Krooninen sairaus

tiivistelmä

Imusolmuke etäpesäke osoittaa huonon ennusteen ruokatorven syöpään. Ymmärtää taustalla olevien mekanismien, useimmat tutkimukset toistaiseksi keskittyneet tutkii kasvaimia itse ja /tai tunkeutuu imusolmukkeet. Kuitenkin ne laiminlyödään potentiaalia tapahtumien sisällä metastaattinen markkinarako, jotka edeltävät hyökkäystä. Kirjoittajat raportoivat ensimmäisestä kuvaus näistä asetusten potilailla transkriptio tasolla. Me määritelty transcriptomic profiilit vielä metastaasit vapaan paikallisiin imusolmukkeisiin kahdelle potilasryhmille: potilaat luokitellaan PN1 (n = 9, metastaattisen solmut olemassa) tai pN0 (n = 5, ei metastaattisen solmut olemassa). Kaikki tutkittu imusolmukkeet, myös niillä, PN1 potilaista, olivat edelleen metastaasit-ilmaiseksi. Tulokset osoittavat, että alueellinen imusolmukkeiden PN1 potilaiden poikkeavat ratkaisevasti kuin pN0 potilaista – jopa ennen etäpesäke on tapahtunut. Vuonna pN0 ryhmässä selvä immuunivasteen kuvioita havaittiin. Sen sijaan, imusolmukkeiden PN1 ryhmän nähtiin selvää profiilia pienentää immuunivasteen ja pienentää leviämisen, mutta lisääntynyt apoptoosi, parannettu hypoplasia ja morfologiset muuntamisprosesseissa. DKK1 oli merkittävin liittyvän geenin molekulaarisia mekanismeja tapahtuu imusolmukkeiden kärsivien potilaiden etäpesäke (PN1). Oletetaan, että kaksi molekyylitason profiileja havaittiin muodostavat eri vaiheissa etenevä sairaus. Lopuksi ehdotamme, että DKK1 voisi olla tärkeä rooli johtavien mekanismien imusolmuke etäpesäke.

Citation: Otto B, Koenig AM, Tolstonog GV, Jeschke A, Klaetschke K, Vashist YK, et al. (2014) Molecular muutokset Pre-Metastasoitunut imusolmukkeisiin ruokatorven syöpäpotilaille. PLoS ONE 9 (7): e102552. doi: 10,1371 /journal.pone.0102552

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 08 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 21 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Otto et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki microarray tiedot on talletettu NCBI GEO julkisen arkiston ja pääsee hakunumerolla GSE51021.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin Stiftung für Pathobiochemie und Molekulare Diagnostik, Deutsche Vereinte Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ruokatorven syöpä (ESC), imusolmuke etäpesäke liittyy huonoon ennusteeseen. Aikana kasvainsolujen vaeltamista kautta imusuonten ja aikana itseohjautuva imusolmukkeissa, nämä tuumorisolut päästä läheiseen kosketukseen endoteelisoluihin ja imusolmuke sinus. Kasvain laajennus hetkellä muodostaa tärkeimmän perustan hoidon valinnassa. Mutta siitä huolimatta ennustearvo merkitystä lymphogenic etäpesäkkeitä, molekyylimekanismeja taustalla metastaattinen reitin ovat vielä enimmäkseen tuntemattomia.

Useat tutkimukset selvitettiin molekyyliprofiilien kasvainten [1] – [4] ja /tai metastaattinen imusolmukkeiden. [5] Jatkotutkimuksissa tutkittiin lymphogenic etäpesäke korrelaatio imusuonten angiogeneesin [6] – [9] ja kemokiinin liittyviä [10] – [12] maahanmuuttoa. Oletettiin, että suunnattu migraatio ruokatorven syöpä soluja voidaan ohjata paikallisesti ilmaistaan ​​kemokiinit. [12] Ja näiden havaintojen perusteella olisi kuviteltavissa, että itseohjautuva prosessi imusolmukkeisiin voisi avustaa lektiini-glykaanitähteen-vuorovaikutukset kasvain solut ja imusolmukkeiden endoteelisoluissa. Hirakawa ym. [13] osoittivat, että hiirillä jo ennen metastasizing, primaarikasvainten (ihosyöpä) saattaa stimuloida vartijaimusolmukkeiden imusuonten. He ehdottivat, että ensisijainen kasvaimia voisi kyetä valmistelevat tulevia metastasoitunut kapealla tuottamalla imusuoniston tekijöitä, jotka saattavat välittää niiden tehokas kuljetus vartijaimusolmukkeista.

Silti sen tekijöiden parhaan tiedon ei ole julkaistu teos nimenomaisesti tutkimalla varhainen molekyylitason mekanismeja tässä metastaattisen kapealla potilailla – mekanismeja kuin vaikuttanut imusolmukkeissa, jotka voivat levittää tai tukahduttaa varhain etäpesäkkeitä potilailla, jotka kärsivät ESC.

tämän tutkimuksen tarkoituksena siis oli nimenomaan tutkia nämä varhaiset muutokset imusolmukkeisiin ennen histopatologisesti havaittavissa etäpesäkkeitä. Työ on ajanut oletusta, että ennen kasvainsolujen etäpesäkkeitä alueellisiin imusolmukkeisiin, merkittäviä muutoksia on jo tapahtunut lisäys tai tukahduttaa itseohjautuva prosessi. Saada käsityksen tähän prosessiin, keräsimme kasvain alue- ja etäinen imusolmukkeet sairastavat ESC järjestetään niin pN0 (ei metastaattinen solmuja olemassa) tai PN1 (metastasoitunut solmut olemassa). Kaikki imusolmukkeet mukana analyysissä oli etäpesäkkeitä vapaa – riippumatta potilaan lavastus. Suoritimme microarray analysoi ja tutki mekanismit liittyvät geenit ilmentyvät differentiaalisesti alueellisten ja kaukaisten imusolmukkeisiin saman potilaan.

Avain työmme tässä on kaksi ominaisuuksia. Ensinnäkin, kaikki analysoitiin imusolmukkeet poikkeuksetta jopa entisten PN1 potilaat olivat vielä vapaana etäpesäkkeiden. Toiseksi, käytimme näytteitä potilaista, joille ei suoriteta mitään neoadjuvant radio-kemoterapiaa ja vakiintunut edelleen menettelyjä, jotka taataan erittäin korkea näyte laatu.

Materiaalit ja menetelmät

Yleinen analyysi työnkulun

mukana potilasta kärsi ruokatorven syöpä ja tehtiin radikaali thoraco vatsaontelon en-blokin esophagectomy lukien imusolmukedissektiossa ylemmän ja alemman välikarsinassa (R0 resektio) ilman neoadjuvant radio-kemoterapiaa. Olemme mukana vain imusolmukkeisiin potilailta järjestetään niin pN0 (paikallisiin imusolmukkeisiin vapaa etäpesäkkeiden) tai PN1 (alueellinen imusolmukkeiden etäpesäkkeiden läsnä) ja tarkasti histopatologisella että imusolmukkeiden valittu analyysimme olivat kaikki kasvainsolun ilmaiseksi. Olemme myös vahvistaneet immunohistologialla että nämä imusolmukkeet olivat vapaita mikro-etäpesäke. Me eristetty kustakin imusolmukkeesta yhteensä RNA mikrosirujen ilmentymisanalyysiä. Parillisten T-testiä käytettiin geenien tunnistaminen, jotka ilmentyvät differentiaalisesti alueellisten ja kaukaisten imusolmukkeisiin ja toimiva rikastamiseen ja verkko analyysi suoritettiin. Myöhemmin suuri ehdokkaita validoitu kautta reaaliaikainen PCR ja DKK1 validoitiin lisäksi kautta immunohistologisilla värjäystä.

Koejärjestely

Tavoitteena työssä esitetään tässä oli tunnistaa mahdolliset tekijät helpottavat ja ajo etäpesäkkeiden imusolmukkeisiin kärsivien potilaiden ruokatorven syöpä. Jotta tällainen käsitys kokeen suunnittelu (Fig. 1) on sisällytetty kaksi muuttujaa kohteisiin.

Imusolmukkeet kahden eri potilasryhmien kärsii (PN1) tai kärsimystä (pN0) alkaen imusolmuke etäpesäke tutkittiin. Kustakin potilaan paikallisiin imusolmukkeisiin (vieressä kasvain) verrattiin kaukaisiin imusolmukkeisiin (viite kuin lähtötilanteessa). Avain kokeilu on, että

kaikki

tutkittu imusolmukkeet, mukaan lukien PN1 potilasta, tehtiin varmasti vielä vapaana etäpesäkkeiden sekä mikro-etäpesäkkeitä.

Ensimmäinen, näytteet luokitellaan pääasiallisen tilan potilaalla ilmenee (PN1 ryhmä) tai ei-näytteille (pN0 ryhmä) etäpesäke alueellisiin imusolmukkeisiin. Vertailu PN1 ja pN0 potilaiden tulee esiin yleinen erilaisia ​​sääntöjä, jotka saattavat johtaa tai ehkäisevät etäpesäkkeitä.

Toiseksi kaksi imusolmuke kerättiin kullekin potilaalle, yksi solmu sijaitsee lähellä kasvain (alueellinen ) ja toisen solmun kaukana kasvaimen. Vaikka kaukainen solmut toimi vertailunäytteellä alueellinen solmut tutkittiin transkription määräyksiä. Pareittain vertailu kasvaimen kaukaisten näytteiden potilaan erityisten aluesolmujen pitäisi paljastaa varhaisessa asetukset mahdollisesti johtuvat sijainti lähellä kasvain. Tässä julkaisussa termiä ”ylössäätöä” käytetään niille geenien ja toiminnot, joilla on korkeampi ilmaisun paikallisiin imusolmukkeisiin verrattuna kaukaisiin imusolmukkeisiin. Toisaalta, nämä geenit ja toimintoja, jotka laskivat imusolmukkeisiin, kutsutaan ”alassäädetty”.

On tärkeää huomata, että kaikki solmut tutkittu tehtiin varmasti vielä metastaasit vapaa, riippumaton potilaiden ”PN1 /pN0 luokittelu ja sijainti suhteessa kasvain. Tämän pitäisi mahdollistaa tunnistamisen varhaisen muutoksiin

ennen

etäpesäkkeiden itseohjautuva.

eettinen toimikunta hyväksynnän potilaat suostumus

Tämä tutkimus tehtiin mukaisesti määräysten ja hyväksyi Hamburg eettinen komitea, Saksa, alle ääni määrä PV3548. Potilaat kirjallinen suostumus osallistua tutkimukseen kerättiin mukaisesti määräysten.

Näyte

Yleisesti näytettä 22 potilailla, joilla on ruokatorven syöpä analysoitiin joista 14 näytteen paria näytteillä riittävä näyte laatu. Jokaisen potilaan näytteestä paria kasvaimen lähellä ja kasvaimen kaukainen imusolmukkeet kerättiin vähentää yksilöiden välisiä eroja, jotka saattavat johtua erilaisista geneettistä taustaa. Imusolmukkeet heti leikeltiin heti louhinnan operaatioon huoneeseen. Segmentit, jotka omistettu microarray ilmaisun analyysi oli kuljetetaan suoraan nestetyppeen laboratorioon RNA. Toinen osa imusolmukkeiden upotettiin parafiiniin luokittelua ja diagnosointia.

Toimintatapa

Kun histologista diagnoosin ruokatorven syöpä, varhaisvaiheen potilaiden leesioita (pT1a) saatettiin kirurgian jos joko endoskooppinen resektio oli puutteellinen tai kasvain oli lavastettu kuin pT1b. Potilaita suoraan viitataan leikkausta, jos ennen leikkausta lavastus oli epäilyttävä joko lihasten seinän osallistuminen (CT2) tai imusolmuke osallistuminen (CN1). Yksikään potilas ei jätettiin neoadjuvant terapia.

Kaikki potilaat saivat mediaani T-muotoinen laparatomy ja oikeanpuoleinen thoracotomy. Potilaille, joilla kaulus anastomosis ylimääräinen vasemman puoleinen cervicotomy kauluksen anastomosis suoritettiin. Jokainen potilas sai radikaali yhtenä ryhmänä esophagectomy kanssa resektio ruokatorven, rintakehä kanavaan, azygos suoneen, ipsilateral keuhkosairaudet, ja kaikki periesophageal kudos taka välikarsina. Jälleenrakennus tehtiin mahaletkun tai paksusuolen väliin yleensä suurella rintaonteloon tai kohdunkaulan anastomosis.

Lisäksi standardoitu kahden kentän imusolmukkeiden suoritettiin. Kaikki imusolmukkeet järjestelmällisesti näytteet kahdeksalla paikkakunnalla: alueellinen välikarsinan, sekä läheisyydessä kasvain ja kaukana siitä; infraclavicular; pallea (alempi välikarsinan); perigastric imusolmukkeet (myös vasen ja oikea sydänpussin); yhteinen maksavaltimo imusolmukkeiden; ja imusolmukkeiden klo keliakia runko. Kaikki solmut kartoitettiin kirurgi man mukaisesti American Thoracic Societyn muuttama Casson ym. [14] Kaikki resektoitiin näytteet arvioitiin vanhempi patologi.

Leikkauksen jälkeinen seuranta toteutettiin osa tavanomaisia ​​jälkihoidon. Potilaat nähtiin poliklinikalla on 3- 4 kuukauden välein 2 ensimmäisen vuoden aikana ja 6 kuukauden välein. Seuranta arviointi sisältyvät lääkärintarkastus, tavallinen Rintakehän röntgenkuvaus, vatsan ultraääni, tähystys, endosonography, CT rinnassa ja vatsan, ja PET-TT jälkeen tammikuun 2006 valikoiduissa tapauksissa, CEA ja CA 19-9 tuumorimarkkeri tutkimuksia, ja luuston kuvauksissa . Aina uusiutumisen epäiltiin, ylimääräisiä radiologisten, endoskooppinen tai histologista vahvistusta haettiin.

uusiutuminen diagnosoitiin jos todistettu biopsialla tai yksiselitteinen näyttöä kasvainmassoja (äskettäin näkymisen etäpesäkkeitä tai paikallisen uusiutumisen), joilla on taipumusta kasvaa aikana jatkotoimia ja /tai seurantaan kuolemaan asti. Uusiutuva sairaus määriteltiin joko Paikallista (esiintyy ylävatsassa tai välikarsina) tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä.

mikrometastaasin värjäystä

hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys käytettiin kasvainsolujen havaitsemiseksi ensimmäisessä diagnostinen askel . Histologisesti ”kasvain-free” imusolmukkeiden seulottiin sitten immunohistokemiallisesti käyttäen anti-sytokeratiini-vasta-aine AE1 /AE3 (Dako, Glostrup, Tanska) laimennettuna 1:50 (v /v), jonka biotiini-streptavidiini-menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [15]. AE1 /AE3 on cocktail kahta vasta-ainetta, joka tunnistaa emäksisiä että happamia CK: n pinnalla ja sytoplasmassa kaikkien epiteelisolujen (paitsi parietaalisoluissa, maksasoluissa, ja pintakerroksiin levyepiteelin). Vasta-aineet eivät reagoi mesenkymaalisten kudosten, mukaan lukien imukudoksen [16].

formaliinilla ja parafiiniin osat 5-6 um paksuus leikattiin kolmella eri tasolla kussakin solmussa ja parafiini standardin histologisia tekniikoita ja siirrettiin lasilevyille, käsiteltiin 3-triethoxysilylpropylamin (Merck, Darmstadt, Saksa). Yksi osa näytettä saadaan kullakin tasolla värjättiin käyttäen alkalisella fosfataasilla anti-alkalinen fosfataasi tekniikka yhdistettynä uuteen fuksiinia tahra (Sena, Heidelberg, Saksa) visualisointiin reaktio [17].

Osiot normaalien paksusuolen limakalvon toimi positiivista värjäytymistä valvonta ja isotyyppiyhteensovitettu, merkityksetön hiiren monoklonaalisia vasta-aineita toimi negatiivisena kontrollina (puhdistettu immunoglobuliini hiiren myeloomaproteiinia IgG1, Sigma, Deisenhofen, Saksa).

levyt arvioitiin pidennetyn menettelyssä kaksi riippumatonta tutkijat. Mikäli incongruent havaintojen kolmannen tutkija on kuultu, ja yhteisymmärrykseen päätettiin. Minimaalinen kasvainsolun osallistumista imusolmuke, joka pidettiin kasvaimeen vapaa tavanomaisten histologisten värjäys määriteltiin läsnäolon yhdestä kymmeneen positiivisten solujen kehon solmun.

Näytteiden valmistus ja puhdistus

eristäminen RNA: n nestemäisellä typellä jäädytetty imusolmuke näytteitä suoritettiin Trizol Invitrogen mukaan valmistajan protokollan (Ilm päivämäärä 12. kesäkuuta 2007 mennessä) ja puhdistettiin jälkeenpäin Qiagen RNeasy-Mini-Kit. Pitoisuudet määritettiin PeqLab NanoDrop fotometri ja RNA laatu kapillaarielektroforeettisesti käyttämällä Agilent Bioanalyzer 2100 System. Niistä 22 näytteestä paria 9 paria potilaalla on havaittu kaukana etäpesäkkeitä ja 5 näytteen paria potilailla, joilla ei ole kaukana etäpesäke havaittu osoitti RNA laatu riittää seuraava analyysi.

mikrosiruanalyysi

Microarray kokeet suoritettiin käyttäen Affymetrix ihmisen koko genomin GeneChips U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, USA) valmistajan protokollan. Valmistamiseksi RNA ilmaisun taulukot cDNA-synteesi edelliseen fotometrisiä määrittämiseksi RNA-pitoisuus oli suoritettu. Seuraavat vaiheet suoritettiin käyttäen 250 ng kokonais-RNA: ensimmäisen juosteen synteesiin. Näytteen valmistus sisällytetty vaiheet cDNA-synteesin, puhdistuksen, synteesi biotiini-leimattua cRNA, in vitro transkriptio, pirstoutuminen, hybridisaatio sekä pesu- ja värjäystä. Valmiste suoritettiin yksi sykli pöytäkirjan käyttämällä GeneChip- 3 ’IVT Express Kit Affymetrix. Sillä Hybridisaatio 12,5 ug hajanainen cRNA käytettiin. Taulukot inkuboitiin 16 tunnin ajan, että Affymetrix Hybidization Uuni 640 45 ° C: ssa. Pesu ja värjäys vaiheet tehtiin puoliautomaatti että Affymetrix Fluidics Station 450, yhden askeleen jälkeen Affymetrix Yksi Cycle Protocol vakio taulukot. Pesun ja värjäämällä taulukot skannattiin käyttäen Affymetrix GeneChip- Scanner 3000 7G ja komentokonsoli ohjelmisto aallonpituudella 570 nm ja pikselikoko 1,56 pm.

Tilastollinen

Imusolmukkeet sekä potilasryhmien (pN0 ja PN1) analysoitiin erikseen. Koska painopiste työstä olivat varhaisia ​​muutoksia edellisen etäpesäke, vain metastaasit vapaa imusolmukkeet analysoitiin. Kasvain kaukainen imusolmuke näytteitä käytettiin referenssinä pariksi paikallisiin imusolmukkeisiin.

Taustakorjaus ja normalisointi suoritettiin käyttäen RMA menettelyä ja quantile normalisointi. Parillisten T-testillä näiden kahden ryhmän (pN0, PN1) suoritettiin ja bootstrapping menettely suoritettiin säätää vääriä positiivisia määräyksiä. Koska sulku arvot korjatun p-arvo 0,05, raaka p-arvo 0,01 ja signaali-log-suhde (SLR) on ± 0,7 määrittämiseen käytettiin alkuun säännelty geenejä.

jälkeen ero geenien ilmentyminen analyysi suoritimme geeniperimä rikastamiseen ja verkko analyysi Ingenuity Pathway Analyysiohjelmisto (Ingenuity Systems, versio 162830). Sillä analyysi korjatun p-arvo raja asetettiin lievempi arvo ± 0,1, jotta sisällyttämistä enemmän hienovaraisia ​​muutoksia.

Validation via RT-PCR

Kaksitoista määritetty kandidaattigeenit validoitu kautta RT-PCR: llä käyttäen kolmea teknistä rinnakkaista näytettä kohden. RT-PCR suoritettiin 96-kuoppaisilla levyillä on StepOne Plus Real Time PCR System Applied Biosystems. Kunkin näytteen 2 ui, jonka pitoisuus on 5 ng /ul käytettiin. Jotta voidaan ottaa huomioon vaihtelut näytteen konsentraatio Beta-2-mikroglobuliini (B2M) otettiin taloudenhoito viitteenä. Määrittämistä varten asetusten ilmentymistaso keskiarvo kolmesta teknisestä toistojen ”delta-Ct-arvot laskettiin. Muutosten merkittävyyttä määritettiin käyttäen parillista t-testiä välillä kasvaimen lähellä ja kasvaimen kaukainen keskimääräisen delta-Ct-arvoista kussakin ryhmässä (pN0, PN1).

DKK1 immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin parafiinileikkeillä tutkittujen imusolmukkeiden käyttämällä polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034). Immunohistokemialliseen havaitsemiseksi osat poistettiin parafiini, vedettömät, ja esikäsitelty 0,1% pronaasilla, 10 min entsymaattista antigeenin paljastumista. Inkuboinnin jälkeen 3% vetyperoksidia 15 minuutin ajan endogeenisen peroksidaasi- aktiivisuuden peittämiseksi ja inkuboimalla 5% BSA: ssa 30 minuuttia estää ei-spesifisen vasta-aineen sitoutumisen primaarinen vasta-ainetta. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa. Biotinyloitu toissijainen vuohen anti-kani-IgG (1:200, Dako Cytomation) käytettiin, jota seurasi inkubointi streptavidiini /HRP (1:200, Dako Cytomation), kuten kolmasosaa vasta-aine. Peroksidaasiaktiivisuuden havaittiin käyttäen DAB kromogeenisubstraattia (Dako Cytomation). Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty. Kuvat koottiin Zeiss Mirax MIDI dia skanneri (Zeiss) ja kuvat otettiin kiinni käyttäen Pannoramic Viewer ohjelmalla.

Tulokset

Etäpesäke vapaa paikallisiin imusolmukkeisiin vaihtelevat PN1 ja pN0 potilaiden transcriptomic taso

kysytään a) metastaattinen paikkansa imusolmukkeisiin voi vaikuttaa jo ennen etäpesäke on tapahtunut ja jos b) vielä metastaasit vapaa imusolmukkeisiin PN1 potilaat saattavat olla partaalla metastaattisen invaasion kuin niille pN0 potilaiden ja jos c) siis ne ”PN1” imusolmukkeiden voisi esiintyä erillisten transkription sääntelyn purkaminen liittyvät kapealla valmisteluun.

sisältyvät kasvain paikallisiin imusolmukkeisiin 14 ruokatorven syöpä potilailla (n = 9 PN1 potilaita; n = 5 pN0 potilasta) tutkia geenin ilmentymistä mahdollisten metastaattisen kapealla. Lisäksi keräsimme pariksi kasvain kaukainen imusolmuke jokaisesta potilaasta toimia referenssinä aluesolmujen (Fig. 1). Sen jälkeen ne analysoitiin transcriptomic tasolla sirutekniikalla.

Avain työ esitetään tässä on se, että kaikki solmut tutkittu varmistettiin olevan histopatologisesti ja immunohistologisesti etäpesäke ja mikrometastaasin-vapaa, riippumaton potilaiden PN1 /pN0 luokittelu ja ja sijainti suhteessa kasvain. Tämän pitäisi mahdollistaa tunnistamisen varhaisessa muutoksiin

ennen

etäpesäkkeiden itseohjautuva. Tietoa potilaiden ikä, sukupuoli, histologia tai luokituksia annetaan taulukossa S1.

Tunnistaa mahdolliset ennalta invasiivisia muutoksia vertasimme paikallisiin imusolmukkeisiin kanssa kaukaisiin imusolmukkeisiin käyttämällä pariksi T-testi sisällä kaksi ryhmää (pN0, PN1). Kasvain kaukainen imusolmukkeet toimi referenssinä aluesolmujen, niin että ajan asetukset kuvaavat näitä geenejä, joilla on suurempi ekspressiotaso aluesolmujen ja alas-asetukset vastaavasti niitä geenejä, joilla on alempi ekspressiotason. T-testi seurasi bootstrapping menettely huomioon useita testejä. Koska sulku arvot korjatun p-arvo 0,05, raaka p-arvo 0,01 ja signaali-log-suhde (SLR) on ± 0,7 määrittämiseen käytettiin alkuun säännelty geenejä. Merkittävimmät ehdokkaat tunnistetut esitetään taulukossa 1, täydelliset tilastot on esitetty taulukossa S2.

Kun näitä kynnysarvoja tunnistimme 173 selostukset (128 geenit) merkittävästi säädellä alueellisten ja kaukaisten imusolmukkeisiin of pN0- luokiteltu potilaille. Useat näistä geeneistä liittyi immuunivasteeseen (kuten CD64, CD32,

FPR1

ja

FPR2

, [18]

IGHG1

,

IL1R2

CCL23

,

MSR1

,

C5AR1

,

LILRA5

, [19] tai

LILRB2

[20]). Mielenkiintoista pari syövän ja etäpesäkkeiden liittyviä geenejä vapautui sekä (kuten

L1CAM

(CD171), [21]

ereg

, [22], [23]

NOVA1

,

HPR

, [24] tai

LAMC2

[25], [26]). Epiregulin, esimerkiksi on angiogeeninen tekijä, joka voi edetä etäpesäke mahdollistamalla kasvainsolujen rikkomaan keuhkojen endoteelin esteitä ja puolestaan ​​vapauttamalla heidät kierrätysjärjestelmään [22], [23].

Sen sijaan tunnistimme 134 säädeltyyn selostukset (109 geenejä, mukaan lukien

IGF1-

,

DKK1

,

PRIMA1

ja

LTF

) alueellisessa imusolmukkeisiin PN1-luokiteltujen potilaille. Niistä geenit pro-proliferatiivisia ja antiapoptooppinen molekyylit alassäädetty – kuten

IGF1

ja

LTF

jotka toimivat säätelyn kautta AKT-signalointireitin [27] ja ERK1 /2-reitin [28] vastaavasti. PRIMA1 moduloi CXCR4 ilmaisun [29] – molekyyli, joka jo on kuvattu korreloivan voimakkaasti lisääntynyt imusuonten etäpesäkkeitä [11], [12], [29].

Erityisesti

DKK1

näytteillä merkittävin sääntelyn (2-kertainen muutos, p-arvo 0,0029). Geeni selvästi alassäädetty alueellisissa imusolmukkeissa PN1 potilaista. DKK1 on WNT estäjä, jonka on osoitettu olevan prognoosi- merkitystä erilaisissa kasvaimen yksiköt, kuten rintasyöpä, keuhkosyöpä, myelooma mutta myös ruokatorven syöpä. [30] – [38] Lisäksi DKK1 on raportoitu olevan koholla seerumin TSK potilaista [37].

validoitu 12 merkittävimpiä geenien kautta RT-PCR: llä (Fig. 2). Viidellä näistä geeneistä (

ISL1

,

LAMC2

,

NOVA1

,

ereg

,

L1CAM

) asetuksen taipumuksia ja vahvuuksia vahvistettiin vaikka p-arvot määritetään PCR-analyysi vaihteli 0,08 ja 0,15, luultavasti johtuen pienestä näytteen koosta. Seitsemän geenit (

IGF1-

,

IGFBP5

,

DKK1

,

LTF

,

TBX3

,

FOXG1

LILRA

) voitaisiin vahvistaminen onnistui osoittaa merkittävää p-arvo on alle 0,05. Korkein merkitys (p-arvo 3 * 10e-4) havaittiin jälleen

DKK1

(katso taulukko S3).

Näkyy signaali-log-suhteet paikallisiin imusolmukkeisiin verrattuna kasvaimeen kaukainen imusolmukkeiden (viite) valitun joukon top säännelty geenejä.

mennessä seurannan analyysi viisi PN1 potilasta oli kuollut sekä yksi pN0 potilaalle. Jälkimmäinen Potilas oli näytteillä keuhkometastaasitestissä on seurantatutkimuksessa. Mielenkiintoista tämä potilas muodostaa Peränpitäjänä kannalta

DKK1

ilmaisu osoittaa alassäätöä alueellisissa imusolmukkeissa.

tulokset Tässä osassa kuvatut osoittavat, että nämä etäpesäke vapaa PN1 imusolmukkeiden näytteille geeni määräykset selvästi poikkeavat pN0 imusolmukkeisiin. Lisäksi ne osoittavat, että DKK1 voidaan merkittävästi liittyy taustalla olevien mekanismien.

toiminnalliset kuviot pN0 ja PN1 näytteet ovat erillisiä, mutta tiiviisti kytketty

Näiden tulosten perusteella kysyimme, onko havaittu asetukset todellakin kuvaavat eri molekyylitason mekanismit – tai pelkästään eri edustajien samoja mekanismeja. Siksi suoritettiin geeniperimä rikastamiseen ja verkoston analysointi.

Koska otoskoko käytetty työmme on varsin pieni p-arvo jakelun vaikutetaan T-testi. Kun tämä otetaan huomioon ja mahdollistaa sisällyttämisen enemmän hienovaraisia ​​muutoksia, jotka kuitenkin saattavat lisätä iso kuva, päätimme käyttää lievempiä p-arvo ± 0,1 tunnistamiseksi säänneltyjen geenien mukaan analyysiin.

analyysi paljasti huomiota herättävän erilliset profiilit (Fig. 3) kuvaavat kasvaimeen viereisten imusolmukkeiden PN1 ja pN0 potilailla. Tulokset osoittivat selvästi aktivoinnin immuunivasteen mekanismeja pN0 ryhmässä. Säänneltyjen geenit liittyvät parannettu tulehdusvastetta, antigeenin esittelyn, vähentää solujen kasvua, immuunijärjestelmän solujen seuranta ja solu-solu-signaloinnin, kun taas lisääntymistä ja syöpään liittyvien mekanismien vähenivät.

näytetyt ovat biologisia ja molekyylien toimintoja ja alatoimintoja liittyviä geenejä säädellään paikallisiin imusolmukkeisiin verrattuna kaukaisessa imusolmukkeiden (viite) ja PN1 tai pN0 potilaille. Yksittäinen läpinäkyvä ympyrät kuvaavat tehtäväänsä värillinen (punainen: aktivoitu, sininen: inaktivoitu) piireissä sisällä kuvaavat merkittävästi rikastettu alatoimintoja (esim kuluessa PN1 solukuolema ympyrä: ”apoptoosin leukemian solulinjoja” – punainen, tai ”cell selviytyminen ’- sininen). Blue alatoimintoja on vahva ennustus inaktivoida, punainen alatoimintoja aktivoitava. Syvempi väri luotettavampia (z-pistemäärä) on aktivointi valtion ennustus. Koko piireissä kasvaa merkitystä (p-arvo) geenin listan yhdessä alatoimintoja. Analyysi suoritettiin Ingenuity Pathway Analyysiohjelmisto. On selvästi nähtävissä, että metastaasin-free alueellisten imusolmukkeiden PN1 potilailla on täysin eri asetus-kuvio, että ne pN0 potilailla.

Toisin alueellisiin imusolmukkeisiin ja PN1 potilailla osoitti vähentäminen immuunijärjestelmän vaste liittyvät mekanismit (Fig. 3). Lisäksi alemmat leviämisen sekä vähennetään kudoksen rakenne, morfologia ja kehitys havaittiin toisaalta – ja tehostettu apoptoosin ja hypoplasia toisella. Aika viisasta olisi odotettavissa, että nämä imusolmukkeet olisi lähempänä pisteeseen metastaattisen invaasion joten oli yllättävää, että immuunivaste ompeleen alassäädetty.

Lisäksi analyysi ennusti inaktivointi β-kateniinin ja loppupään sääntelyviranomaisten (Fig. 4a). Tärkeimpiä β-kateniinin tavoitteita,

VEGFA

,

CCND1

,

MSX1

,

IGFBP5 ja DKK1

osoitti vähentynyt ilme mikrosirulla. Vaikka vain perustuu tilastollisiin todennäköisyyksiin, ennuste on merkittävä, koska aktiivinen β-kateniinin vaaditaan

DKK1

ilme. [39] Mahdollisuuksia passiivisuudesta β-kateniinin siis saattaa korreloivat havaittua alas-säätely

DKK1

.

verkko analyysi suoritettiin käyttäen Ingenuity Pathway Analysis ohjelmisto. a) Mekanistiset verkosto β-kateniinin loppupään sääntelyviranomaisten näyttämällä ennusti aktivointia valtion ja sääntelyn suhteen (aktivointi tai esto) väliin single sääntelyviranomaisten. β-kateniinin ja useita alavirran säätävät ennustetaan inaktivoituu. b) Analyysi osoittaa tiukka yhteyden geenien säädellään PN1 näytteistä (vaaleanharmaa solmut) ja niitä säädellään pN0 näytteistä (tummanharmaa solmut) yhdistää ERK1 /2 ja DKK1 upotettu verkkoon.

tutkia tarkemmin, miten liittyvät taustalla molekyylitason reitit ovat, olemme mukana geenin ilmentymisen määräyksiä havaittiin PN1 näytteistä (109 geenit) ja pN0 näytteistä (128 geenit) yhdessä yhteisessä luettelossa suorittaa verkon analyysi. Mielenkiintoista on, että vaikka selvä ero molekyylimekanismin profiilien välillä PN1 ja pN0 näytteiden analyysi paljasti, että useat mukana geenien (28/128 pN0 geenit; 19/109 PN1 geenejä) näytti tiukasti kytketty (Fig. 4b) sekä kautta ryhmät – kanssa DKK1 upotettu verkko.

yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että etäpesäke-vapaa paikallisiin imusolmukkeisiin ja PN1 potilaiden sovelletaan jo molekyyliprosessien erilaiset kuin pN0 potilaiden – vaikka etäpesäkkeitä ei ole vielä tapahtunut näissä solmuissa. Lisäksi osallistuminen

DKK1

sääntelyn kautta WNT /β-kateniinin reitin vaikuttaa uskottavalta. Siitä huolimatta molekyyli verkkoja taustalla näitä eri malleja voidaan liittää. ESC potilailla imusolmuke etäpesäke on vain ajan kysymys, ellei ajoissa tuumoriresektion suoritetaan. Siksi tuntuu uskottavalta, että havaitut transkription kuviot eivät korreloi täysin eri mekanismien vaan esittävät kaksi kertaa olevia etenevä prosessi.

DKK1 voidaan havaita selvä alirakenteisiin imusolmuke ja astiassa endoteelisoluissa

koska merkityksestä

DKK1

meidän tuloksia ja koska DKK1 on jo osoitettu olevan ennustetekijöitä lopputuloksen kannalta useista pahanlaatuinen kasvain yhteisöistä [30] – [38] keskityimme tämän molekyyli immunohistokemiallista validointi. Me värjätään parafiinileikkeillä tutkittujen imusolmukkeiden käyttämällä polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​DKK1 ja vastavärjättiin kohdat hematoksyliinillä. Immuunihistokemialliset värjäys paljasti taipumusta DKK1 on vähemmän ilmaistaan ​​alueellisella PN1 potilaiden imusolmukkeet (Fig. 5a). Vuonna DKK1 positiivinen imusolmukkeiden sen ilmentymistä voitiin selvästi havaita kapselinalaisessa sinus ja joissakin tapauksissa ulottuu välittäjän sinus ja trabekkelien (Fig. 5b). Lisäksi pari näytteitä DKK1 ilmentymistä ei voitu havaita astiassa endoteelisoluja (Fig. 5c).

Imusolmukkeet värjättiin käyttäen polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034) ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. a) edustaja DKK1 negatiivinen imusolmuke. Mitta-asteikko: 200 um. b) edustaja DKK1 positiivinen imusolmuke. Sub- kapsulaarisessa sinus on merkitty (I) ja välittäjän sinus ja luupalkkien kanssa (II). Mitta-asteikko: 200 um. c) DKK1 positiivinen verisuonten endoteelisoluissa. Mitta-asteikko: 100 um.

Keskustelu

Vaikka useat syövän ilmaantuvuus laski Yhdysvalloissa ja muissa länsimaissa viime vuosikymmeninä esiintyvyys ruokatorven adenokarsinooma on kasvanut. [ ,,,0],40] Yksi parametrit osoittavat taudin etenemistä on kasvain laajennus, että tällä hetkellä muodostaa perustan hoitoa valinnan.