Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

In vitro

aktivointi ja kasvua ensiarvoisen lepääviä munarakkuloita tuottaa fertilizable varhaismunasolujen olisi hyödyllinen väline hedelmällisyyden säilyttämiseen. Työllistymistä fosfataasilla ja TENsin homologi (PTEN) estäjiä, yhdistettynä proteiinikinaasi B (Akt) stimuloiva molekyylejä, on aiemmin käytetty lisäämään follikkelien aktivointi kautta stimulaation PTEN-Akt-reitin.

Methods

Pyrimme luomaan parannettu

in vitro

aktivointi myös syöpäpotilaille, joiden munasarjakudoksen jo kylmäsäilyttää. Tuore ja aiemmin kryosäilytetään ihmisen munasarja- aivokuori altistettiin lyhytaikaisia, alhaisen pitoisuuden ja munasarja-erityistä hoitoa vain PTEN estäjä.

Tulokset

in vitro

aktivointi protokolla parantaa aktivointi mekanismeja ensiarvoisen munarakkuloita sekä tuoreita ja kryosäilytetään näytteitä, ja suurentaa väestö kasvaa ilman aiheuttamaan apoptoosin joko follicles tai ympäröivään strooman. Hoito täydentää estradioli eritystä ja palauttaa ekspressiotasot aiemmin vähentynyt Anti-Muller hormonin avulla kylmäsäilytys menettelyjä. Genominen modulaatio suhteellisen ilmentymisen

PTEN

reitin geenien havaittiin käsitellyissä näytteissä.

Johtopäätös

in vitro

aktivointi protokolla tarjoaa uusia vaihtoehtoja potilailla, joilla kylmäsäilytetyt kudosta, koska se lisää käytettävissä elinkelpoisten aktivoitua munarakkuloita käytettävissä

in vitro

kasvun menettelyjä. Yhdistelmä munasarjakudoksen kylmäsäilytyksen ja

in vitro

aktivointi ensiarvoisen munarakkuloiden tärkein munasarjojen varauksesta komponentti, on merkittävä edistysaskel hedelmällisyyden säilyttämiseen.

Citation: Novella-Maestre E, Herraiz S , Rodríguez-Iglesias B, Díaz-García C, Pellicer A (2015) Lyhyen aikavälin PTEN estäminen parantaa

in vitro

aktivointi Primordial munarakkuloita, Säilyttää Follikulaarinen elinkelpoisuus, ja palauttaa AMH tasot Kryosäilötyt munasarjakudoksen syöpäpotilaista . PLoS ONE 10 (5): e0127786. doi: 10,1371 /journal.pone.0127786

Academic Editor: Wei Shen, Qingdao Agricultural University, Kiina

vastaanotettu: 12 tammikuu 2015; Hyväksytty: 19 huhtikuu 2015; Julkaistu: toukokuu 29, 2015

Copyright: © 2015 Novella-Maestre et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ on tuettu Grants SAF 2011-30031-CO2-01 ja FIS PI13 /02353 Espanjan talousministeriön ja kilpailukyky, jota Dexeus naisten Health Foundation Grant 2011 ja PROMETEOII /2014/045 ja GV /2014/115 alueellisen Valencian opetusministeriö. SH osallistuminen on tukenut avustuksen CD11 /00292 Espanjan talousministeriön ja kilpailukyvyn ja BRI AP-2010-0675 avustusta Espanjan opetus-, kulttuuri- ja urheilu. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Survival syövän jälkeen nuoruusiässä ja lapsuusiän on parantunut [1]. Näin suuri väestö nuorten naisten, jotka eivät ole täyttäneet lisääntymis- hanke, kärsii toissijaisia ​​vaikutuksia syövän hoidossa, kuten gonadotoksisuus. Tämä seikka, sekä se, että yhteiskuntamme viivästää hedelmällisessä iässä [2], merkitsee sitä, että hedelmällisyys säilyttäminen (FP) on yhä pyydetty, erityisesti nuorilla syöpäpotilailla.

Useita vaihtoehtoja on tällä hetkellä saatavilla naisten FP, kuten kylmäsäilytyksen varhaismunasolujen [3], alkioita [4], tai munasarjakudoksen [5-7].

munasarjojen aivokuori sisältää lepotilassa ensiarvoisen munarakkuloita ominaista niiden vastustuskyky jäädytys ja sulatus prosesseja. Koska nämä ominaisuudet, Kryosäilytysseoksen munasarjojen cortex myöhemmin autologiseen orthotransplantation on yleisimmin käytetty tekniikka säilyttää hedelmällisyyden syöpäpotilailla [8]. Lisäksi se on ainoa vaihtoehto lapsipotilailla, joilla ei ole kypsä oosyyteillä olla kylmäsäilytetyt, ja tapauksia hormoniriippuvaisten tautien [9, 10].

kokonaismäärä käytettävissä primordial follicles on, muiden tärkeiden kysymyksiä, tärkein tekijä varmistamaan FP menestykseen. Tämä voi vaarantua useat tekijät, kuten munasarjojen cortex koko, ikä, aikaisemmat kemoterapiaa, ja muut mahdolliset vaikutukset syövän naisten sukuelimiin. Se on jo julkaistu, että pahanlaatuisia kasvaimia, kuten rintasyövän, voivat myös vaikuttaa lisääntymiskykyyn lopputulokseen kuin munasarjojen varauksesta on heikentynyt nuorten naisten ituradan

BCRA1

mutaatioita [11]. Munasarjavaste Hallitun stimuloiva sykliä vähenee syöpäpotilailla, jo ennen kuin he saavat hoitoa [12]. Kuitenkin riski uudelleen käyttöön pahanlaatuisten solujen siirretyn kudoksen on tärkein huolenaihe munasarjojen kylmäsäilytys. Tämä haittavaikutus on suurentunut [13-15] potilailla, joilla on hematologisia syöpiä, kuten leukemia, yleisin maligniteetti lapsuuden [16]. Siksi uusi turvallisia vaihtoehtoja on kehitettävä optimoimaan munasarjojen varauksesta näillä potilailla jossa kylmäsäilytyksen ja elinsiirtoa munasarjojen cortex ovat vasta [17], tai lapsipotilailla, joilla ei ole kypsä varhaismunasolujen olla kylmäsäilyttää [18].

kuten edellisessä vaiheessa kasvua, primordial lepotilassa munarakkuloiden tärkein munasarjojen varauksesta komponentti [19, 20], on aktivoitava niiden kehitykseen ohjelma alkaa. Monipuolisia polkuja ovat mukana follicle aktivointi johdatukseensa ohjaus munasolun kasvun aloittamista ja ylläpito, kuten fosfataasi ja tensin homologin poistetaan kromosomissa 10 (PTEN), fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K), forkhead laatikko O3 (FOXO3), ja nisäkkään rapamysiinin kohde monimutkaisten 1 (mTORC1) [21-26]. Kuitenkin taustalla olevien mekanismien aktivoinnin ole tiedossa.

On raportoitu, että kasvu kaikkien ensiarvoisen rakkulat vastasyntyneiden ja aikuisten eläinten edistetään munasolu-erityinen poisto

PTEN

geeni [21, 24-26]. Tämä geeni koodaa fosfataasientsyymin joka säätelee negatiivisesti PI3K-proteiinikinaasi B (Akt) signalointireitin.

PTEN

poisto lisää Akt fosforylaation ja tumasta loppupään FOXO3 proteiinien [24]. Itse

FOXO3

geenideleetio- aktivoi myös kaikki lepotilassa munarakkuloiden hiirillä. Äskettäin, Li et al. 2010 [26] kehitti lyhytaikainen, munasarja-erityistä hoitoa jyrsijöiden ja ihmisen munasarjojen PTEN estäjän ja /tai PI3K aktivaattori. Käsittely lisäsi FOXO3 ydinvoiman puristamiseen alkeisfol- munasolut, joka johti niiden aktivoitumisen.

Näiden havaintojen kliininen tutkimus toteutettiin Kawamura [27] tutkimaan tehokkuutta PTEN estäjien ja Akt stimulaattori molekyylejä käytetään että

in vitro

aktivointi (IVA) menettely naisilla, joilla ennenaikainen munasarjojen vajaatoiminta. Tämä tutkimus osoitti, että jäljellä lepotilassa follikkelia munasarjojen varauksesta voidaan pelastaa indusoimalla aktivointi mekanismeja tuottaa fertilizable varhaismunasolujen.

Kannustaa Näiden tulosten Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli saavuttaa aktivointiin ihmisen lepääviä ensiarvoisen munarakkuloita upotettuna in munasarjojen aivokuoren syöpäpotilaiden inkuboimalla PTEN estäjän välttää oocyte heikentyä, siis lisätä ”pool” elinkelpoisten ensiarvoisen munarakkuloita käytettävissä

in vitro

kasvun menettelyjä.

Material ja menetelmät

kemikaalit

Kaikki kemikaalit, elatusaineet ja reagenssit tässä tutkimuksessa käytetyt ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), ellei toisin mainita.

tutkimuksen suunnittelu

Ethics selvitys ja kudoksen keräys.

tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, Espanja (2011/0018) ja johdetaan periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Saatuaan kirjallinen suostumus, 18 ihmisen munasarja- aivokuoren koepalat naisista rekrytoitiin meidän hedelmällisyyttä Preservation Program saatiin. Munasarjojen aivokuori koepalat mukaan vain, jos jäljellä kudos oli saatavilla, kun munasarjojen aivokuori kokoelman hedelmällisyyttä säilytettäväksi. Potilaat kärsivät rintasyövästä (n = 8), rabdomyooma (n = 1), akuutti lymfaattinen leukemia (n = 1), Hodgkinin lymfooma (n = 4), anti-syntetaasin oireyhtymä (n = 1), Ewing’s sarkooma (n = 1), medulloblastooma (n = 1), ja ei Hodgkin-lymfooman (n = 1). Keskimääräinen potilaan ikä oli 27,8 (vaihteluväli 14-37) vuotta. Ei potilas oli läpikäynyt kemoterapia /sädehoitoa ennen munasarjojen aivokuori uuttamalla. Munasarjojen koepaloja (noin paksuus 10x10x1 mm) pestiin välittömästi seerumittomalla M199 37 ° C: ssa, leikattiin poistamalla ydin ja leikataan kaksi kappaletta: yksi testata IVA protokollaa tuoreesta kudoksesta ja toinen testata sitä kylmäsäilytetyt /sulatettu kudosta. Rajallisen otoksen koko, vain 14 18 saatua koepaloja sisällytettiin kylmäsäilytetyt ryhmässä.

Experimental ryhmiä.

tuore munasarjojen kappaletta (n = 18) jaettiin nauhat; yksi oli heti vahvistettu toimimaan alkuehto raikas ohjaus kudosten ja kohdennettiin Ryhmä 1 (S1 kuvio); toinen oli kohdistettu ryhmä 2 ja oli

in vitro

aktivoitu ja viljeltiin 25 h PTEN estäjä.

Sen arvioimiseksi, oliko jotka johtuvat siitä, viljelyolosuhteet, lisä- tuore munasarjojen nauhat (n = 9) myönnettiin Group 3 ja inkuboitiin samoissa olosuhteissa kuin aktivoituna niitä, mutta ilman PTEN estäjä toimimaan tuore viljelty kontrolli.

Kryosäilötyt /sulatettu munasarjojen kappaletta ( n = 14) oli myös jaettu nauhat; yksi korjattiin välittömästi sulatuksen jälkeen toimimaan alkuehto kylmäsäilytetyt kontrollikudoksen ja nimettiin Group 4; toinen kohdistettiin Group 5 voidaan inkuboida ja viljelty PTEN estäjän 25 h; kolmasosaa yksi viljeltiin 25 h ilman PTEN: n estäjä ja pidettiin kylmäsäilytetty viljeltiin ohjaus, jota kutsutaan ryhmän 6.

näytteet tuoretta ja kryosäilöttiin viljeltiin kontrolliryhmiin (ryhmät 3 ja 6) käytettiin TUNEL määritys ja hormonin tuotanto kvantifiointiin ELISA, kuten on kuvattu alla.

munasarjakudoksen kylmäsäilytys ja sulatus.

A hidas jäädytys tekniikkaa käytettiin kylmäsäilöä munasarjojen nauhat. M199-viljelyalustaan, joka sisälsi 5% ihmisen seerumin albumiinia (HSA) ja 10% dimetyylisulfoksidia (DMSO), käytettiin kryosuojana ratkaisu. DMSO lisättiin peräkkäin on 2-vaiheen menettelyn ja fragmentit jaettiin etyylivinyyliasetaatti pussit (Cryocyte, Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA). Sinetöityä sijoitettiin pakastuskammioon kontrolloidun nopeuden jäädyttämistä laite (Planer). Hidas-jäädyttämistä protokollaa sovellettiin samaa menettelyä noudattaen tällä hetkellä työssä kliinisiin tarkoituksiin meidän hedelmällisyyttä säilyttämisohjelmasta. Pussit varastoitiin nestemäisessä typessä (-196 ° C), kuten aikaisemmin on kuvattu [28, 29]. Sulattaminen tapahtui 24 tunnin kuluttua. Laukut sulatettiin ja kylmältä suojaavaa eluoitiin käyttäen 3-vaihe protokollaa, kuten muualla on kuvattu [28, 29].

IVA-protokollan

Lyhytaikaiset inkubaatioista Dikaliumvetymonofosfaatti Bisperoxo (pikolinaatto) oxovanadate V, PTP Inhibitor XV (BPV (kuva)), suoritettiin kuten IVA-protokollaa. Lyhyesti, aktivoitu näytteitä inkuboitiin ensin 1 tunnin ajan 100 uM BPV (pic) (Calbiochem, Merck KGaA, Saksa) on α-MEM-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% HSA ja 1% antibiootti-antimykoottiliuoksella (ATB). Sitten näytteitä inkuboitiin 24 tuntia samaa materiaalia (100 uM BPV (pic) + 10% HSA, 1% ATB- α-MEM), johon oli lisätty 0,3 I.U. FSH. Kaikki inkuboinnit suoritettiin tavanomaisissa viljelyolosuhteissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

viljeltiin kontrolliryhmiin (G3 ja G6), näytteitä inkuboitiin samoissa olosuhteissa, mutta BPV ( pic) ei lisätty kasvatusalustaan. Kun IVA menettelyn ja viljely, näytteet kiinnitettiin neutraaliin formaliiniin ja elatusaine heti säilytettiin -80 ° C: ssa hormoni kvantifiointiin.

Histologinen arviointi ja follikulaarinen määrä

Formaliinifiksoidusta näytteet upotettiin paraffiiniin (FFPE) ja leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä. Joka 10.

th jakso oli värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla (H Ensisijainen vaihe: munasolu ympäröi täydellinen kerros cuboidal GC; Toissijainen vaihe: munasolu ympäröi kaksi kerrosta, tai enemmän, on cuboidal GC [19]. Munarakkuloita laskettiin vasta kun munasolu ydin oli läsnä päällekkäisyyden välttämiseksi. Vain terve munarakkuloita [30] laskettiin perustaa tiheydet ja prosenttiosuudet lepotilassa (alkukantainen) ja kasvavia munarakkuloita (ensisijainen, toissijainen). Kaikki H että positiiviset kontrollit ylimääräinen dia, joka sisältää keuhko, proliferatiivinen kohdun limakalvo ja kiveksissä, oli mukana.

munarakkuloita katsottiin aktivoituu FoxO3 ydinvoiman suulakepuristuksen munasolu havaittiin. Ki-67 ja AMH olivat positiivisia, kun havaitaan GC ja oocyte ytimet /GC, vastaavasti.

AMH ja estradioli (E2) tuotanto

AMH määritystä elatusaineet näytteet analysoitiin AMH-Gen-II ELISA (Beckman Coulter, Immunotech, Texas, USA) seuraten val- mistajan protokollaa. Lyhyesti, ja kontrollit jaettiin mikro-titrattiin kuoppiin, jotka on päällystetty anti-AMH-vasta-ainetta. Inkuboinnin ja pesun jälkeen, biotiinilla leimattu anti-AMH toteamisvasta-ainetta lisättiin. Pesun jälkeen streptavidiini-piparjuuriperoksidaasi lisättiin kuoppiin ja kehitetään. Sitten absorbanssi mitattiin automaattisella ELISA-lukijalla (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Toteamisrajan (LOD) on AMH määrityksessä oli 0,08 ng /ml; tässä määrityksessä ei havaitse inhibiini A, aktiviini A FSH ja LH. Intra- ja määritysten välinen vaihtelu oli 3,7% ja 4,4%, vastaavasti.

E2 mitattiin Estradioli EIA Kit (Cayman Chemical Company, Michigan, USA). Testi suoritettiin sen jälkeen, kun val- mistajan protokollan laimentamattomana näytteissä. Absorbanssi mitattiin 405-420 nm: ssä. LOD E2 määritys oli 20 pg /ml, ja häiriöitä muiden steroidihormonien oli 0,01%. Sillä 102,4 pg /ml, intra- ja määritysten välinen vaihtelu oli 13,0% ja 8,2%, vastaavasti.

Molemmissa määrityksissä, absorbanssi oli kääntäen verrannollinen pitoisuudet AMH ja E2 näytteissä, jotka oli lasketaan kalibrointikäyrästä. Näytteet ajettiin kolmena kappaleena. Tulokset ilmaistaan ​​ng /ml ja pg /ml, vastaavasti, ja myös vakiintuneita standardikäyrä.

Apoptoosi kvantifiointiin TUNEL

DNA: n fragmentoituminen havaittiin TdT (terminaali deoxyribonucleotidyl transferaasi) -välitteisen dUTP nick-end merkinnät (TUNEL) määritys käyttäen TMR punainen

in situ

solukuoleman havaitseminen kit (Roche Diagnostics, Saksa). Kolme parafinoidut Kustakin näytteestä selvitettiin ksyleenillä ja nesteytyksestä (etanoli, tislattua vettä) ennen määritystä. PBS-pesun jälkeen antigeeni haku 10 mM sitraattipuskurilla suoritettiin mikroaalloilla 5 minuutin ajan. Sitten objektilaseja inkuboitiin 60 min ajan 37 ° C: ssa sisällä tumma kostutetussa kammiossa 50 ui TUNEL reaktioseokseen; tämä seos jätettiin pois negatiivisen kontrollin. Näytteet asennettu pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) ja tutkitaan mikroskoopilla tavanomaisilla fluoresenssi. Apoptoottiset signaali kirjattiin positiivinen kun dUTP värjätään ydin punainen.

soluvaurioita kvantitoitiin alkeisfol- munarakkuloiden tärkein munasarjojen varauksesta komponentti, ja munasarjojen strooman. Munarakkuloita katsottiin vahingoittua munasolu ydin, eli yli 50% GC, värjättiin punaisella dUTP. Vuonna munasarjojen strooman solukuolema tutkittiin TUNEL ilmaistiin solukuoleman prosenttiosuutta [(TUNEL + solua /solua yhteensä) * 100]. Apoptoottisen nopeus IVA ryhmien (G2 ja G5) verrattiin niiden viljellyt ohjaimet (G3 ja G6). Valinta viljeltiin valvonnan antoi meille mahdollisuuden selvittämiseksi, jos soluvaurioita, kun havaitaan, voi johtua PTEN inhibition tai vain sen viljelyolosuhteet. Lisäksi apoptoottisten arvosana havaittu tuoreiden munasarjojen cortex tai aiheuttama syväjäädytysmenetelmillä, on aiemmin perustettu [28, 31-34].

määrällisesti TUNEL määrityksen, korkean resoluution kuvia saatiin valomikroskoopilla ( LEICA DM4000B, Leica Microsystems GmbH, Saksa) digitaalikameralla liitteenä (LEICADFC450C, Leica Microsystems GmbH, Saksa). Kvantifiointi määritettiin Image ProPlus 6,3-ohjelmisto (Media Cybernetics Inc. Rockville, MD, USA).

suhteellinen geenin ilmentymisen PTEN reitin

mRNA saatiin 7-9 FFPE munasarjanäytteiden kunkin ryhmän kanssa takaisin kaikki Total Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) seuraten val- mistajan protokollaa. Jokaisesta näytteestä, neljä 15-um dioja käytettiin. Sitten cDNA syntetisoitiin MultiScribe käänteiskopioijaentsyymi- High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Byosistems, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Erityisiä Taqman analysoitiin Real-Time PCR määrällisesti suhteellisen ilmentymisen seuraavien geeneistä:

PTEN

,

PI3KCB

,

AKT1

ja

FOXO3

. PCR-reaktioseokset valmistettiin 100 ng cDNA: ta templaattina 1xTaqman Gene Expression Master Mix jälkeen val- mistajan protokollaa. Sitten näytteet monistettiin 7900HT Fast PCR -järjestelmää (Applied Byosistems, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). PCR-olosuhteet muodostui ensimmäinen aktivointi uracyl-

N

-glycosylase 50 ° C: ssa 2 min., Jonka jälkeen AmpliTaq Gold aktivointi 95 ° C: ssa 10 min. Sitten näytteitä sykleillä 40 kertaa denaturaatio 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan, ja hehkutus pidennys 60 ° C: ssa 1 min per sykli. Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

Kun ohjaamiseksi monistuksen tehokkuus tavoitteiden geenien suhteellinen ilmentyminen saatiin vertaileva Ct menetelmä (DDCt) [35]. Ekspression kohdegeenin mRNA normalisoitui ilmentymisen kanssa 18S reportterigeenin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. Friedmanin testi, jonka jälkeen Wilconox pariksi

post hoc

testissä suoritettiin tulosten arvioimiseksi ryhmien välillä. p 0,05 arvoja pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki analyysit suoritettiin SPSS 19,0 (IBM, Somers, NY, USA).

Tulokset

follikulaari tiheydet ja populaatiot

joukossa H G4: 55,0 ± 6,1%, G5: 38,2 ± 7,1%), mutta prosenttiosuudet kasvava niitä lisääntynyt (G1: 37,7 ± 8,3%, G2: 52.03 ± 8,2%; G4: 46,9 ± 6,1%, G5: 61,9 ± 7,1%) verrattuna niiden valvontaa, tai verrattuna viljellyt säätimet (G3 ja G6). Ilmiö oli tilastollisesti merkitsevä vain G5 ryhmässä (p = 0,02 ja p = 0,03, vastaavasti).

Jotta valaista oliko mitään eroa meidän välittömästi kiinteän valvonnan ja viljellyt valvonta, parhaillaan tutkimusta suoritettiin (S1 taulukko). Eroja ei havaittu välillä tuoretta ja kryosäilöttiin alkuehto kontrollisilkkipaperia kun varhais-, ensisijainen ja toissijainen follikulaarinen tiheydet verrattiin niiden viljellyt kontrollisilkkipaperia, eikä silloin, kun lepotilassa ja väestö kasvaa verrattiin.

follikulaari aktivointi

FOXO3 tumasta, indikaattori follicle aktivointi, seurattiin (kuvio 1A ja 1B) ja mitattujen (kuvio 1 C ja 1 D) on aktivoitu näytteissä, ja myös niiden valvontaa. 3-kertainen nousu prosenttiosuuden aktivoitua ensiarvoisen munarakkuloita nähtiin tuoreiden aktivoitua näytettä (G2: 59,55 ± 9,88%) verrattuna niiden alkuperäiseen ohjaus (G1: 23.69 ± 5,71%; p = 0,03). Kun ensisijainen follikkelia aktivointi analysoitiin, ei ollut tilastollisesti merkitsevä vaikka 15%: n nousu havaittiin aktivoitu ryhmä (G2: 80,44 ± 4,8%, G1: 66,4 ± 8,9%, p = NS). Vuonna kylmäsäilytetyt aktivoitua näytettä (G5), IVA menetelmä sai aikaan merkittävän 2-kertainen nousu ikiaikaisen ensisijainen follikkelia aktivointi (kuvio 1 D) verrattuna niiden kontrolliryhmään (Primordial: G5: 63,7 ± 8,9%; G4: 36,8 ± 7,2 %, p = 0,04 ja ensisijainen: G5: 93,80 ± 2,4%; G4: 47,5 ± 8,9%; p = 0,03).

(A) ja (B); FOXO3 havaitseminen ja lokalisointi seurata follikkelien aktivointia. Follicles G2 ja G5 näytteet esitetään vastaavasti. Huomaa, että aktivoitu munarakkuloita G2 ja G5 ryhmien esittää FOXO3 ydin- puristamiseen (nuoli) ja positiivisen signaalin GC; (C) osuus ensiarvoisen follikulaarinen aktivaation arvioitiin tuoreessa munasarjojen kudoksiin, ja merkittävä kasvu havaittiin G2 verrattuna G1 (* p = 0,03); (D), kun aktivoitu alkukantainen follikulaarinen prosenttiosuus verrattiin aikaisemmin kylmäsäilöttyjä sulatettu ryhmä, follikkelia aktivaatio vahvistui G5 vs. G4 (** p = 0,03); (E) tuoreet aktivoitu näyte (G2), primordial follikkelia osoittaa Ki-67 värjäytymisen GC ja munasolujen ytimiä; F) Ki-67-positiivisia signaalin munasolupuutoksen varhais follikkelia päässä kylmäsäilöttyjä aktivoitua näytettä (G5); (G) kvantifiointiin AMH ilmaisun GC. Nostamalla AMH ilmentymistä havaittiin GC alkaen rakkulat molemmissa G2 (§ p = 0,006) ja G5 (§§ p = 0,008) seurauksena

in vitro

aktivointi käsittävään 100gM BPV (kuva); (H) estradioli erittymisen elatusaineet. Koska kuvaaja esittää,

in vitro

aktivointimenettelyillä kasvoi E2 eritystä

in vitro

aktivoitu tuore (G2

vs

. G3 * p = 0,036) ja kryosäilöttiin (G5

vs

. G6 ** p = 0,001) näytteiden verrattuna oman valvonnan.

leviämisen ja kasvun toissijaiseen vaiheisiin

Ki-67-positiivisia -soluja havaittiin oosyyteissä ja GC kaikkien aktivoitu näytteet (kuvio 1E ja 1F). Tämä havainto osoitti, että BPV (kuva) altistumisen jälkeenkin kylmäsäilytys menettelyjä, ei vaikuta proliferatiivista kykyä ensiarvoisen ja ensisijaisen munarakkuloita.

AMH immuunivärjäysmenetelmällä paljasti merkittävää kasvua, on noin 23-30%, vuonna AMH positiivinen munarakkuloita jälkeen IVA hoidon aktivoitujen näytteissä ryhmistä G2 ja G5 verrattuna alkuperäiseen kunnon valvonta kudoksen (G1: 53,3 ± 8,7%

vs

.G2: 76,3 ± 9,4%; p = 0,006 ja G4: 25,7 ± 8,2%

vs

. G5: 54,5 ± 10,2%; p = 0,008) (kuvio 1G).

AMH ja estradioli tuotannon

kvantifiointi AMH viljelyalustaan ​​osoitti, että IVA protokolla kasvatti merkittävästi AMH pitoisuus tuoreen aktivoituu näytteet verrattuna viljelty kontrolliryhmään (G2: 0,34 ± 0,1 ng /ml

vs

. G3: 0,47 ± 0,1 ng /ml ; p = 0,017). Tämä korotus ei ole havaittu aiemmin kylmäsäilytetyt näytteitä, joissa AMH pysyivät alle alhainen LOD kaikissa tutkituissa näytteissä.

Huomattava kasvu E2 pitoisuus erittyy elatusaineeseen havaittiin molemmissa tuoretta (G3: 84,9 ± 17,7 pg /ml

vs

. G2: 98,6 ± 22,9 pg /ml; p = 0,036) ja kryosäilöttiin IVA ryhmät (G6: 33,6 ± 6,3 pg /ml

vs

. G5: 40,8 ± 6,8 pg /ml; p = 0,001) verrattuna niiden viljelty ohjaimet (kuvio 1 H).

Apoptoosi TUNEL

Valaistaan ​​onko IVA-protokollan aiheuttama mitään haitallista vaikutusta munasarjojen strooman tai follikkelia, soluvaurioita tutkittiin ja kvantifioitiin TUNEL aktivoidussa ja valvonta-viljeltiin näytteitä. TUNEL-positiivisia soluja havaittiin kaikissa koeryhmissä, vaikka sekä viljellyissä kontrolliryhmissä, koska viljelyolosuhteet (kuvio 2A 2D). Mitä follikulaarinen soluvaurioita (kuvio 2E), tutkimus osoitti, että ei ollut tilastollista eroa aste vahingoittuneiden follicles välillä aktivoitujen ryhmien ja niiden kulttuuri kontrollinäytteistä tuoreen (G2: 7,7 ± 4,0%

vs

. G3: 13,0 ± 7,6%; p = NS) ja kryosäilöttiin kudokset (G5: 6,25 ± 6,0%

vs

. G6: 28 ± 18,4%, p = NS), vaikka monet vaihtelu näytteiden välillä oli havaittu (S2 Kuva). Kun soluvaurioita oli määrällisesti strooman, ei havaittu merkittäviä eroja johtuen aktivointimenettelyillä havaittiin (kuvio 2F).

(A) soluytimet värjättiin DAPI (sininen) suorittaa TUNEL määrityksessä. Näyte G3 ryhmä. TUNEL + signaali löytyi avanne soluissa (punainen) G3; (B) huomaa varhais follikkelia G2 näytteessä. TUNEL + signaali löytyi strooman, mutta huomaa, että se oli poissa munasolu ja GC peräisin follikkelia G2 ryhmä; (C) G6 näyte. Primordial munarakkuloita ympäröi litistetty muotoinen GC ja strooman ytimet värjättiin DAPI (sininen). TUNEL-positiivisten solujen värjätty punaisella strooman. Munarakkuloita olivat negatiivisia DNA-vaurioita G6 näytteessä; (D) G5 näyte, joka sisälsi kaksi alkukantainen munarakkuloiden solutumissa värjättiin DAPI. Ei TUNEL + signaalia havaittiin varhaismunasolun ja GC, mutta oli positiivinen munasarjojen strooman; (E) solukuoleman indeksi. Kvantifiointi munarakkuloiden positiivisen TUNEL signaalin varhaismunasolujen tai GC. Eroja ei havaittu välillä aktivoidaan ja ei aktivoitu näytteitä; (F) TUNEL-positiivisia strooman alue kvantifiointiin. Mitään eroja ei havaittu munarakkuloita kun TUNEL + alue verrattiin välillä aktivoidaan ja ei aktivoitu ryhmiä. Tämä havainto viittaa siihen, että soluvaurioita löytyy stroomaan kaikkien ryhmien johtui viljelyprosessin.

suhteellinen geenin ilmentymisen

PTEN

reitin

validoida vaikutus BPV (kuva) inkubaatiot on geeniekspressiota

PTEN

reitti, suhteellinen ekspressio pääasiassa geenien kvantifioitiin.

tuoretta kudoksissa, IVA protokolla indusoi useiden merkittäviä muutoksia, kuten alennettua kertainen muutos (fc) on

PTEN

(fc = -1,21, p = 0,03) ja

PI3K

(fc = -2,43) geenejä, ja yli- on

AKT

(fc = 7,65, p = 0,015) ja

FOXO3

(fc = 6,78, p = 0,01) verrattuna kontrolleihin (Kuva 3A ja 3B). Kun Delta Cycle Threshold (ACt) oli tilastollisesti verrattiin aktivoitua ja vertailunäytteet (taulukko 2), merkittäviä eroja huomattiin myös joukkoon

PTEN

,

PI3K

ja

FOXO3

geeniekspressioprofiilit (p = 0,01; p = 0,03 ja p = 0,015, vastaavasti).

(A) kertainen muutos

PTEN

geenin. Merkittäviä eroja Saatiin kun ACt analysoitiin ja osoitti PTEN esto tuottaman BPV (kuva) 100 uM tuoreeseen (G1

vs

. G2 p = 0,01) että aiemmin kryosäilytetään munasarjojen kudoksiin (G4

vs

. G5 p = 0,04); (B) kertainen muutos

FOXO3

geeni. Merkittävä väheneminen havaittiin vain raitista kudoksissa, jotka kävivät IVA kohtelun ACt analysoitiin (G1

vs

. G2 p = 0,015).

kylmäsäilytetyt näytteiden suhteellinen ilmaisu tai taita muutos

PTEN

reitin geenien myös muutettu IVA

(PTEN

fc = -1,29,

PI3K

fc = 0,59,

Akt

fc = 2,27, p = 0,007, ja

FOXO3

fc = 1,94, p = 0,008) verrattuna kontrolleihin (Kuva 3A ja 3B). Vaikka saman ilmaisun malli havaittiin tilastollisesti merkitseviä eroja havaittiin vain

PTEN

geeni verrattaessa ACt (p = 0,04).

Lisäksi parhaillaan tutkimusta geenien ilmentyminen suoritettiin välillä alkuehto näytteitä ja niiden viljelty kontrolli. Kuten S2 Taulukko esitetty, ei tilastollisesti merkitseviä eroja havaittu välillä kontrolliryhmää verrattuna kanssa pariksi testi.

Keskustelu

käyttö IVA-protokollan kanssa PTEN estäjän ihmisen kylmäsäilytetyt munasarja- aivokuoren syöpäpotilaita lisääntynyt altaan elinkelpoisten aktivoitua ensiarvoisen munarakkuloita aiheuttamatta vahingollisia vaikutuksia, koska saadut tulokset osoittavat. Tämä lähestymistapa on merkittävä parannus ensimmäisten vaiheiden

in vitro

kasvun tekniikoita. Se pitää erityisen tärkeänä: ne syöpäpotilaille, joiden munasarjojen aivokuori on kylmäsäilytetyt ainoana vaihtoehto FP, mutta joille suoraan kudoksen uudelleen on vasta [9, 10, 18];