Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä (CRC) moninaisuus on liittyvät pääasiassa polyyppitautia ja ei-polypoosin perinnöllinen oireyhtymät. Yksittäisissä CRC, poikkeava geeni promoottori metylaatio on osoitettu olevan keskeisessä asemassa Karsinogeneesin vaikka vähän tiedetään sen osallistumisesta moninaisuus. Vaikutuksen arvioimiseksi metylaation vuonna kasvainten lukumäärää satunnaista CRC, hypermetylaatiota keskeisten tuumorisuppressorigeeneille arvioitiin potilailla, joilla oli sekä useita ja yksinäinen kasvaimia, kuten proof-of-concept of taustalla epigenetic vika.

Menetelmät /Principal havainnot

tarkasteli kaikkiaan 47 synkroninen /metachronous ensisijainen CRC 41 potilasta, ja 41 sukupuoli, ikä (5 vuoden välein) ja kasvaimen sijainti-pariksi potilailla, joilla on yksinäinen kasvaimia. Hylkäämisperusteet olivat polypoosia oireyhtymiä, Lynch oireyhtymä ja tulehduksellinen suolistosairaus. DNA: n metylaatio on promoottorialueen

MGMT

,

CDKN2A

, S

FRP1

,

TMEFF2

,

HS3ST2 (3OST2)

,

RASSF1A

ja

GATA4

geenien arvioitiin kvantitatiivinen metylaatio PCR sekä kasvaimen ja vastaavat normaali esiintyvät peräsuolen limakalvo näytteitä. Kaiken potilaalla on useita leesioita esiintyi suurempaa metylaation Tuumorinäytteissä kuin ne, joilla on yksinäinen kasvaimia koskevat kaikkia arvioidaan geenejä. Säätämisen jälkeen ikä ja sukupuoli, binominaalinen regressioanalyysimme tunnistettu metyloinnin

MGMT2

(OR 1,48; 95% CI, 1,10-1,97; p = 0,008) ja

RASSF1A

(OR, 2,04 ; 95% CI, 1,01-4,13; p = 0,047) muuttujina itsenäisesti liittyy kasvainten lukumäärää, joka liittyvä riski metyloinnin tahansa näistä kahden geenin 4,57 (95% CI, 1,53-13,61; p = 0,006). Lisäksi kuudella potilaalla, joille molemmat kasvaimet olivat saatavilla, löysimme korrelaatio metylaatiotasot on

MGMT2

(r = 0,64, p = 0,17),

SFRP1

(r = 0,83, 0,06),

HPP1

(r = 0,64, p = 0,17),

3OST2

(r = 0,83, p = 0,06) ja

GATA4

(r = 0,6, p = 0,24). Metylointi normaalissa esiintyvät peräsuolen limakalvon potilailta, joilla on useita ja yksinäinen CRC osoittanut mitään merkittävää eroa missään arvioitiin geenissä.

Johtopäätökset

Nämä tulokset tarjoavat proof-of-concept että geeni promoottori metylaatio liittyy kanssa kasvainten lukumäärää. Tämä taustalla epigeneettisellä vika voi olla huomionarvoista vaikutuksia ehkäisyssä potilailla, joilla on satunnaista CRC.

Citation: Gonzalo V, Lozano JJ, Muñoz J, Balaguer F, Pellisé M, de Miguel CR, et al. (2010) Poikkeava Gene Promoottori Metylointi Associated kanssa Sporadic Multiple peräsuolen syövän. PLoS ONE 5 (1): e8777. doi: 10,1371 /journal.pone.0008777

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 syyskuu 2009; Hyväksytty: 23 joulukuu 2009; Julkaistu: 19 tammikuu 2010

Copyright: © 2010 Gonzalo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF 07-64873), Fondo de Investigación Sanitaria (PI061384 ja PI080024), Asociación Española Contra el Cancer (Fundación Científica ja Junta de Barcelona), Fundación Investigación Médica mutua Madrileña (PI040296) , Fundación Olga Torres (PI040212), ja Acción en Cancer (Instituto de Salud Carlos III). Victoria Gonzalo tukivat apurahan Hospital Clinic, Cristina Rodriguez avustus Olympus Medical Systems-Europe, Mireya Jimeno avustus Instituto de Salud Carlos III (PI016017), Francesc Balaguer avustus Fundación Alfonso Martín Escudero , ja Sergi Castellvi-Bel sopimuksella päässä Fondo de Investigación Sanitaria (CP 03-0070). Centro de Investigación BioMedica en Red en el Área temática de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd) rahoittaa Instituto de Salud Carlos III. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Cristina Rodriguez oli tutkimuksen sairaanhoitaja rahoitaa Olympus Medical Systems-Euroopassa. Rahoittaja, ei kuitenkaan ollut mukana tutkimuksen suunnittelu; kerääminen, analysointi ja tulkinta tietojen kirjallisesti paperi; eikä päätös jättää julkaistavaksi.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on merkityksellinen kansanterveydellinen ongelma, koska se edustaa toiseksi yleisin pahanlaatuinen kasvain ja myös toiseksi suurin syy syövän kuolemaan Läntiset maat. Perintö muodostaa perussyynä jopa kolmannes kaikista CRC tapauksissa erittäin läpitunkeva neste ja hyvin määritelty perinnöllinen häiriöt, eli adenomatous ja hamartomatous polypoosin ja Lynch oireyhtymä, eli 3-5% koko CRC taakan [1]. Näissä olosuhteissa, läsnäolo ituradan mutaation aiheuttava geeni (eli

APC

,

MYH

,

LKB1

,

Smad4

,

BMPR1A

,

PTEN

,

MLH1

,

MSH2

,

MSH6

ja

PMS2

) [1], [ ,,,0],2], altistaa nämä yksilöt rinnakkaisten peräsuolen kasvaimet. Itse asiassa, kun taas familiaalinen adenomatoottisen polypoosin edustaa paradigmaa kasvainten lukumäärää, läsnäollessa joko synkroninen tai metachronous CRC on myös yksi yleisimmistä kliiniset kriteerit epäillä Lynch oireyhtymä [3].

Lisäksi edellä mainittujen perinnöllisten sairauksien , kasvainten lukumäärää on myös usein havainto potilailla, joilla on CRC, jotka eivät ilmeisesti alttiita neoplasmojen perusteella geneettistä taustaa. Itse asiassa, synkroninen ja metachronous peräsuolen adenoomien raportoidaan jopa 30% ja 48% potilaista, joilla satunnaista CRC, vastaavasti, kun taas vastaavat luvut karsinooman ovat 4% ja 9%, vastaavasti [4], [5]. Tässä asennossa ilmeistä familiaalinen syöpä yhdistäminen tai erottuva henkilökohtaiset ominaisuudet eivät avoimesti erottaa, ja vaikka yleinen solu- tai molekyylin häiriö koko peräsuolen limakalvon voidaan epäillä, taustalla patogeeninen mekanismi edelleen heikko.

kentän vaikutus taustalla peräsuolen syövän synnyn on hyvin tunnustettu tilanne potilailla, joilla on tulehduksellinen suolistosairaus, syöpää edeltävä ehto lisääntynyt kumulatiivinen riski kehittää CRC liittyy varhain puhkeamisikä, taudin kesto, ja laajuus ja vakavuus tulehduksen [6], [7]. Tarkkaa mekanismia, jolla kroonisen paksusuolen limakalvon tulehdus aiheuttaa maligniteetti tässä yhteydessä tunnetaan hyvin huonosti, vaikka sen on tarkoitus liittyä epäonnistuminen sääntelymekanismeja solunjakautumisen aikana. Krooninen tulehdus johtaa vapautumiseen vapaiden radikaalien leukosyytit ja makrofaagit, ja nämä reaktiivisia happiradikaaleja voi ajaa syövän synnyn aiheuttamalla DNA-vaurioita [8]. Koska useimmissa tapauksissa DNA-vaurioita johtaa inaktivaatioon kasvaimen synnyssä, käsite ”kentän vaikutus” voitaisiin paremmin nimetä ”-kenttään vika”. Otaksuttu osallistuminen tällaisen näkökenttäpuutoksesta satunnaista CRC kuitenkaan ole riittävällä tavalla osoittanut toistaiseksi.

Sporadic CRC syntyy seurauksena kertyminen geneettiset ja epigeneettiset muutokset, jotka muuttavat koolonin epiteelisolujen paksusuolen adenokarsinoomasolua [9]. Menetys genomista vakauden ja tuloksena geenin muutokset ovat keskeinen molekyyli patogeenisiä vaiheita, jotka tapahtuvat varhain kasvainten synnyssä: ne sallivat hankinta riittävä määrä muutoksia kasvainten ja onkogeeneihin jotka muuttavat soluja ja edistää syövän etenemiseen. Analogisesti genomin epästabiilisuuden, epigeneettisiä epävakaus johtaa poikkeavaan metylointi tuumorisuppressorigeeneille [9]. Itse asiassa, epigeneettinen tuumorisuppressorigeeni geenien on yleisesti mukana kaikenlaisia ​​ihmisen kasvaimista, mukaan lukien CRC [10]. Poikkeava sytosiini metylaatio näyttelee preeminent rooli solujen transformaatio, kun se vaikuttaa geenejä, jotka turvaavat genomin epävakautta. Tämä epigeneettiset muutos voidaan myös havaita syövän esiasteita ja näennäisesti normaalin peritumor kudoksissa [11], [12], [13], [14], [15], mikä viittaa sen mahdolliseen osallistumiseen alkuperäisen karsinogeenisia prosessi. Tämä otaksuttu näkökenttäpuutoksesta liittyy geenin promoottori hypermetylaation normaalissa esiintyvät peräsuolen limakalvo on ehdotettu suhteessa

MGMT

geeni [12], sekä

ERa

,

myod

,

P16 (INK4a) B,

MLH1

,

TIMP-3

ja

DAPK

[13].

Koska hypermetylaatiota promoottori alueet tuumorisuppressorigeeneille voitiin havaita normaalissa esiintyvät peräsuolen limakalvo, me arveltu, että tämä ilmiö olisi erityisen hyödyllinen potilailla, joille kehittyi useita CRC. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida metylaation liittyvien geenien ja peräsuolen syövän synnyn tätä mekanismia sekä kasvainkudoksessa ja normaali esiintyvät peräsuolen limakalvo näytteitä potilaista, joilla on useita ja yksinäinen CRC, koska proof-of-concept of oletetun taustalla epigeneettisellä vika liittyy kasvainten lukumäärää.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat

tarkasteli kaikkiaan 47 synkroninen /metachronous ensisijainen CRC 41 potilasta (36 synkroninen, 4 metachronous ja yksi molemmat) ja 41 sukupuoli, ikä (5 vuoden välein) ja kasvaimen sijainti-pariksi potilailla, joilla on yksinäinen kasvaimia. Ohjaus potilailla, joilla on yksinäinen kasvaimia rekrytoitiin EPICOLON hanke, prospektiivinen monikeskustutkimus, maanlaajuinen, väestöpohjainen kohortti (n = 1222) [16] ja satunnaisesti valittujen joukossa joilla ei ole aikaisempaa CRC ja vähintään seuranta 5 vuotta sen jälkeen, kun syövän diagnoosissa, joissa säännöllisesti kolonoskopia valvonta ei ole havainnut mitään ylimääräistä vaurio. Mitä potilaat, joilla on useita CRC, 31 rekrytoitiin myös vuonna EPICOLON projektin ja 10 potilasta lisää on tähystys yksikkö klinikka Barcelona välillä kesäkuun 2007 ja toukokuun 2008 ei ollut eroja suhteen kliinis ominaisuuksia molempien potilaiden useita leesioita (tuloksia ei ole esitetty). Hylkäämisperusteet tähän tutkimukseen oli peräsuolen polypoosia oireyhtymiä, Lynch oireyhtymä ja henkilökohtainen historia tulehduksellinen suolistosairaus. Väestörakenteen, kliininen ja kasvaimeen liittyvät piirteet potilaiden mukana tutkimuksessa on koottu taulukkoon 1. Tutkimuksen hyväksyi institutionaalisten eettisen komitean kunkin osallistuvan sairaalan, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. Jäsenet EPICOLON hankkeen esitetään liitteessä S1.

Frozen kasvain ja vastaavat normaali-näkymästä, peritumor peräsuolen limakalvon kudokset saatiin joko leikkauksen tai endoskopian kaikista potilaista, ja heti säilytettiin -80 ° C käyttöön asti. Potilailla, joilla on useita leesioita, kudosnäyte saatiin vähintään yksi kasvain (pisimmällä yksi tai suurin, kun useita kasvaimia oli sama kasvaimen vaiheesta).

DNA eristäminen ja vetysulfiittikäsittely

jäädytetyt näytteet sulatettiin ja genominen DNA eristettiin käyttäen QIAamp DNA Mini Kit® (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vetysulfiittikäsittelyä suoritettiin genominen DNA käyttäen EZ DNA Metylointi-Gold Kit® (Zymo Research, Orange, CA) valmistajan protokollan vähäisin muutoksin alla [17]. Tämä menettely integroitu DNA denaturointi- ja bisulfiittikonversion yhdeksi vaiheelta käyttäen lämpötila denaturaatio korvata kemiallisia denaturointi- natriumhydroksidilla, ja se perustui kolmivaiheisen reaktion prosessin välillä sytosiini ja natriumbisulfiittia, joka muuntaa metyloitumattomat sytosiinit osaksi urasiileja. Määränä, joka on 250 ng genomista DNA: ta eristettiin kustakin kasvain- tai normaalia kudosta näytettä käytettiin reaktiota kohti, ja jonka tilavuus oli 15 gl käytettiin kunkin bisulfited DNA voidaan eluoida. Saatu DNA: ta käytettiin PCR-monistuksen tai säilytettiin -80 ° C: ssa.

Kvantitatiivinen metylaatiospesifisen PCR

jälkeen bisulfiittikonversion kaksoiskappaleet 0,5 ui kutakin bisulfited DNA monistettiin MethyLightT tekniikalla , joka on aiemmin kuvattu fluoresenssiin perustuvat kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR, hyvin spesifisiä, herkkiä ja toistettavia määritys [18]. Locus PCR alukkeiden ja koettimien seitsemän tuumorisuppressorigeeneille –

MGMT1

(minimaalinen promoottori),

MGMT2

(tehostaja-alue),

CDKN2A

,

SFRP1

,

TMEFF2

,

HS3ST2 (3OST2) B,

RASSF1A

ja

GATA4

– oli suunniteltu erityisesti bisulfited muunnetaan DNA-sekvenssit ja jotka sijaitsevat kussakin geenin promoottorialue. Nämä geenit valittiin niiden osallistumisesta peräsuolen syövän synnyn kautta metylointi-ajettu hiljentäminen ja näyttöä jonkin verran hypermetylaation normaaleissa-näkymästä, peritumor peräsuolen limakalvon vastine (taulukko 2). Tässä mielessä on tärkeää korostaa, että geenit ehdotettu markkereita CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi, joka määritelmän mukaan on lähes yksinomaan metyloitu syöpäkudoksessa vältyttiin. Primer ja koettimia käytetään bisulfited DNA-sekvenssit on listattu taulukossa S1. Täysin metyloimattomia ja täysin

Sss

l-metyloitua DNA käytettiin aluksi 0 ja 100% metyloituja viittauksia testata vahvistus tuloksia, ja metyloitua DNA: ta edelleen käytettiin kalibraattori kaikissa testatuissa näytteissä.

ALUC4

geeniä käytettiin endogeenisenä viitteenä normalisoimaan määrän tulo DNA [19]. MethyLightT reaktiot suoritettiin 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), jonka lopullinen tilavuus 12,5 ui, joka sisälsi 900 nM kutakin aluketta ja 250 nM vastaavan koettimen. PCR-olosuhteet olivat: 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 92 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 58 ° C: ssa 1 minuutin ajan, koska se on aiemmin kuvattu [18].

Jokainen mittaus tietyssä erässä tehtiin kahtena sekä testattu ja endogeenisten geenien, ja kynnys sykli (C

t) -the murtoluku, jossa määrä monistetun tavoitteen saavuttaminen kiinteä threshold- määritettiin. Keskihajonta kaksoisnäytteiden oli aina alle 0,2. Suhteelliset määrät Molempien geenien myös normalisoitiin kaupallisia 100% metyloitua DNA: ta (Zymo Research, Orange, CA) toimii kalibraattorimatriiseina sallimaan vertailun kaikilla tutkituista näytteistä. Vertaileva C

t menetelmä [20], joka tunnetaan myös 2

-ΔΔCt menetelmää, laskettiin fromwhere

ACk

t, näyte testatut geenit C

t vastinetta otosta normalisoitu

ALUC4

, ja

ACk

t, kalibraattori oli testattu geenit C

t-arvo kalibraattorin myös normalisoitu

ALUC4

. Tulos johdettu

ΔΔC

t × 100 vastaa prosenttiosuutta metyloitu viite (PMR), joka ilmaisee prosenttiosuuden täysin metyloitu molekyylien tiettyyn lokukseen [21].

Tutkijat suorittavat metylaatiospesifisen PCR reaaliaikainen kokeita sokaissut kliinisen ominaisuudet potilailla (eli kasvainten lukumäärää).

arviointi kasvaimen täsmää korjaus puutos

kasvain yhteensopimattomuuden korjauksen puutos arvioitiin sekä immunovärjäyksellä ja microsatellite epävakautta testaus. Immunohistokemiallista analyysiä lisäksi arvioitiin MSH2 (anti-MSH2, Oncogene Research Products, Boston, MA), MLH1 (anti-MLH1, PharMingen, San Diego, CA) ja MSH6 (anti-MSH6, BD Transduction Laboratories, San Jose, CA), kuten muualla on kuvattu [16]. Kasvaimen solut arvioitiin negatiiviseksi proteiinin ilmentymisen vain, jos ne puuttui värjäytymistä näytteessä, joissa normaalit colonocytes ja strooman solut värjättiin. Jos ei immunovärjäystä normaalin kudoksen voitiin osoittaa, tulokset pidettiin epäluotettavina. Mikrosatelliittimarkkereita epävakaus arvioitiin käyttäen 5-markkeripaneeli ehdottama National Cancer Institute ja /tai pentaplex on mononukleotidi toistoista, kuten muualla on kuvattu [22].

Tilastollinen analyysi

Comparison of metylaation asteen välillä useita ja yksinäinen CRC potilaille tehtiin laadullisesti jossa metylaatio positiivisuus asetettiin PMR ≥4, kuten aikaisemmin validoitu [23]. Koska tietoa metylaatio normaalissa esiintyvät peräsuolen limakalvo oli rajallinen, analyysi tässä asetelmassa suoritettiin sekä ≥4 PMR katkaisun ja lisäksi, mielivaltaisesti valittu ≥1 PMR cut-off varmistuakseen mahdolliset vähäinen vaikutus. Analyysi suoritettiin käyttämällä Fisherin tarkkaa testiä. Korrelaatio metylaatiotasoilla kasvaimen parien analysoitiin Spearmanin korrelaatio analyysi.

vertailu potilaalla on useita ja yksinäinen kasvaimia koskevat metylaation aste sekä kasvain ja normaali esiintyvät peräsuolen limakalvo näytteistä suoritettiin myös käyttämällä binomial logistista regressiota, molemmat oikaisematon ja ikä- ja sukupuoli. Lisäksi testasimme itsenäinen vaikutus geenin metylaatio on kasvainten lukumäärää ottamalla mukaan kaikki arvioitiin geenien binomimallia logistinen regressiomalli, sekä iän ja sukupuolen. Nämä muuttujat olivat ”karsittiin” automaattisella vaiheittainen optimointiin Akaike tiedot kriteeri [24]. Multiplikatiivinen vuorovaikutukset testattiin kunkin parin geenien itsenäisesti liittyvän kasvainten lukumäärää mukaan lukien sekä tärkeimmät vaikutukset ja vuorovaikutus termi (tuote kaksi pääasiallista vaikutusta) logistisessa regressiomallin. Lopuksi testasimme kumulatiiviset vaikutukset metyloitu geenien kasvainten lukumäärää laskemalla valittujen geenien itsenäisesti liittyy tämän ilmiön kuhunkin aiheeseen. Ristitulosuhde kasvainten lukumäärää potilaille kuljettaa mitä tahansa valitun metyloitua geenit arvioitiin vertaamalla niitä potilaita kuljettavat mikään näistä geeneistä käyttämällä regressioanalyysimme. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen ”R” (R Core Development joukkue, https://www.R-project.org).

Jatkuva muuttujat ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Kaikki p-arvot olivat kaksipuolisia. P-arvo on alle 0,05 pidettiin osoittamaan tilastollisesti merkitsevää eroa.

Tulokset

Neljäkymmentä potilasta joko synkroninen tai metachronous CRC, ja 41 sukupuoli, ikä ja kasvaimen sijainti-pariksi potilailla, joilla on yksinäinen kasvaimia muodosti tämän tutkimuksen perusteella. Kuten on esitetty taulukossa 1, molemmissa potilasryhmissä olivat samanlaisia ​​suhteen mitään demografiset, kliinisiä ja kasvaimeen liittyvät piirteet, paitsi läsnäolo synkroninen peräsuolen adenoomien.

Gene Promoottori Metylointi Tuumorinäytteissä

Comparison of geenin promoottorin metylaation tuumorinäytteissä potilailta, joilla on useita ja yksinäinen CRC on esitetty taulukossa 3. kaiken potilaalla on useita leesioita esiintyi suurempaa metylaation tuumorinäytteissä kuin ne, joilla on yksinäinen kasvaimia koskevat kaikkia arvioidaan geenejä. Osuus kasvainten näytteille geenin promoottori hypermetylaation oli merkittävästi suurempi potilailla, joilla on useita leesioita kuin niillä, joilla on yksinäinen CRC suhteen

MGMT2

(40,4%

vs.

14,6%, tässä järjestyksessä; p = 0,009) ja

RASSF1A

(17,0%

vs.

0%, vastaavasti; p = 0,006) (taulukko 3).

riskin arviointi kasvaimen moninaisuus liittyy geenin promoottori metylaation tuumorinäytteissä on esitetty taulukossa 4. Kun tulos korjattiin iän ja sukupuolen, binominaalinen logistinen regressio analyysi osoitti, että metylaatio promoottorialueiden

MGMT1

lokuksen (riskisuhde (OR), 1,57 ; 95%: n luottamusväli (CI), 1,01-2,43; p = 0,04),

MGMT2

lokuksen (OR, 1,50; 95% CI, 1,14-1,96; p = 0,003), ja

RASSF1A

geeni (OR, 2,02; 95% CI, 1,03-3,93; p = 0,03) on liitetty suurentunut riski sairastua useita CRC (taulukko 4).

oikaistu monimuuttuja regressioanalyysimme tunnistettu metylaatio

MGMT2

lokuksen (OR, 1,48; 95% CI, 1,10-1,97; p = 0,008) ja

RASSF1A

geeni (OR, 2,04; 95% CI, 1,01-4,13; p = 0,047) muuttujina itsenäisesti liittyy kasvainten lukumäärää. Lisäksi kun tuote näiden kahden muuttujan lisättiin regressiomalli, tämä vuorovaikutus termiä ei valittu (OR, 0,88; 95% CI, 0,67-+1,16; p = 0,37). Lopuksi, kun kumulatiiviset vaikutukset metyloitua geenien arvioitiin riski kasvainten lukumäärää liittyy metyloinnin tahansa näiden kahden valitun geenin oli 4,57 (95% CI, 1,53-13,61; p = 0,006), joilla ei ole merkittävää kasvua, kun molemmat geenit olivat samanaikaisesti metyloitu (OR, 2,31; 95% CI, 0,00 määrittelemättömiä; p = 0,99).

Lopuksi analysoimme korrelaation metylaatiotasoilla osajoukkoon kuusi potilasta, joilla on useita kasvaimia, joille molemmat kasvaimet olivat saatavilla analyysiä varten (kuvio 1). Tämä analyysi osoitti ei-merkitsevä korrelaatiota metylaatiotasot on

MGMT2

(r = 64, p = 0,17),

SFRP1

(r = 0,83, 0,06),

HPP1

(r = 0,64, p = 0,17),

3OST2

(r = 0,83, p = 0,06), ja

GATA4

(r = 0,6, p = 0,24).

MGMT1

ja

CDKN2A

eivät osoittaneet todisteita välistä yhdenmukaisuutta kasvainten samalla potilaalla (r = -0,05, p = 0,91; r = -0,09, p = 0,91, vastaavasti), ja

RASSF1A

harvoin metyloitu näissä kasvaimissa, mikä esti asianmukainen korrelaatioanalyysiä.

tulokset ilmaistaan ​​prosentteina metylaation perustuu PMR.

Gene Promoottori metylointi Normal Ilmestyttyään peräsuolen limakalvon näytteitä

metylointi normaalissa esiintyvät peräsuolen limakalvon potilailta, joilla on useita ja yksinäinen CRC osoittanut mitään merkittävää eroa missään arvioitiin geeni (taulukko 5). Jotta voidaan varmistua mahdolliset vähäinen vaikutus, analyysi toistettiin käyttäen ≥1 PMR cut-off (taulukko 5). Tässä toisessa analyysissä, mitään johdonmukaista metylaatiokuvion havaittiin, joidenkin geenien osoittavat hypermetylaation (eli

MGMT1

,

MGMT2

ja

RASSF1A

) ja muut hypometylaatio (eli

SFRP1

,

TMEFF2

ja

GATA4

) potilailla, joilla on useita vaurioita. Mikään näistä erot olivat tilastollisesti merkitseviä (taulukko 5).

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että kasvaimia potilailta synkronoitu ja metachronous CRC osoittavat suurempaa metylaation kuin potilaista, joilla yksinäinen vaurioita. Kasvain hypermetylaatiota

MGMT

geenin tehostaja-alue ja

RASSF1A

geenipromoottorialueen tunnistettiin muuttujia itsenäisesti liittyy viisinkertainen riski sairastua useita leesioita. Lisäksi löydettiin vastaavia metylaatiovyöhykkeiden kasvaimen pareittain samasta potilaasta. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot tarjoavat proof-of-concept of epigeneettisestä vika välittämä geenin promoottori hypermetylaation jotka suosivat kasvainten lukumäärää satunnaista CRC.

vahvuudet Tutkimuksen luottaa siihen, että se toteutettiin yleisellä väestölle prospektiivinen monikeskustutkimus, valtakunnallinen tutkimus, jossa valitsemattomat ja peräkkäistä potilasta, joilla CRC otettiin mukaan riippumatta heidän henkilökohtaisten ja familiaalinen ominaisuudet; edellinen geneettinen karakterisointi suoritetaan yhteydessä EPICOLON hankkeen sallitaan riittävä tunnistamista ja myöhempi sulkeminen potilaalla on perinnöllinen häiriöt (eli peräsuolen polypoosin, Lynch oireyhtymä ja MYH liittyvä CRC) [16], [22], [25], [26 ], [27], [28], johon erityinen ja hyvin määritelty molekyylimekanismin oikeuttaa kasvainten lukumäärää; se on suurin sarja potilaalla on useita leesioita arvioidaan toistaiseksi kasvaimen metylaation sekä ensimmäinen tutkimus, jossa kontrolliryhmän potilailla, joilla on yksinäinen vaurion mukana riittävä ositusta sukupuolen, iän ja kasvaimen sijainti; ja lopuksi, kvantitatiivinen metylaatiospesifisen PCR suoritettiin sekä kasvaimen näytteen ja pariksi normaalilta näyttäviä peräsuolen limakalvon, ja tiedot analysoitiin sokkona.

Olemme tietoisia kuitenkin joitakin rajoituksia tämän tutkimuksen. Ensinnäkin, RNA-näytteet eivät olleet käytettävissä suorittamaan rinnakkain ilmaisun analysoi ja todentaa biologinen merkitys geenin promoottorin metylaation. Tästä huolimatta on olemassa suuri määrä todisteita, jotka MethyLightTM määritykset tarjoavat erinomaisen korrelaatio promoottorin metylaation ja geenien vastaavissa kasvaimen asetuksista [11], [29]. Enemmän epävarmuutta on kuitenkin suhteessa arvoon nämä tulokset ei-neoplastisia kudoksia. Vaikka on ehdotettu, että epigeneettiset allekirjoitus syövät saattaa olla alkuvaiheen, normaali-kudoksessa kollegansa mahdollisesti mukana aloittamisen karsinogeenisia prosessi [14], on vielä epäselvää, jos sama raja-metylaation käytetään kasvaimen näytteen ( eli PMR ≥4) voidaan käyttää ei-neoplastisia kudoksia. Jotta päästäisiin eroon tämä rajoitus, saadut tulokset normaalilta näyttäviä peräsuolen limakalvo analysoitiin kahdella eri cut-off tasoa. Toiseksi, tämä tutkimus edustaa ehdokas-geeni, hypoteesi perustuva tutkimus, jossa pienempi määrä geenejä valittiin perusteella aiempien tietojen osoittavat niiden osallistumista peräsuolen syövän synnyn kautta metylointi välittämän geenien, ja todisteet vähenevä asteen hypermetylaation keskuudessa kasvain, peritumor normaalilta näyttäviä peräsuolen limakalvon, ja normaali peräsuolen limakalvo ei-kasvain yksilöitä. Päätarkoituksena tämä lähestymistapa oli tarjota proof-of-concept mahdollisista osallistuminen geenin promoottorin hypermetylaatio in kasvainten lukumäärää sijaan tunnistaa epigeneettiset allekirjoituksen taustalla prosessi. Saavuttaakseen tämän jälkimmäisen tavoitteen, suurikapasiteettisten tekniikoiden kanssa genomin laaja ominaisuus tarvitaan, lähestymistapa käynnissä laboratoriossamme. Kolmas arviointi normaali-näkymästä peräsuolen limakalvon rajoittui peritumor alue useimmissa tapauksissa, koska useimmat näytteet on saatu kirurgisista näytteistä. Tämä näkökohta vastaista yleistäen saatujen tulosten näennäisesti normaalin limakalvon koko paksusuoli. Todellakin, silmiinpistävää paksusuoli segmentti-eroja yleisyydessä metyloinnin joidenkin geenien (eli

MLH1

ja

MGMT

) on havaittu [14]. Miten tämä hajonta malli vaikuttaisi mahdollinen käyttö metylointianalyysi CRC riskinarvioinnissa ja sen seurauksena otaksuttu metylointi perustuva seulonta ja valvonta strategioita, arvioidaan parhaillaan.

näkökenttäpuutoksesta välittämä

MGMT

geenin promoottorin metylaation on aikaisemmin ehdotettu [12]. Että uraauurtava tutkimus, hypermetylaatiota

MGMT

geenin havaittiin 46% kasvainten sekä 50% normaalista esiintyy paksu- ja peräsuolen limakalvon näytteitä potilaista, joille

MGMT

promoottorin metylaation todettiin vastaavassa kasvain. Toisessa tutkimuksessa, osallistuminen DNA: n metylaation viiden CIMP-geenistä promoottorit, mukaan lukien

MGMT

, tutkittiin myös kuuden synkroninen karsinooma paria [30]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että vaikka jotkut kasvain paria osoitti ristiriitainen metylaation, toiset osoittivat samanlaisia, mutta ei täysin identtinen, profiilit promoottorin metylaation, mikä viittaa siihen, että epigeneettiset muutokset synkronisessa CRC todennäköisesti sekä satunnaisia ​​ja sattumanvaraisen osia [30]. Äskettäin Konishin

et al.

Löytyi huomattavia eroja metylaatio välillä useita kasvaimia verrattuna yksinäinen vaurioille

MGMT

(26,5%

vs.

17,3%; p 0,05) ja

P14

(16,1%

vs.

9,3%; p 0,05) [31]. Mielenkiintoista, nämä kirjoittajat löysivät merkittävän korrelaation metylaation erilaisten geenien, kuten

MGMT

, välillä kasvain paria samassa paikassa (proksimaalinen

vs.

Distaalinen). Valitettavasti tämä mielenkiintoinen kysymys voi vain osittain käsiteltävä tutkimuksemme jälkeen, koska suunnittelu EPICOLON projektin, vain yksi kasvain näyte kerättiin useimmille potilaille on synkronoivat CRC, mikä rajoittaa tämän pareittain verrattuna 6 potilasta. Vaikka positiivinen korrelaatiot

MGMT2

ei ollut tilastollisesti merkitsevä (johtunee vähäisestä määrästä pariksi kasvainten käytettävissä), meidän tulokset ovat yhdenmukaisia ​​saadut tiedot Konishin

et al.

[31 ], tukee oletusta, että potilaalla on useita kasvaimia osoittavat yhtäpitävät metylaatio niiden tuumorikudoksissa. Aivan viime aikoina on uraauurtava julkaisu, LINE-1 metylaatiotasoilla olivat merkittävästi korreloivat 10 synkroninen CRC paria, mikä vahvistaa hypoteesia kentän vaikutus [32].

Metylointi liittyvä inaktivointi

RASSF1A

on usein havaittu useissa ihmisen maligniteettien lukien satunnaista CRC [33], [34], [35], [36], [37]. Todellakin, kasvain promoottori hypermetylaatiota

RASSF1A

esiintyy noin 20%: CRC, ja se näyttää olevan olemassa toisensa poissulkevia suhdetta läsnäolo

KRAS

mutaatioita [34], [35]. Mielenkiintoista, kasvaimissa mismatch korjaus puutos, ei havaittu merkittäviä eroja siinä, kuinka usein

RASSF1A

metylaatio välillä epävakaa satunnaista CRC ja kasvaimet liittyvät Lynch oireyhtymä [37]. Edellä mainittu tulokset [32], sekä esittelyn

RASSF1A

metylaatio Tuumorinäytteissä potilailta useita leesioita, ja puute muiden tekijöiden erojen altistava kasvainten lukumäärää (eli suvussa) suosia hypoteesi piilevän epigenetic vika. Se, onko tämä metylaatio perustuvan geenien mekanismi on potentiaalinen kentän vaikutus johtuu tunnistamattomasta molekyylitason muutos normaalissa limakalvon tai ilmentymisen ennestään useita hyperplastic polyypit, josta CRC syntyy läpi sahalaitaiset reitin [38], koska se on ollut ehdotti äskettäin [32], on edelleen tuntematon.

Kuten mainittiin, poikkeava metylaatio joidenkin CpG-saarekkeiden on nähty normaalilta näyttäviä peräsuolen limakalvo. Eräässä tutkimuksessa [13], tämä ilmiö osoitettiin

ERa

ja

myod

geenejä, sekä

P16 (INK4a) B,

MLH1

,

TIMP-3

ja

DAPK

geenit alemmalla tasolla. Mielenkiintoista, jotkut geenipolymorfismien liittyi alemman metylaation CpG-saarekkeiden tutki, mikä viittaa siihen, että geneettiset tekijät voivat vaikuttaa tähän epigeneettiset muutos normaalissa peräsuolen limakalvolla [13]. Fysiologisen tilan, johon liittyy poikkeava promoottori metylaation näennäisesti normaalin peräsuolen limakalvo on myös äskettäin arvioitu suhteessa kahden DNA-korjaus geenejä,

MLH1

ja

MGMT

[14]. Tässä tutkimuksessa näytteet miehillä ei osoittanut johdonmukaista kaavoja joko promoottoria, mutta esiintyvyys

MLH1

ja

MGMT

metylaatio kasvoi merkittävästi iän myötä, etenkin oikealla paksusuolessa, ja olivat yhdenmukaisia nykyinen epigeneettisellä profiilit CRC osajoukkoja.