Krooninen sairaus

tiivistelmä

Micro RNA: t (miRNA) ovat tärkeitä sääntelyviranomaisten mukana erilaisia ​​fyysisiä ja patologisia prosesseja, kuten syövän. Mirna-302 perhe on dokumentoitu niillä on keskeinen merkitys syövän synnyssä. Tässä tutkimuksessa selvitimme rooli miRNA-302a paksusuolen syöpä. MiRNA-302a ekspressiota havaittiin 44 paksusuolensyöpä kudosten ja 10 normaalin paksusuolen kudoksiin, ja niiden kliinis merkitsevyys analysoitiin. Solujen lisääntyminen ja solusyklin analyysi tehtiin koolonkarsinoomasoluissa että pysyvästi ilmensivät miRNA-302a. Tavoitteena geeni miRNA-302a ja alavirran polku tutkittiin tarkemmin. Verrattuna normaaliin paksusuolen kudoksiin, miRNA-302a ilmentyminen säädeltiin vähentävästi paksusuolen syövän kudoksissa. Yli-ilmentymisen miRNA-302a aiheuttamaa G1 /S solusyklin pysähtymisen koolonkarsinoomasoluissa, ja tukahdutti paksusuolensyöpä solujen lisääntymistä sekä

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi miRNA-302a esti

AKT

ilmentymisen suoraan sitoutumalla sen 3’alueella, jolloin myöhemmin tehtävät muutokset

AKT-GSK3p-sykliini D1

kautta. Nämä tulokset paljastavat miRNA-302a tuumorisuppressorina paksusuolen syöpä, mikä viittaa siihen, että miRNA-302a voidaan käyttää mahdollisena kohteena terapeuttiselle interventiolle paksusuolensyöpä.

Citation: Sun S, Zhang G, Wu Z, Shi W, Yang B, Li Y (2014)

MicroRNA-302a

Toimii Otaksuttavat tuumorisuppressori Colon Cancer by Targeting

Akt

. PLoS ONE 9 (12): e115980. doi: 10,1371 /journal.pone.0115980

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 15 syyskuu 2014; Hyväksytty: 02 joulukuu 2014; Julkaistu: 26 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Sun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kliinis ominaisuudet eivät ole yleisesti saatavilla, mutta voidaan antaa pyynnöstä vastaavaan tekijän. Kaikki tiedot, joita tarvitaan toistamaan tutkimuksen ovat läsnä paperin.

Rahoitus: Kirjoittajat ole rahoitusta tai tukea raportti.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

mukaan Kiinan Syöpärekisterissä vuosikertomuksen (2012), paksusuolen /peräsuolen syöpä on tullut toiseksi yleisin syöpä ja toiseksi ja neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuus naisilla ja miehet, vastaavasti, Kiinassa [1]. Itse asiassa, paksusuolen syöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti, noin 9% syöpään liittyvien kuolemien [2], lähinnä metastasointiin [3]. Tämä edellyttää tunnistaminen kehittynyt molekyylimarkkereita diagnosointiin mikä auttaisi varhainen diagnosointi ja ehkäisy metastasointiin paksusuolen syöpä. Leikkaus on edelleen hoidossa valinta paksusuolensyöpä; mutta myöhässä, enemmän monialaista lähestymistapaa, jossa yhdistetään neoadjuvanttikemoterapian on tullut tunnusmerkki hoito [4]. Se ehkä ei voi korostaa tarpeeksi, vaikka tarve seurata kasvaimen hoitovaste, jotta valitaan parhaat ehdokkaat leikkausta varmistaa positiivisia tuloksia, ja siellä sijaitsee tarvetta ymmärtää taustalla patologinen mekanismi paksusuolensyöpä puhkeamista ja etenemistä. Kriittinen tapahtumia, jotka ohjaavat koko prosessi paksusuolensyöpä etäpesäkkeiden ovat yhä suurelta osin tuntemattomia.

Kasvava näyttö osoittaa, että MikroRNA (miRNA), eräänlainen endogeenisen, pienet ei-koodaavaa RNA: ita, osallistua erilaisiin solun prosesseissa. Kautta erityisesti sitovat ja pilkkomalla mRNA: iden tai estämällä niiden käännös [5], miRNA toimivat joko onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla [6].

miRNA-302 perhe oli ensimmäinen tunnistettu ihmisen alkion kantasoluja (hESCs) ja ihmisen alkion karsinoomasolut vuonna 2004. Sittemmin useat tutkimukset miRNA-302 perhe on keskitytty sen mahdollisen roolin uudelleen ohjelmointi somaattisten solujen aiheuttama pluripotenttien kantasolujen, sekä alkion itseuudistumisen [7]. Useat transkriptiotekijät, joita ilmentyy varhaisen syövän kantasolujen kehittäminen ja ylläpito, kuten

Oct4

,

Sox2

, ja

Nanog

, havaittiin olennaista transkription säätelyyn mirna-302 perhe [8]. Mielenkiintoista on, Fareh et ai. osoittivat, että stabiili ilmentyminen miRNA-302 kykeni indusoimaan menetys

Oct4

,

Sox2

, ja

Nanog

[9]. Rooli miRNA-302 kasvainten synnyssä on keskusteltu viime aikoina, koska ristiriitaisia ​​päätelmiä on tehty eri tutkimusryhmää. Esimerkiksi endogeenisen miRNA-302 ei havaittu kohdunkaulan syöpäsoluja, ja ektooppinen ilmentyminen miRNA-302 esti solujen lisääntymistä ja kasvaimen muodostumisen [10]. Sen sijaan, transfektio miRNA-302b paksusuolen syöpäsoluissa johti lisääntymiseen stemness on CD133 + HT 29-solujen

in vitro

[11]. Tähän mennessä ei ole tehty tutkimuksia tutkia mahdollisen roolin miRNA-302 paksusuolen syöpäpotilaiden tai /ja paksusuolen syövän synnyssä ksenograftimalleissa, mikä oli tärkein tavoite nykyisen tutkimuksen.

materiaalit ja menetelmät

Potilasnäytteet

Colon syöpä kudosta ja hyvänlaatuisia paksusuolikudos saatiin kudospankille General Hospital kansan vapautusarmeijan. Kliinis näistä potilaista haettiin Syöpätautien tietokantaan. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Institutional Research Review Board at General Hospital Kansan vapautusarmeijan ja allekirjoitettu tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta TET. Kaikki menettelyt tehtiin noudattaen Helsingin julistuksen ja toiminnan mukaisia ​​Kiinassa.

Soluviljely

Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa, HCT8 ja HCT116, ja ihmisalkion munuais- 293T-solut ( HEK293T-) ostettiin Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kiina). HCT8, HCT116, ja HEK293T-soluja kasvatettiin DMEM-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

RNA miRNA uuttamalla, ja kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Kokonais-RNA eristettiin viljellyistä soluista ja kasvaimen kudoksiin käyttämällä Trizol reagenssia. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen RevertAid First Strand cDNA-synteesi Kit (Life Technology, Carlsbad, CA), joka käytettiin sitten reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR), sekä eteen- ja taaksepäin-alukkeita ja virran SYBR Green PCR Master sekoita. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina

AKT

transkriptipitoisuuksissa. Alukesekvenssit olivat seuraavat:

AKT

-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, käänteinen: GTCCATGGTGTTCCTACCCA; β-aktiini-eteenpäin: ACCGAGCGCGGCTACAG, käänteinen: CTTAATGTCACGCACGATTTCC. Mukaan valmistajan ohjeiden miRNA päässä kudokset ja solut eristettiin käyttäen Mirvana miRNA eristyspakkausta (Life Technology, Carlsbad, CA), ja ekspressiotasot miRNA-302a havaittiin TaqMan miRNA määritykset (Life tekniikkaa, Carlsbad, CA) käyttäen U6 pieni ydin- RNA sisäisenä kontrollina.

vector rakentaminen, lentivirus tuotanto, ja vakaa transfektio

kypsän HSA-miRNA-302a-sekvenssi syntetisoitiin ja tuotu PLKO.3G vektori tuottamaan PLKO.3G-miR-302a. Lusiferaasi-3′-alue (UTR) toimittaja vektori aikaansaatiin subkloonaamalla

AKT

3′-UTR, joka kuljettaa oletetun miRNA-302a sitoutumiskohdan vektoriin MT01. Kaikki rakennettu vektorit varmennettiin sekvensoimalla. PLKO.3G-miR-302a sekoitetaan psPAX2 ja PMD2-G transfektoitiin HEK293T-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000-reagenssia (Life Technologies, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, lentivirus kerättiin ja käytettiin infektoimaan HCT8 ja HCT116-soluissa. Seuraavaksi solut lajitellaan virtaussytometrialla (Beckman Coulter, Brea, CA) vakaan solulinjoja ilmentävät konstitutiivisesti miRNA-302a (HCT8-302a ja HCT116-302a solut).

Lusiferaasimäärityksiä

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin käyttäen 50 ui passiivisen lyysipuskuria. Seuraavaksi dual-lusiferaasin määritys suoritettiin ohjeiden valmistajan (Promega, Madison, WI). Suhde tulikärpäsen ja Renillan lusiferaasiaktiivisuudeksi käytetään ilmaisemaan lusiferaasiaktiivisuudet. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (sd).

Protein satoa ja western blot

Yhteensä proteiinit kerättiin käyttäen CelLytic Extraction Kit (Roche, Basel, Sveitsi), joka sisälsi proteaasi-inhibiittorit ja sitten mittaamaan BCA Protein Assay Reagent kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) mukaan valmistajan ohjeiden. Erottamisen jälkeen proteiinit käyttäen natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi, proteiini siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvot ja sitten estettiin 5% rasvatonta maitoa. Käyttäen ensisijaisena vasta-aineet ja anti-kani on liitetty piparjuuriperoksidaasiin (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), kuten toisen vasta-aineen, kohde-proteiinit seulottiin ja sitten visualisoidaan käyttäen ECL Plus Western Blotting System (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA). Kalvoista poistettiin ja tutkittiin α-β-aktiini-vasta-ainetta vahvistaa vastaava kuormitus. Primaaristen vasta-aineiden sisältyivät seuraavat: AKT (1:1000), GSK3p (1:500), sykliini D1 (1:1000), PI3K (1:1000), PTEN (1:500) (Cell Signaling Technology, Boston, MA ) ja β-aktiini (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX).

Solulisääntyminen ja solusyklin määritykset

CCK-8 ja edu analyysit suoritettiin havaita solujen lisääntymistä . Lyhyesti, CCK-8 määritykset suoritettiin seuraavasti: solut ympättiin 96-kuoppalevylle konsentraatiossa 1 x 10

4 solua /kuoppa. Kiinnittymisen jälkeen, soluja viljeltiin tuoreeseen elatusaineeseen sekoitetaan CCK-8 (10:01) (Dojindo, Shanghai, Kiina) 2 tunnin ajan, ennen kuin absorbanssi mitattiin mikrolevylukijalla aallonpituudella 450 nm. Oppilaitoksille määrityksiä, soluja inkuboitiin edu liuokseen (1:5000) 2 tuntia, sitten kerättiin ja värjättiin käyttäen Cell-Light edu Apollo 643 In vitro virtaussytometria Kit (Ribobio, Guangzhou, Kiina), mukaan valmistajan ohjeiden . Sitten solut analysoitiin virtaussytometrialla.

solusyklin analyysi suoritettiin myös käyttäen virtaussytometriaa: lyhyesti, solut kiinnitettiin 75% kylmällä etanolilla yön yli, ja sitten se pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Seuraavaksi propidiumjodidilla (50 ug /ml) lisättiin soluihin DNA-värjäystä ennen virtaussytometria-analyysi.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

yksittäisiä soluja ympättiin 60 mm: n maljoille konsentraationa 500 solua /kuoppa ja inkuboitiin sitten 5% CO

2 37 ° C: ssa. Kaksikymmentä päivää myöhemmin solut värjättiin 0,5% kristallivioletilla 30 minuutin ajan. Colony numerot kunkin levyn laskettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia.

In vivo

tuumorigeenisyyden

PLKO.3G-Scr-transfektoiduissa HCT8 soluja (HCT-8-Scr-soluja ) ja HCT116-302a solua injektoitiin ihonalaisesti joko taka kylkeen saman 4-6 viikkoa vanhoja nude mouse. Kasvaimen tilavuus laskettiin ja kasvaimen paino mitattiin eläinten lopettamisen jälkeen vuorokautena 40. Kasvaimet sitten jaettu kahteen osaan, kukin osa kiinnitettiin 10% formaliinilla tai säilytetään -80 ° C. Eläin kokeet suoritettiin hyväksynnän Animal Studies eettisen komitean General Hospital Kansan vapautusarmeijan.

immunohistokemia

immunohistokemia (IHC) värjäys parafinoidut yksilöitä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, kanin anti-AKT vasta-aine ja anti-hiiri /kani piparjuuriperoksidaasileimattua vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology Co., Ltd, Shanghai, Kiina) käytettiin ensisijaisena ja toinen vasta-aine, vastaavasti.

Statistical analysoi

ero jatkuvia muuttujia analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä tai varianssianalyysillä. Kaksipuolinen P-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS versio 20,0 (IBM Corporation, NY).

Tulokset

miRNA-302a ilmentyminen vaimennetaan paksusuolensyöpä kudoksissa

Colon syöpä kudoksia hankittiin yhteensä 44 mies potilasta, joiden keski-ikä oli 67 vuotta (vaihteluväli, 49-77 vuotta), joilla oli äskettäin diagnosoitu, patologisesti vahvisti paksusuolensyöpä. Kaikki potilaat olivat saaneet kirurgista resektiota. Patologisesti vahvisti normaali paksusuoli kudokset hankittiin 10 miehen virtsarakon syöpä, joka oli saanut radikaalin cystectomy.

Olemme havainneet miRNA-302a ilmentymistason 44 paksusuolen kudoksiin ja 10 normaalia paksusuolen kudoksiin ja totesi, että verrattuna normaaliin paksusuolen kudokset, paksusuolen syöpä kudoksiin ilmaistuna alhaisempi miRNA-302a (Fig. 1A). Lisäksi olemme analysoineet suhdetta miRNA-302a tasoilla ja kliinis-paksusuolen syövän potilaille. Ei ollut merkittävää yhteyttä havaittu miRNA-302a tasoilla ja iän tai kliinisessä vaiheessa (tuloksia ei ole esitetty).

(A) miRNA-302a ilmentyminen säädeltiin vähentävästi paksusuolen syövän kudoksen verrattuna normaaliin paksusuolen kudosta. (B) Alhainen miRNA-302a ilmentymistä havaittiin neljässä ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, HCT8, HCT116, HT29, ja Caco2. (C) Korkeat miRNA-302a ilmentymistä havaittiin HCT8 ja HCT116 paksusuolen syöpäsoluja, jotka ilmentävät pysyvästi miRNA-302a (* P 0,05).

yli-ilmentyminen miRNA-302a estää paksusuolen syövän solujen kasvua in vitro ja in vivo

tutkimiseksi funktio miRNA-302a paksusuolen syöpä, mittasimme ilmaus miRNA-302a neljässä ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa (HCT8, HCT116, HT29, ja Caco2) kvantitatiivisella real-time PCR. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, oli alhainen ilmentyminen miRNA-302a kaikissa neljässä solulinjoissa. Koska me arveltu, että yli-ilmentyminen miRNA-302a voi estää paksusuolen syövän solujen kasvua, olemme vakaasti yli-ilmentynyt miRNA-302a in HCT8 ja HCT116-solut (kutsutaan kuin HCT8-302a ja HCT116-302a solut), joka vahvistettiin määrällinen käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioanalyysillä (qRT ) -PCR (Fig. 1 C).

CCK-8, edu, ja pesäkkeitä muodostavien määritykset suorittaa tutkia miRNA-302a yli-ilmentymisen vaikutti paksusuolensyöpä soluproliferaatiota

in vitro

. Kuten on esitetty kuviossa. 2, oli merkitsevästi pienempi (P 0,05) kasvu HCT8-302a ja HCT116-302a solujen kontrolleihin verrattuna. Virtaussytometrinen analyysit osoittivat, että prosenttiosuudet Edu-positiivisten solujen sekä HCT8-302a ja HCT116-302a solut olivat pienempiä kuin kontrolleissa. Lisäksi kontrolleihin verrattuna, sekä HCT8-302a ja HCT116-302a solujen kehitetty vähemmän pesäkkeitä 20. ja 15. päivinä, vastaavasti. Näin ollen,

in vitro

kokeet osoittivat, että miRNA-302a kohdistuvaa estävää rooli paksusuolen syövän solujen proliferaatiota.

CCK-8-määritys suoritettiin mittaamiseksi lisääntymistä (A) HCT8 ja (B) HCT116-solut. Tulokset edustavat keskiarvoa ± keskihajonta optinen tiheys (OD) arvo havaittiin 450 nm: ssä kolmesta itsenäisestä kokeesta. Soluproliferaatiota havaittiin (C) HCT8 ja (D) HCT116-soluissa käyttäen edu määritystä analysoitiin virtaussytometrialla. (E, F) Pesäkkeenmuodostusta tutkimukset osoittivat vähemmän siirtomaat miRNA-302a yliekspressoivia HCT8 soluja. (* P 0,05).

edelleen vahvistaa havaintomme

in vivo

, HCT8-Scr solut ja HCT8-302a solut ruiskutetaan vasempaan ja oikeaan taka kyljen nude hiirillä, vastaavasti. Tuumoritilavuudet mitattiin mittaharpilla eri ajankohtina siirrostuksen jälkeen, ja kasvaimen painot mitattiin lopettamisen jälkeen. Sekä tilavuus ja massa olivat huomattavasti alhaisemmat HCT8-302a kasvaimia kuin HCT8-Scr kasvaimet (P 0,05, Fig. 3). Yhdessä ilmeinen solujen lisääntymisen inhibitio havaittiin sen jälkeen, kun yli-ilmentymisen miRNA-302a paksusuolen syöpäsoluissa.

HCT8-GFP-soluissa ja HCT8-302a solut injektoitiin vasemman ja oikean taka karvattomien hiirten kyljen, vastaavasti ( A, B). Kasvaimen tilavuus (C) ja massa (D) HCT8-302a ryhmässä olivat huomattavasti alhaisemmat kuin HCT8-GFP ryhmä. (* P 0,05).

yli-ilmentyminen miRNA-302a indusoi solukierron pysähtymisen koolonkarsinoomasoluissa

Nyt kasvun estämistä havaittiin koolonkarsinoomasoluissa teimme solusyklin analyysi tutkimaan, yli-ilmentymisen miRNA-302a johti solusyklin muutoksiin. Kuten on esitetty kuviossa. 4, osuus soluja G1-vaiheessa on lisääntynyt merkittävästi HCT8-302a soluissa, kun taas osuus solujen S-vaiheeseen oli huomattavasti pienempi kuin vertailuryhmässä. Vastaavia tuloksia havaittiin HCT16-302a soluissa, mikä viittaa siihen, että miRNA-302a tehokkaasti indusoivat G1 /s solusyklin pysähtymisen koolonkarsinoomasoluissa.

osuus soluja G1-vaiheessa lisääntynyt huomattavasti HCT8-302a soluissa ( A, C) ja HCT116-302a solujen (B, D), verrattuna kontrolleihin, kun taas osuus solujen S-vaiheessa oli huomattavasti pienempi kuin kontrollit. (* P 0,05).

miRNA-302a estää AKT ilmentyminen suoraan kohdentamalla sen 3’UTR

havaitsemiseksi molekyylitason mekanismeja, joilla miRNA-302a kykenee sen posttranskriptionaalisella sääntelytehtävät käytimme bioinformatiikan algoritmeja (https://www.targetscan.org) hankkia mahdollisia kohdegeenien, ja totesi, että 3’UTR

AKT

mRNA satamat konservoituneen sitoutumiskohta miRNA-302a. Seuraavaksi tutkimme ilmaus AKT mRNA ja proteiini tasolla HCT8-302a ja HCT116-302a soluja ja valvontaa. Kuten on esitetty kuviossa. 5A ja 6, verrattuna kontrolleihin, AKT ilmaisuja laski merkittävästi HCT8-302a ja HCT116-302a soluja, sekä mRNA ja proteiini tasolla. Lisäksi AKT ilmentyminen HCT8-302a kasvaimissa oli merkittävästi alhaisempi kuin HCT8-Scr kasvaimet, määritettynä reaaliaikainen PCR ja IHC värjäytymistä (kuvio. 5B, C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että AKT ilmentyminen säädeltiin vähentävästi mukaan miRNA-302a paksusuolen syöpä.

AKT

-mRNA huomattavan tukahdutettiin (A) HCT8-302a ja HCT116-302a soluja, ja (B ) HCT8-302a kasvaimia. (C) immunohistokemia värjäys osoitti pienempi ilmentyminen AKT in HCT8-302a kasvaimia. (D) Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus erityisesti vaimentaa villityypin AKT-3′-alue (UTR) transfektoitujen solujen. (E) Kaavamainen esitys lusiferaasireportteri, joka kuljetti villityypin tai mutantti

AKT

-3 ’UTR. (* P 0,05).

Western blot-analyysit osoittivat vaimentua AKT ja sykliini D1 tasolla, ja upregulated GSK3p tasoilla miRNA-302a yliekspressoivassa HCT8 soluja. PTEN ja PI3K tasoja ei vaikuttanut.

Voit testata, onko miRNA-302a säätelee

AKT

suoraan sitoutumalla sen 3’UTR, lusiferaasireport- vektori, joka sisältää ihmisen

AKT

3’UTR kantoi villityypin miRNA-302a sitova sekvenssi sub kloonattu. Lusiferaasia kantava vektori mutantti 7-bp alueella, jotka ovat komplementaarisia 5 ’siemenen alueen miRNA-302a synnytettiin ohjaus toimittaja (Fig. 5E). Kontrolliin verrattuna, suhteellisen lusiferaasiaktiivisuus tukahdutettiin 36% (P 0,05) villityypin

AKT

3’UTR transfektoiduissa soluissa (kuvio. 5D). Siksi miRNA-302a estää paksusuolen syöpäsoluissa kautta suoraan kohdistaminen

AKT

.

miRNA-302a indusoiman solusyklin muutoksia koolonkarsinoomasoluissa estämällä AKT-GSK3p-sykliini D1 reitin

edelleen vaikutuksen arvioimiseksi miRNA-302a on AKT signalointireitin, havaitsimme ilmaus ylävirtaan (PI3K ja PTEN) ja loppupään (GSK3p ja sykliini D1) AKT effektorit western blot. Verrattuna vastaavaan kontrolliin solut, GSK3p tasot olivat huomattavasti koholla, kun taas sykliini D1 huomattavasti vähennetty miRNA-302a transfektoitujen HCT8 andHCT116 soluja. Kuitenkin ilmaus kaksi suurta ylävirtaan efektoreita AKT, PI3K ja PTEN, ei vaikuttanut miRNA-302a transfektiolla (Fig. 6). Koska kriittinen rooli AKT-GSK3p-sykliini D1 signalointireitin solusyklin siirtymävaiheessa, tulokset viittaavat siihen, että miRNA-302a saattaa aiheuttaa G1 /S solusyklin pysähtymisen koolonkarsinoomasoluissa estämällä AKT-GSK3p-sykliini D1-reitin, mikä tukahduttaa paksusuolensyöpä solujen lisääntymisen.

keskustelu

tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miRNA-302a säädeltiin vähentävästi paksusuolen syövän kudoksissa. Yli-ilmentymisen miRNA-302a aiheuttamaa G1 /S pidätys koolonkarsinoomasoluissa, ja hämmästyttävän tukahdutti paksusuolensyöpä soluproliferaatiota

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi

AKT

paljastui välittömänä ja toiminnallinen kohdegeeni miRNA-302a.

Kuluneen vuosikymmenen aikana, suurin osa tutkimusta, jossa miRNA-302 on keskittynyt rooliaan hESCs, jotka ovat ominaista itseuudistumisen ja pluripotentti-. Tutkimukset analysoidaan miRNA-302 toiminto karsinogeneesissä ovat rajalliset ja epäjohdonmukaisia. Lin et ai. havaitsi, että miRNA-302 voi estää tuumorigeenisyyteen ja indusoi apoptoosin ihmisen rintasyövän MCF7-solut, alkion teratokarsinooma Tera-2-soluissa, ja maksasyövän HepG2-soluissa [13]. Vastaavasti solujen lisääntyminen estyi kohdunkaulan syövän Hela ja SiHa-soluja, samoin kuin maksasyövän SMMC-7721-solujen, kautta solusyklin säätelyssä [10], [14]. Kuitenkin, Zhu et ai. havaittiin käänteinen ilmiö koolonkarsinoomasoluissa, jossa yliekspressio miRNA-302B johti tehostetun pesäkkeitä muodostavien kyky

in vitro

[11]. Täydennetty pesäkkeenmuodostus kyky niinikään validoitu syövän kantasoluja pään ja kaulan okasolusyöpä [15]. Ensimmäistä kertaa, me paljastaa tukahdutettu miRNA-302a ilmentymisen paksusuolensyöpä kudoksissa verrattuna normaaliin paksusuolen kudoksiin. Siksi me spekuloida, että miRNA-302a voisi olla tärkeä rooli paksusuolen syövän kehittymistä ja etenemistä.

Tutkimuksessamme estävä vaikutus miRNA-302a soluproliferaatioon havaittiin paksusuolensyöpä HCT8 ja HCT116-solut, kautta estää G1-S faasimuutos, jota pidetään keskeisenä tapahtuman aikana solujen lisääntymistä. Yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, [8], [10], [14], löysimme myös huomattava downregulation sykliini D1 miRNA-302a yliekspressoivia koolonsyöpäsoluihin. Mielenkiintoista, miRNA-302 ennustetaan kohdistaa paljon solusyklin sääntelyviranomaiset. Esimerkiksi Lin et ai. osoittivat, että miRNA-302 samanaikaisesti vaimentaa sekä sykliini E-CDK2: n ja sykliini-D-CDK4 /6 signalointireittien [13], ja tämä tavoite esto on säätelevät useat transkriptiotekijöitä, kuten Oct4 ja Sox28. Kuitenkin Card et al. kertoi, että miRNA-302a edistänyt kasvua S-vaiheessa ja lasku G1 vaiheeseen hESCs, vaikka sykliini D1 myös tukahdutettiin [8]. On selvää, lisätutkimuksia selvittämiseen tarkka mekanismeja miRNA-302 toiminto on perusteltua.

havaintojen yliekspressio miRNA-302a in koolonkarsinoomasoluissa indusoi solujen kasvun estäminen

in vitro

ja

in vivo

viittaavat siihen, että miRNA-302a voi lähettää transkription säätelemiseksi keskeinen geeni, joka on osallisena solujen lisääntymisen. Tärkeänä onkogeeni,

AKT

vaikuttaa monenlaisia ​​fysiologisia toimintoja, kuten aineenvaihdunta, lisääntymistä, eloonjääntiä, angiogeneesiä, muuttoliike, ja hyökkäys [16]. Tuloksemme osoittavat, että miRNA-302a tukahdutetaan leviämisen ja tuumorigeenisyystesti paksusuolen syövän solujen kautta AKT-GSK3p-sykliini D1 reitin, ja suoraan sitomalla 3’UTR

AKT

. Lisäksi ilmaus PI3K ja PTEN, jotka ovat pääasiallinen ylävirtaan efektoreita AKT ja ovat myös osoittautuneet tärkeitä paksusuolensyöpä kehittämiseen, ei vaikuttanut miRNA-302. Sääntelevä rooli miRNA-302 AKT osoitettiin myös Cai et al: jälkeen miRNA-302S transfektiolla kohdunkaulan syöpäsoluja, ne havaittiin kohonnut ilmentyminen sykliiniriippuvaisen estäjät p27Kip1 ja p21Cip1 yhdessä vaimentua AKT tasoilla [10]. Siksi tavoitteeksi asetettiin miRNA-302,

AKT

oli erityisesti tukahdutettiin ja herätti muutoksia monissa loppupään signalointi polkuja.

Meidän tulokset antavat myös tiettyjä vihjeitä suhteen miRNA kohdistetun syövän hoitoon. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että tiettyjä miRNA usein yli-ilmentynyt kasvaimia, kun taas useimmat miRNA olivat.

vaimentua [17], [18]. Global miRNA tukahduttaminen havaittiin lisätä syövän syntymistä sekä

in vitro

ja

in vivo

malleissa [19], korostaen pro tuumorigeenisen vaikutukset seuraavat miRNA menettämisestä toiminnon. Liang et ai. havaittu herkistävää roolin miRNA-302 korvaushoito rintasyöpäsoluissa ionisoivaa säteilyä [20]. Toinen tuore tutkimus kertoo, että viraalisia let-7 miRNA voisi estää kasvaimen kasvua hiiren keuhkoadenokarsinooma malli [21]. Samoin, tuloksemme validoitu inhiboiva vaikutus miRNA-302a korvaaminen paksusuolen syöpäsoluissa. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että yli-ilmentyminen jopa yksittäinen miRNA syöpäsoluissa voisi antaa huomattavaa terapeuttista hyötyä.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoittaa, että miRNA-302a on keskeinen paksusuolen syöpäsolujen kasvua säätelemällä G1-S faasimuutos. MiRNA-302a ilmentyminen vaimennetaan paksusuolensyöpä kudoksissa. Lisäksi suoraan sitova sen 3’UTR miRNA-302a inhiboi

AKT

ilmaisua, jolloin myöhemmin muutoksia AKT-GSK3p-sykliini D1 reittejä. Vaikka on selvää, että miRNA-302a osallistuu paksusuolensyöpä, lisätutkimuksia tarvitaan selittämään tarkkaa mekanismeista sen rooli paksusuolen syövän etenemiseen, ja siten määrittää sen potentiaalista arvoa biomarkkerina ja /tai terapeuttisena kohteena.