Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisin syy syövän liittyvän kuoleman länsimaissa. Tehokkaampien NSCLC terapeuttisia edellyttää selvittäminen geneettisen ja biokemialliset emäksiä tähän tautiin. Bronchioalveolar kantasolut (BASCs) ovat oletettu syövän kantasolujen populaation hiirimalleissa onkogeenisten

K-ras

indusoima keuhko- adenokarsinooma, joka on histologinen alatyyppi NSCLC. Signaalit aktivoidaan onkogeeninen K-ras, jotka välittävät BASC laajeneminen ei ole täysin määritelty.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käytimme geneettinen ja farmakologinen lähestymistapoja moduloivat fosfatidyyli 3-kinaasi ( PI3K), keskeinen välittäjäaine onkogeenisten

K-ras,

kaksi geneettistä hiirimalleissa keuhkoadenokarsinooma. Onkogeeniset

K-ras

indusoima BASC keskittymisen ja kasvaimen kasvua estettiin käsittelemällä pieni molekyyli, PI3K-estäjä ja parantaa inaktivaation

fosfataasi ja tensin homologi poistettu kromosomista 10

, negatiivinen säätelijä PI3K.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme päätellä, että PI3K on kriittinen säätelijä BASC laajennus, joka tukee hoidon strategioita kohdistaa PI3K NSCLC potilailla.

Citation: Yang Y , Iwanaga K, Raso MG, Wislez M, Hanna AE, Wieder ED, et al. (2008) fosfatidyyli 3-Kinase sovittelee Bronchioalveolar Stem Cell Laajentuminen Mouse mallit onkogeeninen

K-ras

aiheuttama Keuhkosyöpä. PLoS ONE 3 (5): e2220. doi: 10,1371 /journal.pone.0002220

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 joulukuu 2007; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2008; Julkaistu: toukokuu 21, 2008

Copyright: © 2008 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: R01 CA117965 , R01 CA105155, U01 CA105352

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on johtava syöpään liittyvän kuoleman länsimaissa ja sen esiintyvyys on kasvussa Aasiassa. Kun se on metastasized, ei ole olemassa parantavaa hoitoja NSCLC. Parempi ymmärrys synnyssä ja riskitekijät tähän sairauteen edistää paitsi parannuksia varhaiseen havaitsemiseen ja ennaltaehkäisyyn, vaan myös kehittämään tehokkaampia hoitoja se.

Noin 10% NSCLC yksilöiden kuljettaa aktivoivia mutaatioita in

K-ras

[1]. Histologinen alatyyppi NSCLC joka useimmin on

K-ras

mutaatioiden on adenokarsinooma; 30% adenokarsinoomien on näitä mutaatioita.

K-ras

mutaatioita on myös tunnistettu epätyypillinen adenomatoottisen liikakasvun (AAH) vaurioita, joiden ajatellaan ennen kehittämiseen keuhkoadenokarsinooma [2]. Yhä useammat todisteet osoittavat, että

K-ras

mutaatiot ovat tärkeitä aloittamisen keuhkoadenokarsinooma kehitystä. Hiiri on kehitetty, että ilmaista mutantin

K-ras

ehdollisesti, somaattisesti tai indusoitavasti [3] – [7]. Nämä hiiret kehittävät AAH vaurioita nopeasti ja suurella penetrance, ja joissakin näistä vaurioista edetä adenokarsinoomia.

Ehdokas keuhkosyövän kantasolujen (bronchioalveolar kantasolu tai BASC) on tunnistettu hiiren malleissa

K-ras

indusoima keuhkosyöpä. BASCs on erityinen malli kantasolujen merkki ilmaisu (Sca-1

pos CD34

pos CD45

neg PECAM

neg), sijaitsevat terminaalin keuhkoputket, ja on kyky itse uudistaa ja tehdään usean linage eriyttäminen [8]. Nämä solut voivat olla samoja kuin variantti Clara (tai Clara

V) soluja, jotka sijaitsevat lähellä klustereita neuroendocrine elinten keuhkoputkien ja keuhkoputkia. Samanlaisia ​​BASCs, Clara

V solut kykenevät palauttamaan Clara solupopulaation jälkeen naftaleenin loukkaantumisen [9]. Sen jälkeen kun nenän sisään asennuksen adenoviruksen Cre osaksi Kras

LSL hiirillä, jotka kehittävät keuhkojen adenokarsinooma, koska aktivointi ehdollisen onkogeenisten

K-ras

alleelin [5], BASCs lisääntyvät nopeasti ennen kehitystä histologiset poikkeavuuksia [8]. BASCs näissä hiirissä sisältävät

K-ras

mutaatioita, jotka ovat identtisiä kasvaimissa [8]. Sen Näiden todisteiden perusteella, BASCs on arveltu toimivan kantasolujen keuhkoadenokarsinooma hiirillä. Biokemiallisia signaaleja, jotka aloittavat laajeneminen tämän solun väestöstä ei ole täysin selvitetty. Tämä puute on tärkeää, sillä selvittäminen näiden signaalien saattaa johtaa parempiin hoito pienisoluista keuhkosyöpää.

Premalignit vaurioita tyypillisesti tehdään ohimenevä laajeneminen seurasi ohjelmoituja vanhenemista, ja vain pieni osa varhaisen vaurioita etenee täysin muuttaneet osavaltio. Kun kyseessä on Ras-riippuvaista syöpää hiiri malleissa, ohjelmoitu vanhenemista premalignien leesioiden aktivoidaan mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin kinaasi /solunulkoisen signaalin säädelty kinaasisignaloinnin, joka estää Ras kautta feed-back reittejä, joihin liittyy lisääntynyt ilmentyminen SPROUTY proteiinien, Ras GTPaasi aktivoivat proteiinit, ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi fosfataasi-3 [10]. Vanheneminen ohjelma syöpää edeltävät vauriot voidaan estää fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) aktivointi [10], mikä osoittaa, että PI3K on ratkaiseva tekijä pahanlaatuinen etenemisen näiden vaurioita. Itse asiassa, PI3K signalointi konstitutiivisesti aktivoituu NSCLC soluihin inaktivoivat somaattiset mutaatiot tai epigeneettiset vaiennettu,

fosfataasi ja tensin homologi poistetaan kromosomista 10

(

PTEN

), lipidiä fosfataasi, joka säätelee negatiivisesti PI3K signalointiryöpyn [11] – [15].

tässä tutkimuksessa arvioimme tärkeyttä PI3K säätelyssä laajentamiseen BASCs kahdessa geneettistä hiirimalleissa onkogeenisten

K-ras-

indusoi keuhkosyöpä. Onkogeenisel-

K-ras

alleelien näissä malleissa aktivoituvat somaattisesti yhteen (Kras

LA1) ja ehdollisesti toisessa (Kras

LSL) (5, 7). Löysimme määrän lisääntyminen BASCs näissä hiirissä suhteessa kuin villityypin poikueesta. BASC laajeneminen ja pahanlaatuisia etenemisen keuhkoissa voitiin vähentää farmakologinen esto PI3K ja parantaa geneettinen inaktivointi

PTEN

. Me spekuloida Näiden havaintojen että farmakologinen strategioita estää PI3K on hyötyä ehkäisyssä ja hoidossa NSCLC.

Tulokset

PX-866 estää keuhkojen tuumorigeneesiä Kras

LA1 hiiret

olettaisi, että PI3K tarvitaan pahanlaatuisia etenemiseen keuhkosyöpää ja testannut tätä hypoteesia käyttäen Kras

LA1 hiirillä mallina keuhkojen kasvaimien syntyyn. Useita viikkoja syntymän jälkeen, Kras

LA1 hiirillä multifocal AAH vaurioita, että 2-3 kuukauden iässä, sulautuvat kiinteiksi tai papillien adenoomia, joka suurentaa ja tehdään histologinen muuttumista adenokarsinooman mukaan 6-8 kuukautta [7]. Ensin arvioitiin ilmentymisen PI3K (p110α ja β-isoformit) keuhkokudoksissa eri vaiheissa kasvaimen (AAH, adenooma, tai adenokarsinooma). Nämä PI3K isoformit havaittiin ja niiden runsaus lisääntyi pahanlaatuinen etenemisen (AAH vaurioita

versus

adenokarsinooman:

P

= 0,006 varten p110α;

P

0,001 p110β) ( Kuva 1A).

(A) PI3K ilmaisun kasvaa pahanlaatuisia etenemisen. Edustavia immunohistokemiallinen värjäys vaurioita kudokseen microarray ja niiden kvantifiointiin baarista kuvaajia. Kalibrointipalkki sisään oikea alapaneeli edustaa 100 um. Kymmeniä sekoitettu (kiinteä /papillaarilihaksessa) adenoomia sisältyvät vaakapalkkia muttei PI3K värjäystä kuvia. (B) PI3K vaaditaan kasvaimen kasvua. Mean muutoksia kasvainten lukumäärää ja tilavuus määritetään mikro-tietokonetomografia suoritettiin ennen ja jälkeen hoidon. (*

P

0,05 verrattuna ajoneuvoon). (C) PX-866 estää PI3K keuhkojen kudoksiin. Western blottaus Ser473-fosforyloitu AKT (P-AKT) ja Ser21 /9-fosforyloitiin GSK3 (P-GSK3α /β) kokonaan keuhkojen lysaatit hiiristä (n = 7 kussakin käsittelyssä kohortin). Kannat Molekyylipainomarkkerciden merkitty vasemmalle. (D) PX-866 vähentää kasvainsolujen proliferaatiota. Edustavia immunohistokemiallinen värjäys ja Ser28-fosforyloitua histoni H3 (P-H3) adenoomia kudoksessa mikrosirulla (x 20 suurennus, alueet positiivisten solujen ympäröi) ja määrittäminen värjäytymistä 16 vaurioita ajoneuvojen käsiteltyjen hiirten ja 4 vaurioita päässä PX-866 saaneilla hiirillä (pylväsdiagrammi, *

P

0,05 verrattuna ajoneuvoon). Inset havainnollistaa ympäröivät solut × 40 suurennus. Kalibrointi palkit kuvaavat 200 mikrometriä.

Perustuu sen runsastuminen täysin transformoiduissa soluissa, me vieressä pyrittiin määrittämään, onko PI3K vaadittiin kasvaimen kasvua. Hoito K-ras

LA1 hiirten PX-866, PI3K-estäjä [16], väheni keuhkovaurioita tilavuuden ja moninaisuus (kuvio 1 B). Tähän liittyi vähennykset PI3K mikä näkyy western blottauksella kokonaisia-keuhko lysaatit fosforyloidun AKT ja glykogeenisyntaasikinaasi- 3 (kuvio 1 C). Kasvainsolujen tehtiin vähentämistä leviämisen aiheuttaman PX-866, joka perustuu sisäiseen leesiottoman fosforyloitua histoni H3 (kuvio 1 D), mutta ei esiintynyt biokemiallinen näyttö apoptoosin, kuten on esitetty western blot -tekniikalla, ja katkaistun kaspaasi-3 ja Poly (ADP-riboosi) polymeraasin ( dataa ei esitetty). Siten käsittelemällä PI3K antagonisti syvästi inhiboivat näiden varhaisten vaurioita.

BASCs ovat erittäin herkkiä PX-866

in vivo

ja

in vitro

vieressä ratkaistava, onko anti-kasvain vaikutus PX-866 in Kras

LA1 hiirillä oli osittain estämällä BASC laajentamiseen. Terminaalissa keuhkoputket, osajoukko epiteelisolujen ilmaistaan ​​sekä Clara solujen spesifisen proteiinin (CCSP) ja pinta-aktiivisen proteiini-C (SPC) (kuvio 2), joka on tunnusomaista BASCs [8]. Kvantitointi dual-positiivisten solujen villityypin hiiriä (83 keuhkoputkien) ja K-ras

LA1 hiiriä (66 keuhkoputkien) paljasti, että ei ole villin tyypin hiirillä oli yli 3 BASCs päätettä kohden keuhkoputki, kun taas osajoukko terminaali keuhkoputkien K-ras

LA1 hiirillä oli 4-7 (

P

= 0,042, villityypin

versus

Kras

LA1) (kuva 2). Siten osajoukko päätelaitteen keuhkoputkien in Kras

LA1 hiirillä oli BASC laajennus. Lisäksi kolmen immunofluoresenssilla tutkimukset paljastivat, että BASCs ilmaistuna p110α ja oli havaittavissa fosforylaation AKT (Kuvio 3), joka on alavirtaan välittäjänä PI3K, todisteeksi PI3K aktivaation näissä soluissa. Käyttämällä kudososat Kras

LA1 hiiriä hoidettiin PX-866 (88 pääte keuhkoputket) tai ajoneuvo (81 terminaali keuhkoputket), määritimme määrä BASCs päätettä kohden keuhkoputken hoitoryhmissä. Ajoneuvon-käsitellyillä hiirillä oli osajoukko päätelaitteen keuhkoputkien kanssa 4-7 BASCs päätettä kohden keuhkoputki, kun taas yksikään PX-866-käsitellyillä hiirillä oli enemmän kuin kolme BASCs päätettä kohden keuhkoputki (

P

= 0,025, ajoneuvon

versus

PX-866-käsitelty) (kuva 4).

immunofluoresenssivärjäyksellä havaitsemaan solujen terminaalin keuhkoputkia että co-express CCSP ja SPC. Ympäröidyt BASCs ylälevyissä (x10 suurennus) esitetty alempaan paneeliin suuremmilla suurennos (x40). Pylväsdiagrammi osoittaa prosenttiosuudet terminaali keuhkoputkien osoitetuilla numerot BASCs. Kalibrointi baareja kuvia H CCSP

Cre /+), ilmaista onkogeenisiä

K-ras

( Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+), on

PTEN

puute ja onkogeenisten

K-ras

lauseke (PTEN

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+), tai joilla ei ole (PTEN

flox /flox; CCSP

+ /+). Hiiret lopetettiin 4 viikkoa tai 12 viikkoa, ja niiden keuhkojen kudoksia tehtiin immunofluoresenssitutkimukset määrittää BASCs.

Kuten odotettua, kolminkertainen immunofluoresenssivärjäyksen (CCSP /SPC /PTEN) paljasti menetys PTEN ilmentymisen BASCs alkaen hiiret, jotka olivat molemmat

PTEN

vajausta ja

K-ras

transformoiduista (PTEN

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) mutta ei hiirillä, jotka olivat vain

K-ras

transformoiduista (Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) (kuvio 6). Kvantifiointi BASCs päätettä kohden keuhkoputki on 4 viikkoa paljasti, että

PTEN

-puutos yksinään (PTEN

Δ5 /Δ5; CCSP

Cre /+) ei riitä muuttamaan BASC numeroita suhteessa, että valvonnan hiiriä (PTEN

flox /flox; CCSP

+ /+) (kuvio 7). Kuitenkin verrattaessa BASC numeroita PTEN

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+ hiirillä kuin Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+ hiirillä osoittivat, että

PTEN

puutos silmiinpistävän parannettu BASC laajeneminen onkogeeninen

K-ras

(

P

= 0,006, PTEN

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+

versus

Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) (kuvio 7). Lisäksi nämä havainnot terminaalissa keuhkoputket, klustereita CCSP

pos SPC

pos soluja havaittiin keuhkoputkia ja pieni keuhkoputkien PTENin

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+ hiirillä; nämä soluklusterien näkyivät jo 4 viikon iässä ja eivät olleet läsnä keuhkoputkien tai keuhkoputkia ja Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+ hiirillä (kuvio 8). Olemme päätellä, että

PTEN

inaktivaatio yhteistyötä onkogeenisella

K-ras

parantaa BASC kertymistä.

immunofluoresenssivärjäyksellä kudosleikkeiden havaita kolmasti värjätään (CCSP /SPC /PTEN) solut liittimessä keuhkoputkien. BASCs (ympyröity) viitenumerolla x 10 suurennus. Kalibrointipalkki sisään oikea alapaneeli edustaa 100 um.

immunofluoresenssivärjäyksellä havaitsemaan solujen terminaalin keuhkoputkia että co-express CCSP ja SPC. BASCs (ympyröity) viitenumerolla × 40 suurennus. Pylväsdiagrammi osoittaa prosenttiosuudet terminaali keuhkoputkien osoitetuilla numerot BASCS. Kalibrointipalkki sisään oikea alapaneeli edustaa 100 um.

immunofluoresenssivärjäyksellä havaitsemaan soluja, jotka ilmentävät CCSP ja SPC. BASCs (ympyröity) viitenumerolla x 10 suurennus. Pylväsdiagrammi esittää prosenttiosuudet keuhkoputkien osoitetuilla numerot BASCS. Kalibrointipalkki sisään oikea alapaneeli edustaa 100 um.

Keskustelu

Kirjoittajat raportoivat, että PI3K vaadittiin BASC laajentamiseen aloittaman onkogeeninen

K-ras

ja, kun konstitutiivisesti aktivoitu

PTEN

inaktivaation, PI3K yhteistyötä onkogeenisella

K-ras

tässä prosessissa. Tämä päätelmä perustuu havaintoihin kokeita, jotka on sisällytetty farmakologisen ja geneettisen lähestymistapoja kohdistaa PI3K kahdessa eri geneettistä hiiri malleja ja

in vitro

mallissa. Olemme aiemmin raportoitu, että

PTEN

inaktivaatio yhteistyötä onkogeenisella

K-ras

nopeuttaa keuhkojen kasvaimien syntyyn, mikä aiheuttaa keuhko kasvaimia, jotka ovat histologisesti kehittyneitä ja nopeammin estää keuhkoputkien lumina ja korvata alveolaarinen tiloja kuin hiirten onkogeenisten

K-ras

yksinään [18]. Yhdessä nämä havainnot esiin mahdollisuuden, että PI3K edistetään keuhkojen kasvaimien synnyn kautta sen vaikutuksista BASCs. Kuitenkin ratkaisevia todisteita tältä osin edellyttää todisteita siitä, että adenokarsinooman syntyvät BASCs. Transplantation tutkimuksia sen määrittämiseksi, onko BASC injektiot ovat riittävät kerrata keuhkojen adenokarsinooma kehityksen hiirillä ovat tähän mennessä ei ole raportoitu. Varsi solupopulaatio on todettu keuhkoissa hiirten ja kasvainten pienisoluista keuhkosyöpää, joka ilmentää CD133, näyttelyissä kantasolujen ominaisuuksia

in vitro

(lomakkeet aloilla ja voidaan saada läpikäymään terminaali erilaistumisen), ja on tuumorigeenisia nude-hiirissä [19]. Vaikka tiettyjä ominaisuuksia, jotka kantasolujen populaation ovat samanlaisia ​​kuin BASCs (eli vastaus naftaleeni-indusoitu keuhkovaurio), niiden suhde on vielä selvittämättä.

Kun aloitetaan alkionkehityksen aikana, ehdollinen

PTEN

inaktivointi keuhkoissa johtaa hypoksia ja perinataalitoksisuuden kuolema, mikä osoittaa, että

PTEN

ilmaus tarvitaan normaaliin keuhkojen kehitykseen [20]. Tässä tutkimuksessa Cre ilmaisun CCSP

Cre hiiret alkoivat syntymän jälkeisenä päivänä 4, jotta voimme arvioida

PTEN

’s rooli ylläpitää keuhkojen toiminnan syntymän jälkeen. Vaikka emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että hienovaraisia ​​muutoksia keuhkojen toimintaa tapahtui,

PTEN

vajausta hiiret tässä tutkimuksessa ei ollut ilmeisiä muutoksia niiden keuhkojen rakenteen ja siinä esiintynyt sairastuvuuden jopa 12 kuukauden ikäisten, mikä viittaa että syntymän jälkeen, keuhkojen kudoksia voi toimia normaalisti ilman

PTEN

. Tämä joustokykyisiltä keuhkojen kudosten

PTEN

puute on vastoin aikuisten hematopoieettiset kantasolut, jotka ovat uhanalaisia ​​40 päivän kuluttua inaktivaatio

PTEN

[21], mikä osoittaa, että itseuudistumisen valmiuksia Veren kantasolut ei voida ylläpitää ilman PTEN: n negatiivisen kasvun sääntely signaaleja. Vaikka syyt tähän eroon eivät ole selvät, se saattaa johtua osittain suhteellisen harvinaisesta jolla keuhkojen kantasoluja yleensä jakautuvat [9].

PI3K on raportoitu tärkeä rooli kasvainten synnyssä vireille onkogeeniset

K-ras

. Kras

LA2 hiirillä, joilla on knock-in

PIK3CA

mutaatio, joka estää vuorovaikutuksen PI3K K-ras kehittää paljon vähemmän keuhkokasvaimia kuin tehdä Kras

LA2 hiiriä villiin

PIK3CA

[22], mikä osoittaa avainrooli PI3K alavirran välittäjänä K-ras. Vahvistavia Tässä vaiheessa huomasimme, että PX-866 käsittely esti keuhko kasvaimen kasvua Kras

LA1 hiirillä. Kuitenkin perustuvat muiden havaintojen raportoitu tässä, että on tärkeää PI3K in

K-ras

indusoima keuhko- kasvainten synnyssä ei voida rajoittaa sen roolia alavirran välittäjänä K-ras. Ensinnäkin, PI3K ilmaus kasvoi Kras

LA1 keuhkokudokset koki pahanlaatuinen etenemistä AAH on adenokarsinooma, mikä viittaa siihen, että PI3K aktivoitiin näissä histologisesti kehittyneitä vaurioita osittain kautta K-ras-riippumattomien mekanismien. Toiseksi, havainnot ilmoitetaan tässä ja muualla [18] osoittavat, että

PTEN

inaktivaatio parannettu kasvaimia synnyttävän

K-ras

indusoimaan keuhko- kasvainten synnyssä hiirillä. Ekstrapoloimalla nämä havainnot, somaattiset mutaatiot NSCLC soluissa, joissa geenit, jotka säätelevät PI3K riippuva signalointi (eli

PTEN EGFR

, ja

PIK3CA

muun muassa [ref. 23]) voi muuntaa nämä solut osittain yhteistyössä onkogeenisella

K-ras

. Mahdollinen merkitys toissijaisten somaattisten mutaatioiden edistämisessä kasvaimia synnyttävän

K-ras

indusoima keuhko- kasvainten synnyssä on havainnollistettu pitkät latenssit on adenokarsinoomia, jotka syntyvät hiirillä muokattu ilmentämään mutantti

K-ras

, joka kehittää keuhkovaurioita nopeasti ja suurella penetrance, mutta vain murto-osa vauriot edetä adenokarsinomia ja vaatia useita kuukausia tehdä niin [3] – [7].

havainnot ilmoitetaan tässä poikkesivat raportoitu aiemmin on eri hiirikanta jotka tehdään ehdollinen

PTEN

poisto indusoi SPC-ajettu Cre ilmaisun [20]. Tässä raportissa

PTEN

inaktivoitumista riitti lisätä BASC numerot ja aiheuttaa keuhkojen kasvaimet, mikä on vastoin havaintoja esitetään tässä ja muualla [18], että

PTEN

puute ei riitä lisäämään BASC numeroita tai indusoi keuhkokasvaimia. Tämä edellisen raportin erilaisin suhteessa geneettisiä tapahtumia yhteistyössä toiminut

PTEN

puute. Tässä tutkimuksessa

PTEN

inaktivaatio kiihtyi keuhko kasvaimen kehittymisen aiheuttama uretaani, joka on karsinogeeni, joka usein aiheuttaa

K-ras

mutaatiot, mutta vain 2 6 kasvainten arvioitiin oli

K-ras

mutaatioita, mikä jättää avoimeksi mahdollisuuden, että uretaani yhteistyötä

PTEN

menetys indusoimalla somaattiset mutaatiot geenejä muista kuin

K-ras

. Tämä on ristiriidassa meidän malliin, jossa ehdollinen

K-ras

ja

PTEN

alleelit rekombinoitua samassa (CCSP-ilmentävien) solujen. Näin ollen erilaisia ​​tuloksia näistä tutkimuksista voi liittyä toissijaiseen geneettisiä tapahtumia uretaani-hoidettujen hiirten tai eroja koeasetelma, kuten geneettiset taustat hiirten tai promoottorin elementit ajo Cre ilme.

menetelmät

reagenssit

Vasta-aineet ostetaan näihin tutkimuksiin sisältyvät kanin anti-p110α (sc-7174), p110β (sc-7175), SPC (sc-13979), vuohen anti-CC10 (sc -9772) ja PTEN (sc-6818) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kanin anti-kokonais AKT (9272), Ser473-fosforyloitiin AKT (9271), Ser21 /9-fosforyloitiin GSK3α /β (9331), yhteensä GSK3 (9332), pilkottiin kaspaasi-3 (9661), poly (ADP-riboosi) polymeraasin (9542), fosforyloitu-histoni H3 (9701), Ser28-fosforyloitiin histoni H3 (9713P) (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) , kanin anti-SPC (WRAB-SPC, Seven Hills Bioreagents, Cincinnati, OH), kanin anti-CCSP (07-623, Upstate Biotekniikka, Lake Placid, NY), FITC-konjugoitu anti-Sca-1 (557405), biotiini konjugoitua anti-CD45 (553771) biotiinikonjugoidulla-CD31 (558737), PE-konjugoitu anti-CD34 (12-0341-33, eBioscience), anti-kani-IgG Alexa Jauhot 488 (A11008), ja anti-vuohi-IgG Alexa jauhot 594 (A11058) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Muita ostettu reagensseja ovat streptavidiini-APC (554067, BD Pharmigen), TSA sarjat 22 (T20932), 25 (T20935) ja 27 (T20937), Avidin /Biotiini esto Kit (00-4303) (Invitrogen), Dispaasi (354235, BD Biosciences), kollagenaasi /dispaasi (10269638001, Roche Biosciences), ja 7-aminoactinomycin D (A1310, Invitrogen).

hiiri tutkimukset

Voit testata, onko PI3K edistää kasvainten kehittymiseen, 9 K- ras

LA1 hiiriä hoidettiin 4 viikon ajan 2 mg /kg /d sisäisen mahalaukun PX-866, pieni molekyyli estäjä PI3K [12], ja 12 annettiin ajoneuvon alkaa 4 kuukautta, ikä, jossa keuhkojen leesioita (AAH ja adenoomia) ovat mitattavissa mikro-tietokonetomografia skannaa. Hiiriä altistettiin nämä skannaa alussa ja hoidon päättymisen laskea leesion numeroita ja arvioida muutoksia vaurion volyymien ajan kuten aiemmin on raportoitu [24].

Ennen niiden aloittamista, kaikki hiiren tutkimukset toimitettiin ja hyväksymä Institutional Animal Care ja Käytä komitean University of Texas-M. D. Anderson Cancer Center. Hiiret saivat hoidon standardit ja lopetettiin standardien mukaisesti mainitsemat IACUC. Hiiret ja soluja ja saatiin läpi yhteistyökumppaneinaan Dr. Tyler Jacks, MIT (Kras

LA1 hiiret ja Kras

LSL hiiret), tohtori Hong Wu, UCLA (PTEN

flox hiiret), ja Dr. Francesco Demayo, Baylor College of Medicine (CCSP

Cre hiiret).

kudossiruina ja immunohistokemiallinen analyysit

Me tehdään immunohistokemiallinen analyysi PI3K on kudos microarray sisältävä AAH (n = 17) kiinteä adenoomien (n = 31), sekakiinteä /papillaarinen adenoomien (n = 36), papillaarinen adenoomien (n = 45), ja adenokarsinoomat (n = 14) ja määrittää, onko tasot PI3K muuttunut maligni kehittyminen. Analysoimme ilmentymisen PI3K-isoformien (p110α ja β).

immunohistokemiallisella värjäyksellä, 4 um parafiiniin upotetut leikkeet paistettiin 60 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten jäähdytettiin ympäristön lämpötilaan. Leikkeitä peräkkäin inkuboitiin ksyleeniä (5 min kahdesti), 100% etyylialkoholia (5 min kahdesti), 95% etyylialkoholia (5 min kahdesti), ja 80% etyylialkoholia (5 min). Kun oli pesty vedellä, leikkeet antigeeniä palauttaa käyttämällä sitraattipuskuria (pH 6,0, DAKO) kanssa höyrystimen 20 minuuttia ja se jäähdytettiin ympäristön lämpötilaan. Sitten leikkeitä pestiin TBS-T: n ja sammutettiin 3% vetyperoksidia TBS: ssä 10 minuutin ajan, blokattiin avidiinilla /biotiini aktiivisuutta, ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen seuraavasti: Jos p110α ja p110β värjäys, leikkeet blokattiin 5% vuohen seerumia 1 h, inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden kanssa 1 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa, ja pestiin sitten TBS-T; ja Ser28-fosforyloitiin histoni H3 värjäys, kohdat blokattiin 10% vuohen seerumia 4 ° C: ssa yön yli, inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 30 min ympäristön lämpötilassa, ja pestiin TBS-T: llä. Värjäytyminen kehitettiin käyttämällä DAB -substraattijärjestelmää. Negatiiviset kontrollit sisältyvät poisjättäminen primaarisen vasta-aineen ja esi-inkubaatio primaarisen vasta-aineen kanssa estävän peptidin. Värjäys kvantifioitiin yksi tutkija (M.G.R.) sokaissut siitä hoitoryhmässä. Sisäiset Leesioton ilmentyminen pisteytettiin perustuu värjäytymisen intensiteettiä ja laajennus kuten aiemmin on kuvattu [24].

Detection of BASCs keuhkokudoksissa

Antigeenit haettiin hiiren keuhkojen kudoksiin 0,01 mol /l sitraatti- (pH 6; DakoCytomation, Glostrup, Tanska) 25 min höyrystimen. Levyjä sammutettiin 1,5% vetyperoksidia Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa 10 minuuttia ja estetty DAKO seerumivapaassa proteiini lohkon (Dako) 1 h ajan ympäristön lämpötilassa. Levyjä inkuboitiin sitten anti-SPC (sc-7705, Santa Cruz Biotechnology; WRAB-SPC, Seven Hills Bioreagents) ja anti-CCSP (07-623, Upstate Biochemicals) vasta-aineita, 4 ° C: ssa yön yli. Immunofluoresenssitutkimukset kehitettiin käyttämällä TSA sarjat 25 ja 22 (Invitrogen) perusteella valmistajan ohjeiden. Käytimme esto peptidejä ja pois ensisijainen vasta negatiivisina kontrolleina määrittää spesifisyys immunovärjäyksen tuloksia. Immunofluoresenssi visualisoitiin käyttäen mikroskooppia, jossa näkyy fluoresenssi-järjestelmä (Olympus Malli IX71SIF-2). Väri hankinta ja taustan fluoresenssi optimoitiin käyttämällä DPController ja DPManager ohjelmistot (Olympus).

BASC eristämistä ja viljelyä

Hiiret tapettiin 12 viikon kuluttua, ja keuhkojen perfusoitiin 10 ml Hankin tasapainotettua suolaliuosta läpi oikeaan kammioon, kunnes ne poistetaan verta. Rollihenkitorvissa injisoitiin Dispaasi (laimentamaton neste, BD Biosciences) ja sen jälkeen 0,5-1 ml 1% LMP agaroosia vedessä. Keuhkot asetettiin jäille, hienonnettu paloiksi, inkuboitiin 0,001% DNAasia (Sigma D-4527) ja 2 mg /ml kollagenaasi /dispaasin (100 mg /ml, Roche) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa 37 ° C: ssa 45 min, suodatetaan (100 pm ja 40 um huokosia kokoinen suodatin), ja sentrifugoitiin. Saatu pelletit suspendoitiin uudelleen 2 ml: aan PF10 (10% naudan sikiön seerumia fosfaattipuskuroitu suolaliuos), joka tuottaa tyypillisesti 1-2 miljoonaa solua yhteensä hiirtä kohti. Punasolut hajotettiin. BASCs eristettiin lajittelemalla ja Sca-1

pos CD45

neg PECAM

neg CD34

pos solupopulaatio joka kolmas laser 13-väri FACS Aria fluoresenssi-soluerottelijaa (BD Biosciences) joka pystyy lajittelu osapopulaatiot pienellä paineella enintään nopeudella 20 miljoonaa solua /tunti. BASCs oli noin 0,1% koko lajiteltu solupopulaation.

tasaisuus tai puhtauden lajitellut solut ei rutiininomaisesti tarkastaa, koska solut kiinnostava olisi kulutettu prosessissa. Tästä huolimatta solut sort-puhdistaa mahdollisimman puhtaus portittamalla koon (by eteenpäin ja sivusironta), lukuun ottamatta dupleteiksi (by sirontamittari leveys

versus

alue ja sivusirontavirtaussytometriaa leveys

versus

alue), ja eristämällä solujen markkereita kiinnostava. Lisäksi yhdenmukaisuus lajitellun solupopulaatioiden Näissä määrityksissä käytetty näkyi toistettavuus havaintomme;