Krooninen sairaus

tiivistelmä

Osoitimme aikaisemmin, että DNA: n fragmentoituminen tekijä, joka käsittää kaspaasi-3-aktivoitu DNaasia (CAD) ja sen estäjä (ICAD), voivat vaikuttaa määrä solukuoleman tuottamalla PARP-1- aktivoimalla DNA taukoja. Tässä testasimme hypoteesia, jonka mukaan ICAD-vajaiden paksusuolen epiteelisolujen, joilla resistenssin kuoleman ärsykkeiden voi kerääntyä geneettisiä muutoksia, mikä johtaa kasvaimia fenotyypin. Osoitamme, että ICAD puute voi liittyä paksusuolen syöpään ihmisillä. Todellakin, tarkastelu ICAD ilmaisun käyttäen immunohistokemia joukko sekä paksusuolen syövän ja normaaleissa kudoksissa paljasti, että ICAD ekspressiotasoja pahoin vaarantunut syöpäkudokset. Kun DNA aiheuttamat vahingot pienellä annoksella säteilytys, ICAD solut hankkia kasvaimia fenotyyppi. Paksusuolen epiteelisolujen, jotka ovat peräisin ICAD hiiret osoittivat merkittävää vastusta kuolemaan indusoimaa paksusuolen syöpää aiheuttavaksi aineeksi dimetyylihydratsiinin in vitro ja hiirillä. Tällainen vastus liittyi lasku PARP-1 aktivointi. Vuonna eläinmallissa dimetyylihydratsiinin aiheuttaman paksusuolen kasvainten synnyssä, ICAD

– /- hiirille kehittyi huomattavasti suurempi määrä kasvainten huomattavasti suurempia kokoja kuin villityypin kollegansa. Mielenkiintoista, fenotyypin ICAD

– /- hiirillä ei liittynyt merkittävää kasvua precancerous poikkeavaan crypt pesäkkeitä mikä viittaa mahdollinen yhteys kasvaimen etenemiseen sijaan aloittamista. Vielä tärkeämpää on, ICAD puute liittyi vakava perimän epävakaisuuden arvioimana array vertaileva genominen hybridisaatio. Tällaiset genomin epästabiilisuuden koostui näkyvimmin of monistukset mutta tuntuvaa deleetioita verrattuna villin tyypin kollegansa, jotka vaikuttavat useisiin syöpään liittyvien geenien myös

RAF-1

,

GSN

,

LMO3

ja

Fzd6

riippumatta

p53

. Kaikkiaan tuloksemme esittää kannattava asia osallistumista ICAD puutos paksusuolen syövän synnyn ja osoittavat, että apoptoosin ja perimän epävakaisuuden voi käsittää keinoja, joilla tällaiset puutos voi edistää prosessia kasvaa herkkyys karsinogeeni aiheuttama kasvaimien syntyyn.

Citation: Errami Y, Brim H, Oumouna-Benachour K, Oumouna M, Naura AS, Kim H, et al. (2013) ICAD puutos Human Colon Cancer ja Taipumus Colon kasvaimien syntyyn: Kytkentä apoptoosiresistenssiin ja perimän epävakaisuuden. PLoS ONE 8 (2): e57871. doi: 10,1371 /journal.pone.0057871

Editor: Vincenzo Coppola, Ohio State University Kattava Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 elokuu 2012; Hyväksytty: 29 tammikuu 2013; Julkaistu: 22 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Errami et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Avustuskohtaisesti RSG-116608 American Cancer Society (https://www.cancer.org/) ja avustus HL072889 National Institutes of Health (https://www.nhlbi.nih.gov/) ja AHB. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät haluavat todeta, että HB ja HA ovat PLoS One toimitusneuvosto jäsenet. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Colon syövän synnyn on monivaiheinen prosessi, joka vaatii vuosia kehittää ja liittyy useita äskettäin tunnettu geneettiset muutokset [1], [2], [3]. Esiintyminen inaktivoivat mutaatiot molemmissa alleeleissa on

adenomatoottisen polypoosin coli

geenin (

APC

) [2], kasvainsuppressorigeenin, pidetään yhtenä alkutapahtumia peräsuolen syövän synnyssä . Mutaatio ja tästä häiriöstä

K-RAS

esikasvaintekijän myös ajateltu muodostavan varhaisessa vaikuttava tekijä paksusuolen syövän synnyn [4]. Liikevaihto epiteelisolujen on suhteellisen nopea ja geneettisiä muutoksia, jotka tekevät nämä solut vastustuskykyisiä apoptoosin tai useamman proliferatiivinen ovat kriittisiä alkutapahtumien paksusuolen kasvainten synnyssä [4]. Myöhempi kertyminen mutantti epiteelisolujen edistää muodostumisen rakenteita tunnetaan poikkeava crypt pesäkkeitä (ACF) [5].

Fragmentation DNA uskotaan olevan tärkeä askel hävittäminen genomin apoptoottisten solujen. Samanaikainen pilkkominen tumalevy, DNA ensin hajotetaan suuria palasia 50-300 kb, joita sitten jalostetaan internukleosomaalisen toistoja [6], [7]. DNA hajautumakerroin (DFF) on ehdotettu osallistumaan prosessiin [8]. DFF koostuu kahdesta alayksiköstä, 40 kDa: n kaspaasi-aktivoitu DNaasia (CAD) tai DFF40 ja sen 45 kDa: n estäjä ICAD (DFF45) [8], [9], [10]. Endonukleaasiksi tämän entsyymin aktiivisuutta, mikä on olennainen CAD, indusoituu pilkkominen ICAD kaspaasi-3. ICAD toimii sekä inhibiittorina CAD toiminnan ja kaperonia tämän alayksikön [10], [11], [12]. Todellakin, ICAD tarvitaan CAD ilmaisun ja runsaudesta endonukleaasia ICAD

– /- solut on paljon pienempi verrattuna villityypin soluissa [8], [9], [10], [13]. Me ja muut [13], [14], [15], [16], [17], on raportoitu, että erilaisia ​​solutyyppejä, mukaan lukien immuunisolujen, fibroblastit, ja aivokuoren neuronien peräisin ICAD

– /- hiirissä, resistenttejä apoptoosin useiden erilaisten ärsykkeiden indusoimaa. Olemme myös osoittaneet, että on tärkeää DFF on pirstoutumista DNA 50-kb kappaletta apoptoosin aikana [13], [14], [15], [16], [17]. Sukupolvi Näiden DNA katkeamisen seurauksena alussa ja ohimenevä aktivoituminen PARP-1. PARP-1-välitteisen poly (ADP-ribosyl) ation johtaa merkittävä lasku solunsisäisessä pitoisuuksia NAD ja ATP luoden soluenergiaa pula että ajatellaan osaltaan kiihtyminen kuoleman prosessi [13], [16], [18], [19]. Osoitimme, että epäonnistuminen ICAD

– /- fibroblastien tuottaa 50-kb DNA-fragmentit vastauksena TNF-α suojasi soluja liialliselta aktivointi PARP-1 ja täten esti ehtyminen solunsisäisen NAD [13], [16] . Viive PARP-1 aktivaatio havaitaan näissä soluissa korreloi viiveet sekä kaspaasi-3 aktivaation ja proapoptoottisiin mitokondrioiden tapahtumia, mukaan lukien mitokondrion kalvon potentiaalin ja vapauttamaan sytokromi c [13], [16]. Perustuen näihin eri havaintojen, ehdotimme, että sukupolven 50-ke DNA-fragmenteista DFF ei ole pelkästään passiivinen askel DNA hajoaminen vaan että se auttaa yhdessä PARP-1, mitokondrioita, ja kaspaasi-3, vahvistimeen vaihe apoptoosin [13], [16].

ICAD ilmaisun ja mutaatioita

ICAD

geenin äskettäin liittyy useita ihmisen maligniteettien sekä eläinmallissa ihosyöpä [20], [21]. Lisäksi, Konishi et ai. kertoi, että ICAD mRNA ilmentyminen oli alempi ruokatorven okasolusyöpä kasvaimia suuremmilla patologisen asteen yhdessä imusolmuke etäpesäke [20]. Kääntäen, ICAD -proteiiniekspressio raporttien mukaan toistuvasti yliaktiivista munasarjojen serous karsinoomia ja voi toimia markkerina aggressiivisen käyttäytymisen kanssa ennusteen arvioinnissa [22]. Kun otetaan huomioon apoptoosin ylläpito koolonkudoksessa ja sen säätelyhäiriö koolonin karsinogeneesissä tarkoituksenamme tässä tutkimuksessa tutkia mahdollisia yhdistyksen välillä osallistumista ICAD vuonna apoptoosin ja genomin vakauteen voi olla kriittinen estämään paksusuolen kasvainten synnyssä. Lisäksi olemme pyrkineet onko vika koolonin epiteelisolujen ilmaista ICAD tehnyt niistä alttiita kerääntyä geneettisiä poikkeavuuksia lisäksi mahdollinen kyky vastustaa apoptoosin induktion, mikä lisää herkkyyttä näiden eläinten karsinogeeniksi (dimetyylihydratsiini; DMH) aiheuttaman paksusuolen kasvainten synnyssä. Näitä tutkimuksia varten käytimme integroiva lähestymistapa kampaus joukko ihmisen paksusuolen syövän ja normaaleissa kudoksissa, äskettäin kehitetty menetelmä eristämiseksi ensisijainen paksusuolen epiteelisoluissa, ja vakiintunut DMH aiheuttama hiirimallissa paksusuolen syövän synnyn.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

nykyinen tutkimus suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Maintenance (IACUC protokolla: BC0015) ja tutkimussuunnitelma (IACUC protokolla: 2227) on hyväksynyt LSUHSC Animal Care ja käyttö komitea. Paksusuolen syöpä puolivälissä tiheys kudoksen array (ostettu Yhdysvaltain Biomax- Inc. Rockville, MD, USA) sekä 23 ihmisen yksilöitä paksusuolen syövän ja normaaleissa kudoksissa (LSUHSC patologia core) kuuluvat IRB poikkeuksen tyyppi 4.

Eläimet ja käsittely

WT ja ICAD

– /- hiirissä, molemmat ylläpidetään C57BL /6 x 129 /sv tausta, oli kasvatettu tietyllä-taudinaiheuttajista vapaa laitokseen LSUHSC, New Orleans, LA, ja annettiin rajoittamaton pääsy steriloitu ruokaa ja vettä

ad libitum

ja pidettiin yllä 12 tunnin valo-12-tunnin pimeäjaksoilla. 5 viikon iässä hiiret (12 eläintä ryhmää kohti) saivat

ip

injektio 20 mg /kg DMH (Sigma, St. Louis, MO) suolaliuoksessa, joka sisälsi 1 mM EDTA: ta kerran viikossa kahdeksan viikon ajan . Sitten eläimet tapettiin CO

2 tukehtumisen 12 tai 24 viikkoa myöhemmin. Akuutin altistuksen hiiret saivat yhden

vatsaontelon.

Injektio 20 mg /kg lääkeainetta ja uhrattiin joko 24 tai 48 tuntia myöhemmin. Kaksoispisteet poistettiin ja kiinnitettiin formaliinilla. Jotkut hiiriä käytettiin eristämään ensisijainen KIE kuten alla on kuvattu.

eristäminen ensisijainen paksusuolen epiteelisolujen, immunofluoresenssilla, hoidot, mittaus solujen elinkelpoisuuden ja klonogeenisten määritys

Colons avattiin pitkittäin ja pestiin perusteellisesti kalsium- ja magnesium-vapaa HBSS täydennetty antibiooteilla. Tissue segmenttejä inkuboitiin 90 min 37 ° C: ssa täydellisessä DMEM-alustassa, joka sisälsi 20% FBS: ää, 2%: Luria-liemessä, glutamiinia, 10 mg dispaasi, ja 0,2% kollagenaasia I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood NJ) jatkuvasti sekoittaen varovasti. Pilkkomistuote pestiin HBSS: llä sentrifugoimalla ja suspendoitiin sitten uudelleen, täydellistä alustaa ilman entsyymejä. Eristetty paksusuolen kryptissa maljattiin sitten ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen kelluva crypts siirrettiin tuoreen levyn täydelliseen alustaan. Tehokkuus solujen eristäminen arvioitiin puhtausaste kryptissa ja pieni määrä kuolleita soluja. Epiteelin solujen luonteesta arvioitiin immunofluoresenssilla vasta pan-sytokeratiini (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), kuten aiemmin on kuvattu [23]. Solun kuoleman määrityksessä, KIE valmistettiin 24-kuoppalevyille ja käsitelty yhdistelmällä 2,5 ng /ml TNF-α, 5 ug /ml syklohek-, ja 3 mM voihappoa (TNF + CHX + BA) tai 1 mM DMH: ssa 24 tuntia edellä kuvatulla tavalla. Solujen elinkelpoisuus määritettiin, neljänä näytteitä käyttäen kalseiinipitoiset AM värjäystä aikaisemmin kuvatulla [23]. Sillä klonogeenisten määritystä, WT ja ICAD

– /- hiiren fibroblasteissa (kuvattu [13]), altistettiin IR (2 Gy), minkä jälkeen solut ympättiin 35 mm: n annoksia 0,5% matalan sulamispisteen agaroosia sängylle 1% jalo agar täydellisessä DMEM. Pesäkettä automatisoituun laskuri ja tulokset ilmaistaan ​​taitettava kasvu verrattuna arvon kontrollina säteilytetty WT soluissa.

histopatologia ja immunohistokemia (IHC).

Serial osastoja parafiinia -Embedded paksusuolen kudokset valmistettiin käyttäen standardimenetelmiä. Joka viides jakso suoritettiin H 17 ulos 23 yksilöitä näkyvät laskua tason ICAD verrattuna tasot havaittiin viereisten normaaleissa kudoksissa. Loput näytteet osoittivat kohtalaisesta juurikaan muuttunut ICAD immunoreaktiivisuus. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset perustaa mahdollisen yhteyden ICAD puute ja paksusuolen maligniteetti. Kuitenkin tarkempi tutkimus tarvittiin ymmärtää ja luoda suhdetta ICAD puute ja paksusuolen maligniteetin, erityisesti ne, jotka liittyvät tarkastelun osallistumista proteiinin solukohtalon ja geneettinen muutos johtaa kasvaimien syntyyn.

(A ) kudosmatriisien sisältävien osien normaalista paksusuoli (n = 60) tai syöpä (n = 131) kudoksiin alistettiin immunohistokemiallinen värjäys aineita ihmisen ICAD. (B) Expression tasot ICAD kroonisesti tulehtunut paksusuolessa. (C) laajuus ICAD immunoreaktiivisuus arvioitiin ja luokiteltu korkean (≥4 +), kohtalainen /korkea (3 +), kohtalainen /matala (2+), matala (1+), tai negatiivinen (-); Tulokset on ilmaistu prosentteina positiivisuus näytteiden kokonaismäärästä (syöpä tai normaali). (D) Normaali ja syöpäkudokset kiinnitettiin formaliiniin, sulautettujen (sekä normaaleissa ja sairaissa kudoksissa kustakin potilasta upotettu yhteen), leikattiin, ja sen jälkeen niille IHC vasta-aineilla ihmisen ICAD. Musta laatikot (A, B, ja D) osoittavat suurennettu alueilla.

Promotion kasvaimia fenotyyppi ICAD puutos altistuessaan DNA aiheuttaman vaurion pieniannoksisen ionisoivan säteilyn (IR)

Osoitimme aikaisemmin, että ICAD puute vähentää herkkyyttä (TNF-α) aiheuttaman solukuoleman [13], [25]. Sen määrittämiseksi, oliko apoptoosin vastustuskykyisten fenotyyppi ICAD

– /- fibroblastit edistänyt niiden muutoksia sen jälkeen induktion DNA-vaurioita, tutkimme kykyä näiden solujen muodostamaan pesäkkeitä pehmeässä agarissa. Villityypin (WT) ja ICAD

– /- solut, laitettiin ensin matala-annos (2 Gy) IR, minkä jälkeen ne suspendoitiin agarilla täydellistä elatusainetta ja pesäkkeet laskettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 3 viikkoa. Kuvio 2A osoittaa, että ICAD puute johti merkittävään (~6.5-kertainen) lisäys solujen kyky muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa altistuksen jälkeen IR; on huomattava, että pesäkkeiden kehittämä villityypin solut olivat pieniä lukumäärältään ja kooltaan. Nämä tulokset viittaavat siihen, kriittinen rooli ICAD solun homeostaasin ja että ICAD puutos voi edistää kasvaimia fenotyypin DNA-vaurioita.

(A) ICAD

– /- ja WT hiiren fibroblasteja joko altistettiin IR (2 Gy) tai sham-säteilytetty, jonka jälkeen ne viljeltiin pehmeässä agarissa täysin väliaineen 3 viikkoa. Pesäkkeet laskettiin sitten automaattisella laskuri. Tiedot ilmoitetaan prosentteina arvon kontrollina säteilytetty WT-solut ja ne ovat keskiarvoja ± SD kolmen rinnakkaisen edustavasta kokeesta. *, Ero valeleika- säteilytetty WT soluja, p 0,05; #, Ero WT soluista alttiiksi IR (2 Gy), p 0,05. (B) KIE valmistettiin WT-hiirissä, ja niiden annettiin lisääntyä ja 4 päivää. Solut kiinnitettiin sitten ja alistettiin immunofluoresenssilla vasta yleiseurooppalainen sytokeratiini (punainen) tai värjäämällä DAPI (sininen); yläpaneeli on esimerkki KIE näkyviksi Kirkas mikroskoopilla. Keltainen nuolet osoittavat paksusuolen crypts. (C) KIE, eristetty WT tai ICAD

– /- hiirissä, käsiteltiin 2,5 ng /ml TNF yhdessä 5 ug /ml syklohek- ja 3 mM voihappoa (nimetty TNF + CHX + BA) tai 1 mM DMH. Soluja inkuboitiin 48 h puuttuessa tai läsnä ollessa TNF + CHX + BA tai DMH, jonka jälkeen, jonka jälkeen solujen elinkelpoisuus arvioitiin mittaamalla kalseiini-AM fluoresenssi. Tiedot ilmoitetaan prosentteina elinkelpoisuuden käsittelemättömien solujen ja ovat keskiarvoja ± S.D. ja arvot neljästä kaivoista edustavasta kokeesta. *, Ero vastaavista ohjaus, p 0,05. #, Ero vastaavista käsitellyistä soluista, p 0,05. (D) Hiiret saivat ip injektio 20 mg /kg DMH tai suolaliuosta (kontrolli). Hiiret lopetettiin 48 tunnin kuluttua, ja niiden distaalinen kaksoispisteet poistettiin ja formaliinilla kiinnitetyt. Kudosleikkeet valmistettiin sitten ja alistettiin H

p

0,01; #, Ero WT hiiret altistettiin DMH,

p

0,01. (E) Hiiriä käsiteltiin kuten (D), paitsi että ne lopetettiin 24 tunnin kuluttua. Distal kaksoispisteet poistettiin ja formaliinilla kiinnitetty. Kudosleikkeet valmistettiin sitten ja alistettiin IHC vasta-aineiden kanssa poly (ADP-riboosi). Punainen ruutu osoittaa suurennetun alueilla; keltaiset nuolet osoittavat, poly (ADP-riboosi) -immunoreactive ytimeksi. (F) kvantifiointi poly (ADP-riboosi) -immunoreactive ytimet KIE paksusuolen limakalvon eri koeryhmiin.

Association between ICAD-geenin poisto ja vähentää herkkyyttä paksusuolen epiteelisolujen kuolemaan ärsykkeisiin

Koska mahdollisia kasvaimia aiheuttavasta vaikutuksesta ICAD puutos kun DNA-vaurioita, tarkastelimme tätä mahdollisuutta paksusuolessa asetus

in vitro

ja

in vivo

. Testauksen aloittaminen hypoteesia, tutkimme vaikutus

ICAD

geeni Knockout vasteesta ensisijainen paksusuolen epiteelisolujen (KIE) ja indusoijien solukuoleman, esimerkiksi TNF-α, sykloheksimi-, ja voihappo ( TNF + CHX + BA) tai paksusuolessa karsinogeeni DMH. Olemme aiemmin osoittaneet, että TNF + CHX + BA yhdistelmä edistää tehokkaasti solukuoleman KIE-maissa [26]. Lisäksi useat raportit meille ja muut osoittivat, että sykloheksamidin tai butyraatti herkistää useita ihmisen paksusuolen epiteelisolujen solulinjoja TNF-α-solukuolema [26], [27], [28], [29], [30]. Olemme äskettäin perustettu menetelmä eristämiseksi ensisijaisesti paksusuolen epiteelisoluissa [26]. Kuvio 2B esittää tyypillisiä ominaisuuksia epiteelisolujen johtuvat yksittäinen paksusuolen crypt; epiteelisolujen luonne eristettyjä soluja vahvistettiin immunofluoresenssilla vasta-aineiden sytokeratiinia. Hoito KIE TNF + CHX + BA aiheuttama kuolema, joka oli kohtalaisen mutta merkitsevästi väheni ICAD puutos (Fig. 2C). Mielenkiintoista, ICAD puutos koitui parempi kestävyys soluntappokyky vastauksena DMH. Me seuraavaksi tutkittava, onko ICAD puutos myös siirrettävä vastustuskykyä DMH

in vivo

upon akuutin altistuksen. Hiiriä hoidettiin yhdellä annoksella (20 mg /kg) DMH 24 tai 48 tuntia. Kuvio 2D esittää, että ICAD puute merkittävästi vähentänyt pycnotic /apoptoottisten solujen paksusuolen limakalvolla arvioitiin 48 tunnin kuluttua DMH altistuksen. Koska meidän aiemmin raportoitu yhteys ICAD ilmaisun ja PARP aktivointi [13], [16], tutkimme onko vastus ICAD

– /- KIE ja DMH aiheuttama kuolema liittyi lasku PARP aktivointi. Kuvio 2E osoittaa, että DMH indusoi vahvaa aktivaation PARP osoituksena poly (ADP-riboosi) immunoreaktiivisuus ytimet KIE paksusuolen limakalvossa käsiteltyjen hiirten. Tämä PARP aktivointi oli selvästi vähemmän paksusuolen epiteelisoluissa limakalvon DMH saaneista ICAD

– /- hiirissä. Kvantifiointi nämä tulokset on esitetty kuviossa 2F. Nämä tulokset viittaavat siihen, että DMH-solukuolema liittyy PARP aktivointi ja ICAD ekspressio tarvitaan tehokkaan induktion kuten solukuoleman. Vielä tärkeämpää on, nämä tulokset viittaavat siihen, että vastus kuolemaan myönnetty ICAD puute voi osallistua koko prosessiin tumorigeneesin paksusuolessa.

Enhancement herkkyys DMH aiheuttamaa paksusuolen tuumorigeneesiä by ICAD puute mahdollisesti post-ACF muodostumisen

edelleen testata edellä mainitun hypoteesin, tutkimme vaikutus ICAD geenideleetiovektoria mallissa paksusuolen kasvaimen kehittymisen. WT ja ICAD

– /- hiiret injektoitiin intraperitoneaalisesti kerran viikossa 8 viikon ajan, 20 mg /kg DMH tai ajoneuvon (1 mM EDTA suolaliuoksessa). Sitten hiiret tapettiin 12 tai 24 viikkoa sen jälkeen, kun viimeisestä injektiosta. Kuvio 1A esittää, että 25% DMH-käsiteltyjen WT hiirille kehittyi kasvaimia näyttää kohtalaisen merkitty vastustuskyky DMH aiheuttama tuumorigeneesiä, piirre, joka on yhdenmukainen raportoidun vastus C57BL /6 ja 129 /Sv-kantojen paksusuolen tuumorigeneesiin indusoi by DMH tai sen sivutuotteena azoxymethane [31]. Kuitenkin 58,3% DMH altistuneet ICAD

– /- hiirille kehittyi kasvaimia, mikä vahvistaa Tuumorigeenisuustutkimuksissa havaittu

in vitro

. Kun taas keskimääräinen kasvaimen hiirtä kohden WT hiirillä oli -0,5, keskimääräinen kasvaimia ICAD

– /- hiirillä oli ~ 3,5 noin 7 kertaa suurempi, mikä viittaa siihen, että ICAD puute ei ainoastaan ​​lisännyt alttiutta hiirten DMH vaan myös lisäsivät kasvainten lukumäärää. Tuumorit havaittiin DMH-käsitelty ICAD

– /- hiirissä vaihtelivat kooltaan, mutta saavutti koot yhtä suuri kuin 1 cm, kuten on esitetty kuviossa 3A-B. Hematoksyliinillä ja eosiini-värjäys paljasti tyypillisen koolontuumoreissa huomattavista liikakasvu ja dysplasia ja kehityksen suuria ACF (Fig. 3C). Nämä kasvaimet osoittivat korkeaa PCNA positiivisuus osoituksena korkeat leviämisen (Fig. 3d). Mielenkiintoista on, että nämä kasvaimet osoittivat suuria nekroottisen alueilla ja näytetään merkittävää tulehdusta osoituksena suuri määrä tulehdussolujen kasvainten läheisyydessä (Kuva. 3E), joka korreloi korkean MCP-1 immunoreaktiivisuus, suuri kemokiini tulehdussolujen rekrytointiin, kuten sekä ilmentyminen COX-2 (Fig. 3F).

WT ja ICAD

– /- hiirille DMH injektiota kerran viikossa 8 viikkoa. Hiiret tapettiin 24 viikkoa myöhemmin. (A) halkaisija kasvainten arvioitiin eri koeryhmään; n = 12. *, Ero DMH saaneista WT hiirillä, p 0,01. (B) brutto tarkastelu suuri kasvain havaittiin DMH saaneilla ICAD

– /- hiirissä. (C) H Huomaa suuri nekroottinen ytimet (mustat nuolet) ja verisuonten muodostumista (keltaiset nuolet). (D) PCNA ilmentyminen paksusuolen kasvainten DMH saaneista ICAD

– /- hiirillä arvioituna IHC. (E) H oikea paneeli on IgG kontrolli.

geneettisiä muutoksia, jotka tekevät KIE resistenttejä apoptoosin tai useamman proliferatiivinen ovat kriittisiä alkutapahtumien paksusuolen kasvainten synnyssä [1]. Myöhempi kertyminen näiden muutettujen epiteelisolujen vaikuttaa ACF muodostumiseen. Nämä syövän esiasteita voidaan tai ei edetä kasvaimia, mutta yleensä pidetään edellytyksenä kasvaimen etenemistä [5]. Siksi tutkittiin, mikä vaikutus ICAD vajauksen ACF aikaisemmassa aikapisteen (12 viikkoa viimeisen DMH injektio) ja ennen kehityksen suuria adenoomien. Yllättäen vaikka määrä ACF vuonna kaksoispisteet of DMH saaneista ICAD

– /- hiirissä tiettyjä kehityssuuntia korkeampi kuin havaittu WT kollegansa eron ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio. 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ICAD puute ollut suurempi rooli syövän etenemiseen eikä aloittamista.

WT ja ICAD

– /- hiirille DMH injektiot kerran viikossa 8 viikon ajan. Hiiret tapettiin 12 viikkoa myöhemmin. ACF tunnistettiin ja laskettiin H n = 12. * Ero DMH saaneista WT hiirillä, p 0,05. Oikeassa paneelissa on esimerkki suuren ACF paksusuolen on DMH käsitellyn ICAD

– /- hiiri.

edistäminen genomista epävakauden ICAD puutos kun DMH altistumisen hiirillä ja vaikutukset paksusuolen syöpään liittyvien geenien

CAD puute oli äskettäin liittynyt perimän epävakaisuuden ihon syövän synnyn ja säteilytettyjen solulinjoissa [20], [21]. Estämällä DNA pirstoutumista kaspaasi-3-resistentti mutantti ICAD lisännyt kromosomipoikkeamia p53-riippumattomalla tavalla [32]. Meidän vieressä halusi tutkia kasvaimen alttius DMH saaneilla ICAD

– /- hiirillä liittyi muutoksen perimän eheyden kaksoispisteet of DMH saaneista ICAD

– /- hiirissä. Tätä varten suoritimme array vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) analyysit kasvaimen sisältävän paksusuolen kudoksiin ICAD

– /- hiirissä ja niitä verrattiin WT kanssa. Kuvio 5 osoittaa, että hoito DMH aiheutti lievää genomista epävakautta WT-hiirissä, jotka olivat pääasiassa deleetioiden merkittävimmin kromosomien 2, 9, 11, 13, ja 15. jyrkästi, muutokset paksusuolen kudoksiin DMH-käsiteltyjen ICAD

– /- hiiret olivat laajoja ja koostuivat etupäässä monistuksissa. Kuvio 5B näyttää kvantitatiivisia arvioita muutosten esimerkkinä osuus ICAD genomiseen epävakautta. On huomionarvoista, että vaikka ICAD puute liittyi 170 vahvistusta ja 120 poistetaan pesäkkeet, ICAD taito liittyi saarto useimpien monistukset (20 polttopistettä) ja kohtalainen vaikutus poistot (68 pesäkkeitä). Kun vaativuutta kasvatettiin ja rajataajuus on 3-kertainen muutos on sovellettu, numerot muunnetun sivustoja huomattavasti vähentynyt, mutta trendi pysyi samana (Fig. 5D), joka edelleen varmistaa osallistuminen ICAD genomisessa eheyden.

eristetty kromosomaalinen DNA eri koeryhmien arvioitiin yleistä kromosomimuutokset käyttäen oligo microarray-pohjainen CGH siru, joka sisälsi 105000 hiiren genomin koettimia.