettu DNA-vaurio ja Evasion G2 /M pidätys ja Apoptosis. PLoS ONE 8 (12): e82363. doi: 10,1371 /journal.pone.0082363

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 23 lokakuu 2013; Julkaistu: 04 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat prinsessa Margaret Hospital Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Bleomycin (BLM) on glykopeptidiantibiootti eristetty

Streptomyces verticillis

[1,2]. Kuten kemoterapeuttinen aine, sitä käytetään hoidettaessa useita kasvaimia, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen kivesten karsinoomat, lymfoomat, ja pään ja kaulan alueen syövissä [3,4]. Vaikka koko polun lääkkeen vaikutusmekanismia ei ole selvitetty, BLM ei sitoudu rautaa ja happea tuottaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) [5], joka indusoi yksi- ja kaksijuosteiset DNA katkoksia, että jälkimmäinen on ensisijaisesti vastuussa sen anti-kasvain vaikutuksia [6,7]. Se aiheuttaa myös lipidiperoksidaation ja mitokondriaalisen DNA-vaurion [8]. Laajennettu solusyklin pidätyksen /vanhenemista, apoptoosin ja mitoosi solukuolemaa ovat yleisimpiä soluvasteita BLM hoitoon [9].

BLM havaittiin indusoivan G2 /M solukierron pysähtymisen syöpäsolulinjoissa [10,11]. Tämä voi selittyä G2 /M tarkastuspiste vasteena DNA-vauriolle. G2 /M tarkastuspiste on tärkeää genomisen vakauden, sillä se varmistaa, että kromosomit ovat ehjät ja valmis erottamista ennen solujen tulla mitoosi [12]. Toisin kuin G1 tarkastuspiste, G2 /M tarkastuspiste geenit eivät usein mutatoitunut syöpäsoluissa [13].

Resistance BLM on kliinistä merkitystä, ja tyypillisesti esiintyy uusiutumisen itusolukasvaimet, jossa BLM on yleisimmin käytetty kliinisesti. Vaikka mekanismia BLM-vastus on epäselvä, useita mahdollisuuksia on esitetty, mukaan lukien: (a) muuttunut BLM saanti ja ulosvirtaus [14,15]; (B) kohonnut antioksidantti taso [5,11]; (C) tehostettu korjaus kyky BLM aiheuttaman DNA-vaurion [14,16,17]; ja (d) lisääntynyt metabolia (inaktivoituminen) BLM [17-19].

kehittyminen BLM resistenssin toimii tärkeänä mekanismi kiertäminen kemoterapeuttisen hävittämisen syöpäsoluissa. Kuitenkin mekanismit vastaava hankittu BLM resistenssin ihmisen kasvainsoluissa ei ole hyvin tutkittu. Tässä tutkimuksessa perustimme BLM-resistenssi seitsemässä ihmisen syövän solulinjoissa, mukaan lukien riviä kasvaintyypeille jo hoidetaan BLM ja muiden tiedetään olevan joko herkkiä tai resistenttejä BLM. Lisäksi olemme tunnettu näistä solulinjoista osalta niiden taso BLM-vastus, BLM aiheuttaman DNA-vaurion, kaksinkertaistaa ajan, solusyklin jakelu, ja aste apoptoosin (ennen ja jälkeen BLM hoitoa) kasvattaa ymmärrystä mahdollisia mekanismeja vastus.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja soluviljelmä

Seven kaupallisesti saatavissa ihmisen syövän solulinjoissa kirjavuudella synnynnäinen herkkyys /kestävyys BLM (HOP62, ACHN, NT2 /D1, SF-295, NCCIT, NCI-H322M, ja MBA-MB-231) valittiin National Cancer Institute (NCI) tai American Type Culture Collection (ATCC) [20]. Kaksi (NT2 /D1, NCCIT) oli kivesten solulinjoja (taulukko 1).

Cell line

Lyhenne (Lapsilukko /Resistant) B Johdettu josta syöpätyypin

Vanhempien IC

50 (ig /ml) *

ACHNACHN

0Renal solun carcinoma0.009ACHN

0.25HOP-62HOP

0Lung adenocarcinoma0.11HOP

0.05SF-295SF

0CNS glioblastoma 0.14SF

0.4NT2 /D1NT2

0Germ solu carcinomaN /ANT2

0.1NCCITNCCIT

0Germ solu carcinomaN /ANCCIT

1.5NCI-H322MH322M

0Lung adenocarcinoma25.8H322M

2.5MDA-MB-231MB231

0Breast adenocarcinoma27.9MB231

3.0Table 1. kuvaus solulinjojen.

Huomautus: Solulinjat kanssa alaindeksi ”0” osoittaa vanhempien (kontrolli) viivoja (esim HOP

0). Resistentti Saharan klooneja on alaindeksi tunnistaa sen ylläpidosta BLM pitoisuus, ug /ml (esim HOP

0,05). * Tiedot saatu NCI-60 lääkeseulontamenetelmä paneelin [20]. CSV Lataa CSV

NT2 /D1 ylläpidettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM). Muut rivit viljeltiin RPMI 1640-olosuhteet olivat 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Soluja kasvatettiin yksikerrosviljelminä 75 cm

2 soluviljelypullot, ellei toisin mainita. Kaikki solulinjat olivat kielteisiä mykoplasmakontaminaation Polymer Chain Reaction (PCR) [21]. Solulinjoja autentikointia Short Tandem Toistot (STR) testaus [22].

perustaminen bleomysiinin vastustuskykyisten sub-kloonit vanhempien (valvonta) solulinjat

Kehitetään BLM-vastus, solut jatkuvasti alttiina portaittain kasvaa pitoisuuden BLM aikana 16 24 kuukautta. Lyhyesti, solut siirrostettiin tiheydessä ~ 5 x 10

5 /ml T75 soluviljelmässä pulloon 10 ml täydellistä elatusainetta. 4-6 tunnin kuluttua inkuboinnin suhteellisen pieninä pitoisuuksina BLM (alueella 0,01 0,1 ug /ml riippuen synnynnäinen BLM-herkkyys) liuotettuna fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) ilman Ca

2+ ja Mg

2+, lisättiin väliaineeseen. Solut jätettiin BLM 2: sta 4 viikon ajan tai kunnes vakaa solun uudelleen väestön muodostunut. Säännölliset keskipitkän täydennystä suoritettiin koko tämän ajan. BLM pitoisuus nostettiin sitten 0,5 2-kertaiseksi. Tämä vaiheittainen annoksen suurentamista jatketaan 16-24 kuukautta, kunnes BLM pitoisuus saavutti vähintään kymmenen kertaa lähtöpitoisuus. Sen jälkeen kaikki BLM-resistenttejä solulinjoja ( ”BLM kestävä sub-klooneja”) ylläpidettiin niiden korkein saavutettu BLM pitoisuus ( ”ylläpitoannos”). Samaan aikaan, säännöllinen kulkua kantasolulinjoista suoritettiin rinnakkain BLM-vastus laitoksessa prosessin.

BLM Herkkyystestiä ja kaksinkertaistaa aikaa analyysi

Ennen BLM vastus /herkkyys arviointi (sytotoksisuusanalyysin), solunlisään- suoritettiin annetun xCELLigence järjestelmä (Roche, USA) tunnistaa optimaaliset olosuhteet, joissa reaaliaikainen sytotoksisuusanalyysin pitäisi olla käynnissä. Erityisesti proliferaatiomäärityksessä suoritettiin: a) tunnistamaan optimaaliset istutustiheyteen sytotoksisuuden määritys kunkin solulinjojen; ja b) määrittää keston sytotoksisuusmääritys.

runsaudenmäärityksessä suoritettiin ymppäämällä eri määrä soluja 96-kuoppalevyllä (E-levy 96, Roche, USA) neljänä, jota seuraa reaaliaikaista seurantaa solujen kasvun korkeintaan 7 vuorokautta . Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun kylvö, puolet levyn kuoppiin käsiteltiin BLM määrittämiseksi soluvasteen. Proliferaatiomäärityksessä toistettiin kahdesti kummallakin solulinjassa. Optimaalinen kylvö tiheydet jokaiselle linjalle valittiin sen perusteella, dramaattisia muutoksia proliferaatioprosessi 72-96 tunnin kuluttua BLM hoidon ja pienet vaihtelut kautta toisinto kuoppiin.

-sytotoksisuusmäärityksiä solupitoisuus oli ensimmäinen suoritettiin, ja solut ympättiin kolmena rinnakkaisena kuoppiin 180 pl BLM-soluviljelyelatusaineella 96-kuoppalevylle. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun alustava pinnoitus, 20 ui soluviljelyalustaa, joka sisälsi laimennettiin sarjoittain BLM vaihtelee 0-800 ug /ml, lisättiin kuhunkin kaivoon. Lukumäärä elinkelpoisia elävien solujen tarkkailtiin 15 minuutin välein, yhteensä ainakin 120 tuntia. IC

50 (integroitu ohjelmisto, xCELLigence järjestelmä) ja taita erot IC

50 välillä BLM kestävä ja vanhempien (valvonta) solulinjoissa (IC

50 BLM-resistenttien /IC

50 ohjaus) olivat sittemmin laskettu. Nopeimmin kasvukausi havaittu kunkin solulinjojen proliferaatiomäärityksessä eristettiin kaksinkertaistamiseksi ajan määrittämiseksi ja sen prosentuaalinen muutos laskettiin xCELLigence järjestelmän ohjelmisto.

Comet määritys arviointi BLM aiheuttaman DNA-vaurion

BLM tiedetään aiheuttavan DNA-vaurioita soluissa [6,7]. Määrittämään alkuperäisen (lähtötilanne) ja DNA katkeamisen jälkeen suuri annos BLM paljastaa, emäksinen Comet määritykset (yksisoluiset geelielektroforeesi) suoritettiin [23] kunkin vanhempien ja kestävät sub-klooneja. Olive Tail Moment (OTM) arvot sata soluja sijoitettiin satunnaisesti per slide fluoresenssi mikroskooppi KOMET 5,0 ohjelmisto (Kinetic Imagine).

BLM aiheuttama γ-H2AX pesäkkeitä muodostumisen

DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t) laukaisee solun muodostumista γ-H2AX pesäkkeitä (fosforyloidun H2AX proteiini) [24]. Vahvista solun DNA-vaurioita vastaus BLM läpi Comet määritys, kvantitatiivinen analyysi γ-H2AX pesäkkeitä muodostumista seuraava suuri annos BLM altistus suoritettiin osajoukko neljä vanhempien /kestävät paria (HOP, ACHN, NCCIT, ja H322M-) [25 ] käyttämällä Phospho-Histone H2AX pSer139 monoklonaalinen vasta-aine, ja Alexa Jauhot 488-konjugoitua anti-fosfo-H2AX (BioLegend, San Diego, CA, USA). Vähintään 10000 tapahtumien laskettiin virtaussytometrissasi kunkin mittauksen; intensiteetti γ-H2AX, joka suoraan korreloi sytometriaa määrä, analysoitiin käyttäen Cell Quest ohjelmistoa (BD, USA).

Cell cycle-analyysillä

Cell cycle jakaumia kunkin parin seitsemän vanhempien ja kestävä osa-kloonit testattiin esi- ja post 24 tuntia suuren annoksen BLM altistumisen kymmenkertainen kestävät sub-klooneja ”huolto keskittyminen. Sitten solut monodisperssejä suspension kiinnitettiin etanoliin, minkä propidiumjodidilla (PI) värjäämällä (PI, Sigma, USA) ja analysoitiin käyttämällä FACScalibur virtaussytometriä (BD, USA). Prosenttiosuudet solujen lepää G1, S ja G2 /M vaiheessa määritettiin (CellQuest- ohjelmisto, BD, USA ja ModFit LT ohjelmisto, Verity Software House). Solusyklin jakelu mitattiin kussakin vanhempien /BLM kestävä pari lähtötilanteessa ja eri ajankohtina jopa 24 tuntia BLM hoidon. Korrelaatiot solusyklin jakelu, IC

50-arvot, ja solulinjaa kaksinkertaistaa kertaa analysoitiin.

anneksiini V /PI määritys BLM indusoiman apoptoosin

Määritä solujen apoptoosin esi- ja post BLM hoitoa, edustava osajoukko neljä vanhempien /kestävät paria (HOP, ACHN, NCCIT, ja H322M) käsiteltiin 24 tunnin korkean annoksen BLM. Sitten solut värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja PI, ja arvioidaan apoptoosin virtaussytometrialla mukaan valmistajan protokollan (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Sekä varhainen (anneksiini V-positiivisia, PI-negatiivinen) ja myöhäinen apoptoottisten solujen (anneksiini V-positiivisia, PI-positiiviset) laskettiin kuten apoptoottisten solujen.

Tilastollinen analyysi

arvioimiseksi hoidon merkitystä tai ero, pariksi T-testejä tai parittomia t-testit (riippuen kokeellinen tiedot) suoritettiin kaksipuolisen merkitsevyystasolla 0,05. Normaalius oletuksia arvioitiin kautta Shapiro-Wilks testejä. Kun normaalius oletus ei voitu pitää, pariksi tai pariton Wilcoxonin-summa suoritettiin sijaan. Comet määritys arviointi emo ja kestävä osa-kloonit annokset ovat suuria BLM hoito, p-arvot laskettiin käyttäen t tilastotieto kuin yhtä suuri vaihtelut, testaus nollahypoteesi tasa log suhde. Logistinen regressio arvioimiseksi suoritettiin perustason G2 /M jakelu erot vanhempien ja kestävä sub-klooneja. Tutkia korrelaatio eri toimenpiteiden (IC

50 ohjaus, IC

50 muutos seuraavan suuren annoksen BLM hoito, kaksinkertaistaa ajan, ja solusyklin jakelu), lineaarinen regressio analyysit suoritettiin. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SAS versiota 9.2 tai SPSS versio 13.0.

Tulokset

BLM-resistenttejä solulinjoja ylläpidettiin BLM pysyvästi näkyvissä korkeampi IC

50-arvot ja pitkäaikainen kaksinkertaistumisaikaa

Kaikki seitsemän BLM kestävät sub-klooneja osoitti suuremman IC

50 kuin niiden vanhempien kollegansa (kuvio 1). -sytotoksisuusmäärityksiä Osoitti välillä 7-49 kertaisesta IC

50 BLM kestävät sub-klooneja. Positiivinen korrelaatio havaittiin välinen huolto- BLM pitoisuuden ja IC

50-arvot (p 0,001, R

2 = 0,58). Pitkien BLM altistuksen solulinjat enemmän vanhempien herkkyys BLM (keskiarvo IC

50, 0,1 ug /ml) osoitti suuremman resistenssin lisääntymistä (keskiarvo 48 kertainen) verrattuna vanhempien linjat, jotka olivat vähemmän herkkiä (keskiarvo IC

50, 9μg /ml, 15-kertainen; p 0,05 vertaamalla vanhempien herkkiä vähemmän herkkä riviä).

Lineaarinen regressio määrittelemää että suuremmat arvot IC

50 liittyi pienempiä arvoja kertainen muutos (logaritmi asteikko kulmakerroin: -0.11 (keskivirhe: 0,02), P 0,0001, R

2 = 0,58). Jokainen IC

50-arvo on keskiarvo kokeista suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Havaittiin, että BLM kestävät sub-klooneja kasvoi hitaammin kuin niiden vanhempien solulinjat. Kaksi solulinjoista, kun ylläpidetään korkeampia pitoisuuksia BLM, kuten MB231

3,0 ja H322M-

2.5 (alaindeksit tarkoittavat ylläpito BLM pitoisuus), oli myös laajentunut ja litistetty solujen morfologia, joka muistuttaa solun vanhenemista verrattuna niiden vanhempien linjat , mutta vasta monien sukupolvien ajan. Sen sijaan, akuutti altistuminen suuria annoksia BLM ei aiheuttanut morfologisia muutoksia. Hitaampi solujen kasvua varmistettiin solun kaksinkertaistaa aikaa lasketaan xCELLigence järjestelmään. Kaikki BLM kestävät sub-klooneista tilastollisesti merkittävä kaksinkertaistuminen ajan pidentyminen ja keskiarvo kaksinkertaistaa aika kasvoi 147% (vaihteluväli: 64% -352%) verrattuna niiden vanhempien solulinjoilla (kuvio 2, p 0,05). Ei ollut mitään korrelaatiota solun kaksinkertaistaa aikaa ja IC

50-arvot, eikä kukaan välinen prosentuaalinen kasvu kaksinkertaistaa ajan ja kertainen IC

50.

keskimääräinen kaksinkertaistumisaika ± keskivirhe keskiarvon (SEM, n = 3) ei raportoitu. Keskimääräinen kaksinkertaistaa aika (mitattuna tunneissa) vanhempien linjat oli lyhyempi kuin BLM kestävät sub-klooneja kaikissa seitsemässä solulinjoissa. * P 0,05 verrattuna vanhempien.

testaamiseksi vakauden BLM vastustuskyvyn BLM kestävät sub-klooneja, vertailut IC

50-arvot ja kaksinkertaistumisaikaa välillä tehtiin normaalisti ylläpidetään BLM kestävät sub-klooneja ja samalla kestävä sub-klooneja, joista myöhemmin viljeltiin BLM-väliaineessa kolmen viikon ajan. Kolmen viikon BLM-vapaan viljelyn, kolme alun perin resistenttien sub-klooneja (sekä kivesten solulinjat NT2

0.1, NCCIT

1,5 ja keuhkosyövän solulinjaa HOP

0,05) osoitti merkittävää IC

50 vähentäminen (kuva 3) ja kaksinkertaistaa lyhenemisen (kuva 4), verrattuna huolletaan BLM kestävät sub-klooneja. Ei ollut tilastollisesti merkittäviä muutoksia IC

50 ja kaksinkertaistaa aikaa loput neljä riviä.

Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Log IC

50 vertailuja tehtiin. Kolme (HOP

0,05, NT2

0,1, ja NCCIT

1,5) seitsemästä solulinjojen havaittiin merkittävästi pienempiä IC

50-arvot seuraavien kolmen viikon BLM-ilmainen ylläpito. * P 0,05 vertailuja BLM kestävät sub-klooneja ja niiden vastaavat kollegansa kanssa kolmen viikon hoidon tauon.

Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Kolme (HOP

0,05, NT2

0.1, NCCIT

1,5) seitsemän solun BLM kestävä linjat osoittivat merkittävää laskua kahdentumisaikoina seuraavien kolmen viikon BLM-hoito ilmaiseksi. * P 0,05 verrattuna poiston jälkeen BLM 3 viikon solulinjoissa.

BLM resistenssi voi olla annoksesta riippuvaa

Koska yleinen korrelaatio välillä IC

50-arvot ja huolto BLM pitoisuudet yli 7-solulinjat (kuvio 1), mahdollisuus annoksesta riippuvaista BLM vastustuskyky testattiin. Yhtä solulinjaa ACHN, IC

50-arvot saatiin ACHN

0 (vanhempien linja), ja sen kahta kestävää Saharan klooneja, ACHN

0.1 ja ACHN

0,25. Positiivinen korrelaatio löytyi ylläpito BLM pitoisuudet (0, 0,1 ja 0.25μg /ml) ja niiden IC

50-arvot (0,01, 0,29, ja 0.74μg /ml, p 0,05). Lisäksi positiivinen korrelaatio havaittiin myös välillä BLM ylläpito pitoisuuksien ja kaksinkertaistaa kertaa (0 ug /ml-12 tuntia, 0,1 ug /ml-16.5hrs, 0.25μg /ml-23.5hrs, p 0,05). Tämä havainto ei testattu tai vahvistetaan jollekin muulle solulinjat.

BLM vastustuskykyisten sub-klooneja oli vähemmän BLM aiheuttaman DNA-vaurioita Comet määrityksissä

kvantifiointi DNA-vaurioita kaikissa seitsemässä vanhempien /kestävät paria käyttäen Comet määritystä (mitattuna OTM) osoittivat, että ennen BLM käsittelyä, kuusi seitsemästä resistenttien solulinjojen oli korkeampi pohjapinta DNA-vaurioita kuin verrokkiryhmän (poikkeuksena oli HOP

0,05, p 0,05). Tämä yleensä korreloi pitkittynyt tyvisolusyöpä kahdentumisaikoina havaittu tässä resistenttien sub-klooneja. Sen jälkeen suuri annos BLM hoitoon, viisi seitsemästä resistenttien sub-klooneja (SF

0,4, HOP

0.1, NT2

0.1, NCCIT

1,5, ja H322M-

2,5) oli pienempi DNA-vaurioita kuin niiden vanhempien linjat. Kasvua ei DNA-vaurioiden jälkeen BLM altistuksen havaittiin viidessä seitsemästä resistenttien linjojen (SF

0,4, NT2

0.1, NCCIT

1,5, H322M-

2,5, ja MB231

3,0). Sen sijaan kaikki kantasolulinjoista oli suurempi DNA-vaurion jälkeisiä BLM kuin ennen BLM (p 0,05 kunkin vertailu; kuvio 5). Lisäksi kaikki seitsemän vanhempien linjat näkyvät huomattavasti suurempi DNA-vaurioita kasvua jälkeisessä BLM kohtelu verrattuna niiden resistenttejä kollegansa (p 0,05).

Kokeet ajettiin kolmena rinnakkaisena. Solut kohteena suuren annoksen BLM altistus (vastaa kymmenen kertaa niiden ylläpito pitoisuudet) 24 tuntia. OTM käytettiin DNA pirstoutuminen (vaurio) kvantifiointi ja laskettiin: OTM = (Tail.mean – Head.mean) x (Tail% DNA) /100. Comet määritys paljasti suurempi kasvu DNA pirstoutuminen (ilmaistuna OTM tasot) jälkeen BLM kohtelu kaikissa vanhempien linjat. * P 0,05 vertailua solulinjojen ennen ja jälkeen suuren annoksen BLM hoitoon. Kaikki vanhempien linjat osoittivat merkittävää kasvua DNA-vaurioita. # P 0,05 vertailua vanhempien ja kestävä solulinjoja lähtötilanteessa (esikäsittely). Kaikki BLM kestävä linjat paitsi HOP

0.05 näytteillä kohonnut DNA vaurioita lähtötilanteessa verrattuna niiden vanhempien linjat. P 0,05 vertailua kestävä solulinjojen ja emosolulinjassa postitse BLM hoitoa. Vähemmän DNA-vaurioita (verrattuna niiden vanhempien riviä) jälkeisessä BLM hoito löydettiin viisi seitsemästä BLM-resistenttejä solulinjoja (SF

0,4, HOP

0.1, NT2

0.1, NCCIT

1,5, ja H322M

2,5).

BLM vastustuskykyisten sub-klooneja oli vähentänyt γ-H2AX tasot verrattuna niiden vanhempien linjat seuraavat suuren annoksen BLM hoito

Toisena mittana soluvastetta DNA-vaurioita, γ- H2AX arvioitiin myös osajoukko neljä solulinjojen (HOP, ACHN, NCCIT ja H322M-). Sen jälkeen 24 tuntia suuren annoksen BLM hoitoa, γ-H2AX intensiteettiä kasvoi kaikilla vanhempien solulinjoissa. Vuonna kestävät sub-klooneja, lisääntynyt γ-H2AX intensiteettejä havaittiin vain kahdella neljä riviä (ACHN

0,25 ja HOP

0,05, kuva 6). Tämä on yhteisymmärryksessä Comet määrityksissä. Kolme (HOP

0,05, NCCIT

1,5, ja H322M-

2,5) neljästä resistenttien Saharan kloonien eläintutkimuksissa merkitsevästi vähemmän muutosta γ-H2AX intensiteetin (γ-H2AX intensiteetin jälkikäsittelyä miinus esikäsittely) verrattuna niiden vanhempien osa-kloonien post BLM hoitoon (p 0,05). Tämä suuntaus oli rajatapaus merkittävä neljännellä rivillä (H322M-

2,5, p = 0,054).

Kokeet suoritettiin kolminkertaisina. Solut kohteena suuren annoksen BLM altistus (vastaa kymmenen kertaa niiden ylläpito pitoisuudet) 24 tuntia. Havaitsemiseen virtaussytometrialla BLM-indusoidun γ-H2AX pesäkkeitä muodostuminen saatiin sitten alaryhmässä neljä solulinjojen (ACHN, HOP, NCCIT ja H322M). * P 0,05 vertailua solulinjojen ennen ja jälkeen suuren annoksen BLM hoitoon. Kaikki vanhempien linjat osoittivat merkittävän kasvun muodostumiseen γ-H2AX. # P 0,05 vertailua vanhempien ja kestävä solulinjoja lähtötilanteessa (esikäsittely). Yksi neljästä BLM-resistenttejä solulinjoja (NCCIT

1,5) oli suurempi γ-H2AX muodostumisen kuin sen lähtöaineena vastine lähtötilanteessa. P 0,05 vertailua kestävä ja vanhempien solulinjoja seuraavista BLM hoitoa. Kaksi neljästä BLM-resistenttejä solulinjoja (HOP

0.1 ja NCCIT1.

5.) Paljasti merkittävästi vähemmän γ-H2AX muodostumisen kuin niiden vanhempien kollegansa lähettää BLM hoitoa, kolmannen linjan (H322M-

2.5) ollessa rajatapaus merkitsevä (p = 0,054).

BLM-resistenttejä solulinjoja oli alhaisempi G2 /M pidätys seuraavan suuren annoksen BLM altistuminen

Koska solusyklin pysähtymiseen G2 /M faasi oli ominaista yleinen soluvaste BLM altistumisen, kyky BLM-resistenttien sub-kloonien tukahduttaa BLM-induced G2 /M-pidätys arvioitiin. Kuten kuviossa 7, kolme seitsemästä BLM vastustuskykyisten sub-klooneja (HOP

0,05, NCCIT

1,5, ja H322M-

2,5) osoitti suurempi G2 /M vaihejakauman lähtötilanteessa, verrattuna niiden vanhempien linjat (p 0,05). Samoin muut neljä solusarjalla kestävät sub-klooneja oli myös suurempi G2 /M vaihejakauman lähtötilanteessa, vaikka ei-merkittävästi. 24 tunnin kuluttua suuren annoksen BLM altistumista, viisi (SF

0,4, NT2

0.1, NCCIT

1,5, H322M-

2,5, ja MB231

3,0) seitsemän BLM vastustuskykyisten sub-klooneja näytteillä alempi G2 /M jakelu kuin niiden vastaavat vanhempien linjat (p 0,05). Verrataan% G2 /M-jakelu ennen ja jälkeen 24 tunnin suuren annoksen BLM hoitoon, kaikki kantasolulinjoista esillä kasvaa G2 /M jakelu hoidon jälkeen (p 0,05) .Sama suuntaus oli nähtävissä kaikissa kestävä osa-klooneja, vaikka kaksi (NT2

0.1 ja MB231

3,0) oli ei-merkitsevä. Laajuus% G2 /M jakelu lisäys (laskettuna% G2 /M

jälkikäsittely miinus% G2 /M

esikäsittely) oli pienempi kaikissa resistenttien Saharan kloonien kuin vastaavat vanhempien linjat (p 0,05).

Korkea annos BLM hoito vastaa kymmenen kertaa vastaava huolto pitoisuudesta kutakin solulinjaa. Keskiarvo ± SEM (n = 3) arvot raportoidaan. * P 0,05 vertailussa solulinjojen ennen ja jälkeen suuren annoksen BLM hoitoon. Kaikki vanhempien linjat osoittivat merkitsevää G2 /M solusyklin jakeluun. # P 0,05 vertailua vanhempien ja kestävä solulinjoja lähtötilanteessa (esikäsittely). Kolme seitsemästä BLM-resistenttejä solulinjoja (HOP

0,05, NCCIT

1,5, ja H322M-

2,5) näytteillä kasvoi% G2 /M jakelu lähtötilanteessa verrattuna niiden vanhempien solulinjoja. P 0,05 vertailussa% G2 /M jakautuminen vanhempien ja kestävät solulinjat jälkeen BLM hoidon. Vähemmän% G2 /M jakelu kuin vanhempien linjat todettiin viidessä seitsemästä BLM-resistenttejä solulinjoja (SF

0,4, NT2

0.1, NCCIT

1,5, H322M-

2,5, ja MB231

3,0) jälkeen BLM hoidon.

G2 /M pidätyksen tulee näkyvästi 8 tunnin suuren annoksen BLM hoito

arvioimiseksi ajoituksen G2 /M pidätyksen jälkeen suuri annos BLM altistuminen, neljä solu- linjat (synnynnäisesti BLM herkkä HOP ja ACHN riviä, NCCIT kivesten linjan ja synnynnäisesti BLM kestävä H322M-, samaa linjaa arvioitiin γ-H2AX kokeilu) koki ajan myötä analyysiin. Vaikka oli yhä G2 /M pidätys sekä vanhempien ja BLM kestävät sub-klooneja (kuvio 8), tämä pidätys oli näkyvimmin nähty välillä 8 ja 12 tunnin kuluttua BLM hoidon vanhempien soluissa.

Kokeet ajettiin kolmena kappaleena. G2 /M jakelu havaittiin olevan suurempi vanhempien linjat (verrattuna resistenttien sub-kloonit) 8 tunnin kuluttua BLM hoidon.

Alennettu apoptoosin löytyi BLM kestävät sub-klooneja

Käyttämällä samaa neljän pariksi sub-klooneja, me tutki solut tehtiin apoptoosin jälkeen suuri annos BLM hoitoon. 24 tunnin kuluttua BLM hoidon prosenttiosuus apoptoottisten solujen kasvoi kaikilla neljällä vanhempien linjat testattiin (kuvio 9). Sen sijaan ei ole kestävä osa-kloonia tilastollisesti merkitsevä apoptoosin seuraavissa BLM hoitoa. Tämä oli yhteisymmärryksessä Comet määritys (DNA-vaurioita) analyysi. Lisäksi kolme neljästä resistenttien sub-klooneja (HOP

0,05, NCCIT

1,5, ja H322M-

2,5) eläintutkimuksissa merkitsevästi vähemmän apoptoosin lisääntyminen (% apoptoosia jälkeen miinus% apoptoosin ennen BLM käsittelyä) verrattuna niiden vanhempien linjat seuraavat BLM hoidon (p 0,05). Tämä yleensä korreloi alentunut DNA-vaurioita ja G2 /M solusyklin pysähtymisen BLM kestävät sub-klooneja (verrattuna vanhempien linjat, jälkikäsittely) havaittuna aiemmin.

* P 0,05 vertailua solulinjojen ennen ja jälkeen suuren annoksen BLM hoitoon. Kaikki vanhempien linjat mutta ei kestävä linjat osoittivat merkitsevää apoptoosin jälkeisessä BLM hoitoa. P 0,05 vertailua kestävä ja emosolulinjassa seuraavat BLM hoitoa. Vähemmän apoptoosia havaittiin kolmessa (HOP

0,05, NCCIT

1,5, ja H322M-

2,5) neljästä BLM vastustuskykyisten linjat, verrattuna niiden vanhempien linjat.

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme onnistunut seitsemän BLM-resistenttejä ihmisen syövän solulinjoja kaupallisesti saatavissa syöpäsolulinjasta eri elimen alkuperää (keuhko, kives, rinta-, munuais-, sekä keskushermostoon). Sen jälkeen äkillinen akuutti, lyhytaikainen altistuminen BLM, nämä BLM kestävät sub-kloonia vähemmän DNA-vaurioita, oli pidempi kaksinkertaistaa kertaa, oli pienempi osuus solujen G2 /M pidätys, ja oli vähentänyt apoptoosin, verrattuna niiden enemmän BLM-herkkä vanhempien solulinjoissa. BLM-resistenttejä solulinjoja ovat kehittäneet asteittain lisäämällä inkuboimalla BLM pitoisuus pidemmän ajan 16-24 kuukautta. Aiemmat tutkimukset ovat saattaneet käyttää samanlaisia ​​menetelmiä viljellä BLM resistenttien sub-klooneja. Kuitenkin vain harvat niistä saavutti korkean BLM-kestävyyden, joka havaittiin tässä tutkimuksessa (joka oli 7-49-kertainen nousu IC

50 välillä kestävä ja vanhempien sub-klooneja, kun verrattuna 3-20 kertainen lisäys toiseen tutkimuksessa [15]). Lisäksi analysoimalla BLM-indusoidun DNA-vaurioita, solusyklin jakautuminen, ja prosenttiosuudet apoptoosin useita oletetun mekanismeja BLM vastus /herkkyys arvioitiin.

BLM tiedetään aiheuttavan laajennettu G2 /M pidätyksen ja /tai solujen apoptoosia [9] BLM herkät solut. Tämä voidaan välittää ATM /ATR [26,27], ylävirran proteiinit DNA korjaukseen ja signalointireitin, joka laukaisee G2 /M pidätyksen tai apoptoosin kautta valikoima loppupään geenituotteiden kuten CHK1 /2, CDC 25 [28 ], p53, ja p21

WAF1 /CIP1, missä kaksi viimeksi mainittua ovat kriittisiä yllä G2 /M sykli pidätys [29]. Lisäksi histoni H2AX havaittiin olevan tarpeen aktivointia G2 /M-Check Point [30].

Comet ja γ-H2AX Tulokset paljastivat vähemmän BLM aiheuttaman DNA-vaurioita resistenttiä linjat, mikä viittaa siihen, että kestävä osa-klooneja voi olla parannettu kyky ehkäistä ja /tai vähentää DNA aiheuttamia vahinkoja BLM. Tämä voi johtua vähentyneestä soluunottoa BLM, ja /tai parannettu BLM poistaminen /vieroitus, välittävät solun pinnan reseptorien tai niiden kuljettajat [31], antioksidantti molekyyliä /entsyymejä, jotka vähentävät BLM syntyvän ROS [11,32]; tai entsyymejä, jotka inaktivoivat BLM [33,34]. Jatkotutkimuksissa on edelleen tutkia näitä mekanismeja.

Tässä tutkimuksessa BLM vastus aiheutti myös vähemmän G2 /M pidätyksen ja solujen apoptoosin, yhdenmukaisia ​​tuloksia aiemman tutkimuksen yhdellä BLM kestävä linjan [11] . Hienoinen kasvu G2 /M pidätys lähtötilanteessa (ennen suuri annos BLM hoito) näille BLM resistenttien sub-klooneja voidaan selittää krooninen altistuminen BLM. Se, että BLM-resistenttien solujen pystyivät lisääntyä, jonka BLM pitoisuus, joka ei ollut elinkelpoinen niiden vanhempien linjat osoittavat, että kiertäminen solusyklin tukos voisi olla toinen mekanismi vastarintaa. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että BLM resistenttien solujen voinut hankkia lisääntynyt kyky estää /vähentää DNA aiheuttamia BLM. Tämä puolestaan ​​saattanut johtaa alennettua G2 /M pysähtymiseen ja apoptoosiin.

vaiheittainen annos laajeneva menetelmä BLM resistenssin kehitys voi johtaa annos-vaste-suhde joukossa BLM huolto pitoisuuksia, IC

50-arvot ja kaksinkertaistaa aikoina havaittu ACHN

0, AHCN

0.1 ja AHCN

0,25 soluja. Siihen saakka kunnes nämä päätelmät vahvistetaan muissa sarjaa osa-kloonien, tämä pysyy mielenkiintoinen havainto tarpeessa validointi.

Kun olet poistanut huollon BLM pitoisuudet kaikista seitsemästä kestävät sub-kloonien, oli osittainen peruutus IC

50-arvot ja kaksinkertaistaa kertaa kolmeen seitsemän solulinjoissa. Puuttuminen palautuvuudesta muissa neljässä solulinjat voivat olla seurausta yksittäisen solulinjan eroja, tai ehkä näissä solulinjoissa tarvitaan enää taukoja BLM altistumisesta kehittää BLM herkkyyttä uudelleen.