Krooninen sairaus

tiivistelmä

Gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH) reseptorit ilmentyvät eturauhassyövän, erityisesti aggressiivisin vaihe kasvain (kastraatio kestävä eturauhassyöpä, CRPC) ja tavanomaisen hoidon, dosetakseli kemoterapian, voi vain parantaa keskimääräinen elinaika mukaan muutaman kuukauden. Osoitimme aikaisemmin, että GnRH-agonistit saavat aikaan tuumorin vastainen aktiivisuus CRPC soluissa; kuitenkin, välisen yhteyden GnRH-reseptoreihin ja apoptoottisen koneiston on määriteltävä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida, onko CRPC soluissa, GnRH saattavat vaikuttaa ilmaus /aktiivisuutta apoptoosin liittyvien proteiinien ja saattaa herkistää tai resensitize, syöpäsolujen kemoterapeuttisia. Olemme osoittaneet, että p53-positiiviset DU145-solut, GnRH: a) lisätä ilmentymistä proapoptoottiset proteiinin Bax; tämä vaikutus välittyy fosforylaation (aktivointi) ja p53, laukaisee p38 MAPK; b) voimistaa antiproliferatiivinen /proapoptoottiset aktiivisuutta dosetakseli; c) resensitize doketakseli-resistenttien solujen antituumorivaikutuksen sytotoksista lääkettä. Nämä tiedot osoittavat, että GnRH-agonistien herkistää ja, mikä tärkeintä, resensitize DU145 CRPC solujen kemotera- p53-riippuvaisella tavalla. Vahvista keskeistä roolia p53 aktiivisuudessa GnRH-agonistien, kokeet suoritettiin p53-null PC3-soluissa. Huomasimme, että GnRH-agonistit eivät nouse Bax ilmaisun eivätkä sytotoksista aktiivisuutta dosetakselia. Nämä tulokset voivat antaa perusteet uusi yhdistelmä hoidon strategioita etenkin dosetakseli kestävä CRPC potilaille ilmentämään toimivaa p53-proteiini.

Citation: Moretti RM, Marelli MM, Taylor DM, Martini PGV, Marzagalli M, LIMONTA P (2014) Gonadotropiinia vapauttava hormoni agonistit herkistää ja Resensitize, syöpäsolujen Docetaxel on p53-riippuvaisella tavalla. PLoS ONE 9 (4): e93713. doi: 10,1371 /journal.pone.0093713

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 14 lokakuu 2013; Hyväksytty 5 maaliskuuta 2014; Julkaistu: 10 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Moretti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Università degli Studi di Milano, PUR-ohjelma (apurahoja n. 01-12-95 ja 12-1-104). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisimmin diagnosoitu syöpä miehillä ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten länsimaiden [1]. Useimmat eturauhasen syöpiä ovat riippuvaisia ​​androgeenien läsnäolon kasvua ja selviytymistä, ja androgeeniablaatio hoito, jonka tarkoituksena estää androgeenin erityksen /toimintaa, edustaa tehokkain hoidon alussa [2], [3]. Tämä hoito sisältää kirurgisen tai kemiallisen kastraation, saavutettu: anto gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH) analogeja; esto sitoutumisen androgeenien niiden reseptoriin antiandrogeenit; esto steroidien entsyymien. Valitettavasti huolimatta erinomainen ensimmäinen vastaus, noin 2-3 vuotta, useimmat eturauhasen syöpiä tulee edetä kastraatio kestävät eturauhassyöpä (CRPC) vaihe lisääntynyt leviämisen ja maligniteetin [4], [5]. CRPc potilaille, taksaani kemoterapian edustaa hoidon valinnan [6], [7]. Doketakseli vaikuttaa sitoutumalla tubuliinin edistää polymeroitumisen ja estää mikroputkidepolymeroitumi- nen puuttuessa guanosiinitrifosfaatin. On myös osoitettu indusoivan kasvainsolun kuoleman vaikuttamalla ilmaisu /aktiivisuutta useita syövän erityisiä tavoitteita, mukaan lukien vaimennussäätely antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja ylössäätely proapoptoottiset proteiinin Bax [8], [9]. Huolimatta alustavan esittelyn paremman selviytymisen dosetakseliannoksella kemoterapian paraneminen todettiin olevan vain ilman taudin etenemistä muutaman kuukauden [6], [10]. Siten potilaiden hoitoon CRPC joka etenee jälkeen dosetakseli kemoterapian edelleen merkittävä kliininen haaste. Tunnistaminen uusia strategioita, joilla pyritään poistamaan doketakseli vastus todennäköisesti parantaa terapeuttisia vaihtoehtoja näille potilaille.

GnRH tunnistettiin ensin hypotalamus avainsäätelijä lisääntymistoimintoja. Sitoutumalla spesifisiin reseptoreihin (GnRH-R) aivolisäkkeen gonadotropes GnRH aktivoi aivolisäkkeessä-sukurauhasakselin akselilla. GnRH-agonistit, kun sitä annetaan jatkuvasti ja suurina annoksina, desensitize aivolisäkkeen GnRH-R, siten välttäen sukurauhasten steroidien eritys; perusteella toimintansa, nämä yhdisteet ovat yleisimmin ja käyttää menestyksellisesti lääkehoitoa androgen reagoiva eturauhassyöpä [2], [11].

Nyt on vakiintunut, että GnRH-reseptorit ilmentyvät eturauhasen syöpäsoluja, erityisesti CRPC soluissa ja kudoksissa [12] – [15].

Nämä reseptorit (sekä GnRH-reseptoreihin rinta- ja gynekologinen syöpä solujen ja kudosten) on ensimmäinen tunnettu suhteen sitoutumisaffiniteetin. Kuitenkin vastakkaisia ​​tuloksia on raportoitu: yksi luokka matalan affiniteetin sitoutumiskohtiin [12], [13], [16] – [18]; kahdenlaisia ​​reseptoreita (yksi suurella affiniteetilla ja yksi alhainen affiniteetti) [19] – [21]; yhden luokan suuren affiniteetin GnRH sitoutumiskohdat [22] – [25]. Erityisesti olemme raportoitu ollessa alhainen affiniteetti GnRH-reseptoreihin eturauhassyövän soluissa [12], [13]. Syynä tähän ero on vielä Kiistanalaista; kuitenkin, se saattaa johtua siitä, että erilaisissa koeolosuhteissa antoi (eri syöpäsolulinjoilla ja ligandit, arviointi sitoutumisaffiniteetti syöpäsoluissa /ilmentävien kudoksien sitoutumiskohdat

vs

. muokatut solut yli-ilmentävät reseptoreita, solu erityinen posttranslational muutoksia reseptorin,

jne.

).

Nämä ensimmäiset vastakkaisia ​​havainnot stimuloi luonnehdinta syövän GnRH-reseptorien molekyylitasolla. Erityisesti, me raportoitu, että sekä mRNA, joka koodaa ihmisen aivolisäkkeen GnRH-reseptorin ja vastaavan proteiinin ilmaistaan ​​eturauhassyöpäsoluissa, joko androgeeniriippuvaisen tai kastraatio-resistenttejä [26]. Lisäksi nukleotidisekvenssi cDNA: n, joka koodaa kasvaimeen reseptorien on osoitettu vastaamaan aiemmin raportoitu aivolisäkkeen reseptoreihin [27], [28].

osoitti lisäksi, että GnRH-agonistien, aktivoimalla paikallisesti ilmaisi GnRH-reseptoreihin, luovat voimakkaita antiproliferatiivinen vaikutus eturauhassyövän soluissa, sekä

in vitro

ja

in vivo

[12], [29], [30]; Tämän antituumorivaikutus on erityinen, koska se kumosi kokonaan sen jälkeen, kun hiljentäminen GnRH-reseptorin, jonka avulla tietyn siRNA [31].

lisäksi vähentää solujen lisääntymistä, apoptoosi on ehdotettu olevan osallisena kasvaimen kasvua estävä aktiivisuutta GnRH-analogien. Kuitenkin tähän asti saadut tiedot tästä asiasta ovat vielä kiistanalaisia ​​[30], [32] – [35].

Täällä vahvistavat aiemmat havainto, että GnRH-agonistit eivät sinänsä indusoi apoptoosin CRPC soluja. Kuitenkin p53-ilmentävät DU145 eturauhasen syöpäsoluja, ne lisäävät ilmentymistä proapoptoottiset proteiinin Bax, fosforylaation kautta Ser-15 (

eli

., Aktivointi) ja p53 tärkeä säätelijä luontaisen apoptoottisen reitin ; aktivointi Tämän p53-Bax apoptoottisten signalointi laukaisee p38 MAPK fosforylaatio. Samalla osoitetaan, että GnRH herkistää DU145 solujen mitoosinvastainen dosetakselia. Vielä tärkeämpää on, GnRH-agonistien resensitize dosetakseli-resistenttejä DU145-solujen kuoleman indusoivaa aktiivisuutta kemoterapeuttisen aineen. Nämä tiedot osoittavat, että p53-positiivisten syöpäsolujen, kohdistaminen paikallisesti ilmaistuna GnRH-reseptorien avulla GnRH-agonistien herkistää ja herkistää syöpäsolut kemoterapia, p53-riippuvaisella tavalla. Ratkaiseva rooli p53 osoittaa edelleen se havainto, että GnRH-agonistit eivät vaikuta Bax ilmaisua ja jättää voimistaa apoptoottinen aktiivisuus Doketakselin p53-null PC3 syöpäsolujen. Yhdessä nämä tulokset edustavat perustelut yhdistelmähoito strategioita dosetakseli vastustuskykyisten CRPC potilaille, ilmentämään toimivaa p53-proteiini.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

Ihmisen kastraatio kestävä DU145 (p53-positiiviset) ja PC3 (p53-null) eturauhassyöpäsolulinjoissa ostettiin American Tissue Culture Collection. Sekä PC3 ja DU145 solut edustavat tarkoituksenmukaista ja laajasti käytetty malli CRPC kirjallisuudessa [36] – [40]. Soluja kasvatettiin rutiininomaisesti Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), glutamiini (1 mmol /l) ja antibiootteja (100 IU /ml G-penisilliini ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia), kosteutetussa atmosfäärissä 5% CO

2/95% ilmaa 37 ° C: ssa.

Materiaalit ja vasta-aineet

GnRH-agonistin Gosereliiniasetaatti [D-Ser (tBu )

6Aza-Gly

10-GnRH, tsoladeksi, GnRH-A] oli ystävällisesti AstraZeneca Pharmaceuticals. GnRH-antagonisti antidi (Ant) ja doketakseli (Doc) ostettiin Sigma-Aldrich.

Kaikissa kokeissa, GnRH-agonisti on käytetty annoksella 10

-6 mol /l, perusteella aiemmissa tutkimuksissa, kirjoittajien laboratoriossa samoin kuin muut, joilla on tarkoitus tutkia molekyyli näkökohtia antituumorivaikutuksen GnRH-analogien CRPC soluihin [29], [41] – [46]. Sama annosvalikoima myös käytetty tutkimaan antituumorivaikutuksen GnRH-agonistien useissa kokeellisissa malleissa syöpäsoluja yli-ilmentävät GnRH-reseptorin [16], [47] – [49].

Pifithrin-α, The spesifinen inhibiittori p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden, ja SB203580, erityinen p38 MAPK estäjä, ostettiin Santa Cruz Biotechnology ja Sigma-Aldrich, vastaavasti.

Vasta-aineet, joita käytetään Western blot kokeissa: kanin anti-humaani Bax (1 :500; # 2772), kaniinin anti-ihmisen p38 MAPK (1:1,000 ;. # 9212) ja kanin anti-humaani p-p38 MAPK (1:1,000; # 9211) Cell Signaling Technology; hiiren monoklonaalista anti-ihmisen Bcl-2 (1:250; # Sc-7382), hiiren monoklonaalinen anti-humaani-p53 (1:1,000; # Sc-53394), kanin anti-humaani-s-p53 (Ser-15; 1: 1000; # Sc-101762) ja vuohen anti-ihmisen aktiini 1-19 (1:1,000; # Sc-1616) Santa Cruz Biotechnology.

Microarray Analysis

DU145 eturauhassyövän solut kylvetään (5 x 10

5 solua /malja) 10 cm: kudosviljelylautasiin; 48 tunnin kuluttua solut käsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l) 24 tunnin ajan, ja kokonais-RNA valmistettiin käyttämällä RNeasy Mini -kittiä (Qiagen), mukaan valmistajan ohjeiden. Sen jälkeen laadunvalvonta käyttäen bioanalysaattorin (Agilent 2100), RNA: t leimattiin mukaan Affymetrix protokollan Yksi Cycle Labeling Kit (Affymetrix). 15 ug saatua cRNA hybridisoitiin päälle koko genomin microarray U133 plus 2.0. Hybridisaation jälkeen on Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 sirut, geenien ilmentyminen arvot arvioitiin kullekin koetinsarjaa käyttäen paketteja Bioconductor suite [50]. Geenit normalisoituivat ja analysoitiin Robust Multichip Analysis (RMA) menetelmä sisällä affy paketti [51] ja GCRMA paketin [52]. Erot loki ekspressiotasoja sekä RMA ja GCRMA normalisoitu data arvioitiin kahden tailed t-testiä toteutettu Limma paketti [53]. Geenejä

P

-arvot 0,05 ja absoluuttinen ilmaisun kertaisesti vaihtaa suurempi kuin 1,5, katsottiin merkittävästi ilmentyvät eri (DE) välillä käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen. Geeni luettelo muodostettiin ottamalla päällekkäisyys DE geenien tuottamat Limma sekä RMA ja GCRMA normalisointi menetelmiä.

Western blot -analyysi

lopussa kokeiden, solut pestiin PBS: lla ja lyysattiin RIPA-puskuriin (0,05 mol /L Tris-HCl pH 7,7, 0,15 mol /l NaCl: a, 0,8% SDS: ää, 10 mmol /l EDTA: a, 100 umol /l NaVO4, 50 mmol /L NaF, 0,3 mmol /l PMSF , 5 mmol /l jodietikkahapon), joka sisälsi leupeptiiniä (50 ug /ml), aprotiniinia (5 ul /ml) ja pepstatiinia (50 ug /ml). Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-menetelmää. Proteiini uutteet (30 ug) suspendoitiin Näytepuskuriin (0,5 mol /L Tris-HCl pH 6,8, 20% glyserolia, 10% SDS, 0,2% 2β-merkaptoetanolia, 0,05% sininen bromifenoli) ja kuumennettiin 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan . Elektroforeettisen erottamisen SDS-PAGE, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Membraanit blokattiin 3% rasvatonta kuivamaitoa ennen inkubointia huoneenlämpötilassa 2 tuntia erityisten primaaristen vasta-aineiden on sopivia laimennoksia. Detektio tehtiin käyttämällä piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja tehostetun kemiluminesenssin reagenssit (SuperSignal Chemiluminescence Detection System). Kussakin Western blot kokeen aktiinin ilmentymistä arvioitiin latauskontrollina. Kunkin proteiinin analyysi, kolmea eri kokeet tehtiin; densitometrinen analyysi raportoitu kuvioissa suoritettiin tuloksista on saatu kolmesta eri kokeissa.

Cell Proliferation ja elinkykyyn Studies

DU145 ja PC3-solut ympättiin (1 x 10

4 solua per malja) on 6 cm ruokia. 2 päivän jälkeen solut käsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l) 24 tunnin ajan, joko yksin tai, kun läsnä on GnRH-antagonisti Antide (Ant, 10

-6 mol /l) , jonka jälkeen dosetakseli (10 nmol /l) 48-72 tuntia. Solut, jotka käsitelty kutakin kahden lääkkeen yksin tai ilman mitään käsittelyä toimivat kontrolleina. Lopussa hoitoja, solut kerättiin ja laskettiin hemosytometrillä. Elinkelpoisuutta tutkimuksia, DU145 ja PC3-soluja käsiteltiin, kuten on kuvattu, ja solujen elinkyky mitattiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Kuolleiden solujen mitattiin laskemalla Trypan Blue-värjäys soluissa.

kaspaasi-3 entsyymiaktiivisuustesti

kaspaasi-3-kaltaisen aktiivisuuden arvioitiin käyttäen CaspACE kolorimetristä määritystä Kit (Promega). DU145 solut ympättiin (2 x 10

5 solua /malja) 10 cm ruokia. 2 päivän jälkeen solut esikäsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l) 24 tunnin ajan ja sitten se käsiteltiin dosetakselin (10 nmol /l) 72 tunnin ajan. Lopussa hoitoja, solut (sekä kiinnittynyt ja irrottaa) lyysattiin lyysipuskurissa kitin sisältämään mitä seurasi sentrifugointi (15000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa). Kaspaasi-3-kaltaisen aktiivisuuden arvioitiin seuraavien proteolyyttisen kolorimetrisen alustan Ac-DEVD-pNA. Näytteet luettiin 405 nm: ssä spektrofotometrillä käyttäen 100 ui quarz kyvettiin. Yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk käytettiin varmistamaan spesifisyyttä.

pesäkemuodostusta

kehittämiseksi dosetakseli-resistenttien solujen (DU145-R), DU145 soluja kylvetään 10 cm: n maljoissa sarjaan käsiteltiin dosetakselin (10 nmol /l, kerran viikossa), kunnes ne on kehitetty kyky kasvaa ja jakautua läsnäollessa lääkeaineen (8 viikkoa). Sen tutkimiseksi, GnRH voi resensitize DU145-R solujen toimintaa doketakseli standardin klonogeenisten määritys suoritettiin. DU145-R-soluja ympättiin 1000 solua /kuoppa kuuteen-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Sitten soluja käsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l) 24 tuntia, minkä jälkeen dosetakselin (10 nmol /l) 72 tunnin ajan. Lopussa hoidon, solut huuhdeltiin ja lisättiin tuoretta väliainetta. Soluja viljeltiin 14 päivää 5% FBS: ää sisältävässä väliaineessa ja sitten kiinnitettiin ja värjättiin kristallivioletilla. Kuvia värjättyä pesäkettä vangiksi Nikonin photocamera.

Tilastollinen analyysi

Tarvittaessa tiedot analysoitiin Bonferronin testi, kun yksisuuntainen varianssianalyysi.

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

GnRH lisäys Bax ilmentäminen DU145 Solut

aiemmin raportoitu, että GnRH-agonistit aiheuttavat antiproliferatiivinen vaikutus DU145 syöpäsolujen. On kuitenkin vielä epäselvää, onko apoptoosin saattaa myös olla mukana antituumorivaikutuksen näiden yhdisteiden [30], [32] – [35]. Bcl-2 perheen solukuoleman sääntelyviranomaisten (sekä proapoptoottiset ja prosurvival) edustaa kriittinen kohta on sisäisen reaktiotien apoptoosin. Tasapaino näiden kahden luokan proteiinien määrää kohtalo solun. Proapoptoottiset proteiini Bax kautta oligomerointia Bak, translokoituu sytoplasmasta mitokondriot lisätä mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi, liipaisu sytokromi

c

vapautumista ja kaspaasi-3: n aktiivisuuden [54]. Tässä me tutkimme, GnRH-agonistit saattavat vaikuttaa geenien mukana apoptoottisen reitin. DU145-soluja käsiteltiin GnRH-A: ssa 24 tuntia ja muutoksia geeni-ilmentymisessä profiili arvioitiin genominlaajuisia transcriptomic analyysi. Niistä geenejä, joiden ilmentyminen oli modifioitu käsittelemällä keskityimme huomiomme ilmaisun

Bax

.

Bax

ilmentyminen lisääntyi merkitsevästi 1,67 kertaiseksi (taulukko 1); tämä kasvu vahvistettiin proteiinin tason Western-blottauksella (kuvio. 1A). Stimuloiva vaikutus GnRH-A Bax ilmentymisen havaittiin olevan spesifinen, koska se on kumottu yhteiskäsittely solujen kanssa GnRH-antagonisti Antiden (Fig. 1 B). Toisaalta, GnRH-agonisti ei ole vaikutusta ekspression antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2 (Fig. 1 C).

(A) DU145-soluja käsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l) ja joko 24 tai 48 tuntia. Western blotting suoritettiin kokosoluekstraktien käyttämällä anti-Bax vasta-aine. Kuten odotettua, GnRH-A hoito lisää Bax-proteiinin ilmentymistä 24 tunnin käsittelyn. (B) DU145-soluja käsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l) ja GnRH-antagonistin Antide (Ant, 10

-6 mol /l), joko yksin tai yhdistelmänä, 24 tuntia. Western-blottaus suoritettiin, kuten on kuvattu kohdassa A). Ant, annetaan yksinään, ei vaikuta Bax ilmentymistä, kun taas GnRH-A, kuten odotettua, lisää ilmentymistä Bax. Tämä stimuloiva vaikutus GnRH-A on erityinen, koska se kumottu yhteiskäsittely solujen kanssa GnRH-antagonisti. (C) hoito DU145 solujen GnRH-A (10

-6 mol /l) joko 24 tai 48 tuntia, ei vaikuta Bcl-2: n ilmentymisen, kuten arvioitiin Western-blottauksella. Sekä Bax ja Bcl-2-proteiinin ilmentymisen analyysi yksi edustaja kolmesta eri kokeesta. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SEM. *

P

0,05

verrattuna

C (käsittelemättömät kontrollit); **

P

0,05

versus

GnRH-A-käsitellyissä soluissa.

In DU145 Solut GnRH upregulate Bax Expression kautta p53 Signaling Pathway

keskeinen rooli p53 luontaisen apoptoottisen reitin on vakiintunut [55]. Sen jälkeen, kun aktivoidaan fosforylaation Ser-15, p53 translokoituu tumaan säätelemään ilmentymistä proapoptoottiset geenien, kuten

Bax

[56]. Lisäksi p53-fosforylaatio raportoitu olevan riippuvainen aktiivisuus p38 MAPK [57]. Western blot-analyysi huomasimme, että DU145 soluissa, GnRH-A hoito (1-48 tuntia) ei vaikuttanut p53; kuitenkin, tasot seriini-15 fosforyloidun (

so

., aktiivinen) muodon proteiinin huomattavasti sen jälkeen, kun 1 ja 5 tuntia hoidon jälkeen (Fig. 2A). Kun solut esikäsiteltiin (2 tuntia) ja pifithrin-α (p53-estäjä) stimuloiva vaikutus GnRH-A (24 tuntia) on Bax ilmentyminen poistaa kokonaan (Fig. 2B). Olemme myös havainneet, että solujen käsittelyä, jossa GnRH-A (5-15 minuuttia) ei ollut vaikutusta ilmentymistason p38 MAPK; mutta se lisäsi merkittävästi tasot fosforyloitua muotoa MAPK, 5 ja 10 minuutin aikavälein (Fig. 3A). Esikäsittely (30 minuuttia) solujen kanssa SB203580 (1 umol /l), erityinen p38-estäjä, vähensi merkitsevästi stimuloivia vaikutuksia GnRH-A p53 fosforylaatioon (1 ja 5 tuntia) (Fig. 3B). Siten DU145-solut GnRH-agonistien upregulate ilmentymisen proapoptoottiset proteiinin Bax kautta p53 phoshorylation; p38 MAPK on ylävirran aktivaattori tämän p53-Bax-signalointireitin.

(A) DU145-soluja käsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l), eri aikavälein (1-48 tuntia). Western blot analyysi suoritettiin kokosolu-uutteista käyttäen p53 tai p-p53 (Ser-15) vasta-aineita. Hoito GnRH-A ei vaikuta p53 milloin tahansa väliajoin huomioon; kuitenkin, tasot seriini-15 fosforyloitua muotoa proteiinin huomattavasti sen jälkeen, kun 1 ja 5 tuntia hoidon jälkeen. (B) DU145-soluja käsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l), joko yksin tai esikäsittelyn jälkeen pifithrin-α (Pif, 30 umol /l, 2 tuntia), erityinen p53-estäjä. Western blot analyysi suoritettiin kokosoluekstraktien käyttäen Bax antiobody. Saadut tulokset osoittavat, että pifitrhin-α, kun sitä annettiin yksin, ei vaikuta Bax ilmaisua. Kuten odotettua, GnRH-A lisää ilmentymistä Bax; tämä vaikutus on täysin poistetaan, kun solut esikäsitellään pifithrin-α. Yksi edustaja kolmesta eri kokeissa kunkin analyysien, on esitetty. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SEM. *

P

0,05

verrattuna

C (käsittelemättömät kontrollit); **

P

0,05

versus

GnRH-A-käsitellyissä soluissa.

(A) DU145-soluja käsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l), eri aikavälein (5-15 minuuttia). Western blot analyysi suoritettiin kokosolu-uutteista käyttäen p38 ja p-p38-vasta-aineita. Hoito GnRH-A ei vaikuta ilmentymistä p38 milloin tahansa aikavälillä harkita. Toisaalta, GnRH-A lisää merkittävästi tasot fosforyloitua muotoa p38 (p-p38) 5 ja 10 minuutin käsittelyn jälkeen. (B) Kuten odotettua, GnRH-A lisää ekspressiotasot p-p53, vahvistaa aikaisempiin tuloksiin; densitometrinen analyysi tiedot osoittavat, että tämä vaikutus on merkittävästi vähentynyt, kun solut esikäsiteltiin erityinen p38-estäjän SB203580 (SB, 1 umol /l, 30 minuuttia). Yksi edustaja kolmesta eri kokeissa kunkin analyysien, on esitetty. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SEM. *

P

0,05

verrattuna

C (käsittelemättömät kontrollit); **

P

0,05

versus

GnRH-A-käsitellyissä soluissa.

GnRH-agonistien Kiinnitetään p53-positiivisia DU145-solujen sytotoksista aktiivisuutta Doketakseli

häiriön välisen tasapainon pro- ja antiapoptoottisten tekijöiden on ratkaiseva askel solussa päätöksessä apoptoosiin tai selviytymistä. Perustuen stimuloivan vaikutuksen GnRH agonistien Bax ilmaisun välittämän p53 aktivaation, me tutkimme, GnRH saattaa aiheuttaa apoptoosin DU145 soluissa. FACS-analyysillä ei voitu havainnoida mitään proapoptoottiset vaikutus GnRH-A näissä soluissa (tietoja ei ole esitetty). Nämä havainnot eivät olleet odottamattomia, koska se oli aikaisemmin todettu, että CRPC soluissa, GnRH vähentää solujen lisääntymistä aiheuttamatta apoptoosin [30], [32], [35]. Syy miksi DU145 soluissa, GnRH lisätä Bax tasoja ilman, että syntyy apoptoottinen tapahtuma on kiehtova. On kuitenkin hyvin tunnettua, että DU145-solut yli-ilmentävät antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2, ja tasot tämän proteiinin ei vaikuta GnRH-A hoitoon (ks. 1C). Näin ollen on mahdollista, että näissä soluissa, lisääntynyt ilmentyminen Bax GnRH-A ei ole riittävä tehokkaasti parantaa Bax /Bcl-2-suhde laukaista apoptoosin. Perusteella näiden seikkojen, päättelimme, että GnRH-agonistit, kautta säätelyä proapoptoottiset tekijöistä, saattaa herkistää syöpäsolujen aktiivisuudelle sytotoksisten lääkkeiden, joiden tiedetään toimivan lisäämällä ilmaus proapoptoottiset tekijöistä väheni että antiapoptoottisten proteiineja. Olemme keskittäneet huomiomme doketakselia alkaen: a) se edustaa hoidon valinta CRPC [4], [5]; b) se on osoitettu indusoivan kasvaimen solukuoleman kautta ylössäätely proapoptoottiset proteiinin Bax ja vaimennussäätely antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2 [8], [9]. Ensimmäinen, Western blottauksella, olemme vahvistaneet, että doketakseli (48 tuntia) vähentää merkittävästi Bcl-2, ja lisäävät, että Bax (Fig. 4A). Sitten arvioimme onko GnRH saattaa voimistaa antituumorivaikutuksen dosetakselia. Ensin havaittu, että kun annetaan yksinään, GnRH-A (24 tuntia) ei vaikuta leviämisen DU145 soluja. Tämä ei ollut odottamatonta, sillä olemme aiemmin raportoitu, että CRPC soluissa, GnRH voi aiheuttavat merkittävän antiproliferatiivinen vaikutus, jos hoidot tehdään pidemmän aikavälein (4-7 päivää) [29]. Vastaavia tietoja on raportoitu muunlaisia ​​kasvaimia [58], [59]. Sitten osoitimme, että esikäsittely DU145-solujen GnRH-A (24 tuntia) parantaa merkittävästi antiproliferatiivisia vaikutuksia dosetakselin (48-72 tuntia) kaikissa aikaväleissä (Fig. 4B). Lisäksi, voisimme osoittaa, että herkistävä vaikutus GnRH-A dosetakselin oli spesifistä, koska se oli täysin kumottu yhteiskäsittely solujen kanssa GnRH-antagonisti Antiden (Fig. 4C). Samassa koeolosuhteissa, solujen elinkelpoisuuden arviointi suoritettiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. GnRH-A, kun sitä annettiin yksin, ei vaikuta solujen elinkykyä (Fig. 4D). Kuten odotettua, dosetakseli lisäsi merkittävästi useita myönteisiä trypaanisineä värjättyjen solujen (kuolleita soluja). Tämä vaikutus on huomattavasti voimistua esikäsittelemällä solut GnRH-A koko ajan välein (Fig. 4D). Sen varmistamiseksi, että esikäsittely GnRH herkistää CRPC solujen antituumorivaikutuksen dosetakselin, DU145-soluja käsiteltiin GnRH-A (24 tuntia) ja sitten sytotoksisen lääkeaineen 72 tunnin ajan. Kaspaasi-3-aktiivisuus arvioitiin sitten markkerina apoptoottisen solukuoleman. GnRH-A, annetaan yksinään, ei vaikuttanut kaspaasi-3: n aktiivisuuden; odotetusti, dosetakseli lisääntynyt entsymaattinen aktiivisuus. Solujen esikäsittely GnRH-A merkittävästi voimisti proapototic vaikutusta kemoterapeuttisen aineen. Vaikutus on spesifinen, koska se on torjua samanaikaisesti käsittelemällä solut pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk (Fig. 4E).

(A) Western blot -analyysi suoritettiin sen varmistamiseksi, että sytotoksinen aktiivisuus dosetakselin (Doc) välittyy häiriön suhde pro-to-antiapoptoottisten proteiinien. DU145 soluja käsiteltiin dosetakselin (10 nmol /l) 48 tuntia. Kuten odotettua, dosetakseli vähentää ilmentymistä antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja lisäävät Bax ilmentymistä. Yksi edustaja kolmesta eri kokeesta. (B) DU145-soluja esikäsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l) 24 ja sitten dosetakselin (10 nmol /l) eri aikavälein (48-72 tuntia). Lopussa hoitoja, solut laskettiin hemosytometrillä. Solujen esikäsittely GnRH-A lisää merkittävästi antiproliferatiivista vaikutusta dosetakselin kaikilla aikaväleillä huomioon. (C) DU145 soluja esikäsiteltiin GnRH-A (10

-6 mol /l) ja GnRH-antagonisti Antide (Ant, 10

-6 mol /l), joko yksin tai yhdessä, 24 tuntia, ja sitten dosetakselin (10 nmol /l) 60 tunnin ajan. Lopussa hoitoja, solut laskettiin hemosytometrillä. Solujen esikäsittely GnRH-A lisää merkittävästi antiproliferatiivinen vaikutus dosetakseli; tämä vaikutus on spesifinen, koska se on täysin kumottu yhteiskäsittely solujen kanssa Ant. (D) lopussa hoitoja (kuvatussa B), solujen elinkelpoisuus mitattiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Kuolleiden solujen mitattiin laskemalla Trypan Blue värjäytyvät solut. Tiedot ilmaistaan ​​prosentin värjättyä solua /solua yhteensä. Doketakseli lisää merkittävästi kuolleiden solujen; kaikilla aikaväleillä, tämä vaikutus on huomattavasti voimistua esikäsittelemällä solut GnRH-A. (E) DU145 soluja esikäsiteltiin GnRH-A 24 tuntia ja sitten käsiteltiin dosetakselilla 72 tuntia. Lopussa hoidon kaspaasi 3-kaltainen aktiivisuus arvioitiin käyttäen CaspACE kolorimetristä määritystä kit. Solujen esikäsittely GnRH-A merkittävästi voimistaa proapototic vaikutusta doketakselia kannalta kaspaasi-3: n aktiivisuuden. Vaikutus on erityinen, koska se torjua samanaikaisesti käsittelemällä yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk. B-E kunkin koeryhmän koostui kuudesta rinnakkaisnäytettä ja jokainen koe toistettiin kolme kertaa. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SEM. *

P

0,05

verrattuna

C (käsittelemättömät kontrollit); **

P

0,05

versus

doketakselia käsiteltyjä soluja.

Nämä tulokset osoittavat, että p53-positiivisia DU145 syöpäsolujen GnRH-agonistit nimenomaan herkistää solut sytotoksista aktiivisuutta dosetakseli; tämä vaikutus on todennäköisesti seurausta siitä, että GnRH-A-indusoidun aktivoitumisen p38 /p53 /Bax apoptoosin signalointireitin.

GnRH-agonistien Resensitize p53-positiivisia DU145-solujen sytotoksista aktiivisuutta Doketakseli

saamiseksi dosetakseli-resistenttien solujen (DU145-R), DU145 soluja sarjoittain hoidettu doketakselilla (kerran viikossa 8 viikon ajan), kunnes he kehittivät kyvyn kasvaa läsnäollessa lääkkeen. Näissä soluissa vastus sytotoksisille yhdiste liittyy merkittävä laskua Bax tasojen, ilman mitään muutosta ekspressiotason Bcl-2 (Fig. 5A), joka vahvistaa aikaisemmat havainnot raportointi vähän yksimielisyyttä taksaania-vastus ja yli-ilmentyminen Bcl-2: [60]. Toisaalta, meidän tiedot osoittavat selvästi, että DU145-soluja voidaan verrata ja voittaa antituumorivaikutuksen kemoterapeuttisten lisäämällä suhde anti ja proapoptoottiset proteiineja. By klonogeenisten määrityksessä, me olivatko GnRH-agonistit saattavat resensitize dosetakseli-resistenttien syöpäsolujen on proapoptoottiset aktiivisuuden kemoterapeuttisen lääkkeen. Hoito DU145-R-solujen GnRH-A (24 tuntia) yksinään ei vaikuttanut kykyyn solujen muodostamaan pesäkkeitä (kuvio. 5B). Kuten odotettua, DU145-R solut muodostivat pesäkkeitä läsnä dosetakselin (72 tuntia), mikä vahvistaa niiden hankinta resistenssin lääkkeelle. Kuitenkin yhdistelmähoito (GnRH-A 24 tuntia, minkä jälkeen dosetakseli 72 tuntia) kokonaan poisti pesäkkeiden muodostumista kykyä DU145-R-soluissa (kuvio. 5B). Nämä tulokset osoittavat, että GnRH-agonistit voivat resensitize dosetakseli-resistenttien syöpäsolujen sen antituumorivaikutuksen kemoterapeuttisen lääkkeen.

DU145 syöpäsolujen tehtiin resistenttejä doketakseli (Doc) käsittelyn jälkeen kemoterapeuttinen lääkeaine (10 nmol /L) kerran viikossa 8 sykliä. (A) Western blot -analyysi Bcl-2: n ja Bax: in dosetakseli-resistenttejä (DU145-R-solut).