Krooninen sairaus

tiivistelmä

miRNA ennustetaan valvoa toimintaa noin 60% kaikista proteiinia koodaavan osallistuvien geenien säätelyyn useiden solun prosessien ja sairauksien, kuten syövän. Viime aikoina olemme osoittaneet, että miR-187 on merkittävästi vaimentua eturauhassyövässä (PCA) ja tässä ehdotamme proteomic lähestymistapa tunnistaa sen mahdolliset kohteet. Tätä tarkoitusta varten, PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti miR-187 edeltäjän ja miRNA matkivat negatiivisena kontrollina. Proteiinit analysoitiin kaksiulotteisen erotuksen geelielektroforeesilla (2D-DIGE) ja määritellään differentiaalisesti säänneltyjen jos havaitaan kertainen muutos oli ± 1,06. Sitten, MALDI-TOF-MS-analyysi suoritettiin sen jälkeen, kun proteiinia ruoansulatusta ja vähäisessä määrin proteiineja tunnistettiin LC-MS /MS: llä. Peptidit tunnistettiin etsimällä vastaan ​​Expasy SWISS PROT-tietokantaan, ja tavoite validointi suoritettiin sekä in vitro Western blot ja qRT-PCR ja kliinisissä näytteissä qRT-PCR, immunohistokemia ja ELISA. DIGE analyysi osoitti 9 ilmentyvät eri paikkoja (p 0,05) ja 7 osoitti alassäädetty ilmaisu upon miR-187 uudelleen käyttöön. Näistä tavoitteista tunnistimme aldehydidehydrogenaasille 1A3 (ALDH1A3). ALDH1A3 ilmentyminen oli merkittävästi vaimentua PC3, LNCaP ja DU-145-solujen jälkeen miR-187 uudelleen käyttöön. Tukea näitä tietoja, ilmaus ALDH1A3 havaittiin merkitsevästi (p 0,0001) säädellään ylöspäin PCa näytteitä ja käänteisesti verrannollisia (p 0,0001) kanssa miR-187 ilmaisua, sen ilme on suoraan liittynyt Gleason (p = 0,05). Ilmentyminen ALDH1A3 mitattiin virtsanäytteistä arvioida ennustava kyky tämän biomarkkeri läsnäolon PCa ja kello merkitys tasolla 10%, PSA ja myös ALDH1A3 liittyi merkittävästi positiivinen biopsia Eturauhassyövän. Lopuksi tietomme kuvaavat ensimmäistä kertaa rooli ALDH1A3 kuin miR-187 tavoite PCA ja tarjota oivalluksia hyödyllisyyden käyttämällä tätä proteiinia uutena biomarkkereiden PCA.

Citation: Casanova-Salas I, Masía E, Armiñán A, Calatrava A, Mancarella C, Rubio-Briones J, et al. (2015) MiR-187 tavoitteet androgeenisäädellyn Gene

ALDH1A3

eturauhassyövässä. PLoS ONE 10 (5): e0125576. doi: 10,1371 /journal.pone.0125576

Academic Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 20 lokakuu 2014; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2015 Julkaistu: toukokuu 13, 2015

Copyright: © 2015 Casanova-Salas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Tiedot microarray analyysi ovat saatavilla NCBI Gene Expression Omnibus tietokannan hakunumero GSE45604.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Instituto de Salud Carlos III PI10 /01206, FPI11 /00505, Madrid, FPI (CTQ2007-60601; CTQ2011-18195) alkaen Espanjan tiede- ja koulutus, ja Italian ministeriön tutkimus- ja Instruction (FIRB projekti numero: RBAP11884 M_005), Italian Association for Cancer Research (Katia Scotlandi-AIRC Project N.14049). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCa) on yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syöpäkuolemien syy miehillä [1]. Noin kolmannes miehistä yli 50-vuotiaat esitetään histologiset PCa. Kuitenkin vain 10% näistä on oikein diagnosoitu kliinisesti merkittäviä PCa [2]. PSA-pitoisuudet yhdessä eturauhasen (DRE) ovat tärkeimmät kriteerit PCA diagnoosin, mutta johtavat usein yli diagnoosiin ja ylihoito [3]. Tämän vuoksi tunnistaminen uusien biomarkkereiden pystyy parantamaan diagnoosin ja havaitsemiseen mahdollisesti aggressiivinen PCA tarvitaan parempaa tukea kliinisiä päätöksiä.

miRNA ovat luokan pienen ei-koodaavan RNA-molekyylejä, joka koostuu 19-22 nukleotidin; ne ovat mukana erilaisissa biologisissa prosesseissa, mukaan lukien kehitys, erilaistuminen, apoptoosi ja solujen lisääntymistä. miRNA säädellä geeniekspressiota läpi translaation repression ja mRNA: n pilkkominen yli 60% proteiinia koodaavan geenien [4, 5]. Useat tutkimukset viittaavat siihen, että yksilö miRNA voi säädellä satoja tavoitteet [6] ja voi toimia joko tuumorisuppressorina tai onkogeeni, riippuen kohdegeeneissä [7], sekä edistää aloittamista ja kehittää erilaisia ​​syöpätyyppejä, mukaan lukien Eturauhassyövän [5].

Käyttämällä miRNA mikrosiruanalyysi (NCBI Gene Expression Omnibus tietokannan hakunumero GSE45604), ryhmämme tunnistettu miR-187 tuumorisuppressorina miRNA PCA [8]. Vaikka sen hyödyllisyys on osoitettu diagnostinen ympäristössä, tähän mennessä ei kokeellisesti vahvistettu tavoitteita miR-187 on tunnistettu PCA. Useimmat algoritmit ennustaa miRNA tavoitteet perustuvat pääasiassa sekvenssin täydentävät toisiaan 5’kypsän miRNA ja 3′-alue (3′-UTR) kohde- mRNA: iden; kuitenkin, nämä algoritmit saadaan suhteellisen korkeat sekä vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia [6]. Lisäksi on tunnettua, että yli 25% kokeellisesti vahvistettu tavoitteita ei voida ennustaa millä tahansa yleisin miRNA tavoite ennustaminen ohjelmisto [9]. Siksi geenien ilmentyminen ja proteomiikka seulonta lähestymistapoja tarvitaan pikaisesti kokeellisesti tunnistaa miRNA tavoitteet.

Tässä tutkimuksessa käytettiin Proteomisten lähestymistapaa, joka perustuu kaksiulotteinen geelielektroforeesi (2D-DIGE) seuraa matriisi laserdesorptio-ionisaatio aika-of-lennon (MALDI-TOF MS) analyysi ja, ensimmäistä kertaa, jonka tunnuksena

ALDH1A3

kuin miR-187 kohde PCA. Lisäksi mahdollinen hyöty ALDH1A3 kuin kasvain biomarkkereiden arvioitiin.

Materiaalit ja menetelmät

2.1. Kliiniset eturauhasnäytteissä

Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut (FFPE) lohkot, jotka vastaavat 195 PCa potilasta noudetaan arkistoista Biopankkiverkosto että

Fundación Instituto Valenciano de Oncología

toteutuksessa seuraavat sisällyttäminen kriteerit: yksilöt saadaan radikaali retropubic prostatectomies vuosina 1996 ja 2002 eikä aiemmista hoito PCA (mukaan lukien androgeenien puute hoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta). Kaikki potilaat antoivat tietoon suostumuksensa kudoksen luovuttamista tutkimustarkoituksiin ennen kudoksen keräämistä, ja hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Fundación Instituto Valenciano de Oncología (vrt. Numero. 2010-19). Hylkäämisperusteet sisältyvät kaikki aiemmat käsittelyä tai on muita kasvaimia yhdessä unacceptance lahjoituksen suostumus. Kliiniset tiedot tarkistettiin kliinisestä kirjaa ja tallennetaan PCA-erityiseen tietokantaan. Potilaiden ominaisuudet ja demografiset esitetään taulukossa 1. Gleason oli tasaisesti arvioitiin samalla patologi (AC). Vertailu- ja kalibrointia varten, 8 näytettä normaalin eturauhasen kudosta saatiin potilailta voimakkaassa cystectomies ilman patologisia merkkejä eturauhasen sairaus analysoitiin myös.

Ten tuoretta kudosnäytteitä histologisesti varmennettu PCa haettiin arkistoista of biopankin päässä Hospital Clínico Universitario de Valencia (INCLIVA) validointitarkoituksissa. Yhteensä virtsanäytteet jälkeen saatiin DRE ja välittömästi ennen diagnostisia neulabiopsiaan riippumattoman kohortin 123 miesten epäillään PCA keneltä 63 johtavat positiivisen koepala.

2.2. Solulinjojen ja miRNA transfektio

PC-3, LNCaP, DU-145, ja 22RV1 viljeltiin RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Life Technologies, CA, USA), kun taas Vcap PCa johdettuja soluja viljeltiin DMEM (ATCC, Middlesex, UK) väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml Penincillin ja 0.1ug /ml streptomysiini vakio soluviljelmässä olosuhteissa (37 ° C: ssa 5% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa). miR-187, joka on aikaisemmin todettu vaimentua PCA [8], analysoitiin näissä solulinjoissa qRT-PCR: llä, kuten on kuvattu alla.

PC-3, LNCaP ja DU-145-soluja väliaikaisesti transfektoidaan käyttäen SIPORT NeoFX transfektio Agent (Applied Biosystems, Life Technologies, Kalifornia, USA), jossa on 40 nM esiasteita miR-187 (HSA-miR-187-3p miRNA matkivat) ja miRNA matkivat negatiivisen kontrollin 1 #, mukaan valmistajan protokollan (Applied Biosystems, Life Technologies, Kalifornia, USA). Solut kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja solujen elinkelpoisuus mitattiin sen arvioimiseksi myrkyllisyyden käyttämällä CellTiter 96 Aqueous-radioaktiivista soluproleferaatiomäärityksessä (Promega, Wisconsin, USA) mukaisesti valmistajan ohjeiden.

2.3. Tunnistaminen kohdegeenejä miR-187

Proteiinit MIR-187 matkivat versus miRNA matkivat negatiivinen kontrolli 1 # transfektoitu PC-3-solut analysoitiin kaksiulotteisella ero geelielektroforeesilla (2D-DIGE). Lyhyesti, proteiinit kahden verrattavan ryhmän saostettiin käyttäen 2-D Clean-Up Kit (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Näytteet suspendoitiin uudelleen DIGE värjäyspuskuria DIGE (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 20 mM Tris) ja kvantitoitiin käyttäen Bradfordin proteiinimäärityksellä (BioRad, Hercules, CA, USA). Näytteet leimattiin 400 pmol /50 ug proteiinia kanssa CyDye DIGE Fluor fluoroforeja Cy3 ja Cy5 (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA) valmistajan suosittelemia. Allas sisältävä yhtä suuret määrät kaikista näytteistä valmistettiin myös ja merkitty Cy 2 voidaan käyttää sisäisenä vakiona kaikissa geelit tukea kuvan matching ja rajat geeli tilastollinen analyysi. Kuusi biologinen toistoja jokaisen transfektoitujen näytettä tehtiin kuusi geelit syntyi yhteensä. Proteiini erottaminen suoritettiin kaksiulotteisesta elektroforeesilla. Ensimmäisessä ulottuvuudessa, proteiinit erotellaan niiden isoelektrisen pisteen immobilisoidulla 24 cm lineaarista pH-gradienttia (IPG) liuskojen (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA), kostutetaan nesteytys puskurissa (7 M urea, 2 M tioureaa, 4% CHAPS, 0,5% IPG puskuri, 50 mM DTT) yön yli. Toisessa ulottuvuudessa proteiinit erotettiin mukaisesti molekyylipainon 25 cm x 21 cm x 1 mm 12,5% akryyliamidigeeleillä. Geelit skannattiin Typhoon 9400 Variable tila Imager (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA) ja myöhemmät geeli kuvat tuotiin DeCyder Differential Analysis Software. Proteiinit määriteltiin differentiaalisesti säänneltyjen jos havaitaan kertainen muutos oli ± 1,06 (

p

0,05) välillä miRNA matkivat negatiivinen kontrolli 1 # transfektoidut PC-3 ja miRNA-187 matkivat transfektoituja PC-3. Proteiinidigestio suoritettiin sekvensoimalla luokka trypsiiniä (Promega, Wisconsin, USA), kuten muualla on kuvattu [10]. MALDI-TOF-MS-analyysi suoritettiin sitten käyttäen 0,5 ui digestointiseoksesta täpliksi MALDI tähyslevyn. Sen jälkeen kun kuivaaminen ilmassa pisarat huoneenlämpötilassa, 0,5 ui matriisin [5 mg /ml CHCA (Sigma, St. Louis, MO, USA) 0,1% TFA-ACN /H 2O (1: 1, v /v)] oli ja annettiin kuivua ilmassa huoneenlämpötilassa. Yksi tunnettu näyte käsiteltiin identtisesti laadunvalvonnan. Tuloksena fraktiot analysoitiin 4700 Proteomiikka Analyzer (ABSciex, Framingham, MA, USA) positiivisessa reflektoritoimintatilaa (2000 laukausta kussakin asemassa). Vähäisessä määrin proteiinit tunnistettiin LC-MS /MS: llä käyttäen ansa sarake (NanoLC Column, 3μ C18-CL, 75 μ mx 15cm, Eksigen, Dublin, CA, USA) läpi isokraattinen virtaus 0,1% TFA: 2 μ L /min 10 min aikana. Kun peptidit keskitetty esikolonnilla ne eluoitiin analyyttiseen kolonniin (LC sarake, 3 μ C18-CL, 75um x 25 cm, Eksigen, Dublin, CA, USA) erottamiseksi. Peptidit lopulta eluoitiin käyttäen 5 a 40% B gradientti 30 minuutin aikana, osaksi nanoESI qQTOF massaspektrometrillä (5600 TripleTOF, ABSciex, Framingham, MA, USA). Tiedot MS ja MS /MS analysoitiin Paragon algoritmin, Protein Pilot Software (ABSciex, Framingham, MA, USA). Peptidit tunnistettiin käyttäen tietoja tandem massaspektrit etsimällä vastaan ​​Expasy SWISS PROT-tietokantaan.

2.4. Western blottaus ALDH1A3

In vitro validointitarkoituksiin, transfektoituja PC-3, LNCaP ja DU-145-solujen miR-187 matkivat tai miRNA jäljittelevät negatiivinen kontrolli (72 h) kerättiin, huuhdeltiin PBS: lla ja sen jälkeen hajotettiin jääkylmällä lyysipuskuria (50 mM Tris-HCI, pH = 8, 150 mM NaCl, 0,02% NaN

3, 0,1%, natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 1% Nonidet P-40-detergenttiä (NP40), 0,5% deoksikoolihappoa (DOC), proteaasi-inhibiittoriseoksen tablettia (1 x). Solulysaatit sentrifugoitiin 10000 rpm: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, supernatantti sekoitettiin sitten 5 x SDS-näytepuskuria, keitettiin 5 minuuttia ja erotettiin läpi 12% SDS sivun geelit. elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille elektroforeettisen siirron. kalvot blokattiin 5% rasvatonta maitoa 1 h ajan, huuhdeltiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden: ALDH1A3 (Novus Biologicals, Littleton , CO, USA, 1: 500 laimennos) ja β-aktiini (Millipore, Billerica, MA, USA, 1: 200000 laimennus). Ylimääräinen vasta-aine poistettiin sitten pesemällä kalvo PBS /0,1% Tween 20, ja kalvot olivat inkuboitiin 1 tunnin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineet: vuohen anti-hiiri IgG- tai aasin anti-kani-IgG: tä (1: 10000) (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Sen jälkeen pesun PBS /0,1% Tween 20, immuuni-tunnistus suoritettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssi (ECL) Western blotting havaitsemisjärjestelmä (Euroclone, Milano, Italia), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

2,5. miRNA tavoite reportterimääritys

PC-3 miR-187 matkivat tai negatiivinen kontrolli solut transfektoitiin 3’UTR Go Clone Reporter (50 ng) (kytkinlaitteet Genomics, La Hulpe, Belgia), joka sisältää 3′-UTR-sekvenssin ALDH1A3 kloonattu alavirtaan RenSP lusiferaasireportterigeenin tai tyhjän vektorin, joka sisältää vain lusiferaasireportteri- käyttäen Dharmafect 2 reagenssia (Dharmacon, GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Solut hajotettiin ja toimittaja aktiivisuus mitattiin 24 tuntia transfektion jälkeen käyttäen LightSwitch Luciferase Assay Reagent (kojeistovalmistajille Genomics).

2.6. RNA: n eristys ja qRT-PCR

eristäminen RNA molemmissa solulinjoissa ja kliinisistä näytteistä suoritettiin käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Technologies, CA, USA). Kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttäen TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit ja miRNA-specific varsi-silmukka-alukkeita (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA) ja High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA) valmistajan merkintöjä. Sitten 2 ui tätä cDNA: ta, joka vastaa 96 PCa kasvainnäytteet, monistettiin reaaliaikaisen PCR: n lopullisessa tilavuudessa 10 ui reaktiota kohti ABI 7500 nopea thermocycler käyttäen mRNA: määrityksiä (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA). Sillä miRNA arviointi, 1,33 ui miRcDNA monistettiin lopullisessa tilavuudessa 20 ui. miRNA määritykset RU44 (001094), RU48 (001006) ja miR-187 (001193), ja mRNA: n määritys

ALDH1A3

(Hs00167476_m1) käytettiin (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA). Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Suhteellinen ilmentyminen mRNA: iden tai miRNA määritettiin käyttämällä keskimääräistä arvoa kontrollinäytteitä kalibraattori ja sen jälkeen, kun 2

-ΔΔCt menetelmä [11]. Solulinjan arviointien miR-187 ilmentyminen analysoitiin qRT-PCR: llä käyttämällä universaali ihmisen RNA-allas (Cat # 740000 Stratagene, La Jolla, CA), kuten normalisoinnin ohjaus.

2.7. Immunohistokemialla ALDH1A3

Sama FFPE PCa lohkoja käytetään RNA-analyysi sisällytettiin 11 kudossiruina (TMA). Kaksi tai kolme edustavalla (1 mm: n halkaisija), kunkin kasvaimen valittiin TMA tuotantoa ensin tutkimalla hematoksyliinillä eosiini-värjättyä prostatektomia kasvain dia ja sitten näytteenotto kudosta vastaavasta parafiinilohkoihin. Kudos mikrosiru väline (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI) käytettiin TMA kokoonpanoon. Vuodesta TMA lohkot, 3 um: n paksuisia leikkeitä alistettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä käyttäen kaniinin anti-ihmis-ALDH1A3 polyklonaalista-Ab (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA, 1:50). Ihmisen eturauhasen kudosta käytettiin positiivisena kontrollina kuin valmistajan suosittelemia. Prosenttiosuus ALDH1A3-positiivisten solujen ja sytoplasmista värjäytymistä intensiteetti pisteytettiin semikvantitatiivisesti, jotka muodostavat neljä ryhmää (0-3). Tapaukset pisteytettiin niin alhainen ekspressöijiksi kun värjäytymisen intensiteetti oli välillä 0 ja 1, ja runsaan ilmentymisen, kun voimakkuus oli 2 ja yläpuolella.

2.8. ALDH1A3 ELISA

virtsanäytteet 123 potilasta, joilla epäillään PCa sentrifugoitiin 1000 x g poista roskat. Virtsa Supernatantti käytettiin arvioitaessa ALDH1A3 proteiinin taso käyttämällä kvantitatiivista ihmisen sandwich ELISA Kit (Blue Gene Biotech Co Ltd, Shanghai, Kiina). Standardi viittaus oli välillä 0 ja 50 ng /ml, jossa on sisäinen ja määritysten välinen CV on alle 10%. Optinen tiheys (O.D.) määritettiin 450 nm: ssä käyttäen Victor Multilabel Plate Reader (PerkinElmer Life Sciences, Massachusetts, USA).

2.9. Tilastollinen analyysi

Tutkia ennustetekijöiden arvo

ALDH1A3

geeni käytimme binary muuttujia heijastaa positiivisuuden toimenpiteitä. Yhdistyksen välillä

ALDH1A3

ilmaisun ja kliinis parametrit (kategorinen) arvioitiin käyttäen Spearman kanssa merkitys harkita 5%. Vaikutus biologisten tekijöiden BPF: iin ja kliinisiin PFS määritettiin Kaplan-Meier suhteellinen riski log rank -testi [12]. Biokemialliset eteneminen määriteltiin seerumin PSA suurempi kuin 0,4 ng /ml seurannan aikana ja kliinisen etenemisen määriteltiin paikallisten (eturauhasen fossa), alueelliset (imusolmukkeet) tai kaukana (etäpesäke) eteneminen. BPF: t ja kliininen PFS pidettiin yksittäin alkaen leikkaus päivämäärä tapahtuman. Tilastollinen analyysi tehtiin SPSS, versio 20.0. Studentin t-testiä aplying FDR, p-arvo, PCA ja hierarkkinen klusterointi levitettiin näytteisiin proteomic tutkimuksen. Kaikki tulokset esitetään keskiarvona ± SEM (GraphPad Prism 4.0 Software, Graph Pad Software, Inc.) B

Tulokset

3.1. miRNA ilmaisu PCA solulinjoissa

analyysi miRNA tasoja qRT-PCR vahvisti vähentynyt ilmentyminen miR-187 PCA solulinjoissa: PC-3, LNCaP, DU-145 ja 22RV1 (kuvio 1A). PC-3 MIR-187 ilmentymisen taso oli vastaava kuin aiemmin havaittu PCa potilailla [8], ja tästä syystä tämä solulinja valittiin myöhempää analyysiä.

A) Expression of miR-187 analysoitiin qRT-PCR: llä käyttämällä universaalia ihmisen RNA-allas kalibraattorimatriiseina normalisoida suhteellinen ilmentyminen analysoitiin miRNA jälkeen 2

-ΔΔCt menetelmällä. Kuten voidaan ymmärtää, kaikki solulinjat mutta VCAP osoitti alas-säätely miR-187. B) miR-187 miRNA matkivat ja miRNA matkivat negatiivisen kontrollin transfektoitiin PC-3, LNCaP ja DU-145 solujen 72h. Uudelleen käyttöön miR-187 PC-3, LNCaP ja DU-145 vahvistettiin reaaliaikainen PCR. Histogrammi näyttää kasvu miR-187 mRNA tasolla miR-187 miRNA matkivat transfektoituja soluja verrattuna transfektoitu miRNA jäljitellä negatiivinen kontrolli ja ei-transfektoiduissa soluissa.

3.2. Tunnistaminen ALDH1A3 putatiivisiksi miR-187 kohde

Jotta voitaisiin tunnistaa mahdolliset kohteet ja miR-187 sarjan proteomiikka-analyysi ja validointi kokeita tehtiin. miR-187 miRNA matkivat otettiin uudelleen käyttöön vuonna PC-3, LNCaP ja DU-145 ja osoitti, että miR-187 ilmentyminen erittyi PC-3, LNCaP ja DU-145-soluissa (kuvio 1 B). Globaali proteomic lähestymistapaa käyttäen DIGE ja LC-MS /MS suoritettiin näytteitä PC-3-solut transfektoitu negatiivinen kontrolli ja PC-3 transfektoitu miR-187 miRNA matkivat. Solut kerättiin 72 transfektion jälkeen, hajotettiin ja erottaa kaksiulotteisesta elektroforeesilla. Erottamisen jälkeen proteiinin tiivisteet ja fluoresenssin skannaus, 9 ilmentyvät eri paikkoja havaittiin (kuvio 2A). Nämä 9 proteiinitäplien (p 0,05) näytetään ainakin 1,06 kertainen sääntely yli kuusi riippumatonta koetta. Seitsemän näistä 9 täplät osoittivat alassäädetty ilmaisu upon miR-187 uudelleen käyttöön, mikä oli yhdenmukainen odotetun estävä vaikutus miRNA useimmista tavoitteensa (S1 taulukko). Näistä tavoitteista aldehydidehydrogenaasille 1A3 (ALDH1A3) tunnistettiin (kuvio 2B).

PC-3-soluja transfektoitiin joko miRNA matkivat negatiivinen kontrolli tai miR-187 miRNA matkivat, korjattu 72 h kuluttua, ja proteiini lysaatit leimattu Cy3 tai Cy5 (miR-187 ja ohjaus) ja Cy 2 sisäisen standardin. A) 2D-DIGE geelikuva saadaan pH 3-10 ja 12,5% SDS-polyakryyliamidi. Numerot viittaavat tunnistamista annetaan paikkoja ilmentyvät differentiaalisesti. Spot 655 edelleen tunnistetaan LC-MS /MS ALDH1A3. B) vertailu ilmentymisen yksi paikoista (655 tai ALDH1A3), kuuden geelit analysoitiin solujen välillä, jotka on transfektoitu miR-187 tai negatiivisen kontrollin. Keskimääräinen kertainen muutos välillä kaksi ehtoa oli -1,06, jonka p-arvo on 0,003. ALDH1A3, aldehydidehydrogenaasin perhe 1 jäsen A3

3.3. Validointi

ALDH1A3

putatiivisiksi miR-187 kohde

Sen osoittamiseksi, että

ALDH1A3

on tavoite miR-187, bioinformatiikan tavoite seulonta; yleisimpien miRNA tavoite ennustaminen ohjelmisto (Targetscan, Pictar ja Miranda) suoritettiin. Kuitenkaan mikään näistä ohjelmista vastasi 3′-UTR alue

ALDH1A3

kanssa miR-187 sekvenssin. Kuitenkin sovellettaessa RNA22 työkalu, joka ei perustu rajat lajien suojelu, on joustava melulle ja mahdollistaa G: U pariksi kohde mRNA miRNA siemenet järjestyksessä [13], vahvisti ottelua

ALDH1A3

ja MIR-187 siemenen sekvenssin (kuvio 3A).

A) RNA22 ennustettu mRNA-miRNA heterodupleksien. RNA22 v1.0 ohjelmisto ennustettu kolme erilaista miR-187 sitoutumiskohtien ALDH1A3 mRNA-sekvenssin. Otaksutun miR-187 sitoutumiskohtia löydettiin ALDH1A3 5’UTR-alue (i), koodaavan alueen (CDS) (ii ja iii) ja 3’UTR (iv). Kaikki ne saavuttaa kriteerit emäsparin minimiarvo 14 ja enintään taitto energia -25. B) Western blot-analyysi osoittaa ilmentyminen vähenee proteiinin ALDH1A3 kun uudelleen käyttöön miR-187 (miR-187 miRNA matkivat transfektoidut solut), mikä vahvistaa inhiboiva vaikutus miRNA kautta oletetun tavoite. Solut transfektoitiin miR-187 miRNA matkivat tai negatiivinen kontrolli ja korjattu 72 h kuluttua. Yhteensä solu-uutteet valmistettiin ja elektroforeesilla SDS-PAGE, jota seurasi immunoblottaus anti-ALDH1A3 vasta-aine. Tasapuolisen Proteiinilisäyksen kalvo immunoblotat- anti β-aktiini vasta-aine. C) lusiferaasireporttiterilla määritys suoritettiin tulikärpäsen lusiferaasi ohjauksessa ALDH1A3 3 ’UTR vahvistaa inhibition ALDH1A3 mRNA: n ilmentymisen (20%: n lasku lusiferaasin signaali), kun miR-187 uudelleen käyttöön. Tiedot esitetään suhteessa vektorisäätö annetaan arvo 100. keskiarvo ± s.e.m. Kolmen itsenäisen kokeen näkyy. D) yli-ilmentyminen ALDH1A3 mRNA vahvistettiin kohortin ihmisen eturauhasen kasvain (n = 96). Oli käänteinen korrelaatio (ei tilastollisesti merkitsevä) välillä alas-säätely miR-187 löytyy näitä näytteitä ja ylös-säätely ALDH1A3.

Validoida Näiden havaintojen varmistimme vahva alas -regulation of ALDH1A3 upon miR-187 uudelleen käyttöön western blot analyysi PC-3, LNCaP ja DU-145-soluja (kuvio 3B).

edelleen varmistamiseksi roolia

ALDH1A3

kuten miR-187 kohdistaa lusiferaasireportteriplasmidi, joka sisältää 3′-UTR-sekvenssin

ALDH1A3

kloonattiin PC-3-solut transfektoitiin miR-187 matkivat. Tehostettu ekspressio miR-187 (PC-3 miR-187 matkivat) vähensi merkittävästi reportteriaktiivisuutta 3’UTR

ALDH1A3

rakentaa noin 20% kontrolliin verrattuna (PC-3 NC matkivat) (kuvio 3C) .

qRT-PCR tiedot osoittivat suuremman ilmentymisen

ALDH1A3

(1,2-kertainen) verrattuna näytteisiin uudelleen ilmentävät miR-187 (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi vertasimme ilmaus

ALDH1A3

mRNA ilmaisun kanssa alas-säätely miR-187 kahdessa itsenäisessä kohorttia ensisijaisen PCa kasvainten FFPE (n = 96) (kuvio 3D) ja tuoreesta kudoksesta (n = 10) (S1 Kuva). Kuitenkaan mitään korrelaatiota

ALDH1A3

ja kliinis parametrien todettiin, ja sitten odotetusti,

ALDH1A3

eivät muodosta ennustetyövälineenä indikaattori joko BPF: iin (p = 0,773) tai PFS (p = 0,430 ) tässä sarjassa.

ALDH1A3 proteiinin ekspressio arvioitiin edelleen immunohistokemialla (IHC) on 195 tapauksissa sisältyvät TMA (kuvio 4). Olemme havainneet, että ALDH1A3 oli merkitsevästi (p 0,0001) säädellään ylöspäin PCa näytteistä (keskimääräinen intensiteetti = 1,42) verrattuna normaaliin eturauhasen kudoksen (keskimääräinen intensiteetti = 0,12). Lisäksi jotta roolin tutkimiseksi

ALDH1A3

kuin miR-187 kohde, tutkimme korrelaatio miR-187 ilme. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että miR-187 ilmentyminen oli merkittävästi korreloi käänteisesti (p 0,0001) ja ALDH1A3 proteiinin ilmentymisen. Olemme edelleen tutki korrelaatio

ALDH1A3

kanssa kliinis parametrien ja ennustetta. Vaikka ALDH1A3 ilmaisu ei ole prognostinen indikaattori, löysimme tilastollisesti merkitsevä suorassa suhteessa Gleason (p = 0,05). Näin ollen 37%: ssa tapauksista, joissa on Gleason pisteet 7 osoitti korkea ALDH1A3 värjäytymisen intensiteetti verrattuna 56% Eturauhassyövän kanssa Gleason≥7.

immunohistokemiallinen värjäys ALDH1A3 on huomattavasti suurempi (p 0,0001) kasvaimen näytteet (oikealla) kuin terveillä (vasemmalla). Värjäys eri kasvaimen laadut (Gleason tulos on pienempi kuin 7, yhtä suuri tai suurempi kuin 7) verrattiin löytää suoraa korrelaatiota Gleason pisteet ja ALDH1A3 lauseke (p = 0,05). Immunohistokemiallinen värjäys on esitetty ALDH1A3 (oikea palsta) kussakin näytteessä yhdessä hematoksyliinillä eosiini-värjättyä kudoksen (vasen sarake).

edelleen tutkia roolia

ALDH1A3

taudinmäärityksen ympäristössä teimme ELISA-määritystä mittaamaan ALDH1A3 ilmentymistä virtsaan (n = 123 ). Univariate logistinen regressiomalli suoritettiin arvioimaan ennustava kyky tämän biomarkkereiden yhdessä PSA, läsnäolo PCA diagnostisten koepaloja. Merkittävyystasolla 10%, PSA ja ALDH1A3 olivat molemmat merkittävästi yhteydessä positiivinen biopsia Eturauhassyövän (kuvio 5).

ROC käyrät PSA ja ALDH1A3 ennustamiseen PCA virtsanäytteistä. Alueet käyrän alla ovat 0,610 (95% CI 0,509-0,710; p = 0,036 ja 0,591 (95% CI 0,490-0,692; p = 0,083) vastaavasti. Merkittävyystasolla 10%, sekä PSA ja ALDH1A3 liittyi merkittävästi positiivinen biopsia Eturauhassyövän.

keskustelu

miRNA ennustetaan valvoa toimintaa noin 60% kaikista proteiineja koodaavat geenit, ja niiden on osoitettu osallistumaan säätelyssä useita soluprosesseihin. By emäspariutumisen mRNA: ihin, MikroRNA sovitella translaation tukahduttamisen tai mRNA: n hajoamisen [4]. Olen aikaisemmin osoittanut roolin miR-187 PCA etenemistä ja diagnoosi [8], päätimme tutkia edelleen mahdollisia kohteita tämän miRNA että voitaisiin myös kiinnostava biomarkkereina. tätä varten me uudelleen miR-187 esiasteena PC-3-solujen ja suoritti proteomic lähestymistapaa.

Jaksot tunnustettu miRNA siemeniä löytyy monien geenien, mikä vaikeuttaa tunnistaa fysiologisesti relevantti miRNA-kohde suhteet sekvenssianalyysistä yksin [14]. Lisäksi aiemmat tulokset, jotka saatiin Yang et al. [6] ja Schramedei et ai. [15] vahvistettiin, että vähemmän kuin 10% proteiineja tunnistetaan proteomic lähestymistapa ennustettiin yleisesti käytetyt algoritmit, kuten Pictar, Targetscan Miranda. Mukaisesti Näiden havaintojen yksikään proteiinien tunnistaa proteomic seulonta esillä olevassa tutkimuksessa ennustettiin

in silico

edellä mainitut algoritmit. Kuitenkin käyttämällä RNA22 työkalun oli mahdollista löytää ottelua miR-187 ja meidän potentiaalisia kohde

ALDH1A3

koodausalue (CDS). Tämä algoritmi on erilainen kuin aiemmin raportoitu menetelmiä, että se ei käytä lajien välisen sekvenssin säilyttäminen suodatin, jolloin löydettiin mikroRNA sitoutumiskohdat, että ei voi olla läsnä läheisten lajien [13]. Lisäksi RNA22 otetaan huomioon hypoteesi, että lisäksi 3’UTRs useita sitoutumiskohtia ovat todennäköisesti olemassa 5’UTRs ja CDS voidaan tunnistaa aiemmin tunnistamattomia miRNA /mRNA-heterodupleksien.

Tässä tutkimuksessa , 9 otaksuttu tavoitteita miR-187 tunnistettiin 2D-DIGE ja MS-analyysi (S1 taulukko). Näistä valitsimme aldehydidehydrogenaasille 1A3 (

ALDH1A3

) tutkitaan tarkemmin, koska se on kuvattu säänneltävä androgeenien [16]. Western blot-analyysi, qRT-PCR ja IHC vahvisti suora sääntely

ALDH1A3

by miR-187. Ensinnäkin käänteinen korrelaatio ALDH1A3 ja miR-187 vahvistettiin talteen miR-187 ilmentymistä PC-3, LNCaP ja DU-145-soluissa, mikä johti alas-säätely ALDH1A3 proteiinin tasoja. Toiseksi, inhiboiva vaikutus miR-187 ALDH1A3 ilmentyminen vahvistettiin edelleen lusiferaasireport- määritystä, joka väheni ALDH1A3 ilmentyminen (-20%: n vähennys Lusiferaasisignaali), kun miR-187 matkivat transfektiota. Kolmanneksi inhibitio

ALDH1A3

havaittiin analysoitaessa kohortin PCa ihmisen potilaan näytteitä, sekä tuoreena että FFPE kudoksissa. Näissä ikäluokat, voimakas säätely alaspäin miR-187 oli mukana lisääntynyt

ALDH1A3

mRNA ilmaisun. Forth, rooli

ALDH1A3

kuin miR-187 tavoite varmistettiin IHC analyysi. Näin ollen, ALDH1A3 havaittiin olevan säädellään ylöspäin eturauhastuumoreissa ja tämän proteiinin ilmentymisen korreloi käänteisesti ekspression miRNA. Lisäksi mahdollista roolia

ALDH1A3

ehdokkaaksi ennustetekijöitä biomarkkerina PCA arvioitiin, vaikka kohortin analysoitujen näytteiden se ei tarjonnut mitään lisätietoja. Kuitenkin yhdistys

ALDH1A3

ilmaisutapoja Gleason antaa näyttöä kasvusta

ALDH1A3

ilmaisun kanssa tuumorin luokitus. Olemme aiemmin esitetty, että menetys miR-187 aikana PCa etenemisen voisi osoittaa rooli tuumorisuppressoriproteiinia [8]. Lisäksi ALDH1A3 todettiin yhteistyössä PSA ennustaminen biopsia tuloksen. Sen lisäksi yhdessä läsnäolo kasvaimen IHC of FFPE dioja, pystyimme mitata ALDH1A3 virtsanäytteistä, löytää positiivinen yhteys kasvaimen ulkonäkö.