Krooninen sairaus

tiivistelmä

fukosyloitu- on ratkaiseva oligosakkaridimodifikaatiokohtaa syövässä. Tunnetut toiminta fukosyloitu- syövän on toimia välittäjänä etäpesäkkeiden kautta selektiiniligandin riippuvia prosesseja. Aiemmin löysimme täydellinen menetys fukosyloitu- että koolonisyöpäsolulinja HCT116 johtuu mutaatio GDP-fukoosia synteettinen entsyymi, GDP-mannoosi-4,6-dehydrataasia (GMDS). Menetys fukosyloitu- johti paeta syöpäsolujen kasvaimen immuunivalvonnan seuraa kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden, mikä viittaa uuden toiminnon fukosyloitu- kasvaimen etenemisen kautta. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet taajuus GMDS mutaation useissa kliinisissä kolorektaalisyöpä kudosnäytteitä: 81 näytettä ensisijainen peräsuolen syövän kudos- ja 39 näytteitä metastaattisen vaurion mukaan lukien maksa ja imusolmukkeissa. Neljä tyypit deleetiomutaation GMDS havaittiin alkuperäisessä syövän kudoksissa sekä etäpesäkeleesioita. Taajuus GMDS mutaatio oli hieman suurempi etäpesäkeleesioita (12,8%, 5/39 näytettä) kuin alkuperäinen syövän kudoksissa (8,6%, 7/81 näytettä). O mutaatio GMDS geenin havaittiin normaaleissa paksusuolen ympäröivien kudosten syöpä kudoksiin, mikä viittaa siihen, että mutaatio on somaattisten pikemminkin kuin ituradan. Immunohistokemiallinen analyysi paljasti täydellisen menetyksen fukosyloitu- kolmessa syöpätapausta kudosta. Kaikissa kolmessa tapauksessa oli GMDS mutaatio. Yhdessä kolmessa tapauksessa, menetys fukosyloitu- havaittiin vain metastaattinen vaurio, mutta ei sen alkuperäisen paksusuolisyöpäkudoksessa. Nämä tiedot osoittavat osallistumista GMDS mutaation etenemisen paksusuolen syövän.

Citation: Nakayama K, Moriwaki K, Imai T, Shinzaki S, Kamada Y, Murata K, et ai. (2013) Mutation GDP-mannoosi-4,6-dehydrataasin in peräsuolen syövän etäpesäke. PLoS ONE 8 (7): e70298. doi: 10,1371 /journal.pone.0070298

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 25 tammikuu 2013; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 29 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Nakayama et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fukosyloitu- on yksi tärkeimmistä oligosakkaridi muutoksia syöpä ja tulehdus [1]. Fukosyloitu- säädellään eri fukosyylitransferaasit, guanosiini-5′-difosfaatti (GDP) -fucose synteettisiä entsyymejä, ja GDP-fukoosin kuljettajat. Useimmat GDP-fukoosin syntetisoidaan de novo -reitin jossa GDP-mannoosia muuntuu GDP-fukoosin BKT-mannoosi-4,6-dehydrataasia (GMDS) ja GDP-4-keto-6-deoxymannose-3,5- epimeraasin-4-reduktaasin (FX) [2] – [4]. Useat vasta-aineita, jotka tunnistavat fukosyloituja glykoproteiinien tai glykolipidien seerumissa potilailla, joilla on syöpä on pitkään käytetty kasvainmerkkiaineet [5]. Alfafetoproteiini (AFP) -L3 jae, joka on fukosyloitu AFP, on myös käytetty kliinisesti tuumorimarkkeri varten maksasyövän vuodesta 1996 Japanissa ja vuodesta 2005 Yhdysvalloissa [6]. Yleensä fukosyloitu- tasot nousivat karsinogeneesi useita syöpiä [7], [8]. Aiemmin olemme kuitenkin havainneet, että täydellinen menetys fukosyloitu- koska deleetiomutaatio GMDS geenin sallittu koolonkarsinoomasoluissa paeta luonnollisten tappajasolujen välittämä kasvaimen valvontaa moduloimalla tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) signalointia [9 ], mikä viittaa siihen, että uusi metastaattinen polku riippuvainen menetys fukosyloitu-. GMDS mutaatio on havaittu paksusuolen (HCT116, LS174T, NCI-H716) ja mahalaukun (SCH) syöpäsolun linjat sekä ihmisen paksusuolen ja munasarjasyövän kudosten [9]. Mielenkiintoista on, GMDS mutaatiota ei löydy mitään vieressä normaaleissa kudoksissa, mikä viittaa siihen, että GMDS mutaatio oli somaattisten. Jos menetys fukosyloitu- on kriittinen tuumorietäpesäke aikana peräsuolen syövän etenemisen, taajuus GMDS mutaation todennäköisesti korotetaan etäpesäkeleesioita. Tässä tutkimuksessa selvitimme taajuus GMDS mutaation metastasoitunut kolorektaalisyöpä kudoksissa, kuten maksassa ja imusolmukkeissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Protokolla ja ilmoittivat suostumus hyväksyi institutionaalisten tarkastuslautakunta Osaka University Graduate School of Medicine. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta, ja tutkimus toteutettiin noudattaen Helsingin julistuksen.

Kudosnäytteiden

Kolmekymmentäyksi näytteitä metastaattisen maksasyövän, 2 näytteitä metastasoituneen muiden syöpien (mahalaukun syöpä, kilpirauhassyöpä) ja 81 näytteitä alkuperäisestä paksusuolensyöpä kudoksia peräisin potilailta, joilla peräsuolen syöpä, joille tehtiin ensisijainen resektion laitoksella kirurgian Osaka Medical Center for Cancer ja Verisuonitautien 1995-2005 säilytettiin -80 ° C, kunnes ne käytettiin. Kuusi näytettä metastaattinen imusolmukkeiden potilailla, joilla peräsuolen syöpä, joille tehtiin ensisijainen resektion laitoksella kirurgian Suita Municipal Hospital 2010-2012 käytettiin myös tässä tutkimuksessa. Kliinisten parametrien potilaita tässä tutkimuksessa on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Jotkin syövän kudokset upotettiin parafiiniin ja käyttää immunohistokemiallista analyysia varten. Nämä tutkimukset hyväksyi institutionaalisten eettinen komitea Osakan yliopistollisen sairaalan.

seulonta GMDS mutaatio Reverse Transcription-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) analyysi

Yhteensä RNA uutettu jäädytetty kudoksista mukaan standardin protokollan TRIzolia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uutettu RNA käänteistranskriboitiin käyttäen Super Script ™ III käänteistranskriptaasia ja oligo-dT-aluketta (Invitrogen). Käyttämällä syntetisoitiin cDNA, PCR suoritettiin KOD-Plus-DNA-polymeraasia (TOYOBO, Osaka, Japani). PCR-alukkeet GMDS olivat seuraavat: F, 5′-GCAAGCTTAAAATGGCACACGCACCGGCAC-3 ’ja R, 5′-GCGGATCCTCAGGCATTGGGGTTTGTC-3’. Glyceraldehydes-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina, ja seuraavat PCR-alukkeita käytettiin monistamaan GAPDH: F, 5′-AACGGGAAGCTTGTCATCAAT-3 ’ja R, 5′-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3’. Sekvenssianalyysi suoritettiin ABI PRISM 3100 geneettistä analysaattoria (Applied Biosystems, Foster City, CA).

immunohistokemiallinen Studies

Syöpä ja normaalin paksusuolen fiksoitiin 10% formaliinilla /fosfaattipuskuroidussa suolaliuosta (PBS) ja varastoidaan parafiiniin upotetut näytteet. 4 um kudosleikkeet de-vahattu ja endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin käsittelemällä 0,3% vetyperoksidia metanolissa 10 min. Kun oli pesty kahdesti PBS: llä, näytteitä inkuboitiin Tris puskuroidulla suolaliuoksella ja Tween 20: tä, joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiinia yön yli 4 ° C: ssa. Näytteitä inkuboitiin biotinyloidun

oranssimaljakas

lektiini (AAL, 2,0 ug /ml) tai kaniinin anti-GMDS-vasta-ainetta (0,3 ug /ml) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Näytteet pestiin kolme kertaa PBS: llä ja sen jälkeen inkuboitiin ABC Kit (Vector Labs, Burlingame, CA) AAL värjäystä tai Dako Cytomation Envision + System HRP leimatun Polymer Anti-Rabbit-vasta-aine (Dako, Glostrup, Tanska) GMDS värjäytymisen huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen näytteet pestiin kolme kertaa PBS: llä, positiivista värjäytymistä visualisoitiin käyttäen diaminobentsidiiniä (Dako).

Tulokset

GMDS Mutaatio peräsuolen syövän

tutkimiseksi taajuus GMDS mutaation alkuperäisen ja metastasoituneen peräsuolen syövät, kokonais-RNA uutettiin 81 näytteitä ihmisen alkuperäisen kolorektaalisyövän kudoksiin, 39 näytteitä metastaattisen syövän kudosten ja viereisen normaalin paksusuolen kudoksiin, ja tehtiin RT-PCR-analyysillä. Neljä lyhyempi PCR-tuotteet oli useissa alkuperäisessä ja metastaattinen kudoksiin (Fig. 1). Yksityiskohtainen sekvenssianalyysi paljasti erilaisia ​​poistamista GMDS eksonien: eksonit 2-4, 5-7, 2-7, ja 3-7. Kaksi näistä mutaatioista, poistetaan eksonien 5-7 ja eksonit 2-4, olivat samat kuin on HCT116 ja SCH solulinjoissa, vastaavasti. Poistot eksonien 2-7 ja 3-7 GMDS geenin edustaa uusia mutaatioita tunnistettu tässä tutkimuksessa. GMDS mutaatiot etäpesäkeleesioita olivat yhdenmukaisia ​​alkuperäisen peräsuolen syöpä kudoksiin. Mielenkiintoista on, että homotsygoottinen on GMDS mutaation ilman normaali tyyppi GMDS transkriptin havaittiin yksi metastaattisen maksasyövän kudoksen (tapaus 1 on esitetty. 1). Taajuus GMDS mutaation etäpesäkeleesioita oli 12,8% (5/39 näytettä): 12,9% (4/31 näytettä) maksassa, 16,7% (1/6 näytteistä) imusolmuke, ja 0% (0/2 näytteistä) muissa elimissä (taulukko 2). Hieman harvemmin 8,6% (7/81 näytteet) on GMDS mutaatio havaittiin alkuperäisessä syöpä kudoksiin verrattuna niiden etäpesäkeleesioita vaikka ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (

p

0,10, jonka χ

2 -testi). Ei GMDS mutaatio havaittiin 24 näytettä vierekkäisten normaalin paksusuolen kudoksiin.

GMDS mutaatioita havaittiin seitsemän tapausta alkuperäisen peräsuolen syöpä kudoksiin ja viisi tapausta etäpesäkeleesioita. Nuolet osoittavat bändejä edustavat GMDS mutaatio: poistetaan eksonien 2-4 (A, 876 emäsparia), 5-7 (B, 693 emäsparia), 2-7 (C, 450 bp), ja 3-7 (D, 495 emäsparia) . Arrowheads osoittavat villityypin GMDS (*) ja epäspesifistä (**) bändejä. L-6 osoittaa yksi niistä tapauksista metastasoitunutta imusolmukkeet. N, vierekkäiset normaali kudos; T, kasvain; LN, imusolmuke.

immunohistokemia

tarkastella cellular fukosyloitu- tasolla näissä syövän kudoksissa, 33 tapausta alkuperäisen peräsuolen syöpä kudoksiin ja neljä tapausta metastasoituneeseen imusolmukkeiden olivat värjätään anti-GMDS vasta-aineen ja fukosyloituja glykaanitähteen sitova lektiini, AAL. RT-PCR-analyysit osoittivat heterotsygoottinen GMDS mutaation viidessä 33 tapauksesta. Kaksikymmentäkahdeksan kolorektaalisyöpä kudoksiin ilman GMDS mutaatio osoitti positiivista värjäytymistä sekä GMDS ja AAL. Edustavia kuvia on esitetty kuvassa. 2A (tapaus-N). Sen sijaan kaksi viidestä tapauksesta alkuperäisen syövän GMDS mutaatio osoitti negatiivista värjäystä sekä GMDS ja AAL (tapaus 4 ja 6 kuvassa. 2A). Kiinnostavaa, yksi viidestä tapauksesta, joissa GMDS mutaatio osoitti negatiivista värjäystä sekä GMDS ja AAL Metastasoituneessa imusolmuke huolimatta positiivista värjäytymistä alkuperäisessä paksusuolisyöpäkudoksessa (tapaus L-6 kuvassa. 2B ja C).

Kolmekymmentä kolme tapausta alkuperäisen peräsuolen syöpä kudoksiin ja neljä tapausta metastasoituneeseen imusolmukkeiden värjättiin anti-GMDS ainetta ja AAL. (A) asiat 4 ja 6, jotka kuvaavat alkuperäistä peräsuolen syövän GMDS mutaatio, mutta ei asia N, joka ei ollut GMDS mutaatio, osoitti negatiivista värjäystä sekä GMDS ja AAL. (B, C) Jos L-6, joka teki satama GMDS mutaation metastaattisen imusolmuke ei värjättiin GMDS (B) ja AAL (C), vaikka positiivista värjäytymistä sekä GMDS ja AAL alkuperäisessä paksusuolen syövän kudosnäyte. Asia L-4 ilman GMDS mutaatio osoitti positiivista värjäytymistä GMDS ja AAL sekä alkuperäisessä ja metastaattisen legioonien. Palkki osoittaa 100 pm. LN, imusolmuke.

Keskustelu

Aiemmissa Meidän tutkimuksessa GMDS mutaatio tunnistettiin gDNA sekvensoimalla kahdessa 100 tapausta paksu- ja peräsuolisyövän kudosten ja RT-PCR analyysi viidessä 10 tapausta microdissected ihmisen munasarjasyövän kudosta. Tässä tutkimuksessa olemme edelleen osoitti GMDS mutaatio useissa ihmisen alkuperäinen ja metastasoituneen kolorektaalisyövän kudoksiin. Taajuus GMDS mutaatio oli hieman suurempi etäpesäkeleesioita (12,8%) kuin alkuperäinen syövän kudoksissa (8,6%). Mielenkiintoista on, että yhdessä tapauksessa (L-6), menetys fukosyloitu- havaittiin metastaattisen imusolmuke mutta ei alkuperäisessä syöpäkudoksessa (Fig. 2B ja C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että GMDS mutaatio on mukana etenemistä peräsuolen syöpä. Tapausten määrä, joissa GMDS mutaatio ei riittänyt tutkia tilastollinen korrelaatio GMDS mutaatio ja sairauden aktiivisuuden mitään varmaa. Tarkempi analyysi enemmän määrä näytteitä tarvitaan määrittämään korrelaatio GMDS mutaatio ja paksusuolen syövän etenemistä. Neljä yhdeksästä potilaalla on GMDS mutaatio (tapaus 1-8 ja kotelo L-6) alistettiin leikkaukseen 3 vuoden kuluessa diagnoosin jälkeen. Siten seurantatutkimuksessa vaaditaan myös tutkimaan toistumisen etäpesäke.

Vaikka suurin osa GMDS mutaatioiden havaittu tässä tutkimuksessa olivat heterotsygoottinen, homotsygoottisia deleetiomutaatio havaittiin yhdellä metastaattisen maksasyövän kudosten (tapaus 1, kuva 1). Koska syöpä kudokset koostuvat erilaisia ​​soluja, mukaan lukien ei vain syövän soluissa, mutta myös interstitiaalinen soluja, on vaikea osoittaa, onko syöpäsoluja satama heterotsygoottinen tai homotsygoottinen mutaation tyypistä RT-PCR-analyysi käyttäen koko syöpäkudoksissa. Näin ollen mahdollisuutta, että syöpäsolut ovat homotsygoottinen GMDS deleetiomutaation kudoksille, joissa heterotsygoottinen deleetiomutaatio havaittiin edelleen. Itse asiassa ilmaus GMDS ja fukosyloituja Glykaanit tuskin havaittiin immunohistokemiallisella analyysillä käyttäen anti-GMDS vasta-aine ja AAL kolmessa tapauksessa viidestä kanssa heterotsygoottinen GMDS mutaatio, mikä viittaa siihen, että syöpäsolut näissä kudoksissa voi todellakin olla homotsygoottinen GMDS mutaatio.

Expression tasoilla GMDS geenin syöpä kudoksiin vaikuttavat paitsi geenimutaatio vaan myös transkription säätelyyn. Vaikka jotkin glykosylaation liittyvien geenien raportoitu epigeneettiseltä säännellä [10], [11], ilmentyminen GMDS ei muuttunut käsittelemällä aineilla, jotka moduloiva epigeneettisellä DNA rakenne välityksellä DNA: n metylaatio tai histoni asetylaatio, mikä viittaa siihen, että epigeneettiset vaikutukset eivät merkittävä rooli säätelyssä GMDS geenin ilmentymistä [12] (tuloksia ei ole esitetty). Lisätutkimukset käsitellään geenien ilmentymisen säätelyn GMDS geenin ovat perusteltuja.

Monien fukosyloitu- liittyviä geenejä, mutaatio fukosyylitransferaasit FUT1, 2, ja 3, jotka katalysoivat α1-2 tai 1-3 /4 fukosyloitu-, on raportoitu potilailla, joilla on harvinainen veriryhmien [13], [14]. Lisäksi GDP-fukoosin kuljettaja on myös raportoitu olevan vastuussa Leukosyyttiadheesion puutos tyypin II, joka on harvinainen peittyvästi oireyhtymä ominaista kasvu ja kehitysvammaisuus ja vaikea immuunipuutos [15] – [17]. Ei mutaatio fukosyloitu- liittyvien geenien on raportoitu ihmisen syövän kudoksissa ennen. GMDS on ensimmäinen fukosyloitu- liittyvä geeni, joka havaittiin olevan mutatoitunut syöpäkudoksissa. Seuraavan sukupolven DNA-sekvenssin analyysi voi olla hyödyllinen väline selvittää, miksi GMDS mutaatio tapahtuu monenlaisia ​​syöpiä.

Korkea fukosyloitu- tason syöpäsoluissa osoitettiin kasvavan etäpesäkkeiden kautta upregulating ilmaus sialyyli Lewis A ja X, selektiiniligandeille, solun pinnalla [10]. Sitä vastoin tuloksemme osoittavat, että menetys fukosyloitu- myös lisääntynyt etäpesäke jopa ilman selektiiniligandeille. Cancer etäpesäke etenee monia vaiheita: paeta immuunisolujen, invaasio, angiogeneesi, intravasation, itseohjautuva metastaattinen kudoksiin, ekstravasaatio, ja kolonisaatio [18]. Fukosyloitu- voisi olla erilainen rooli jokaisessa vaiheessa. Fukosyloitu- syöpäsoluissa on tiukasti säädeltyä ja sen dysregulaiton aiheuttaa lisää syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Johtopäätöksenä on, että esillä oleva tutkimus osoitti, että GMDS mutaatio tulisi osallistua etenemistä peräsuolen syöpä. Seuraavan sukupolven DNA analyysi voi antaa meille lisätietoja GMDS mutaatio peräsuolen syövän.

Kiitokset

Tämä tutkimus suoritettiin tutkimusohjelmaan Project for Development of Innovative Research on Cancer Therapeutics (P-Direct), opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede- ja teknologiaministeri Japanissa ja oli osittain tukee New Energy ja Industrial Technology Development Organization (NEDO) osana Kehittyvä teknologia Project toteuttaminen Sugar Chain toiminnot Japanissa . Tätä työtä tuki myös osittain Global Huippuyksikkörahoituksen Osakan yliopiston rahoittama opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan.