Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nuclear reseptori co-repressori (N-AK ) näyttelee tärkeä rooli transkriptionaalisen säätelyn välittämien useita kasvaimia estävä proteiineja. Viime aikoina olemme raportoitu rooli väärin laskostuneen-konformaatiosta riippuvaisia ​​tappio (MCDL) N-AK aktivoitumista onkogeenisten selviytymisreittiin akuutissa promyelosyyttinen leukemia (APL). Koska N-AK näyttelee tärkeä rooli solun homeostaasin erilaisissa kudoksissa, siksi meidän hypoteesi, että APL kuten MCDL N-AK saattaa myös olla mukana muissa maligniteetti. Todellakin, meidän alustava seulonta N-AK asema eri leukemian ja kiinteiden kasvainten soluja paljasti APL kuten MCDL N-AK ensisijaisen ja toissijaisen kasvainsolut ovat peräisin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). NSCLC soluspesifinen N-AK menetys voitaisiin estää Kaletraa, kliininen arvosana proteaasinestäjä ja genistein, estäjä N-AK väärinlaskostumista aiemmin ominaista meille. Väärin laskostuneet N-AK esitetty NSCLC soluissa liittyy vahvistus ER stressiä ja alistettiin hajoamiselle NSCLC-soluille spesifisten poikkeava proteaasiaktiivisuutta. NSCLC-solut, väärin laskostuneet N-AK havaittiin liittyvän Hsc70, molekyyli chaperone mukana kaperoni- välittämää autophagy (CMA). Geneettinen ja kemiallinen estäminen Lamp2A, nopeutta rajoittava tekijä CMA, merkittävästi esti menetys N-AK NSCLC soluissa, mikä viittaa ratkaisevaa asemaa CMA N-AK hajoamista. Nämä havainnot tunnistaa tärkeä rooli CMA aiheuttama hajoaminen väärin laskostuneen N-AK: n neutralointi ER stressiä ja ehdottavat mahdollista roolia väärin laskostuneen N-AK-proteiinin aktivoitumisen onkogeenisten selviytymisen väylän NSCLC soluissa.

Citation: Ali AB, Nin DS, Tam J, Khan M (2011) rooli Chaperone välitteisen Autophagy (CMA) on hajoaminen väärin laskostuneen N-AK proteiinin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin. PLoS ONE 6 (9): e25268. doi: 10,1371 /journal.pone.0025268

Editor: Michael Sherman, Boston University Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 25, 2011; Hyväksytty: 30 elokuu 2011; Julkaistu 23 syyskuuta 2011

Copyright: © 2011 Ali et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia SSCC-04-06 ja NMRC /1213/2009 MK Singaporesta Stem Cell Consortium ja National Medical Research Council of Singapore. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

transkriptiotekijöitä ja sukulais-co-tekijät ovat merkittäviä säätelijöitä kehityksen epiteelisolujen ja ovat yksi yleisimmistä tavoitteet onkogeenisten loukkaus ihmisen eri maligniteettien, mukaan lukien keuhkosyöpä [1] – [4]. Transkriptionaalisen säätelyn opetetaan tumareseptorin co-repressori (N-AK) näyttelee tärkeä rooli kasvun tukahduttava toiminta useiden tuumorisuppressorin proteiineja [5], [6]. Vapautuminen N-AK välittämä transkription ohjaus johtuu väärin laskostuneet konformaatiosta riippuva tappio (MCDL) N-AK on patogeneesiin akuutin promyelosyyttisen leukemian (APL) [7], [8]. Mielenkiintoista, jotkut transkriptiotekijöiden ja keratekijöitä alun perin tunnistettiin normaalien hematopoieesin todettiin myös olevan osallisena säätelyssä normaalin kasvun ja kehityksen keuhkojen epiteelisolujen [2] – [4]. Nämä havainnot ehdotti, että huomattava päällekkäisyys saattaa myös esiintyä taustalla oleva mekanismi hematologisten pahanlaatuisten kasvainten ja keuhkosyöpään. Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvän kuolleisuuden ja sairastavuuden ihmisen maailmassa. Kanssa 5 vuoden pysyvyys on vain 15%, sitä pidetään yhtenä kaikkein kohtalokas syövät ihmisen. Perustuen hetkellä tiedossa histo-patologinen kriteerit, keuhkosyöpä on karkeasti kahteen suurta alatyyppiä: ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [9], [10] ja pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) [11]. NSCLC, joka koostuu 80% kaikista keuhkosyövässä ihmisen, jaetaan edelleen adenokarsinoomat, okasolukarsinoomia, adenosquamous karsinoomat, ja iso-solukarsinoomat [12]. Huolimatta siitä, että johtava syy ihmisen kuolleisuuden ja liikkuvuuden, tiedetään hyvin vähän siitä, taustalla oleva mekanismi pahanlaatuisen kasvun ja transformaatio soluja, jotka muodostavat suurimman osan kasvaimen massan keuhkosyöpä. Tämä johtuu osittain puutteesta selkeä käsitys onkogeenisel- selviytymismekanismi joka ylläpitää kasvua pahanlaatuisia soluja ravinteiden köyhdytetyn ja stressaavaa mikroympäristölle näyttävästi esillä sisällä kiinteän massan Keuhkosyöpä kudosta.

Nuclear reseptori co-repressori (N-AK) on olennainen osa monen proteiini Repressorikompleksin olennainen toiminto monien transkriptiotekijöiden ja tuumorisuppressoriproteiinia proteiinit [13] – [16]. Koska transkription valvonta opetetaan tekijät, kuten N-CoR ajatellaan olevan osallisena säätelyssä normaalin kasvun ja kehityksen solujen eri kudosten alatyyppeihin, siksi meidän hypoteesi, että APL kuten MCDL N-AK saattaa myös liittyä onkogeenisel- kasvu muilla ihmisen kasvaimissa. Tämän hypoteesin testaamiseksi, analysoimme N-AK asema kasvainsoluissa peräisin suurten ihmisen leukemian ja kiinteiden kasvainten ja havaittiin valikoivaa väärin laskostuneet konformaatiosta riippuvaisia ​​menetys N-AK useissa kasvainsolulinjoissa ja ensisijainen ihmisen syövän kudoksissa peräisin NSCLC. NSCLC-solut, väärin laskostuneet N-AK havaittiin liittyvän Hsc70, molekyyli chaperone mukana kaperoni- välittämää autophagy (CMA). Geneettinen ja kemiallinen esto CMA johti N-AK vakauttamista NSCLC soluissa, mikä viittaa ratkaisevaa asemaa CMA N-AK menetys. Nämä havainnot kuvaavat mahdollisesta roolista autophagic hajoamisen väärin laskostuneen N-AK: n neutralointi ER stressiä sekä selviytymisen ja kasvun NSCLC-solujen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

Kaikki keuhkosyövän solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa, hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä ylläpidettiin alustassa suosittelemat ATCC. Genistein, klorokiini ja nikotiini hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA) ja Kaletraa oli Abbott Laboratories (IL, USA). N-AK (C-20), PDI ja HSC-70-vasta-aineita ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineet Lamppu-2A (Abcam Inc, MA, USA) ja β-aktiini (Sigma, St Louis, MO, USA) ostettiin vastaavista lähteistä. Rekombinantti lippu-merkitty N-AK valmistettiin 293T [17], jotka oli transfektoitu N- AK ekspressioplasmidin (liittyy kaksi tandem lippu sekvenssi) käyttämällä Fugene 6 (Roche, Basel, Sveitsi). N-CoR ja ohjaus siRNA duplex kuvattu aiemmin [18], [19] syntetisoitiin pienin muutoksin N-AK-sekvenssin (Qiagen GmbH Hilden, Saksa), ja transfektoitiin käyttämällä Oligofectamine reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ).

ensisijainen ihmisen keuhkojen kasvainnäytteestä ja kudosmatriisien

Ten histologisesti vahvistettu ensisijainen ihmisen NSCLC näytteet saatiin kudoksesta varasto National University Hospital-National University of Singapore (NUH-NUS) kanssa hyväksynnän National University of Singapore-Institutional Review Board (NUS-IRB). Nämä näytteet olivat snap-jäädytetty 40 minuutissa (keskimäärin) kirurgisen resektion ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Ihmisen keuhkosyöpä kudosta array BC04012 ostettiin Biomax (US Biomax- Inc, Maryland, USA) ja värjättiin N-AK (C-20) vasta-aine käyttäen ABC-värjäystä järjestelmää (Santa Cruz, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Semikvantitatiivisilla ja reaaliaikainen PCR

Yhteensä-RNA eristettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH Hilden, Saksa). Kustakin näytteestä, 2 ug RNA: ta muutettiin cDNA: ksi oligo (dT)

18-pohjustettu käänteistranskriptio käyttäen SuperScript II RT Ensimmäisen Strand (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), kuten valmistaja on kuvannut. CDNA sovellettiin semikvantitatiivinen PCR-analyysi käyttäen Accuprime Taq -polymeraasijärjestelmää (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan suositusten mukaisesti. Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen TaqMan® Gene Expression Assay System (Applied Biosystems, CA, USA) ja C

t-arvot rekisteröitiin käyttäen ABI Prism 7300 Real Time PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, CA, USA) .

Analyysi tosiaikaisen PCR data

data analysoitiin käyttäen vertailevaa C

t menetelmä, jossa solulinja SAEC käytettiin näytteen ja HPRT-geenin käytettiin endogeenisen geenin valvontaa. Data edusti pylväskaavio piirretään log mittakaavassa pohjan 10. N-AK-ilmentymisen määrä erilaisissa solulinjoissa laskettiin suhteessa N-AK tasolla SAEC [20] soluja, jotka oli asetettu 0. Data edusti on saatu keskiarvo 3 itsenäisestä kokeesta.

In-vitro N-CoR: n pilkkominen määrityksessä

soluraakauutteet sisältävät aktiivisia proteaasit saatiin inkuboimalla, keuhkosyövän solut tai cryo säilynyt ihmisen ensisijainen keuhkojen syöpä kudosten RSB-puskurissa [10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl

2, 0,1% NP-40] 4 ° C: ssa 10 min ja tumat poistettiin sentrifugoimalla. Supernatantit kerättiin ja proteiinisisältö määritettiin myöhemmin. N-AK alustaan ​​valmistettiin transfektoimalla 293T-solut, joissa Flag-merkityn N-AK-plasmidi. Optimoitu pilkkominen Määritys suoritettiin 300 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0), 37 ° C: ssa eri keston. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 50 ° C: ssa SDS-näytepuskurissa, ja proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle ja western-blottauksella.

immunosaostus

Kaksi lähestymistapaa suunniteltiin havaita fyysistä vuorovaikutusta N-CoR ja Hsc70. Eräässä lähestymistavassa, proteaasi köyhdytettyä HLPC fraktioi ja H2170-soluja inkuboitiin flag-merkityn N-CoR: n IP-puskurissa [40 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA: ta, 0,75 mM MgCl

2, 0,25% NP-40] 5 minuuttia samalla pyörittäen 4 ° C: ssa. Anti-flag-M2-affmiteettigeeliin helmiä (Sigma) lisättiin ja inkuboitiin edelleen 2 tuntia kierto 4 ° C: ssa. Toisessa lähestymistavassa ajoneuvon tai Kaletra käsiteltyjen H2170-soluja (5 uM 96 tuntia) sonikoitiin lyysauspuskurissa [150 mM NaCl, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM NaF, 1 mM Na

2VO

4, 20 mM β-glyserolifosfaattia, 1,5 mg /ml IAA, proteaasiestäjäseostabletit] 10 s. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla, ja seuraavaksi inkuboitiin Hsc70 tai kontrollivasta-aineiden 2,5 tuntia kierto 4 ° C: ssa. Proteiini G helmet lisättiin sitten ja sen jälkeen 1,5 tunnin kierto 4 ° C: ssa. Immunosaosteita erotettiin SDS-PAGE-geelillä ja N-CoR ja Hsc70 havaittiin Western blottauksella.

immunofluoresenssikokeessa värjäystä

Solut levitettiin lasilevyille käyttäen Sytospin sentrifugointia, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja permeabilisoitiin 0,2% Triton X-100 PBS: ssä 4 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut sen jälkeen värjättiin asiaan primaaristen vasta-aineiden ja sen jälkeen FITC- tai rodamiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA). DNA värjättiin DAPI (Invitrogen-Molecular Probes) ja fluoresenssisignaalit otettiin käyttäen konfokaalimikroskopialla.

Protein liukoisuutta määritys

N-AK liukoisuutta määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu, joissa joitakin muutoksia [8 ]. Lyhyesti, soluja sonikoitiin lyhyesti soluhajotuspuskurin [50 mM Tris (pH 8,0), 5 mM MgCl

2, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, ja proteaasi-inhibiittoriseosta] ja pidettiin jäissä 30 minuuttia. Liukoiset ja liukenemattomat fraktiot erotettiin sentrifugoimalla 15000 rpm: ssä 10 minuuttia 4 ° C: ssa. Liukenematon fraktio käsiteltiin DNaasi I: llä 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Liukoiset ja liukenemattomat fraktiot eroteltiin SDS-PAGE: lla ja värjättiin anti-N-CoR: n (C-20).

Lysosomaalinen oton määritystä

lysosomeihin eristettiin H2170-soluissa käyttäen lysosomissa Enrichment Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Lysosomaalisen oton määritystä käyttäen lippu-merkitty N-AK substraattina, suoritettiin oleellisesti kuten on kuvattu muualla [21].

Tulokset

Post-transkription menetys N-AK kasvainsoluissa peräisin NSCLC

analyysi N-AK asema eri keuhkosyövän soluja paljasti näennäinen tappio N-AK: proteiini tasolla useilla kasvainsolulinjoissa peräisin NSCLC, mutta ei DMS-79; solulinja on peräisin SCLC (Fig. 1A, tukeminen Information S1). Samanlainen N-CoR menetys on havaittu myös normaaleissa pienten hengitysteiden epiteelisolujen (SAEC) käsittelyn jälkeen nikotiini, syöpää aiheuttavaa ainetta laajalti sidoksissa Keuhkosyöpä (Fig. 1 B). N-AK menetys havaittu NSCLC soluissa oli todennäköisesti posttranskriptionaalisella tapahtuma koska taso N-AK transkripti, määritettynä reaaliaikaisia ​​PCR, ei merkittävästi säädeltiin verrattuna sen tasolle DMS-79 tai SAEC soluja (Fig. 1 C). Identtiset malli N-CoR tappio proteiinin taso havaittiin myös yhdeksän kymmenestä histologisesti vahvisti ihmisen ensisijainen NSCLC soluja, mikä viittaa siihen, että N-CoR tappiota ei ole yksinomainen tapahtuma rajoitu NSCLC solulinjoja (Fig. 1D, tukeminen Information S1) . N-CoR: n menetys havaittu H2170-soluissa, voitaisiin estää viemällä Kaletra, kliininen arvosana HIV-proteaasinestäjä ja dokumentoitu estäjä kasvun NSCLC-solujen (Fig. 1 E) [22]. N-AK menetys oli myös estänyt genistein (Fig. 1 F), estäjä N-AK väärinlaskostumista aiemmin ominaista meille [23]. Nämä havainnot ehdottivat, että menetys väärin laskostuneen N-AK voisi olla syy liittyy kasvua ja selviytymistä NSCLC-solujen.

A B, taso ja eheys täyspitkä N-AK-proteiinin eri keuhkosyövän soluista määritettiin western blotting määrityksessä. Taso β-aktiini määritettiin kokeellisen ohjaus. DMS-79 on johdettu SCLC, kun taas jäänteet solut ovat peräisin NSCLC. B, taso koko pituudeltaan N-CoR: n proteiinin SAEc käsiteltiin nikotiinia 48 tuntia annoksesta riippuvaisella tavalla määritettiin. C, taso N-CoR: n transkriptin solulinjoja käytettiin kuviossa 1 A B kvantifioitiin reaaliaikainen PCR. Identiteetti soluja käytetään kuviossa 1A C on esitetty tukeminen Information S1. D, taso täyspitkä N-AK-proteiinin kymmenessä histologisesti vahvisti ihmisen ensisijainen NSCLC-solut määritettiin western blottauksella määrityksessä N-AK-aine. Identiteetti ihmisnäytteillä esitetään tukeminen Information S1. E ja F, taso ehjä N-AK proteiinin H2170 käsitellyissä soluissa Kaletran (E) tai genistein (F) määritettiin määritettiin western blottauksella määrityksessä.

stabilointi N-AK by genisteiiniä ehdotti, että NSCLC-soluille spesifisten N-AK menetys oli todennäköisimmin laukaisi sen väärinlaskostumista kuten aiemmin havaittu APL. Vahvista, että konformaatio N-CoR proteiini stabiloidaan Kaletran tai genisteiini määritettiin. Natiivi konformaatio, N-AK rajoittuu tumaan ja pysyy liukoinen puskurissa, joka sisältää orgaanista pesuainetta; kun taas väärin laskostuneet konformaatiossa, N-CoR muuttuu liukenemattomaksi ja kulkeutua sen Endoplasmakalvosto [7], [8]. Käytimme näitä kriteereitä, onko N-CoR, joka alistettiin hajoamisen NSCLC soluissa väärin laskostuneet. Merkittävä osa N-CoR stabiloitu Kaletra havaittiin liukenematon osa H2170-solujen, viittaa siihen, että H2170-solut kanna väärin laskostuneet N-CoR: n proteiinin (kuvio. 2A). Toisaalta, N-AK stabiloi genisteiini- oli pitkälti pesuainetta liukoinen, mikä viittaa siihen, että genistein voisi pelastaa natiivin N-AK konformaation (Fig. 2B). Suuri osa N-AK normaaleissa pienten hengitysteiden epiteelisolujen (SAEC) havaittiin liukoisessa fraktiossa, kun taas SCLC peräisin olevat solut DSM-79, N-AK oli pitkälti liukenematon (Fig. 2C). Yhdenmukainen toteaminen liukoisuutta määrityksen, N-AK näkyy pääasiallisesti sytosolin jakelu useita NSCLC peräisin olevat solut (Fig. 2D, punainen signaali) ja histologisesti varmennettu ihmisen ensisijainen NSCLC kudosleikkeiden (Fig. 2E, paneelit 2-6). Sitä vastoin N-CoR: n on pääasiassa tumassa ihmisen normaalin keuhkokudoksen epiteelisoluissa (kuvio. 2E, paneeli 1) ja SAEc-soluissa (kuvio. 2F, vasen paneeli). Ydinvoima N-AK löytyy SAEC soluissa siirtämisellä ER jälkeen nikotiinikorvaushoitoon, mikä viittaa siihen, että nikotiini voi laukaista N-AK väärinlaskostumista (Fig. 2F, oikea paneeli). Yhdessä nämä havainto viittasi siihen, että N-CoR, joka alistettiin hajoamisen NSCLC soluissa oli todennäköisesti väärin laskostuneen proteiinin.

A, B C, liukoisuus (S) /liukenemattomuus (I) N-CoR tai β-aktiini in Kaletra (A) tai genistein (B) käsiteltiin H2170 soluja, sekä DMS-79 tai SAEC soluja (C), määritettiin proteiinin liukoisuutta määritys. D, Subsellulaariset jakelu N-AK (punainen merkkivalo) in NSCLC (H2170, H1299, H358, H596, H650, H1869 ja H1666) ja SCLC (DMS-79) soluista määritettiin immunofluoresenssikokeessa määritys suoritettiin N-CoR-aine. DNA (sininen signaali) värjättiin DAPI. E, Subsellulaariset jakelu N-AK histologisesti vahvisti ihmisen ensisijainen NSCLC kudosnäytteiden (paneeli 2-6) ja normaalin ihmisen keuhkokudoksen (luukku 1) määritettiin immunohistokemiallisella (IHC) määritys suoritettiin N-CoR-aine. Ruskehtava värjäytyminen sytosoliin yksilöityihin mustalla nuolella edustaa N-AK-signaalin (paneelit 2-6). N-AK värjäytyminen normaalissa keuhkokudoksessa osassa näkyy mustina pisteinä päällekkäin nucleus (paneeli 1). Toinen paneeli osoittaa poikkileikkaus, joka sisältää sekä syöpäkudoksessa (vasen puoli) ja normaalin keuhkokudoksessa (oikea puoli) vierekkäin. F, Subsellulaariset jakelu N-CoR ja PDI vuonna SAEC soluissa vehikkeliä tai nikotiinia 48 tuntia määritettiin konfokaalimikroskopialla.

NSCLC-soluille spesifisten N-AK menetys liittyy solulimakalvostoon (ER ) stressi

APL, N-AK tappio oli tulos solua suojaavien UPR jonka välittämä APL-soluille spesifisten poikkeava proteaasiaktiivisuutta että lopulta suojattu APL solujen ER stressin aiheuttama apoptoosin [7]. Sen tutkimiseksi, N-AK tappio NSCLC soluissa helpotettu myös samanlainen poikkeava proteaasiaktiivisuutta, optimoidun N-AK pilkkominen määritys suoritettiin. Tässä määrityksessä lippu-merkitty N-AK ektooppisesti ilmaistu 293T-soluissa inkuboitiin otteen H2170-solujen, joka on NSCLC solulinjaa, joka osoitti N-AK menetys, tai DMS-79-soluja, SCLC solulinjaa, joka ei havaittavissa N-AK menetys, ja taso N-CoR pilkottu tänä inkubointia määritettiin western blotting määrityksessä. Flag-merkitty N-CoR inkuboitiin uutteen H2170-solujen pilkottiin ajan riippuvaisella tavalla ja pilkottu N-CoR: n fragmentti 100 kDa syntyi (Fig. 3A, kaistat 6-8), kun taas N-CoR-Flag inkuboitiin jossa ote DMS-79-soluissa ei pilkottu (Fig. 3A, kaistat 2-4). Mielenkiintoista on, että N-CoR: n pilkkomisaktiivisuus esitetty H2170-soluissa oli täysin deaktivoitu keittämällä, mikä viittaa siihen, että aktiivisuus voi olla lämpöherkkä proteaasi (Fig. 3A, kaista 9). Kuten havaitaan NSCLC johdettujen H2170 soluja, tiivisteet kahden ihmisen ensisijainen NSCLC-solut, joissa ei täyspitkä N-CoR havaittiin, sisälsivät aktiivisuutta että täysin pilkottu lippu-merkitty N-AK-proteiinia (kuvio. 3B). Identtiset lämpölabiilista N-AK pilkkomisaktiivisuus löytyi myös kolme muuta edustajaa NSCLC-solujen HLF-a, H23 ja H1650 (Fig. 3C).

, H2170 solut satama N-AK pilkkomisaktiivisuus. Käsittely Flag-merkityn N-AK inkuboitiin otteita DMS-79 (kaistat 2-5) tai H2170 (kaistat 6-9) soluja ajaksi kuten edellä määritettiin western blotting-määritys suoritettiin Flag-vasta-aineen. Uute ladataan kaistaa merkintä ”keitetty”, kuumennettiin 100 ° C: ssa 10 minuuttia ennen inkubointia. Yhtä suuri tilavuus puskuria puuttuu solu-uutetta käytettiin kaistalla merkintä ”puskuri”. Nuoli merkitsee asentoa pilkotun 100 kDa N-AK fragmentti. B, Processing Flag-merkityn N-AK inkuboitiin otteet kolmen ensimmäisen ihmisen ensisijainen NSCLC-solut (Täydentävä taulukko 2) määritettiin western blotting kanssa Flag-vasta-aineen. C, N-AK pilkkominen määritys käyttäen otteet NSCLC-solujen HLF-a, H23 tai H1650, suoritettiin oleellisesti kuvatulla tavalla legenda kuvion 2A. D, taso ER stressin eri keuhkosyövän soluista analysoitiin pitoisuuksien määrittämiseksi GRP-78 ja PDI (pohjapinta ja HMW: suuri molekyylipaino). E, N-CoR: n on lokalisoitu ER visualisoitiin värjäämällä H2170-solujen N-CoR (punainen) ja PDI (vihreä) vasta-aineita. DNA värjättiin DAPI (sininen). F, taso PDI vuonna H2170 tai DMS-79-solut altistettiin muokkaamaan tai N-CoR siRNA määritettiin western blotting (ylempi paneeli). N-CoR: n knock-down tehokkuuden kussakin osajoukossa solujen varmistettiin RT-PCR-määritys (alempi paneeli). G, taso PDI nauhoituksen SAEC käsitellyissä soluissa nikotiinia 48 tuntia määritettiin RT-PCR-analyysillä.

Seuraava testata onko NSCLC-soluille spesifisten N-AK menetys liittyi ER stressiä havaittiin APL, taso ER stressin poikki NSCLC soluissa verrattiin DMS-79-soluissa mittaamalla tasoja GRP78 ja PDI proteiineja, kaksi bona fide merkkiaineiden ER stressin [24], [25]. Tasot GRP78 ja PDI, sekä normaali- että suurimolekyylipainoista (HMW) variantti nimenomaan todennut soluissa meneillään ER stressiä, olivat merkittävästi korkeammat kaikissa NSCLC soluissa, jotka osoittivat N-AK menetys, kun taas näiden kahden proteiinin olivat lähes havaitsematon DMS-79 solut (Fig. 3d). Mahdollinen rooli väärin laskostuneen N-AK: n monistamiseen ER stressiä ehdotti kolokalisaation N-CoR ja PDI vuonna H2170 soluissa (Kuva. 3E), ja pelkistämällä PDI tason jälkeen N-AK taintumisen (kuvio . 3F). Lisäksi hoito SAEC solujen nikotiinia pitoisuus käynnistäneen N-AK menetys johti jopa sääntelyn PDI tasolla, mikä viittaa siihen, että nikotiinin aiheuttaman N-AK menetys voitaisiin myös liittyy ER stressiä (Fig. 3G). Nämä havainnot yhdessä ehdottaneet yhteyden N-CoR menetys ja monistamisen ER stressiä NSCLC soluissa. Se ehdotti myös, että hajoamista väärin laskostuneen N-AK saattanut osaltaan vaimennus ER stressiä ja lopulta suojelemiseksi NSCLC-solujen ER stressin aiheuttama apoptoosin kuten aiemmin todettu APL.

väärin laskostuneet N-AK heikkenee kautta kaperonin välittämä autophagy

päästääkseen paremmin sisälle mekanismia taustalla menetys N-CoR ja ymmärtää toiminnallisen seurausta N-CoR menetys, päätimme tunnistaa proteiinit, jotka ovat saattaneet liittyvät väärin laskostuneet N-CoR proteiini ennen sen hajoamista. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, joka on erityisesti suunniteltu samanaikainen immunosaostus analyysi suoritettiin käyttäen proteaasia köyhdytettyä sytosolin uutteen H2170 solujen ja lippu-tagged N-AK ektooppisesti ilmaistu 293T-soluissa. Flag-merkitty N-AK inkuboitiin proteaasilla köyhdytettyä sytosolin uute H2170 solujen immunosaostettiin lippu vasta-aineella ja identiteettiä liittyvien proteiinien N-CoR määritettiin massaspektrometrialla (MS) jälkeen erottamisen SDS-PAGE. Mielenkiintoista on, että ulos useita proteiineja kerasaostuvat flag-merkityn N-CoR: n, yksi tunnistettiin Hsc70 (Fig. 4A), molekyyli- kaperonin olennainen translokaatiolle erityisiä CMA substraattien lysosomeihin [26] – [28]. Testata välillä suoraa yhteyttä N-CoR ja Hsc70, alikvootti proteaasi-köyhdytettyä sytosolin uute H2170 soluja inkuboitiin uutteen 293T-soluihin transfektoitu lippu-merkitty N-AK-plasmidi, ja taso Hsc70 saostetaan N-CoR määritettiin western blottauksella määrityksessä. Merkittävä määrä Hsc70 proteiinia (Fig. 4B, yläpaneeli) oli kerasaostuvat yhdessä Flag-merkityn N-AK (Fig. 4B, alempi paneeli) saostetaan Flag-vasta-aineen. Yhdistyksen välillä N-CoR ja Hsc70 proteiinien varmistettiin lisäksi yhteistyössä immuunisaostustesti suoritettiin otteita ajoneuvon tai Kaletran käsiteltyjen H2170-soluissa (kuvio. 4C). Lisäksi epäsuora immunofluoresenssikokeessa määrityksessä merkittävää kolokalisaation välillä N-CoR ja Hsc70 havaittiin edelleen viittaa niiden in vivo yhdistys H2170 soluissa (Kuva. 4D).

, sarake puhdistettu sytosolin otteet H2170 soluja inkuboitiin lippu-merkitty N-AK ektooppisesti ilmaistu 293T-soluissa. N-AK immunosaostettiin anti-flag-vasta ja proteiinit kerasaostuvat N-AK ratkaistiin SDS-PAGE, leikattiin ja niiden identiteetti määritettiin MS. B, välinen yhteys Flag-merkityn N-CoR ja Hsc70 sai vahvistusta samanaikainen immunosaostus määritys suoritettiin olennaisesti, kuten on kuvattu legenda kuvion 4A. Havaitsemisen jälkeen kerasaostuvat Hsc70 kanssa Hsc70 vasta-aineella (ylempi paneeli), kalvo uudelleen koetettiin lippu vasta määrän kvantitoimiseksi saostunut N-AK-proteiinin (alempi kuva). In ”input” kaistaa, alikvootti kokosolu-uutetta ladattiin. C, Hsc70 immunosaostettiin otteita ajoneuvon tai 5 uM Kaletran käsitelty H2170 soluja ja yhteistyön tason saostunut N-AK määritettiin N-AK-aineella (ylempi paneeli). Kalvo uudelleen koetettiin Hsc70 vasta-aineella (alempi kuva). In ”input” kaistaa, alikvootti kokosolu-uutetta ladattiin. D, N-AK (punainen) ja Hsc70 (vihreä) jakelua H2170 soluissa määritettiin läpi immunofluoresenssikokeessa analysoinnin konfokaalimikroskopia. Intensiteetti keltainen signaaleja merkitsee asteen kolokalisaation kaksi proteiineja. DNA leimattiin DAPI (sininen).

Useimmat tunnetut substraattien CMA sisältävät lysosomaalisen kohdistaminen motiivi biokemiallisesti liittyvät KFERQ [21], [29]. Tämä motiivi koostuu Q reunustaa kummallakin puolella neljä aminohappoa, joka koostuu perus-, hapan, tilaa vievä hydrofobinen, ja toistuva perus- tai tilaa vieviä hydrofobisen aminohapon. Analyysi N-CoR peptidin sekvenssi paljasti, että läsnä on lähes identtinen lysosomaalisen kohdistaminen motiivi, joka käsittää sekä QEIFR pentapeptidin, viittaa siihen, että N-CoR: n voi olla substraatti CMA (Fig. 5A). CMA, Hsc70 ensin assosioituu sen väärin laskostuneet lastia cytosole ja sitten Hsc70-lasti kompleksi kuljetetaan lysosomiin [29], [30]. Kun toimitetaan lysosomaalisen kalvoon Hsc70, The väärin laskostuneet Lastiproteiinimalleja kulkeutua sen lysosomaalisen onkalo avulla Lamp2A, nopeutta rajoittava tekijä CMA [26] – [28]. Sen todistamiseksi, että N-AK hajonnut kautta Lamp2A välittämän lysosomireitin, vaikutus Lamp2A ablaation tasolla N-AK-proteiini määritettiin. N-CoR: n menetys oli merkittävästi päinvastainen (kuvio. 5B, ylemmät paneelit) jälkeen Lamp2A ablaatio tehokas anti-Lamp2A siRNA (Fig. 5B, alempi paneeli), mikä viittaa siihen, on tärkeä rooli Lamp2A menetys N-CoR-proteiinia. Lisäksi hoito H2170 soluja klorokiinin, kemiallisen estäjä lysosomaalisen toiminto [31], merkittävästi estänyt menetys N-AK-proteiinia (kuvio. 5C).

A, N-AK sisältää konsensus lysosomaalisen kohdistaminen motiivi. Lysosomaalisen kohdistaminen motiivin N-AK peptidisekvenssi on korostettu alleviivattu lihavoituna. B, Lamp2A ablaatiota estetty N-AK tappio H2170 soluissa. N-AK tasolla H2170 altistuneiden solujen anti-Lamp2A tai kontrolloida siRNA 72 tuntia määritettiin N-AK-aineella (ylempi paneeli) vahvistuksen jälkeen Lamp2A ablaation RT-PCR-analyysillä (alempi kuva). C, kemiallinen estämällä lysosomaalisen toiminta vakiintui N-AK. Taso N-AK H2170 käsitellyissä soluissa 72 tuntia ajoneuvon tai 25 uM klorokiinin, selektiivinen estäjä lysosomaalisen toiminto, määritettiin N-AK-aine. D, Flag-merkityn N-AK inkuboitiin puhdistetun lysosomaalisen tai ei-lysosomaalisen jakeet H2170 (vasemmalla) tai DMS-79 (oikea) solut ja taso N-CoR hajoaminen määritettiin lippu vasta-aineella. Taso Lamp2, lysosomaalista proteiinia, määritettiin osoittaa puhtauden kunkin fraktion. E, N-AK tarttunut kymostatiini käsitelty lysosomeihin suojattiin proteinaasi K ruoansulatusta. Flag-merkitty N-CoR tai Hsc70 inkuboitiin lysosomeihin eristetty muoto H2170 soluja esikäsitellään kymostatiinista alistettiin proteinaasi K ruoansulatusta ja suhteellisen tason suojattu N-CoR tai Hsc70 määritettiin lippu- tai Hsc70 vasta-aine. Lamp2 taso määritettiin määrällisesti määrä lysosomeista kunkin näytteen.

edelleen todistaa, että lysosomeihin olivat lähde N-CoR pilkkomisaktiivisuus esitetty NSCLC soluissa, ruoansulatusta Flag-merkityn N-AK inkuboitiin ote lysosomaalisen tai ei-lysosomaalisen jakeet H2170 soluja määritettiin. Flag-merkitty N-AK inkuboitiin ote lysosomaalisen osa H2170 solujen hajotettiin täysin samalla Flag-merkityn N-AK inkuboitiin kuin lysosomaalisen jakeet ollut (Kuva. 5D, vasen paneeli), mikä viittaa siihen, että N-CoR pilkkomisaktiivisuus oli todennäköisesti lokalisoitu lysosomeihin. Identtisissä määritys kunnossa, Flag-merkityn N-AK inkuboitiin lysosomaalisen osa DMS-79-soluissa ei pilkottu (Fig. 5D, oikea paneeli). Sen todistamiseksi, että N-AK on todellakin substraatti CMA, lysosomaalista oton määritystä, jossa CMA alustoille ottaneet kymostatiinilla käsiteltyjen lysosomeihin olisi suojattava proteinaasi K ruoansulatusta, suoritettiin [21]. Flag-merkitty N-CoR tai Hsc70, tunnettu CMA alustan, inkuboitiin proteinaasi K ja lysosomeihin isolaed alkaen kymostatiinista käsiteltyjen H1270 soluja, ja taso N-CoR tai Hsc70 proteiinien suojattu proteinaasi K digestio määritettiin western blottauksella. Merkittävä määrä Flag-merkityn N-AK sekä Hsc70 suojattiin proteinaasi K ruoansulatus kun inkuboidaan kymostatiinista käsitelty lysosomeihin, mikä viittaa siihen, että N-CoR, kuten Hsc70 voi olla kuljetettu sen lysosomaalisen onteloon (Fig. 5E).

tietojen perusteella tähän asti kuvattu tässä raportissa, mahdollista roolia CMA aiheuttama hajoaminen väärin laskostuneen N-AK proteiinin selviytymistä ja kasvua NSCLC solujen havainnollistetaan kautta kaavamainen malli (Fig. 6). Tämä malli korostaa, miten N-AK menetys voisi mahdollisesti edistää selviytymistä ja kasvua NSCLC-solujen kautta dual mekanismi. Hajoaminen väärin laskostuneen N-AK-proteiinia, toisaalta, voi välillisesti edistää eloonjäämistä NSCLC-solujen neutraloimalla ER stressin aiheuttama solunsisäisen kertymisen väärin laskostuneen N-AK-proteiinia. Samaan aikaan, menetys N-CoR-toiminto, koska väärinlaskostumista voi johtaa aktivoinnin onkogeenisten selviytymisen polkuja, jotka ovat yleensä tukahdutettu jonka natiivisti taitettu ja toiminnalliset N-CoR: n proteiinia. Lisäksi väärin laskostuneet N-CoR ja sen huonontuneen fragmentteja voitaisiin myös suoraan aktivoida erilaisia ​​kasvaimia synnyttävän mekanismin liittyvät kasvun ja eloonjäämisen NSCLC soluja. Siten CMA aiheuttama hajoaminen väärin laskostuneen N-AK voi edistää kasvua ja muutosta NSCLC solujen yhdistämällä menetyksen ja vahvistuksen toiminta mekanismeja.

Tämä malli kuvaa, kuinka CMA aiheuttamaa hajoamista väärin laskostuneen N- AK voisi edistää selviytymistä ja kasvua NSCLC-solujen kautta menetys normaalin toiminnan ja voitto poikkeavan toimintamekanismi.

keskustelu

N-AK epävakautta tai väärinlaskostumista havaittu NSCLC