Krooninen sairaus

tiivistelmä

käyttää pieniä antimikrobiset peptidit tai bakteriosiineja, kuten nisiinin, syöpälääkkeitä on uusi lähestymistapa että erittäin lupaava. Nisiini on esimerkki tästä uudesta lähestymistavasta, koska sitä on käytetty turvallisesti ihmisillä jo vuosia elintarvikkeiden säilöntäaineena, ja viimeaikaiset laboratoriotutkimukset tukevat sen anti-kasvain potentiaalia pään ja kaulan alueen syöpä. Aikaisemmin osoitimme, että nisiinin (2,5%, alhainen pitoisuus) on antitumor potentiaalia pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC)

in vitro

ja

in vivo

. Nykyinen tutkimukset tutkitaan luonnossa esiintyvä variantti nisiinin (nisiinin ZP 95%, korkea pitoisuus) sen antituumorivaikutukset

in vitro

ja

in vivo

. Nisiini ZP aiheuttama korkeimman tason apoptoosin HNSCC soluissa verrattuna alhainen nisiinistä. HNSCC solut käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla nisiinin ZP osoittivat lisääntyvää apoptoosin ja vähenevän solujen lisääntymisen, klonogeenisten kapasiteettia, ja pallo muodostumista. Nisiini ZP aiheuttaman apoptoosin kautta calpain-riippuvaisen reitin in HNSCC soluissa, mutta ei ihmisen suun keratinosyyteissä. Nisiini ZP myös indusoi apoptoosia annoksesta riippuen ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) samanaikaisen vähenemistä verisuonten verso muodostumiseen

in vitro

ja vähentää kasvaimensisäisenä mikroverisuonitiheys

in vivo

. Nisiini ZP vähensi kasvainten synnyssä

in vivo

ja pitkäaikaista hoitoa nisiinin ZP laajennettu selviytymisen. Lisäksi nisiinin hoidetut hiiret osoittivat elimen normaalia logian mitään todisteita tulehdus, fibroosi tai kuolion. Yhteenvetona nisiinin ZP näyttelyitä suurempi antituumorivaikutukset kuin alhainen nisiinin, ja näin on mahdollista toimia uusia terapeuttisia varten HNSCC.

Citation: Kamarajan P, Hayami T, Matte B, Liu Y, Danciu T , Ramamoorthy A, et al. (2015) Nisiiniä ZP, bakteriosiini ja elintarvikkeiden säilöntäaine, estää pään ja kaulan alueen syöpä kasvaimen kehittymisen ja pidensi elinaikaa. PLoS ONE 10 (7): e0131008. doi: 10,1371 /journal.pone.0131008

Toimittaja: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 10 helmikuu 2015; Hyväksytty: 26 toukokuu 2015; Julkaistu: 01 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Kamarajan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot alueella on käytettävissä paperi- ja sen tukeminen Tietopaketti.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Michiganin yliopistossa MCUBED rahoitus # U036798 on YK, FPW, ja AR. BM tukivat Brasilian CAPES ja CNPq sponsoroi, Science ilman rajoja Program. YL tukivat Scholars Program Pekingin yliopiston ja sairaalan hammaslääketieteen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Head ja kaulan okasolusyöpä (HNSCC) on kuudenneksi yleisin kuolinsyy maailmanlaajuisesti. Potilaat diagnosoitu HNSCC hoidetaan kirurgian, sädehoidon ja kemoterapian. Koska sen anatominen sijainti, HNSCC kirurginen resektio on usein tuhoisia ja usein, täydellisen poistamisen kasvain massa ei ole toteuttamiskelpoinen vaihtoehto, usein tekee näillä potilailla, joilla on parantumaton sairaus seuraavien hoitojen kemosädehoito [1]. On rajoitetusti kemoterapeuttisten vaihtoehtoja potilaille kerran heidän sairautensa ei enää myöntyväinen parannuskeinoa, ja matalan 5 vuoden eloonjäämisluvut metastasoituneen HNSCC eivät ole parantuneet vuosikymmeniin [2,3]. Nämä seikat korostavat parantamisen kiireellisyydestä hoitovaihtoehdot näille potilaille.

Muutamat raportit ovat ehdottaneet, että antimikrobiset peptidit tai bakteriosiineja on sytotoksinen vaikutus syöpäsoluja [4-8]. Koska tämä mielenkiintoinen lähtökohta, selvitimme sytotoksisia ja antituumoriominaisuuksia antimikrobiaalisen peptidin, nisiinin, ja totesi, että se estää HNSCC tumorigeneesin [9]. Nisiini on 34-aminohapon polysyklisiä antibakteerinen peptidi, joka on tuotettu fermentoimalla gram-positiivisten bakteerien

Lactococcus lactis

. Monet antibakteeriset aineet ovat tehokkaita samankaltaisia ​​bakteerilajien; kuitenkin, nisiinin on laaja-alaista vaikutuksia, koska se estää myös gram-negatiivisten bakteerien [10]. Nisiini ei ole myrkyllistä eläimille ja on turvallinen ihmisravinnoksi [11]. Nisiini on hyväksytty ihmisille tarkoitettuja elintarvikkeen säilöntäaine Maailman terveysjärjestö (WHO) vuonna 1969 ja elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) vuonna 1988, ja se on annettu yleisesti pidetty-as-turvallinen (GRAS) nimeäminen FDA [12]. On arvioitu, että 0,94-2,24 mg nisiinin kulutetaan per henkilö per päivä Yhdysvalloissa [12]. Vaikka bakteriosiineja, kuten nisiinin, on käytetty vuosikymmeniä estämään bakteerien kasvua elintarvikkeissa, ne ovat vasta hiljattain on testattu ehkäisyyn kasvun tai apoptoosin induktiota syöpäsoluja. Apoptoosi tai ohjelmoitu solukuolema on luonnollinen prosessi, joka eliminoi ei-toivottuja tai vanhempi soluja. Kuitenkin, syöpäsolut ovat vastustuskykyisiä apoptoosin. Näin ollen on paljon vaivaa ymmärtää mekanismit, jotka säätelevät apoptoosia näissä soluissa niin, että uusia aineita voidaan kehittää indusoida syöpäsolujen. Nisiini voi palvella tässä asemassa ja kehitystä nisiinin syövän terapeuttista voidaan helposti pyrittävä annostelun jälkeen määritykset.

Viime aikoina olemme ilmoitti, että nisiinin, voi toimia uutena mahdollisia terapeuttisia hoitoon HNSCC [9]. Nisiini välittää nämä vaikutukset indusoimalla etuoikeutetut apoptoosin, solusyklin pysähtymiseen ja vähentää solujen lisääntymistä HNSCC soluissa, verrattuna ensisijainen keratinosyyttejä. Nisiini myös vähentää HNSCC tumorigeneesin in vivo. Mekanistisesti nisiinin aikaan nämä vaikutukset HNSCC, osittain kautta kationinkuljetusjärjestelmän säädin homologin 1 (CHAC1), joka on proapoptoottiset kationinkuljetusjärjestelmän säädin ja kautta samanaikaisesti CHAC1 riippumaton tulva ekstrasellulaarisen kalsiumin [9,13]. Nämä havainnot tukevat nisiinin potentiaalisesti uusia terapeuttisia varten HNSCC, ja koska nisiinin on turvallista ihmisravinnoksi elintarvikkeena säilöntäaineena, muuntamisen hoitopaikassa voidaan helpottaa.

Nisiiniä toimii muuttamalla eheys ja solukalvon ja muodostaa lyhytikäisiä huokoset, mikä muuttaa kalvon potentiaalia [14]. Nisiini tulee upotettu solukalvon läpi kationisia osia aminohappoja ulottuu toiselle puolelle molekyylin. Nämä kationiset osat ovat vuorovaikutuksessa negatiivisesti varautuneiden fosfolipidi päätä, kun taas hydrofobinen osa nisiinin vuorovaikutuksessa kalvon ytimeen [15]. Nisiini osallistuminen kalvoineen siis välittää fosfolipidin uudelleenjärjestely ja mahdollistaa tulva-ionien [14,16]. Koska HNSCC parit ja keratinosyyteissä eroavat lipidikalvoihin kokoonpano ja toiminta ja vastaus kalsiumvirtauksissa, nisiinin kyky muuttaa transmembraanisen potentiaali ja kalvon koostumus solut voivat johtaa erilaiseen vaikutukset näissä soluissa [17-22]. Todellakin, meidän tiedot tukevat tätä oletusta pohjana nisiinityyppinen välittämä ero apoptoottisen solukuoleman ja vähentänyt leviämisen HNSCC solujen verrattuna ensisijaisen keratinosyyttejä [9].

Koska nisiinin roolia turvallisena bakteriosiinin elintarvikkeiden säilyttämiseen, ja tieto siitä, että muut bakteriosiineja hallussaan proapoptoottiset ominaisuuksia syöpäsoluja vastaan, meidän havainnot vaikutuksista nisiinin on HNSCC tumorigeneesin apua tarjoavat perustan nisiinille mahdollisena uusia terapeuttisia varten HNSCC. Niinpä meidän keskittyä nykyisessä tutkimuksessa oli laajentaa tämän perustason tietoa. Aiemmin käytimme 2,5% nisiinin (alhainen pitoisuus) muotoilua. Tässä tutkimuksessa tavoitteenamme oli testata tehoa 95% nisiinin (korkea pitoisuus) on HNSCC apoptoosia ja proliferaatiota in vitro ja kasvaimen kehittymisen in vivo. Erityisesti olemme keskittyneet sen translaation potentiaalia tutkimalla erittäin puhtaassa, elintarvikekäyttöön muodossa nisiinin sen in vivo ja pitkän aikavälin vaikutuksia. Tämän vuoksi testasimme kaksi luonnossa esiintyviä, korkea nisiinin pitoisuus variantteja, nisiinin ZP ja nisiinin AP. Ottaen huomioon nisiinin turvallisuutta ihmisravinnoksi ja annetaan sen in vitro ja in vivo teho HNSCC, nisiinin voitaisiin kehittää uutena syövän terapeuttista varten HNSCC.

Materiaalit ja menetelmät

Institutional Review Board hyväksyntä

Tämä tutkimus on hyväksynyt ja suoritettiin säännösten mukaisesti asetetut jonka Institutional Review board ja valiokunnan käytöstä ja hoidosta eläinten Michiganin yliopistossa.

Soluviljely

neljä ihmisen HNSCC solulinjoja käytettiin näissä tutkimuksissa. HNSCC solulinja todennus ja alkuperä toimittivat niiden lähteiden ja julkaissut runsaasti. Ihmisen HNSCC solulinjat, UM-SCC-17B (supraglottis /pehmytkudos-kaula) ja UM-SCC-14A (kerroksessa suussa) saatiin tohtori Thomas Carey (professori, University of Michigan, MI) [23]. Suullinen SCC solulinja HSC-3 (kieli) saatiin tri Randall Kramer (professori, University of California, San Francisco, CA) [24]. Suullinen SCC solulinja, OSCC-3 (kieli) saatiin tohtori Mark Lingen (professori, University of Chicago). HNSCC soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 1% penisilliiniä ja 1% streptomysiiniä. Normaali-ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC), ja mukana soluviljelyaineessa ja täydennykset (EGM-2 Bullet Kit) saatiin Lonza (Allendale, NJ). Ihmisen rekombinantti VEGF165 saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ja Matrigel Matrix saatiin BD Biosciences (San Jose, CA). HUVEC viljeltiin EGM-2 -peruselatusaineessa 37 ° C: ssa 5% CO

2.

Nisiiniä

Nisiini A ja nisiinin Z on kaksi luonnossa esiintyviä variantteja nisiinin, jotka on tuotettu käymisen

Lactococcus

lactis ja ne eroavat toisistaan ​​yhden aminohapon tähteen asemassa 27; histidiinin nisiinin A ja asparagiinin nisiinin Z [25]. Korkea pitoisuus muodot näiden kahden vaihtoehdon, nisiinin ZP ja nisiinin AP (95% pitoisuus /ultrapure;% paino /paino; vettä sisältäviä teho ≥38,000 IU /mg) ostettiin Handary (Bryssel, Belgia) ja alhainen nisiinin A (2,5% pitoisuus tasapainossa natriumkloridia ja denaturoitu maidon kiintoaineita; teho ≥1,000,000 per IU /g) ostettiin Sigma-Aldrich (N5764). Nisiini ZP ja AP ja alhainen nisiinin olivat sekoitetaan veteen ja käytettiin kaikissa kokeissa.

Cell Proliferation ja Colony Formation Analyysit

vaikutuksen määrittämiseksi nisiinin soluproliferaatioon, The CyQuant NF Cell leviämisen Assay Kit käytettiin val- mistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, NY). Pesäkkeiden muodostumista määrityksiä, 2000-solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle. Yön yli inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla nisiinin ZP 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen lisättiin tuoretta väliainetta lisättiin välein 2 päivää ajaksi 10 päivää. Pesäkkeet värjättiin 0,5% kristallivioletilla ja pesäkkeet, jotka sisälsivät 50 solut laskettiin. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

Orasphere Pitoisuus

Sphere määrityksiä arviointiin käytettiin kiinnittymisestä riippumatonta kasvua, kiinteistön arvellaan vaikuttavan metastaattista potentiaalia. HNSCC oraspheres (UM-SCC-17B) valmistettiin, kuten aikaisemmin on raportoitu [26-29]. Lyhyesti, solut, jotka hengissä ankkurointi peruuttamislomaketta monisoluisten aggregaatteja tai oraspheres. Oraspheres kehitettiin ylläpitämällä soluja väliaikaisesti olosuhteissa poly (2-hydroksietyylimetakrylaatti) (poly-HEMA) päällystetyillä levyillä (7,5 mg /ml 95%: ista etanolia, Sigma-Aldrich) 36 tuntia. Orasphere määritellään yhteenlaskettu soluja, jotka on vähintään 50 um. Yhteenlaskettu pinta-ala oraspheres kussakin kuopassa määrällisesti kunkin hoidon edellytys käyttäen NIS-elementit BR4.13.04 kuvankäsittelyohjelma. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Nisiini lisättiin kuhunkin kuoppaan aikaan solun pinnoitus.

Apoptosis määritykset

vaikutusten määrittämiseksi kolmen eri nisiinin on HNSCC-solujen apoptoosin kolmea eri määritykset suoritettiin. Apoptoosi arvioitiin nisiinin käsitellyissä soluissa käyttämällä suoraa värjäystä menetelmällä, virtaussytometria perustuva määritys, ja Western blotting lähestymistapa arvioida tunnettujen apoptoottisia signalointi proteiineja.

apoptoosin: Värjäys ja Mikroskopia

etidiumia bromidi ja akridiinioranssia (EB /AO) värjäystä käytettiin apoptoosin mittaamiseksi kuten aikaisemmin on kuvattu [30]. Näissä kokeissa solut maljattiin 96-kuoppalevyille 2 x 10

4 solua /cm

2, ja 24 tunnin kuluttua, käsiteltiin erilaisilla pitoisuus nisiinin (0, 100, 200, 400 ja 800 ug /ml) 24 tunnin ajan. Sitten solut värjättiin EB /AO tahra. EB saatiin Bio-rad (Berkeley, CA) ja AO saatiin yhtiöltä Acros Organics (Geel, Belgia). EB /AO väriainereagenssi koostui 100 ug /ml etidiumbromidia ja 100 ug /ml akridiinioranssin PBS: ssä. EB /AO väriaine lisättiin kuhunkin kuoppaan, poistettiin, ja sitten kuvien värjäytyneiden solujen otettiin käyttäen mikroskooppia, jossa on digitaalinen kuvantamisjärjestelmä (Eclipse 50i Nikon, Melville, NY). Solut laskettiin ja, joka perustuu niiden väriä, luokiteltiin joko elintärkeää, apoptoottisten tai nekroottisen. AO läpäisee kaikki solut ja tekee ytimien näyttävät vihreää. EB on vain siirtyy solujen kun solukalvon eheys menetetään, ja se värjää ytimien joten ne näkyvät punaisella. Siten varhainen apoptoottiset solut näyttävät vihreä kirkkaan vihreitä pisteitä tumissa johtuvat kromatiinin tiivistyminen ja ydinvoiman pirstoutumista. Late apoptoottiset solut näyttävät oranssi (yhdistelmä vihreä ja punainen väri), jossa merkittävämpiä kromatiinin tiivistyminen ja ydinvoiman pirstoutumista. Nekroottinen solut näyttävät oranssi mutta niiden ydin- morfologia muistuttaa eläviä soluja, mikä on poissaolon kromatiinin tiivistymistä. Solujen prosenttiosuus kussakin luokassa määritettiin laskemalla vähintään 100 solua. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Apoptosis: Virtaussytometria

prosenttiosuus apoptoottisten solujen indusoima nisiinin hoidon määritettiin virtaussytometrialla. Lyhyesti, solut irrotettiin inkuboimalla entsyymiä free dissosiaatio-puskurilla (Invitrogen), pelletoitiin sentrifugoimalla, ja värjättiin anneksiini V (BD Pharmingen) analyysiä varten virtaussytometrillä (FACSDiVa Cell lajittelija, Becton Dickinson).

apoptosis: Western-blottaus

vaikutusten arvioimiseksi nisiinin ZP ilmenemistä pro-apoptoottisten proteiinien HNSCC soluissa, teimme Western blot-analyysit UM-SCC-17B-soluissa, joita oli käsitelty nisiinin ZP 18 tuntia . Calpain estäjä tutkittiin myös tässä yhteydessä sen kyky kääntää apoptoottinen aiheuttamia vaikutuksia nisiini ZP; nimittäin estää PARP pilkkominen. Kalpaiinin inhibiittori hankittiin Sigma-Aldrich (A6185, St. Louis, MO), sekoitetaan veteen, ja sitä käytettiin pitoisuutena 500 nM. Seuraavat erilaisia ​​hoitoja, solut kerättiin, pestiin kerran fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja lyysattiin 30 minuuttia, kun jäällä radioimmunoprecipitatation määrityksessä (RIPA) puskuria (R0278, Sigma-Aldrich), joka sisälsi 1% proteaasiestäjäseostabletit (P8340, Sigma- Aldrich). Lysaatit oikaistu proteiinipitoisuus kanssa BCA proteiini iinianalyysikitissä (Bio-Rad, Berkeley, CA). Proteiini lysaatit erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Billerica, MA). Western blot -analyysit suoritettiin käyttäen anti-poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP, SC-7150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) primaarisen vasta-aineen, kaspaasi-3 primaarinen vasta-aine (SC-7148, Santa Cruz Biotechnology), joka on kalpaiinin primääristä vasta-ainetta (MAB3083, Millipore), jota seurasi piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua anti-kani-vasta-aine (SC-2004, Santa Cruz Biotechnology) tai anti-hiiri-vasta-ainetta (A9044, Sigma-Aldrich). Sitten blotit kehitettiin ECL-plus tunnistusjärjestelmä (Pierce). Arvioidaan näytteet samasta Proteiinilisäyksen, kalvot riisuttu ja uudelleenseulottiin anti-β-aktiini vasta-aineella (SC-1615, Santa Cruz Biotechnology).

In vitro angiogeneesimääritys

Määritä vaikutus nisiinin ZP angiogeneesistä, suoritimme in vitro versoa määrityksissä [31]. Sillä versoa määrityksiä, HUVEC käsiteltiin trypsiinillä ja suspendoitiin endoteelisolujen kasvun media (EGM-2), joka sisälsi 50 ng /ml yhdistelmä-DNA-verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) ja eri pitoisuuksia nisiinin ZP (0, 100, 400 ja 800 ug /ml ). Solut ympättiin 1 x 10

4 solua /cm

2 Matrigel päällystetty 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli. Kuvia ituja siepattiin käyttäen Evos XL Core Imaging System (Life Technologies, Grand Island, NY), sitten koko verso pituus mitattiin Image J (National Institutes of Health). Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

immunohistokemiallinen analyysit

arvioimiseksi nisiini vaikutuksista angiogeneesiä in vivo, immunohistokemiallista analyysejä käytettiin arvioitaessa CD31 ilmentymisen, joka on endoteelin adheesiomolekyyli, hiiren kasvainkudossektioista. Lyhyesti, sen jälkeen, kun antigeeni haku mikroaalloilla esikäsittely (sitraattipuskuria, 10 mM, pH 6,0), kalvot inkuboitiin CD31 primaarista vasta-ainetta (DIA-310, Dianova, Hampuri, Saksa) yli yön 4 ° C: ssa. Sen jälkeen diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia kromogeenilla (DAB) reaktio, dioja vasta- värjättiin rutiininomaisesti hematoksyliinillä. Immunohistokemiallinen värjäys CD31 luokiteltiin ja tekee patologi pidennetyn tavalla.

Suun syöpä hiirimallissa

tutkimiseksi in vivo antituumorivaikutukset nisiinin ZP, suullinen syöpä lattia-of- suu hiirimallissa käytettiin. UM-SCC-17B solua injektoitiin limakalvonalaisesti lattiaan suun hiirillä kuten aikaisemmin on kuvattu [9, 28, 29, 32]. Kaikki protokollia in vivo tutkimuksissa hyväksyttiin valiokunnassa käytön ja hoidon eläinten Michiganin yliopistossa. Erityisesti, solut kasvatettiin 70% konfluenssiin, suspendoitiin DMEM, sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen kasvutekijä vähentää matrigeeliä tyvikalvon matriisin (BD Biosciences, San Jose, CA) lopulliseen pitoisuuteen 1,25 x 10

4 /0,05 ml. Kuuden viikon ikäisiä kateenkorvattomia nude-hiiriin (NCR-nu /nu-kanta, NCI, Frederick, MD) nukutettiin injektoimalla vatsaonteloon 100 mg /kg ketamiinia ja 10 mg /kg ksylatsiinia. Kokonaistilavuus 0,05 ml SCC solu /Matrigel Suspensio injektoitiin limakalvonalaisesti lattiaan suun. Kolmen viikon kuluttua tuumorisolujen injektion ja kun varmistetaan, että kasvaimia perustettiin, eläimet tasaisin kuuteen ryhmään: kontrolliryhmä, joka annettiin vettä (yhtä suuri tilavuus /kontrolli) letkulla suun kautta 3 viikkoa ja viisi eri hoitoryhmään, jotka annettiin nisiinin käsittely letkulla suun kautta 3 viikon ajan. Sen jälkeen kasvainsolun injektiot, Hiiriä seurattiin joka toinen päivä. Hoitoryhmien koostui hiirillä, jotka saivat nisiinin ZP kahdella eri pitoisuuksina (400 ja 800 mg /kg per päivä), ja hiirillä, jotka saivat nisiinin AP kahdella eri pitoisuuksina (400 ja 800 mg /kg per päivä). Myös toinen ryhmä hiiriä, jotka annettiin nisiinin ZP (800 mg /kg per päivä) pidemmän ajan kuluessa (kk). Päättymisen jälkeen nisiinin annon, hiiret tapettiin CO

2 yliannostuksen ja taittamalla niiltä niskat, sitten kasvaimet kerättiin, huuhdeltiin fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), kuvaamisen, ja kiinteä yön yli 10% puskuroituun formaliiniin. Digitaalinen työntömitta käytettiin määrittämään kasvaimen tilavuuden kaavalla

x

x

b Twitter /2, jossa

on pienempi ulottuvuus. Yleensä hiiret lopetettiin, jos hiiret osoittivat fysiologisia oireita stressiä kyvyttömyys syödä tai juoda, laihtuminen, tai kun kasvainten nousta alueelle 300-500mm

3, ja siten hiiret yleensä lopetettiin noin 3 viikkoa lyhyen aikavälin protokollaa. Hiiret lopetettiin CO

2 yliannostus.

Tilastollinen analyysi

yleensä arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. Intergroup erot analysoitiin varianssianalyysillä (ANOVA) ja Tukey-Kramer HSD testi. In vivo tutkimuksissa, riippumaton t-testit varianssi on erisuuruinen käytettiin.

Tulokset

Nisiini ZP ja nisiinin AP aiheuttaa merkittäviä HNSCC-solujen apoptoosin annoksesta riippuen ja sen jälkeen, että alhainen nisiinistä

hoito sekä nisiinin ZP (95%) ja nisiinin AP (95%) indusoi merkittäviä lisäyksiä apoptoosin HNSCC soluissa (UM-SCC-17B ja HSC-3) verrattuna hoitoon alhainen pitoisuus nisiinin (2,5% ) (kuvio 1A ja 1 B). Apoptoosi mitattiin etidiumbromidia ja akridiinioranssia (EB /AO) värjäys ja mikroskopia. Vaikutukset nisiinin ZP ja AP apoptoosiin olivat annoksesta riippuvaisia, ja kasvaa, kun konsentraatiot nisiinin ZP ja AP nousi 200-400 ug /ml. Vaikka erot apoptoosin välillä nisiinin ZP ja nisiinin AP eivät olleet merkittäviä, nisiinin ZP näytteillä parempi liukoisuus, ja siten useimmat kokeet suoritettiin nisiinin ZP.

A ja B

, Kuvaajat osoittavat muutokset prosentteina apoptoottisten HNSCC solujen (HSC-3 ja UM-SCC-17B), käsiteltiin kontrolli media tai median, joka sisältää 2,5% nisiiniä, 95% nisiinin AP, tai 95% nisiinin ZP 24 tuntia. Sitten solut värjättiin käyttäen etidiumbromidia ja akridiinioranssia (EB /AO) tahra ja laskettiin. Vertailut ryhmien välillä suhteessa kontrolleihin analysoitiin ANOVA merkitsevyystasoksi asetettu * p 0,05.

C

, mikroskooppinen kuvat osoittavat morphologhy on HNSCC käsiteltyjen solujen ohjattu media tai median, joka sisältää nisiiniä ZP (100-800 ug /ml) 24 tuntia, sitten värjättiin EB /AO (Mittaviivat 100 um).

DF

, Kuvaajat osoittavat muutokset prosentteina elintärkeää, apoptoottisten, ja nekroottinen solut (UM-SCC-17B, HSC-3 ja normaali suullinen keratinosyytit) käsiteltiin kontrolli media tai median sisältävä nisiiniä ZP (400 tai 800 ug /ml) 24 tuntia. Vertailut ryhmien välillä suhteessa kontrolleihin analysoitiin ANOVA merkitsevyystasoksi asetettu * p 0,05 elintärkeää solujen; # P 0,05 apoptoottisia soluja.

Lisäksi vaikutukset nisiinin ZP on HNSCC apoptoosia oli merkittävää koko laajan annoksina 100, 200, 400 ja 800 ug /ml (kuvio 1C- 1E) ja useissa HNSCC solulinjoissa (UM-SCC-17B ja HSC-3). Coordinately, solut käsiteltiin kasvavia annoksia nisiinin ZP näytteillä merkittävästi vähentynyt määrä elintärkeitä solujen ja merkittävästi yhä useammat apoptoottisten solujen, kun taas määrä nekroottisen solujen pysyi suhteellisen alhainen ja muuttumaton. Sen sijaan ensisijainen keratinosyytit eivät osoittaneet kohonneelta apoptoosin niin nähdään HNSCC solulinjoissa (kuvio 1 F).

Nisiiniä ZP indusoi apoptoosin kautta kalpaiinia, kaspaasi 8 ja PARP pilkkominen

Edelleen tutkia mekanismi nisiinin-välitteisen apoptoosin, käytimme lisää apoptoottisia määrityksissä ja valvoma tunnettu apoptoottisten signalointi proteiineja. Neljä eri HNSCC solulinjojen tutkittiin niiden nisiinille reagointikykyä. Nisiini huomattavasti apoptoosin kaikissa neljässä HNSCC solut riviä arvioimana anneksiini V värjäys ja virtaussytometria (kuvio 2A).

, Kuvaajat osoittavat muutokset prosentteina apoptoottisten solujen (UM-SCC -17B, HSC-3, UM-SCC-14A ja OSCC-3), käsiteltiin kontrolli media tai median, joka sisältää nisiiniä ZP (400 ug /ml) 24 tuntia. Sitten solut värjättiin anneksiini V ja apoptoosi arvioitiin virtaussytometrialla. Vertailut ryhmien välillä suhteessa kontrolleihin analysoitiin ANOVA merkitsevyystasoksi asetettu * p 0,05.

B

, Immunoblotit osoittavat kalpaiini 1, kaspaasi-8, kaspaasi-3, ja PARP-proteiinin tasot HNSCC (UM-SCC-17B) ja

C

, normaali ihmisen suun keratinosyyttien solulysaateista jälkeen hoidon nisiinin ZP 18 h.

D

, Immunoblotit osoittaa PARP ja calpain 1 aktivoinnin HNSCC solulysaateista hoidon jälkeen 18 h ohjaus, media, joka sisältää nisiiniä ZP (400 ug /ml), media, joka sisältää calpain estäjä (ALLN, 500 nM) tai väliaineessa, joka sisältää sekä kalpaiinin inhibiittori (ALLN, 500 nM) ja nisiinin (400 ug /ml).

D

, immunoblottauksesta SS-aktiini näyttää latauksen valvontaa.

Koska meidän aikaisempia havaintoja, nisiinin välittää kalsiumista riippuvaisen apoptoosin, selvitimme mahdollisia osallistumista kalpaiini, tunnetun kalsiumista riippuvaa välittäjänä apoptoosin [9]. Todellakin, nisiinin käsiteltiin HNSCC solut osoittivat vähentynyttä ilmentymistä tasoilla calpain 1 pienen alayksikön, osoittaa kalpaiini 1 aktivaation (kuvio 2B). Väheneminen ilmentymistä calpain 1 pienen alayksikön peilataan yhä annokset nisiinin ZP 100-400 ug /ml, ja näin oli annoksesta riippuvaa.

edelleen tutkia mekanismia indusoiman apoptoosin nisiini ZP, kaspaasi -8 ja kaspaasi-3 pilkkominen tutkittiin tässä yhteydessä. Nisiini indusoi kaspaasi-8 aktivaation annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2B). Kuitenkin hoito HNSCC solujen nisiinin ZP aiheuttama kaspaasi-3 riippumatonta apoptoosin (kuvio 2B). Western blotting kaspaasi-3 in nisiinille ZP käsitellyissä soluissa paljasti tasainen kaspaasi-3 ilmaisun ja puuttuminen kaspaasi-3 pilkkominen riippumatta nisiinin testattu annos (kuvio 2B).

Nisiiniä ZP käsiteltyjen solujen myös näytteillä poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) pilkkoutumisen, tunnusmerkki apoptoosin (kuvio 2B). PARP pilkkominen lisäsi annoksesta riippuen kuten nisiinin ZP annoksina lisääntynyt. Sen määrittämiseksi, onko nisiinin välittämää PARP pilkkominen oli calpain riippuva mekanismi, joka on kalpaiinin estäjä (ALLN) tutkittiin tässä yhteydessä (kuvio 2C). Hoito HNSCC solujen sekä nisiinin ZP ja kalpaiini-inhibiittori, pienentää niiden kokoa PARP pilkkominen, verrattuna soluihin, käsiteltiin nisiinin yksin. Normaali ihmisen suun kautta keratinosyyttien ei esiintynyt aktivointi kalpaiini, kaspaasi-8, kaspaasi-3 tai PARP hoitovaste nisiinin ZP (kuvio 2D). Niinpä nisiinin ZP indusoi apoptoosin HNSCC solujen aktivoimalla /katkaisulla calpain, kaspaasi 8 ja PARP, mutta riippumaton kaspaasi-3 pilkkominen.

Nisiini ZP ja nisiinin AP vähentää merkittävästi HNSCC soluproliferaatiota ajasta ja annoksesta -dependently

vaikutukset nisiinin ZP ja AP HNSCC solujen lisääntymiseen tutkittiin seuraavaksi, ja havaitsimme, että potilaille, joiden hoito nisiinin ZP ja nisiinin AP vähensi merkitsevästi HNSCC cell (UM-SCC-17B) lisääntymistä (kuvio 3A ). Vaikutukset nisiinin ZP ja AP HNSCC soluproliferaation oli annoksesta riippuvaista, koska leviämisen taso laski, kun pitoisuus nisiinin ZP ja AP nousi 400-800 ug /ml. Lisäksi erot HNSCC solujen lisääntymisen aiheuttama nisiini ZP versus nisiinin AP hoitoon, oli merkittävä siten, että aiheuttamia vaikutuksia nisiini ZP oli nopeampaa. Koska osapuolet ovat suuremmat vaikutukset nisiinin ZP vähentämisessä leviämisen ja annetaan parempi liukoisuus nisiinin ZP yli nisiinin AP, nisiinin ZP valittiin jatkotutkimuksiin. Vaikutukset nisiinin ZP on HNSCC soluproliferaation olivat merkittäviä koko laajan annoksina 100-800 ug /ml ja useissa HNSCC solulinjoissa (kuvio 3B). Lisäksi nisiinin ZP-välitteinen väheneminen HNSCC soluproliferaation oli aika-riippuva, ​​joka osoittaa merkittäviä vaikutuksia 6, 12, 24, ja 48 h (kuvio 3C). Pelkistetty soluproliferaatiota todennäköisesti johtuu osittain solusyklin pysähtymiseen välittyy nisiinin [9]; Muita osoituksia vähentynyt fosforylaatio solusyklin Checkpoint merkki, cdc2 (S1 Kuva).

. Kaavioita, joissa muutokset soluproliferaation UM-SCC-17B: llä käsiteltyjen solujen ohjattu media tai median, joka sisältää nisiiniä AP tai ZP (400 tai 800 ug /ml) 48 tuntia. Vertailut ryhmien välillä suhteessa kontrolleihin analysoitiin ANOVA merkitsevyystasoksi asetettu * p 0,05. # Vertailu nisiinin AP ja nisiinin ZP * p≤0.05.

B

. Kaavioita, joissa muutoksia solujen proliferaatiota HNSCC soluissa (UM-SCC-17B, HSC-3 ja UM-SCC-14A), käsiteltiin kontrolli media tai väliaineessa, joka sisältää kasvavia annoksia nisiinin ZP (100-800 ug /ml) 48 tuntia. Vertailut ryhmien välillä suhteessa kontrolleihin analysoitiin ANOVA merkitsevyystasoksi asetettu * p 0,05. ¶Comparison välillä 100 ug /ml ryhmässä vertailuryhmään nähden UM-SCC-17B soluihin * pμ0.05.

C

. Kaavioita, joissa muutokset soluproliferaation UM-SCC-17B: llä käsiteltyjen solujen ohjattu media tai median, joka sisältää nisiiniä ZP (400 ug /ml) 6, 12, 24 ja 48 tuntia. Vertailut ryhmien välillä suhteessa kontrolleihin analysoitiin ANOVA merkitsevyystasoksi asetettu * p 0,05.

D

, Kuvat ovat UM-SCC-17B käsiteltyjä soluja 48 h ohjaus- media tai median sisältävä nisiiniä ZP (400 tai 800 ug /ml) viljeltiin sitten 10 päivän ajan, värjättiin kristallivioletilla ja kuvattavan kohteeseen arvioida klonogeeniset kapasiteettia.

E

, Kaavio näyttää prosentteina pesäkkeiden läsnä suhteessa kontrolleihin testeissä mitataan klonogeeniset kapasiteettia. Vertailut ryhmien välillä suhteessa kontrolleihin analysoitiin ANOVA merkitsevyystasoksi asetettu * p 0,05.

F

. Kaavioita, joissa muutokset soluproliferaation normaalin ihmisen suun keratinosyytit on käsitelty kontrolli media tai median, joka sisältää nisiiniä ZP (100, 200, 400 tai 800 ug /ml) 48 tuntia. Vertailut ryhmien välillä suhteessa kontrolleihin analysoitiin ANOVA merkitsevyystasoksi asetettu * p 0,05.

Nisiiniä ZP vähentää HNSCC solujen pesäkkeiden muodostumisen

tutkia tarkemmin vaikutukset nisiini ZP soluproliferaatioon mittaamalla sen pitkäaikaisvaikutuksia käyttäen pesäkemuodostusta määrityksiä. Yhteisymmärryksessä lyhytaikainen proliferaatiomäärityksillä hoito nisiinin ZP esti pesäkkeenmuodostusta HNSCC soluissa (kuvio 3D ja 3E). Inhiboiva vaikutus pesäkkeen muodostumista olivat annoksesta riippuvaisia, koska pesäkkeiden muodostumisen väheni merkittävästi, kun nisiinin ZP annos nousi 400-800 ug /ml. HNSCC solut käsiteltiin näitä kahta annosta näytteillä 2 ja 50-kertaisesti alentunut klonogeeniset kapasiteettia. Nisiini ei estänyt proliferaatiota normaaleissa ihmisen suun keratinosyyttien kuin että HNSCC soluissa (kuvio 3F).

Nisiiniä ZP lohkot orasphere muodostumista

lisäksi havaittu että hoito nisiinin ZP merkittävästi estänyt orasphere muodostumista tai ankkurointi riippumattomaan kasvuun (kuvio 4A ja 4B). Orasphere muodostuminen tai ankkurointi riippumaton kasvu on ominaisuus, joka edistää Tuumorigeenisuustutkimuksissa. Nisiini ZP vaikutuksista orasphere muodostumiseen olivat annoksesta riippuvaisia, niin että koko orasphere ala pieneni tasaisesti hoidon jälkeen nisiinin annoksilla 100, 200, 400 ja 800 ug /ml.

, vaihe kontrasti kuvia ja

B

, käyrä, joka esittää prosenttiosuutta orasphere esto (kokonaispinta-ala) in HNSCC soluissa (UM-SCC-17B) viljeltiin jousitus olosuhteissa ja käsiteltiin kontrolli media tai median sisältävä nisiiniä ZP (100-800 ug /ml) 36 tuntia. Vertailut ryhmien välillä suhteessa kontrolleihin analysoitiin ANOVA merkitsevyystasoksi asetettu * p 0,05.

Nisiiniä ZP indusoi endoteelisolujen apoptoosia ja estää angiogeenisten itämistä

aiemmin osoitti että hoito alhainen pitoisuus nisiinin esti kasvaimen kasvua ja aiheutti pieniä vaalean kasvaimissa, mikä viittaa siihen, että nisiinin vaikuttaa kasvaimen verenkiertoa. Meillä on myös aiemmin raportoitu, että nisiinin n antituumorivaikutukset välitettiin CHAC1, joka on proapoptoottiset indusoija endoteelisoluissa [9]. Siten onko nisiinin ZP vaikuttaa angiogeneesiin, arvioimme vaikutukset nisiinin ZP endoteelisolujen apoptoosin ja versoja.