Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska tärkeät roolit miRNA jälkeisessä transkription säätelyyn ja sen vaikutuksia syövän, luonnehdinta miRNA helpottaa meitä paljastaa molekyylitason mekanismit etenemistä androgeenista riippumaton eturauhassyöpä (PCA). Syntymistä seuraavan sukupolven sekvensointiteknologioihin on dramaattisesti muuttunut nopeutta kaikilla sekvensoinnin nopeasti ja kustannustehokkaasti tavalla, joka voi sallia puolueettoman, määrällisen ja perusteellisen tutkimuksen pienten RNA transcriptome. Tässä tutkimuksessa käytimme suurikapasiteettisten Illumina sekvensointi kattavasti edustamaan täysi yksittäisten pienten RNA ja luonnehtia miRNA ekspressioprofiileja sekä androgeeniriippuvaista ja itsenäinen Pca solulinja. Ainakin 83 miRNA merkittävästi ilmentyvät eri, joista 41 ovat säädelty ja 42 alassäädetty merkitty näiden miRNA saattaa olla mukana siirtymistä LNCaP on androgeenista riippumaton fenotyyppi. Lisäksi olemme tunnistaneet 43 novel miRNA päässä androgeeniriippuvaista ja itsenäinen PCa kirjasto ja 3 heistä ovat ominaisia ​​androgeenisäädellyn riippumaton PCa. Toiminto merkintä kohdegeenien osoitti, että suurin osa näistä ilmentyvät eri miRNA taipumus kohdistaa geenien signaalitransduktioon ja solujen viestintä, epically MAPK signalointireitin. Pieni RNA transcriptomes Tässä tutkimuksessa saadut tarjota huomattavia oivalluksia paremmin ymmärtämään ilmentymistä ja toimintaa pieniä RNA: ita kehittämisessä androgeenista riippumaton eturauhassyöpä.

Citation: Xu G, Wu J, Zhou L, Chen B, Sun Z, Zhao F, et ai. (2010) karakterisointi Small RNA Transcriptomes of androgeeniriippuvaisessa ja Independent eturauhassyöpäsolulinja Deep Sequencing. PLoS ONE 5 (11): e15519. doi: 10,1371 /journal.pone.0015519

Editor: Patrick Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 01 elokuu 2010; Hyväksytty: 06 lokakuu 2010; Julkaistu: 30 marraskuu 2010

Copyright: © 2010 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Zhejiangin maakunnan Natural Science Foundation of China (nro Y2100902), Wenzhou Science and Technology Project (Y20100011), Zhejiangin maakunnan tieteen ja teknologiayhteisön määritykseen ja testaukseen teknologiaprojektit (2009F82G2090045) ja National High Technology tutkimuksen ja kehittämisen ohjelma Kiina (2006AA02A304). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCa) on yleisin maligniteetti miehen virtsa- ja sukupuolielinten ja kolmas johtava syöpäkuolemien syy [1], [2]. Koska PCa kasvu on aluksi riippuvainen androgeenien eloonjäämisestä androgeenien puute hoitoa (ADT) on hoidon kulmakivi PCA. Nämä kasvaimet lopulta edetä androgeenista riippumaton fenotyyppi ja eivät vastaa ADT hoitoa, tulossa suurin este kliinisen hoidon. Ymmärtäminen molekyyli- mekanismeihin, jotka ovat etenemistä androgeenista riippumaton PCA irtoa merkittävää valot mahdollisista hoitostrategioiden PCA. miRNA (MikroRNA) ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: ta (~20-22 nukleotidia), joka säädellä negatiivisesti geenin ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla [3]. Kertyvät todisteet osoittavat, että miRNA voi toimia tuumorisuppressoreilla ja oncogenes [4], [5]. Ottaen huomioon sen tärkeän roolin miRNA jälkeisessä transkription säätelyyn, tunnistaminen näiden differentiaalisesti ilmaistaan ​​ja uusia miRNA helpottaa meitä paljastaa molekyylitason mekanismit etenemisen androgeenista riippumaton eturauhassyöpä.

karakterisoimiseksi pieniä RNA transcriptome uusi ”deep-sekvensointi” tekniikoita, kuten Roche 454 ja Illumina Solexa, on käytetty, joilla on merkittäviä etuja aikaisempiin hybridisaatioon perustuvia menetelmiä, kuten microarray ja PCR-perustaiset määritykset [6], [7]. Ensinnäkin se tarjoaa entistä yhtenäinen kuva miRNA transcriptome. Suurikapasiteettinen sekvensointi on kyky tunnistaa vaatimaton tai jopa alhainen runsas miRNA näytteille ilmaisun eroja erillisistä näytteistä, siinä määrin, että aiemmin ei voitaisi tehokkaasti havaita. Toiseksi suora sekvensointi tarjoaa myös mahdollisuuksia havaita pituuden vaihtelu kypsä miRNA ja mahdolliset entsymaattisen muutoksia. Kolmanneksi, suurikapasiteettisten sekvensointi mahdollistaa onnistuneen löytö uusien miRNA, joiden ei tarvitse tukeutua hakujen ehdokas genomin alueita, vaan voidaan saavuttaa suora havainnointi ja validointi taitto potentiaalin reunustavan genomisen sekvenssin. Yhdessä seuraavan sukupolven sekvensointi teknologia tarjoaa erittäin vankka, tarkka ja skaalautuva järjestelmä, joka asettaa uudet standardit nopea, tuottavaa ja kustannustehokasta tutkimus miRNA transcriptome.

Tähän asti on kuusi genominlaajuisten miRNA ilmaisun tutkimukset eturauhassyövän tarkastelleet Gandellini et al. [8]. Ensimmäinen miRNA ilmentymisen profilointi eturauhassyövän suoritettiin Lu ja työtovereiden [5], jossa he käyttivät helmi-pohjainen virtaussytometristen tekniikkaa arvioimaan miRNA profiloinnin eri kasvaintyypeissä. Loput viisi tutkimuksessa sovellettu microarray tai helmi-pohjainen hybridisaatio menetelmä tutkia miRNA ilmentymisen allekirjoitukset eturauhassyövässä verrattuna normaaliin kudokseen, ja yksilöitiin poikkeavien ilmaistuna miRNA kasvainsoluissa. Kuitenkin nämä tutkimukset vasta keskityttiin vertailuun miRNA ekspressioprofiileja välillä PCa näytteiden ja ympäröivän ei-tuumorikudoksia, vaikka ei paljastaa millaisia ​​miRNA saattaa korreloida siirtymistä androgen-herkkä androgeeni-riippumattomia eturauhassyövässä. Viimeksi Sun et al. todettiin, että useat miRNA, erityisesti miR-221 ja miR-222, oli merkittävästi-ilmaistuna androgeeni-riippumaton syöpäsolujen verrattuna androgeenistä riippuvaa solulinjaa, ja hiljaista osallistumista sekä miRNA in kehittymistä ja etenemistä androgeenin-riippumattomuus eturauhassyövän [9]. DeVere White et ai. (2009) tunnistaa pieni joukko miRNA oli poikkeuksellisesti ilmaistu androgeeni-riippumaton PCa solulinjoissa käyttämällä sirutekniikalla [10]. Yksityiskohtainen vertailu miRNA ekspressioprofiileja välillä androgeeniriippuvaisen ja androgeenista riippumaton syöpiä voi paljastaa, miten miRNA reitin osallistuu etenemisen eturauhasen syövän androgeeniriippumattomuuteen. Käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi, olemme saaneet miRNA ilmaisun allekirjoitusta androgeenista riippumaton eturauhassyöpä ja tunnistettu 83 miRNA differentiaalisesti ilmaistut LNCaP-AI solulinjoissa sekä otaksuttu tavoitteet näille miRNA. Tietääksemme tämä tutkimus on ensimmäinen esimerkki pienten RNA transcriptome korkean suoritustehon sekvensoinnin eturauhasen syöpä ja on osoittanut, että syvä sekvensointi voi toimia ihanteellinen, nopea ja kustannustehokas alustan luonnehdinta pienten RNA ekspressioprofiileja.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

androgeeniriippuvaisissa LNCaP-solulinja saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD) ja sen rutiininomaisesti yllä säännöllisesti väliaine: fenolipunaista-positiivisia F-12 (Gibco), jossa oli 10% FBS: ää (Biowest) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Solut syötettiin kahdesti viikossa ja jakaa kerran viikossa trypsinisaation (määritelty yhdeksi passage). Perustaa androgeeni-riippumaton solulinja, LNCaP pidettiin ensin fenolipunaista vapaata DMEM /F-12-väliaineessa (Gibco), 10% puuhiilellä /dekstraani-FBS: ää (Biowest). Sen jälkeen, kun niitä viljeltiin 5 viikkoa, solut siirrettiin edellä väliaineessa 1,0 x 10

-7 mol /l flutamidi (Schering Plough) ja viljeltiin vielä 105 kohdat.

proliferaatiomääritystä

solut ympättiin tiheydellä 3 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle viljelylevylle 90 ui säännöllisesti media. 24 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, elatusaine vaihdettiin puolet kuopat saavat säännöllisesti keski- ja puoli vastaanottaa androgeenien väliainetta (ilman fenolipunaista väliaineessa 5,0 x 10

-6 mol /l FLUTAMIDE). Soluja inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa 72 tunnin ajan, lisättiin 10 ui CCK-8 liuos (Dojindo) lisättiin kuhunkin kuoppaan, minkä jälkeen inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa, ja absorbanssi lopulta määritettiin 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Bio-Rad).

Western blottaus suoritettiin menetelmillä, joita on kuvattu aikaisemmin [11]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: kanin anti-Bcl-2 (1:200, Cell Signaling), kanin anti-Bax (1:100, Cell Signaling) ja hiiren anti-β-aktiini (1:1000, Cell Signaling).

Cell Cycle määritys

solut suspendoitiin hormonitonta ja säännöllinen keskisuurten vastaavasti ja sitten istutettu kolmessa 24-kuoppaisille levyille, joissa on useita 3,3 × 10

5 solua kohti hyvin. Inkuboinnin jälkeen 5% CO

2 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan, flutamidi lisättiin reikiin. Solut kerättiin inkuboinnin jälkeen 5% CO

2 37 ° C: ssa 72 tunnin ajan. Esikäsittelymenettely solusyklin analyysi jälkeen käsikirja Cycle Test

plusDNA Reagent Kit (Becton Dickinson). Solusyklin analyysi tehtiin FACScan-virtaussytometrillä (BD Company).

Reaaliaikainen RT-PCR

Pieni RNA: iden ( 200 nt) on eristetty

Mirvana

™ PARIS ™ Kit (Ambion) mukaan valmistajan ohjeiden. RT reaktiot, 1 ug pieniä RNA: ta käytettiin käänteistranskriptioon kanssa miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen), suoritettiin 37 ° C: ssa 60 min ja lopullinen inkubaatio 95 ° C: ssa 5 min. MiRNA reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin käyttäen miScript SYBR Green PCR-pakkausta (Qiagen) käyttäen Applied Biosystems 7000 reaaliaikainen PCR-laite (ABI). PCR-reaktio suoritettiin 95 ° C: ssa 15 min, jota seurasi 40 sykliä, joissa oli inkuboitu 94 ° C: ssa 15 s, 55 ° C: ssa 30 s, ja 70 ° C: ssa 30 s. Kukin PCR toistettiin vähintään kolme kertaa. Suhteellinen ekspressiotaso kunkin miRNA normalisoitiin vastaan ​​U6 snRNA tasoilla. Fold-muutos laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmällä.

Small RNA kirjasto Rakentaminen ja Suurikapasiteettinen Sequencing

Eristetty kokonais-RNA fraktioidaan koon 15% tris -borate-EDTA (TBE) urea polyakryyliamidigeelissä rikastamiseksi molekyylien 15-30 nt. Pieni RNA ligoitiin 3 ’(5′-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT-3′) ja 5 ”(5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3 ’), sovittimet käyttäen T4-RNA-ligaasia, ja se oli jälleen fraktioidaan koon 15% TBE urea polyakryyliamidigeelillä. Saatu RNA käänteisesti cDNA: ksi, jossa Solexa pieni RNA RT-aluketta (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ’). CDNA: ta käytettiin templaattina PCR-monistus käyttäen Solexa pieni RNA alukesarja (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ’; 5′-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’). Lopuksi, noin 20 ug pienten RNA käytettiin sekvensointiin käyttämällä Illumina 1 G Genome analysaattorin mukaan valmistajan protokollia.

Lue Filter ja Small RNA Lisäykset

deep-sekvensointi lukee tuottaman Illumina Genome Analyzer, heikkolaatuisia lukee erotettiin suodattamalla jättää nämä todennäköisimmin edustaa sekvensointivirheitä ja 3/5 ”sovitin sekvenssit jälkeen leikattu puhtaaksi täyspitkä lukee muotoiltuja ei-tarpeeton Fastaa muodossa. Esiintymät uniikkeja järjestyksessä lukee laskettiin kuten sekvenssin leimoilla (lukumäärä lukee jokaisen tag heijastaa suhteellinen ilmentymistaso) ja vain pieniä RNA-sekvenssit 18-30 nt oli tarkasteltiin yksityiskohtaisemmin.

Kaikki ainutlaatuinen sekvenssi tunnisteet, jotka läpäisevät edellä suodattimet kartoitettiin päälle viittaus ihmisen genomin käyttäen SOAP 2.0 ohjelmaa korkeintaan kaksi epäsuhta [12]. Myöhemmin ainutlaatuinen sekvenssimerkkejä rinnastettiin vastaan ​​miRBase14.0, laskennallisesti ennustaa ihmisen ncRNAs ja Rfam 9,1 (https://rfam.sanger.ac.uk/), The RepeatMasker merkintä alkaen RepBase 14.09 (http: //www.girinst. org /), ihmisen geenit UCSC merkintä hg18 (https://genome.ucsc.edu/) luokitella tiedossa miRNA, hajoamista fragmentteja ei-koodaavan RNA genomin toistoja ja mRNA, vastaavasti. Sekvenssit, jotka eivät ole päällekkäisiä tahansa näistä merkeistä, mutta voitaisiin yhdenmukaistaa viitteen genomin oli nimetty ”luokkiin”.

Differential Expression Detection ja Novel miRNA Prediction

Jos haluat vertailla ilmentyvät eri miRNA välillä LNCaP ja LNCaP-AI, lukea laskee kunkin nimetyn miRNA normalisoitiin kokonaismäärä miRNA lukee. Tilastollinen merkitsevyys (P-arvo) oli päätellyt perustuu Bayes menetelmää, joka on kehitetty analyysi digitaalisen geeniekspressioprofiilien ja voisivat selittää näytteenottoa vaihtelevuutta tunnisteet alhainen määrä [13]. Erityinen miRNA katsottiin merkittävästi ilmentyvät eri jos

P

arvo annetaan tällä menetelmällä oli ≤0.001 ja siellä oli ainakin 2-kertainen muutos normalisoitu järjestyksessä laskee. Kohdegeenien kunkin ilmentyvät differentiaalisesti miRNA ennustettiin käyttämällä TargetScan (https://www.targetscan.org/), Miranda (https://www.microrna.org/), PicTar (http: //pictar.mdc-berlin .de /) ja RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/). Koska miRNA tavoitteet ennustus kärsivät usein korkea vääriä positiivisia, vain kohdegeenin kannattaa vähintään kolme riippumatonta välineitä otettiin huomioon. Gene ontologia (GO) ehdot ja Kegg polkuja kohdennetun geenit selityksin käyttäen DAVID geeniä käsinkirjoitustyökalun (https://david.abcc.ncifcrf.gov/UTH).

annotoimaton sekvenssit, joita voidaan kuvata ihmisen genomin katsottiin havaitsemiseksi ehdokas uusia miRNA geenejä. Lyhyesti, 100 nukleotidin genomisen sekvenssi, joka reunustaa kummallakin puolella näiden sekvenssien uutettiin ja RNA toissijaisia ​​rakenteita ennustaa käyttäen RNAfold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). Ehdokas novel miRNA tunnistettiin käyttäen MIREAP perusasetuksilla, joka on otettu laajalti käyttöön liittyvien tutkimusten [14], [15].

Kaikki sekvenointitulosten ohella merkintä tulokset voivat olla käytettävissä osoitteessa http: //59.79. 168,90 /pca.

tulokset

perustaminen androgeenin riippumaton LNCaP Cell Line

Perustuu raportit että androgen herkkien LNCaP-soluja (kuvio. 1A) voidaan muuntaa androgeenista riippumaton solujen [16], [17], yritimme tuottaa androgen riippumaton solulinja jatkuvasti viljelemällä LNCaP-solujen

in vitro

. Kolmen viikon kulttuurin aloittamista hormonien riistää välineellä leviämisen solujen vähitellen hidastua ja huomattava määrä soluja (noin 40-50%) koki apoptoosin (Fig. 1 B). Jäljellä olevat muuttunut morfologia näyttää neuroendokriini kaltainen fenotyyppi (Fig. 1 B). Yhä siirrostusjärjestysluku solut näyttivät selviä morfologisia muunnelmia ja tullut pieni ja tasainen, kehittää kyky kasvaa androgeeni-riippumaton muoti (ilmiasuun että me nimetty LNCaP-AI) (Fig. 1 C). Arvioida vaikutuksia androgen vapaassa ympäristössä on LNCaP-AI solun kasvu, me jatkuvasti tutkinut solujen lisääntymistä nopeudella solulinjan eri kohtia. On osoitettu, että solujen kasvu LNCaP-AI-solujen osoitettiin asteittain downtrend kanavasta 1, 2, 5, 10-20, kuitenkin, koska kanavan määrä kasvoi, soluproliferaatiota nostettiin vähitellen ja saavutti lähes 100%: iin ( kuva 1D). Sen jälkeen 110 kohtia aikana 2 vuoden kulttuuri, solujen kasvua oli vakiintunut ja voi kasvaa hyvin androgeeni-köyhdytettyä ympäristössä.

(A) Morfologia vanhempien LNCaP, joka viljeltiin säännöllisesti väliaineessa 3 päivää. (B) Neuroendokriininen fenotyyppi LNCaP-soluja. LNCaP-soluja pidettiin androgeeni-köyhdytettyä keskipitkällä ja viljeltiin 3 kohtia. (C) morfologia LNCaP-AI soluissa. LNCaP-soluja viljeltiin kanssa FLUTAMIDE androgeeni-köyhdytettyä väliaineessa 110 kohtia. (D) Solu kasvuvauhdin androgeenin köyhdytettyä viljellyt LNCaP eri kohtia kasvatettuna androgeenien puute ympäristössä. (E-F) vaikutukset androgeenista köyhdytettyä ympäristön ja flutamidi LNCaP-AI (E) ja LNCaP-FGC (F) solusyklin. (AI: androgeeni-köyhdytetty tiedotusväline Flu: 1,0 × 10

-7 mol /l flutamidia; normi: säännöllinen medium). (G) Bcl-2: n ja Bax ilmaisun LNCaP ja LNCaP-AI soluissa.

edelleen todistaa, että LNCaP-AI solut ovat saaneet kykyä sopeutua hormoni-vapaa ympäristö, lisää tutkimuksia tarvitaan oivalluksia vaikutuksia flutamidia tai androgeenin-ympäristössä on solusyklin LNCaP-solujen virtaussytometrialla, ja androgeeniriippuvainen LNCaP-soluja sisällytettiin kontrolliksi. Kuten odotettua, FLUTAMIDE tai androgeeni-ympäristössä ei ollut merkittävää vaikutusta solusyklin jakautuminen LNCaP-AI-soluissa (kuvio. 1 E). Sitä vastoin, tämä käsittely on LNCaP-soluissa indusoi kertyminen solujen G0 /G1 vaiheen ja mukana väheneminen S-vaiheessa, ja inhibitio vaikutus oli paljon voimakkaampaa, kun molemmat yhdistettiin (Fig. 1 F). Edellinen tutkimus on osoittanut, että Bcl-2 yliekspressoituu etenemisen androgeeni-tulenkestävien eturauhassyöpä [1]. Luonnehtia ilmentymisen sekä Bcl-2: n ja Bax (Bcl-2-associated X proteiini) proteiinien kahden solulinjan (LNCaP ja LNCaP-AI), Western blotting -analyysi suoritettiin (Fig. 1 G). Olemme löytäneet lisääntyneen ekspression Bcl-2-proteiinin LNCaP-AI-soluja verrattuna LNCaP-soluja. Samaan aikaan, LNCaP-solut ilmaisivat samantasoiset Bax-proteiinin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että LNCaP-AI-soluissa sai parannettu anti-apoptoottista aktiivisuutta. Edellä esitetyn perusteella havaintojen olemme onnistunut androgeenista riippumaton LNCaP-solulinjasta pitkäaikaisilla kulttuuri LNCaP.

Pienet RNA Transcriptomes ja Annotation

tutkimiseksi pieniä RNA transcriptomes, Illumina suurikapasiteettisten sekvensointi-menetelmää käytettiin sekä LNCaP ja LNCaP-AI pieni RNA kirjastot. Aluksi, yhteensä 9107833 ja 10083251 raaka-sekvenssin lukee tuotettiin LNCaP ja LNCaP-AI, vastaavasti. Sen jälkeen suodatin ja leikkaus on lukee heikkolaatuisia ja sovitin, 3978524 ja 4734866 järjestyksessä lukee saatiin vastaten 302325 (LNCaP) ja 416924 (LNCaP-AI) ainutlaatuinen tunnisteita. Havainnointi pituus jakelu pienten RNA: iden, huomasimme, että suurin osa niistä molemmista kirjastoista oli 22 nt kooltaan (Fig. 2A), joka on yhdenmukainen kooltaan tyypillinen miRNA peräisin Dicer ruoansulatusta tuotteita. Samaan aikaan oli suuri osa identtinen sekvenssin leimoilla (88,90%) välillä LNCaP ja LNCaP-AI. Nämä tulokset osoittivat, että miRNA ovat peräkkäin rikastettu molemmista kirjastoista.

(A) Pituus jakelu sekvensoitiin lukee. Molemmat kirjastot kertynyt 22-nukleotidin pieniä RNA: iden, joka on sopusoinnussa tyypillinen koko miRNA. B) osuudet eri luokkien pienten RNA: iden havaittu LNCaP ja LNCaP-AI. On osoitettu, että suurin osa lukee molemmissa kirjastoissa kuuluvat miRNA perheille.

Myöhemmin 18-30 nt-sekvenssit kummastakin kirjastoista valittiin kartoittaa ihmisen genomiin, ja yhteensä 3747159 (94,18%) ja 4433423 (93,63%) sekvenssit havaittiin vastaamaan genomin vain korkeintaan kahden epäsuhta, tässä järjestyksessä (Kuva. 2B). Perustuen ihmisen genomia merkinnöistä ja useita hyvin tunnettu RNA tietokantoja (katso materiaalit ja menetelmät), nämä pienet RNA-sekvenssit olivat selityksin kuten tunnettua miRNA, hajoamista fragmentteja ei-koodaavan RNA (tRNA, rRNA, snRNA /snoRNA et al.) genomista toista, mRNA tai luokkiin. Kuten odotettua, runsaimmat RNA luokka molemmista kirjastoista tunnettiin miRNA: 65,22% ja LNCaP ja 62.33% varten LNCaP-AI. Loput vähemmän runsas luokat olivat ei-koodaavat RNA ja genomista toistoja. Lisäksi pieni osa lukee voitaisiin kuvata koodaavat sekvenssit, jotka ovat todennäköisesti RNA: n hajoamistuotteita. Kertyvät näytön mukaan jotkut genomit voivat myös puhtaaksi lyhyt toiminnallinen koodaamattomalla selostukset, kuten endogeeninen pieniä häiritseviä RNA: ita tai toista liittyvä häiritseviä RNA: ita, joka on ominaista säädellä of retrotranspositioon tukahduttaminen [18]. Esimerkiksi, se on paljastanut, että L1 retrotranspositioon vaimennetaan endogeenisesti koodattua pieniä häiritseviä RNA: ita ihmisen viljellyissä soluissa. Näin ollen on huomattava, että nämä pienet RNA: ita voi sisältää myös tärkeä biologinen toiminto, joka ansaitsee enemmän huomiota.

ilmentyvät eri miRNA Between LNCaP ja LNCaP-AI

Perustuu miRBase, 360 miRNA (285 miRNA ja 75 miRNA *) ja 380 miRNA (282 miRNA ja 98 miRNA *) havaittiin LNCaP ja LNCaP-AI, vastaavasti (taulukko S1). Ensimmäinen, olemme huomanneet, että eri miRNA osoitti merkittävästi erilaiset ekspressiotasot mitattuna taajuus lukea laskee, mikä osoittaa huomattavaa toiminnallista eroja näiden miRNA. LNCaP-AI, esimerkiksi noin 8,99% of miRNA ja miRNA * t ovat korkealla luku- määrä ( 1000), joista HSA-let-7 perhe (HSA-let-7c, HSA-let-7f, HSA-let-7a, HSA-let-7d, HSA-let-7b ja HSA-let-7e) on yksi runsaimmin miRNA meidän tietokokonaisuus, edistää 8,94% koko miRNA lukee. miRNA laskea vaihteluvälien sisällä väli 100-1000 lukee oli jopa 17,4% ja loput miRNA laskee noin 73,7%.

Suhteellinen määrä of sekvensointi lukee voitaisiin käyttää määrittämään miRNA ekspressiotasot välillä LNCaP ja LNCaP -A. Perustuen normalisoitu määrä lukee per näyte (erityisvaatimusten miRNA /yhteensä sekvensoinnin tageja kirjastossa), suurin osa miRNA (256) ekspressoitiin suunnilleen tasan kaksi kirjastojen. Kuitenkin 83 niistä oli tunnistettu ekspressoitua eri taitettavalla muutoksia 2,0 ja

P

-arvo 0,001 (taulukko 1, Fig. 3A ja Taulukko S1). Niistä 41 oli säädelty ja 42 olivat alassäädetty. Edelleen vahvistaa nämä ilmentyvät eri miRNA, 29 yksittäisiä miRNA valittiin suorittamaan kvantitatiivinen RT-PCR-määritys itsenäisiltä biologisista rinnakkaista. Nämä 29 valitaan miRNA kattaa sekä erittäin ilmaisseet miRNA (miR-222, miR-30a *, miR-100, miR-10b, miR-148B, miR-1323, miR-221, miR-7, miR-223, miR-374b , miR-486-5p, miR-7a *, miR-125b-2, miR-27a ja miR-423-5) ja alempi ilmaisi miRNA (miR-15b, miR-21, miR-17, miR-28-5p , miR-532-3p, miR-200c, miR-93, miR-96, miR-200b *, miR-331-3p, miR-200b, miR-106a, miR-301b ja miR-301a). Kuten on esitetty kuviossa. 3B, vahva korrelaatio (Pearsonin korrelaatio = 0,91) paljastui välillä Illumina syvä sekvenointitulosten ja kvantitatiivinen RT-PCR mittauksia, mikä osoittaa luotettavuutta syvä sekvensointi perustuvan ilmentymisanalyysiä.

(A) Expression taso LNCaP ja LNCaP-AI miRNA. Lasken kunkin miRNA piirrettiin normalisoinnin jälkeen. Punainen väri ympyrä osoittaa ilmentyvät eri miRNA välillä LNCaP ja LNCaP-AI vähintään 2-kertainen muutos ja

p

-arvo alle 0,001. (B) Solexa vs. qRT-PCR miRNA-kertaisesti-muutoksia.

Novel miRNA Genes

Yksi tärkeimmistä eduista korkean suoritustehon sekvensoinnin pieniä RNA transcriptome on, että se sallii löytö mahdollisten uusien miRNA. Kartoittaakseen uusia miRNA LNCaP ja LNCaP-AI, ensin suodatetaan pois Illumina sekvenssimerkkejä jotka on luokiteltu selityksin luokkiin, kuten tunnettua miRNA, ei-koodaavan RNA, genomista toistoja tai koodaussekvenssit. Olemme havainneet, että 235058 ja 259454 pienten RNA-sekvenssin tunnisteet LNCaP ja LNCaP-AI, vastaavasti, olivat peräisin annotoimaton alueet ihmisen genomin. Nämä luokat tunnisteet yhdessä 100 emäsparin viereiset sekvenssit analysoitiin MIREAP, hienostunut työkalu yleisesti käytetty tunnistaa uusia miRNA korkean suoritustehon sekvenointitulosten [14], [15]. Tällä tavoin olemme määritelleet 43 oletetun novel miRNA sekä kirjastojen (taulukko 2 ja taulukko S2): 22 LNCaP ja 31 LNCaP-AI (taulukko 2 ja taulukko S2), ja vain 10 niistä ovat yhteisiä kirjastoja.

Havaitsimme myös, että nämä 43 miRNA on kokoluokkaa 20-24 nt ja pituudet arvioidun hiusneularakenteiden vaihtelevat 65-98 nt, joka on samanlainen kuin tunnettujen ihmisen miRNA (taulukko S2) . Pienin vapaa energiat niiden esiasteita vaihtelevat -18,20–67,40 kcal /mol, jossa keskimääräinen arvo -52,70 kcal /mol. Edelleen vahvistaa näitä uusia miRNA, suoritimme reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi kaikilla 10 romaanin miRNA ehdokkaiden normalisoitu sekvensoimalla taajuus suurempi kuin 10 (muut jätettiin koska niiden alhaisen ekspressiotason ja herkkyyttä reaaliajassa RT-PCR-analyysi). Tämän seurauksena olemme onnistuneet validoitu kahdeksan heistä (taulukko 2), mikä osoittaa, että 80% voitiin validoitu sekvensseriohjelmasta riippumaton menetelmällä.

Verrattuna muihin miRNA tutkimuksessamme, nämä uudet miRNA on paljon pienempi ilmentymistaso keskimääräiseksi arvioidun sekvensointi tiheys 45, mikä osoittaa, että suurin osa niistä ei saa esiintyä merkittäviä toimintoja eturauhassyövässä. Heistä kolme LNCaP-AI erityinen miRNA näytteillä suhteellinen järjestyksessä laskee suuri kuin 10 ja validoitu reaaliaikaisella RT-PCR, syytetään niiden todennäköinen osallistuminen kehittämiseen LNCaP-AI, ja siten ansaitsevat edelleen toiminnallinen arviointi.

ennustettu kohderyhmä ilmentyvät eri miRNA

tutkia biologinen funktio ilmentyvät eri miRNA tunnistettu analyysimme, suoritimme laskennallisen analyysin neljällä itsenäistä algoritmit, kuten TargetScan, Miranda RNAhybrid ja PicTar, tunnistamiseen ennustetun lähetti-RNA tavoitteet kullekin miRNA olevan merkittävästi differentiaalisesti ilmaisi. Taulukko S3 luettelot ennusti tavoitteita, jotka tukivat ainakin kolme edellä mainituista neljästä algoritmeja, joissa on yhteensä 6902 geenejä mahdollisia kohteita näitä miRNA. Mielenkiintoista, näistä ennusti tavoitteet, AKT3 oli mukana 11 merkittävästi alas-ilmaisi miRNA. AKT3 koodaa jäsen seriini /treoniini proteiinikinaasi perhe, jonka tiedetään olevan osallisena erilaisia ​​biologisia prosesseja, mukaan lukien solujen proliferaatio, erilaistuminen, apoptoosi, ja kasvaimen kehittymisen. Up-ilmentyminen AKT3 androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä solulinjoissa osoittaa, että se voi edistää aggressiivisempia fenotyypin androgeenista riippumattoman eturauhaskarsinoomien [19].

arvioimiseksi kohdegeenin toimintoja, me selityksin nämä lähdettävä miRNA tavoitteita geeni ontologian (GO) ja Kegg järjestelmiä käyttäen DAVID. Ennustettu miRNA tavoitteet asutuilla monia merkittäviä GO luokkia, ja jotkut heistä määrä geenikohteet merkittävästi rikastettu (

P

0,001, jossa Benjamini korjaus). Kolme GO luokitukset, molekyyli- toiminto, biologisen prosessin ja solukomponenttiin arvioitiin tasolla, mutta vain merkittävät ehdot tasolla 5 biologisen prosessin luetellaan taulukossa S3. Kuten odotettua, suurin osa merkittävistä GO termejä liittyvät transkription säätelyyn (esim. GO: 0045449, GO: 0006351 ja GO: 0006357). On myös useita merkittävästi rikastettu GO luokkaan, mukaan lukien solujen morfogeneesiin (GO: 0000902), solunsisäinen liikenne (GO: 0046907), ja apoptoosin (GO: 0006915). Analysoida roolia, miRNA pelata säätelyverkkoja, me osoitettu otaksuttu miRNA tavoitteet osaksi Kegg polkuja, ja tunnistettiin 14 niistä oli merkittävästi rikastettu (

P

0,001, jossa Benjamini korjaus). Useimmat näistä miRNA pyrkivät suuntaamaan geenien signaalin siirtoon ja solujen viestintä (taulukko S4). Esimerkiksi, olemme havainneet, että 130 kohdegeenien (2,3%), voitaisiin osoittaa MAPK signalointireitin, joka on mukana monenlaisia ​​soluvasteita, mukaan lukien geenien ilmentyminen, erilaistuminen, proliferaatio ja apoptoosi [20]. Eturauhassyövän, MAPK signalointipolkujen pidetään yleensä edistää kasvaimen kasvua ja syntyy hormonin tulenkestävä tauti [21], [22], [23].

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet suuren joukon miRNA jotka ilmentyvät eri taustalla etenemistä androgeenista riippumaton eturauhassyöpä, jotka myös varmistettiin qRT-PCR. Jotkut näistä miRNA ovat hyvin tuettu julkaisi äskettäin tutkimuksissa. Silmiinpistävä esimerkki tulee yli-ilmentyminen miR-221 ja miR-222 LNCaP-AI näytteestä 10-20 kertainen lisäys, jossa molemmat ovat runsain miRNA että LNCaP-AI solulinjassa. Yli-ilmentymisen miR-221 tai miR-222 LNCaP voisi vähentää huomattavasti tasoa dihydrotestosteronin aiheuttama säätely ylöspäin eturauhasen antigeeni ilmaisun ja lisätä androgen riippumaton kasvu LNCaP [9]. Useita rivejä näyttö viittasi siihen miR-221 ja miR-222 voisivat alas-säädellä tuumorisuppressori p27 LNCaP-soluissa, ja niiden yli-ilmentyminen saattaa olla yksi tekijä, joka voi etenemisen eturauhasen syöpä [24]. Lisäksi lisääntynyt ilmentyminen miR-125b, miR-30c, miR-100 että havaitsimme LNCaP-AI solulinjojen tunnistettiin myös olla säädelty viidessä AI CaP solulinjat [25], ja

in vitro

kokeilu osoitti, että miR-125b voisi stimuloida AI kasvua ja alas-säätelemään BAK1 [25]. Vähentäminen miR-141, miR-19b, miR-22, miR-29a, ja miR-29b tunnistettu tässä myös huomattava joukossa 15 miRNA jotka laskivat neljässä hormoni tulenkestävät eturauhaskarsinoomien kuvatulla Porkka et al. ” s microarray-pohjainen tutkimus [26].

Meillä on myös tunnistettu joukko differentiaalisesti ilmaisi miRNA, jota ei ole dokumentoitu eturauhasen kasvainten synnyssä tai AI kehitystä. Esimerkiksi miR-124, miR-148B, miR-320a ja miR-423-5p kasvoi-säädellään 2-14-kertaiseksi, kun taas miR-29a, miR-93, miR-200 ja miR-1277 oli alaspäin säännellään 2-10-kertainen, mikä viittaa siihen, että nämä miRNA voi kohdistaa rooli tuumorisuppressorigeeneille tai onkogeenien eturauhasen syövän kehittymisessä. On kiinnostavaa huomata, että kaikki viisi jäsentä miRNA-200 perhe (miR-200a miR-200b, miR-200c, miR-141 ja miR-429) olivat merkitsevästi alassäädetty LNCaP-AI soluissa. Kaikki nämä miRNA havaittiin myös olla seisonta-ilmentää soluissa, jotka oli tehty epiteelin ja mesenkymaalitransitioon [27], jota pidetään olennaisena varhaisen vaiheen etenemistä ei-invasiivisia tuumorisolujen metastaattinen karsinoomien [28]. Tavoitteet näistä MikroRNA havaittiin olevan E-kadheriinin transkriptiorepresso- ZEB1 ja SIP1, tekijät aiemmin osallistuvat kasvaimen etäpesäkkeiden [27]. Kaikkein Tuoreessa tutkimuksessa kävi ilmi, että ZEB1 ilmaisu voisi lisätä migraatiota eturauhassyöpäsoluissa [29].