Krooninen sairaus

tiivistelmä

Esillä olevassa tutkimuksessa arvioitiin ilmaisun väli- johtavuuden omaavia kalsiumin aktivoimia kaliumkanavia (KCa3.1) kanavan ihmisen glioblastooma kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS) ja tutkitaan sen rooli solun liikkuvuus. Vaikka KCa3.1 kanava ei ilmaistu neuronal- ja glial-johdettu kudoksissa terveillä yksilöillä, sekä KCa3.1 mRNA: ta ja proteiinia, on läsnä glioblastooma kasvaimen väestöstä, ja vahvistetaan huomattavasti CSCS peräisin sekä vakiintuneesta solulinjasta U87MG ja ensisijainen solulinja, FCN9. Yhdenmukainen Näiden tietojen jännite riippumaton ja TRAM-34 herkkiä kalium virrat johtuvista KCa3.1 kanava kirjattiin hiiren GL261 solulinjassa ja useat ensisijainen ihmisen glioblastoomasoluista linjat. Lisäksi merkittävästi suurempi KCa3.1 nykyinen kirjattiin U87MG-CD133 positiivisia soluja verrattuna U87MG-CD133 negatiivinen alaryhmässä. Edelleen olemme huomanneet, että kasvain solun liikkuvuus liittyy vahvasti KCa3.1 kanavan ilmaisun. Salpaus KCa3.1 kanavan kanssa spesifinen estäjä TRAM-34 on itse asiassa suurempi vaikutus motiliteettia CSCS (vähennys 75%), jotka ilmentävät korkea KCa3.1 kanavan, kuin on FCN9 vanhempien väestöstä ( vähennys 32%), jossa KCa3.1 kanava ilmaistaan ​​alemmalla tasolla. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös CSCS johdettu U87MG. Koska invaasio ympäröiviin kudoksiin on yksi tärkeimmistä syistä hoidon epäonnistumisen glioblastoma, nämä havainnot voi olla merkitystä tulevaisuuden kehittää uusia syövän terapeuttisia lääkkeitä.

Citation: Ruggieri P, Mangino G, Fioretti B, Catacuzzeno L , Puca R, Ponti D, et al. (2012) esto KCa3.1 Kanavat Activity Vähentää soluliikkuvuus glioblastoma Johdetut Cancer Kantasolut. PLoS ONE 7 (10): e47825. doi: 10,1371 /journal.pone.0047825

Editor: Massimo Avoli, McGill University, Kanada

vastaanotettu: toukokuu 30, 2012; Hyväksytty: 17 syyskuu 2012; Julkaistu: 22 lokakuu 2012

Copyright: © Ruggieri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Fondazione Cassa di Risparmio, Perugia (FF) ja COFIN-MIUR (Ministero dell’Università e della Ricerca SCIENTIFICA) 812,111, 2007 (AC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

glioblastoma multiforme (GBM) on yleisin pahanlaatuinen keskushermoston (CNS) kasvain aikuisilla, ja kaikkein vaikea parantaa, vaikka kehitys leikkaus ja adjuvanttihoito [1]. Se muodostaa 30 60% CNS ensisijainen kasvaimia, joiden esiintyvyys on 2-3 tapausta 100 000 henkilöä kohti vuodessa [2], [3]. Vain 30%: GBM potilaista elää pidempään kuin yhden vuoden kuluttua diagnoosista, ja keskimääräinen elinikä on edelleen noin 14-18 kuukausi [4], [5]. Köyhät ennuste GBM potilaille ei ole parantunut merkittävästi viime vuosikymmeninä, lähinnä vaikeuksista ja haasteista havaitsemiseen ja hoitoon tämän tappava syöpä.

Useat ominaisuudet syöpä, mukaan lukien glioblastooma, vaikuttavat misregulation ionin kanava ilmentymistä tai toimintaa [6] – [8]. Alennettu ilmentyminen sisäänpäin tasasuuntaajan K-kanavien [9] ja lisääntyneen ekspression amiloridi-herkkien Na-kanavat [10], jännite-aktivoitu Cl-kanavat [11], ja BK-kanavien [12] on raportoitu useissa glioomissa, verrattuna normaaliin astrosyytit. KCa3.1 kanavaekspression voidaan myös vapautettiin glioblastooma. KCa3.1 kanava, joka tunnetaan myös nimellä IK1, SK4, KCNN4, IKCa on jäsen kalsium-aktivoitujen kalium (Kca) kanavan perhe, jossa on yhtenäinen konduktanssi 20-60 pS symmetrisiä 150 ep [13], [14 ]. Se eroaa toiminnallisesti liittyvät kalsiumin aktivoimien kaliumkanavien suurempia (100-200 pS, BK) ja pienempi (2-20 pS; SK) yhtenäinen johtokykyä sen farmakologian, biofysiikan ja fysiologia [13], [14]. Kaikki kolme perheenjäsenet KCa kanavien osoitettiin Sontheimer ryhmä voidaan transkriptoidu glioomasoluihin, vaikka vain BK-kanavat olivat funktionaalisia kasvain, ja niiden estäminen vaikuttavat voimakkaasti solujen vaeltamiseen in vitro [15]. Äskettäin ryhmämme raportoitu funktionaalisen ilmentymisen KCa3.1 kanavan glioblastoomasolulinjoissa ja osoittivat, että nämä kanavat ovat syvällisiä vaikutuksia edistämisessä solujen vaeltamiseen, mikä näkyy siirtokuoppaan migraatiokokeessa läsnäollessa tietyn KCa3.1 salpaajien [16]. Myöhemmin ilmaisun ja toiminnallinen aktiivisuus KCa3.1 kanava vakiintunut kahteen glioomasolulinjoja ja solujen yksi ensisijainen kulttuuri [17].

Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että glioblastomas peräisin poolista Stern- kuten solut, jotka jakavat ominaisuudet yhteisiä hermosolujen kantasoluja. Stemness käyttäytyminen ja leviämiskyky ovat tiiviisti mukana ja säänneltävä yhteisin signalointireitteihin [18]. Näiden tietojen perusteella ryhdyimme tutkimaan, ovatko KCa3.1 kanavat ovat mukana muuttoprosessista kantasolujen kaltaisia ​​soluja eristettyjen kasvain peräisin ensisijainen ja pysyvä solulinjoissa. Löysimme selvä ilmaus aktiivitoimisia KCa3.1 kanavia rikastetun osa solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia ja että niiden valikoiva tukos dramaattisesti estetty solujen liikkuvuutta.

Tulokset

Toiminnallinen KCa3.1 kanavat ilmaisten U87MG ja GL261 solulinjat

sen määrittämiseksi tasot KCa3.1 mRNA glioblastooma syöpäsoluissa, mittasimme niiden ilmentyminen reaaliaikaisella PCR: kaksi hyvin tunnettu solulinjat, ihmisen U87MG ja hiiren GL261.

KCa3.1

mRNA havaitaan selvästi molemmissa solulinjoissa ja ilmaisi korkeammilla tasoilla kuin ihmisen ja hiiren normaali astrosyytit. Heidän tasot olivat 118,47 ± 14,6 kertaa suurempi U87MG ja 76,13 ± 16,52 vuonna GL261 soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Western blot-analyysi kokosolulysaateista, arvioimiseksi suoritettiin proteiinin ilmentymistä, osoittivat bändi ~48 kDa molemmissa solulinjoissa kanssa rinnakkain liikkuvasta positiivisen kontrolliseerumin kanssa, edellyttäen, että spesifinen vasta-aine tuottaja (kuvio 1A). Määrä KCa3.1 proteiinia havaittiin U87MG on selvästi suurempi verrattuna havaita GL261 solulinjasta. Optinen tiheys (OD) mittaukset kaistan intensiteetin, normalisoinnin jälkeen, arvioi KCa3.1 tasolla U87MG olevan noin 4 kertaa suurempi kuin GL261. Arvioitiin myös taajuuden positiivisten solujen kahden solulinjojen sytometria-analyysi (kuvio 1 B, C). Prosenttiosuus KCa3.1 positiivisten solujen oli 72,66% vuonna U87MG solulinjassa ja 37,51% vuonna GL261 solulinjassa. Nämä taajuudet ovat suhteellisen korkeita, jos verrattuna KCa3.1 positiivisten solujen (2,82%), havaittu hiiren normaalin aikuisen astrosyyttien, otetaan kontrollisolut (kuvio 1 D).

(A) immunoblot-analyysi U87MG ja GL261 osoittivat ilmaus KCa3.1 kanavien korreloi transkriptipitoisuuksissa. (B) (C) sy- tofluorimetrisillä analyysi KCa3.1 on U87MG, GL261 ja hiiren normaalin aikuisen astrosyytit (NMA). Soluja inkuboitiin anti-KCa3.1 seurasi AlexaFluor488-konjugoitu vuohen anti-kani-vasta-aine, kuten on esitetty Materiaalit ja menetelmät osassa. Kymmenentuhatta tapahtumaa tallennettiin ja analysoitiin Cyflogic. Harmaat histogrammit: cellular autofluoresenssia; mustat histogrammit: AlexaFluor488 konjugoitu vuohen anti-kani yksin; vihreä histogrammit: anti-KCa3.1 (D) Tyypillinen aika aikana KCa3.1 virtaa joko GL261 solusta, tallennettu IV käyrät 0 mV, hallinnassa olosuhteissa, soveltamisen jälkeen DC-EBIO (100 uM) + ionomysiini ( 500 nM), ja soveltamisen jälkeen 3 uM TRAM-34 jatkuvassa läsnä DC-EBIO + ionomysiinillä. Jännite rampit levitettiin joka 5. s. Täytetyt ympyrät ovat saadut datapisteet välittömästi ennen IV esitettyjen käyrien paneelissa E. (E) edustaja IV käyrät saadaan soveltamalla jännitettä luiskat -100-+50 mV pitopotentiaalissa 0 mV, hallita olosuhteissa (CTRL), seuraavat soveltamista DC-EBIO + ionomysiinin, ja lisäyksen jälkeen TRAM-34 jatkuvassa läsnä DC-EBIO + ionomysiinillä. (F) Mean KCa3.1 virrantiheys mitattiin hiiren NMA, kuten valvontaa, GL261 ja U87MG glioblastoomasolulinjoissa 0 mV, arvioitiin välinen ero virrantiheyden huippuarvo DC-EBIO + ionomysiiniä ja vikavirta lisäyksen jälkeen raitiovaunu-34 (vrt täytetyt ympyrät paneelissa D).

funktionaalisen ekspression KCa3.1 kanavien U87MG ja GL261 glioblastoomasolut todennettiin patch-clamp mittauksia koko solun rei’itetty kokoonpano. TEA (3 mM) ja octanole (1 mM) olivat läsnä kaikissa ratkaisuja estää BK ja kuilu junctional kanavia, yleensä koekspressoitiin KCa3.1 kanavat glioblastoomasoluissa (katso Methods, [16]). Tyypillinen koe havainnollistaa protokollaa käytetään arvioitaessa KCa3.1 virta on esitetty kuvassa 1E ja F. Soluja stimuloitiin toistuvasti jännite luiskat -100-+50 mV pitopotentiaalissa 0 mV, ja KCa3.1 nykyiset arvioitiin ensin soveltamalla KCa3.1 /SK-kanavan aktivaattori DC-EBIO (100 uM) plus ionomysiinillä (500 nM; DC-EBIO + ionomysiinin), ja sitten lisäämällä erityisiä KCa3.1 kanavan estäjä TRAM-34 (3 uM) jatkuvassa läsnä DC-EBIO + ionomysiinillä. Molemmissa solulinjoissa jälkeen solunulkoinen perfuusion DC-EBIO + ionomysiini, havaitsimme kehittäminen jännite riippumaton nykyisen käännettä potentiaali (keskiarvo -85 ± 3 mV GL261 soluja, n = 3, ja -82 ± 4 for U87MG soluja, n = 4) lähelle K tasapainopotentiaalia meidän tallennusolosuhteissa (-90 mV). DC-EBIO + ionomysiinillä aiheuttama nykyinen oli useimmissa soluissa aluksi ohimenevä vaihe edellisen jatkuvaa tasangolla. Sekä ohimenevää ja jatkuvia komponentteja voitaisiin itse asiassa syyttää KCa3.1 nykyinen, koska niitä ei koskaan havaittu hakemuksesta DC-EBIO + ionomysiinillä in TRAM-34-esi-soluissa. Keskimääräinen KCa3.1 virrantiheydellä U87MG ja GL261 soluja (ohimenevä plus jatkuva, arvioitu 0 mV) oli 16,2 ± 5,0, n = 18, ja 11,5 ± 3,9, n = 7, vastaavasti. Sen sijaan ei ole DCEBIO + ionomysiini-aktivoitu TRAM-34 sensitiivistä virtaa ei havaittu normaalin hiiren aikuisen astrosyytit (n = 7) (kuvio 1G).

induktio Neuropalloja ja CD133 on Seuraaja stimulointi KCa3.1 kanavat Expression, että U87MG Cell Line

vieressä pyrittiin tutkimaan ilmentymistä ja toimintaa KCa3.1 kanavien U87MG viljeltyjen solujen kantasolujen salliva välineellä. Solujen ilmastointi arvioitiin optisella mikroskoopilla ja cytofluorimetry tarkistamalla ulkonäkö neuropallojen ja CD133

+ soluja, jotka seurattiin jopa kolme viikkoa sen jälkeen (kuvio 2A, B, C). CD133 on merkki eniten kasvaimen kantasolujen kaltaisia ​​soluja, erityisesti aivokasvaimia [19]. CD133

+ solujen kasautua enintään 6,3% (kuvio 2D) 10 päivän jälkeen ilmastointi (U87MG-NS), ja ne olivat vielä positiivisia 16 päivän jälkeen (4,6%, tuloksia ei ole esitetty).

(A) Vaihe mikroskopia kuva näkyy U87MG solujen subkonfluenteista ja U87MG johdetun neuropallo jälkeen 7 (B) ja 14 päivää (C) seerumivapaassa ilmastointi. (D) sy- tofluorimetrisillä analyysi CD133 U87MG ja U87MG-NS. Solut värjättiin PE-konjugoidulla anti-CD133 (1) tai histotype täsmäsi vasta-aineita, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Kymmenentuhatta tapahtumaa tallennettiin ja analysoitiin Cyflogic. Gray histogrammi: cellular autofluoresenssia; musta histogrammi: isotyyppiset valvonta; oranssi histogrammin: anti-CD133 (1) (E) immunoblottianalyysi U87MG ja U87MG-NS osoittivat ilmaus KCa3.1 kanavien korreloi transkriptipitoisuuksissa. (F) Faasikontrasti- (ylhäällä) ja immunofluoresenssilla (alhaalla) kuvat mekaanisesti dissosioitujen U87MG-NS-soluissa 30 minuutin inkuboinnin anti-CD133-vasta-aine, joka osoittaa CD133

+ ja CD133

– soluja (merkitty paksu ja ohut nuolet, vastaavasti). (G) Bar tuloste, joka esittää keskimääräisen KCa3.1 virrantiheys mitattuna 0 mV CD133

+ ja CD133

– U87MG-NS soluissa. Kokeet suoritettiin, kuten on kuvattu legenda kuvion 1D-F. * ANOVA testi, p 0,05.

Sen tarkistamiseksi varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia U87MG-NS suoritimme Reaaliaikainen PCR tutkia ilmaus

nestiinifenotyypin

ja

GFAP.

muutoksia ilmaus

nestiinifenotyypin

, merkki hermoston kantasoluja, ja

GFAP

, merkkiaine eriytetty astrosyyttien, ovat osoitus erilaistumisen

vuonna vitro

varren kaltaisten solujen, jotka ovat peräisin glioblastoma [1]. Verrattuna käsittelemättömiin U87MG,

nestiinifenotyypin

ekspressio lisääntyi 2,68 ± 0,56 kertaa (p 0,001), kun taas

GFAP

todettiin vähentävän (0,516 ± 0,05, p 0,05). Nämä tulokset vahvistettiin immunofluoresenssivärjäyksen on U87MG ja U87MG-NS kanssa vasta-aineita CD133, GFAP, ja nestiinifenotyypin (katso Täydentävät tiedot).

Sitten tutki KCa3.1 kanavaekspression U87MG-NS. Ilmaus

KCa3.1

mRNA oli 2,02 ± 0,10 kertaa suurempi kuin käsittelemättömissä soluissa (p 0,001). Myös määrä KCa3.1 proteiinia havaittiin U87MG-NS on suurempi kuin U87MG (OD suhde on 1,8), kun odotetaan korkeita mRNA (kuvio 2E). Elektrofysiologisiin analyysi suoritettiin CD133

+ soluja, jotka ovat peräisin U87MG-NS osoitti myös korkeampi aktiivisuus kanavien näissä soluissa. Tarkemmin, suoritimme patch-clamp mittaukset joko CD133 negatiivisia tai positiivisia soluja, värjäyksen jälkeen anti-CD133-vasta-aineita immunofluoresenssilla (kuvio 2F). Kuten kuviossa 2G, sekä soluilla KCa3.1 virtauksia, kuten arvioitiin soveltamalla protokollaa koko solun konfiguraatiota. Erityisesti CD133

+ solujen havaittiin ilmentävän huomattavasti korkeampi KCa3.1 virrantiheys (21,3 ± 3,7 pA /pF, n = 7, vs. 8,1 ± 3,5 pA /pF, n = 5, vastaavasti; p 0.05).

osajoukon CD133

+ U87MG Solut Nopea Korkeammalla

KCa3.1

mRNA

Koska merkittävä painopiste tutkimuksemme on

KCa3.1

kanavaekspression aivokasvain solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia, me sitten ohjataan tutkimuksemme kohti CD133

+ osapopulaatioiden fraktioitu U87MG-NS. Käyttämällä solulajittelussa olemme saaneet solufraktiois- jopa 32% of CD133

+ soluja (kuvio 3) ja jonka taso

CD133

selostukset yli 11 kertaa suurempi (11,63 ± 3,23, p 0,001 ).

KCa3.1

mRNA tasolla CD133 fraktiolla, myös analysoitiin Reaaliaikainen PCR, oli noin 4 kertaa suurempi (3,99 ± 0,195, p 0,05) kuin CD133-köyhdytettyä subsets.

sy- tofluorimetrisillä analyysi pakatun U87MG-NS tehtiin värjäämällä solut PE-konjugoidulla anti-CD133-vasta raportoitu Materiaali ja menetelmät osassa. Prosenttiosuus CD133

+ soluja ennen (vasen paneeli) ja sen jälkeen lajittelun menettely (oikea paneeli) näkyvät punaisena. Kymmenentuhatta tapahtumia hankittiin ja analysoitiin FACS DiVa ohjelmistoa.

Euroopan KCa3.1 Specific Inhibitor TRAM-34 Vähentää motiliteettia U87 MG-NS

Olemme aiemmin osoittaneet, että modulaatio of ionivirroista kalvosuodattimilla kanavia on välttämätöntä stimulaatio glioblastoomasolulinjan liikkuvuuteen. Koska TRAM-34 estää selektiivisesti ioni nykyinen kautta KCa3.1 kanavien testasimme hypoteesia, että haittaavaa ioni ajantasalla TRAM-34 olisi vaikutusta

in vitro

motiliteettia U87MG-NS (arvioitiin fibronectin- päällystetyn siirtokuoppaan määritykset). Kuten kuvassa 4A huomasimme, että TRAM-34 pitoisuus 1 ja 3 uM inhiboi liikkuvuus mukaan 49,5% ± 21,52 (n = 10, p 0,001), ja 65,4% ± 27.46, (n = 10, p 0,001 ), vastaavasti.

(A) kvantitatiivinen analyysi soluinvaasion fibronektiinin kanssa päällystetty Boyden kammion määritys on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Eri pitoisuuksia TRAM-34 (1 ja 3 uM) esti solun motiliteettia annoksesta riippuvalla tavalla. Inhibitio oli tilastollisesti merkitsevä verrattuna käsittelemättömiin soluihin (*** p 0,001). Tangot ovat keskiarvo ± SD. (B, C, D) edustaja mikroskooppiset aloilla U87MG-NS glioblastoma kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka ovat siirtyneet 48 h-8 mm: n huokoskoon suodattimen puuttuessa (B) ja kun läsnä on 1 uM (C) ja 3 uM (D) TRAM-34.

KCa3.1 Kanavat ovat lainkaan Adults Healthy Brain ja Cerebellum, mutta erittäin ilmoitettuna glioblastoma Kasvain Näytteet ja Johdetut Ensisijainen Solulinjat

Määritä ovatko havainnot voivat olla tärkeitä tutkimuksen aivokasvainten, laajensimme tutkimuksensa KCa3.1 kanavaekspression normaalia ihmisen astrosyytit (NHA), parafiiniin upotetut leikkeet ihmisen gliatuumorit, ja kolme ihmisen ensisijainen glioblastoomasolulinjoissa (CRL8 , FCN9 ja MZC12). Tasot KCa3.1 ilmaisun suuresti erosivat keskuudessa tutkittu näytteitä. Keskimääräinen kertainen muutos suhteessa NHA oli 318,9 ± 21,13 varten CRL8, 176 ± 34,64 (FCN9) ja 57,6 ± 2,4 (MZC12) (p 0,001) kolme ensisijaista solulinjoissa (kuvio 5A). Immunohistokemiallinen värjäys osoitti, että KCa3.1 kanavat olivat poissa normaalin valkean aineen aivojen, paitsi endoteelisolujen verisuonten (kuvio 5B), kun taas ne olivat erittäin ilmaistuna kohdissa kolmesta eri kasvaimia (kuvio 5C, D, E). Arvosana I astrosytooma on kuvassa 5F kanssa KCa3.1 positiivista värjäytymistä rajoittuu alueille rikastettu uusia verisuonia. Kuviossa 5G kudosleikettä normaalin keuhkokudoksen esitetään positiivisena kontrollina.

(A) Reaaliaikainen PCR on kolme ensisijaista ihmisen solulinjoja glioblastoomien (CRL8, kaista 1; FCN9, kaista 2; MZC12, kaista 3) osoittivat, että KCa3.1 selostukset ilmaisu on suurempi kuin NHA (kaista 4). (B-G): n immunohistokemiallinen värjäys ihmisen normaaleista aivokudoksen paljasti KCa3.1 proteiinin läsnä vain endoteelisoluissa verisuonten (B), kun havaitsimme diffuusia värjäytymistä korkealaatuista kasvaimet (CRL8, C, FCN9, D, MZC12, E ) ja KCa3.1 signaali ainoastaan ​​neovaskularisaatiolla alue (glio huono laatu, F). Positiivisena kontrollina käytettiin fysiologisia keuhkokudoksessa (G). (H) Tyypillinen ajankulku nykyisen kirjattiin -40 mV peräisin FCN9 solusta käyttämällä toistuvia (joka 5s) jännite luiskat -100-100 mV. 3 mM TEA ja 1 mM octanole lisättiin estää BK ja aukon junctional kanava, vastaavasti, yleensä koekspressoitiin KCa3.1 kanavat glioblastoomasoluissa (21; 22). DC-EBIO (100 uM) + ionomysiinillä (0,5 uM) ja DC-EBIO + ioni +3 uM TRAM-34 levitettiin peräkkäin tarkistaa funktionaalisen ekspression KCa3.1 virtojen (vrt teksti). (I) edustavia I-V suhteet, kun läsnä on DC-EBIO + ionomysiinin, ja DC-EBIO + ionomysiinillä + TRAM-34. Data paneelissa (H) ja (I) ovat samassa kokeessa.

Inset

: I-V suhde KCa3.1 nykyisen saadaan vähentämällä nykyisestä rampit tallennettu DC-EBIO + ioni + TRAM-34, joka on tallennettu DC-EBIO + ioni. (L) Plot raportoida KCa3.1 virrantiheys 0 mV (arvioituna paneelissa I) mitataan kolme ensisijaista glioblastoomasolulinjoissa. Koska useissa soluissa jänniteherkkiin K nykyisen aktivoiva kalvo mahdollisuuksia suurempi kuin -20 mV oli läsnä näissä tapauksissa mittaukset KCa3.1 virrantiheys tehtiin -40 mV, ja arvioitiin virrantiheyden sitten ekstrapoloitu 0 MV olettamalla lineaarinen virta-jännite suhde. * ANOVA testi, p 0,05.

Functional Studies in Primary glioblastoomasolulinjoissa

funktionaalisen ekspression KCa3.1 kanavien kolme ensisijaista glioblastoomasolulinjoissa todennettiin patch- puristin mittaukset koko solun rei’itetty kokoonpano (kuvio 5H, I, L). Kaikissa soluissa testataan (CRL8, n = 8; FCN9, n = 5, ja MZC12, n = 4) KCa3.1 nykyisen tunnistettiin ulospäin nykyisen aktivoidaan solunulkoisen perfuusio DC-EBIO + ionomysiinin, ja inhiboi KCa3.1 kanava-selektiivinen TRAM-34 (3 uM) (kuvio 5H, I). Kuvio 5L, joka esittää keskimääräisen KCa3.1 virrantiheys arvioidaan kolmen solulinjoissa, osoittaa, että CRL8 solulinja on merkittävästi suurempi tiheys kuin FCN9 ja MZC12 solulinjat. Huomaa, että toisin kuin stabiileja solulinjoja, primaarisissa soluissa KCa3.1 virtaukset rakentaa tontille on otettu -40 mV sijasta 0 mV koska tässä enemmän depolaroiduissa jännitteen merkittävä jänniteherkkiin DRK virta oli joskus esittää joka järkevästi esti jonka KCa3.1 aktivoimalla ratkaisun DC-EBIO + ionomysiinillä. Siksi mahdollistaa suoran vertailun kanssa KCa3.1 virrantiheyksiä arvioidaan glioblastoomasolulinjoissa, data kuvassa 5L ovat osoitteessa 0 mV. Tiedot saatiin lineaarinen sovitus ekstrapoloimalla IV suhde -100 /-40 jännitealueella.

motiliteettia Stem kaltaisten solualapopulaatioiden johdetut solulinjat esti voimakkaasti raitiovaunulla-34

Viime selvitimme

KCa3.1

mRNA ilmaisun ja siirtyminen kyky alle TRAM-34 hoidon ensisijainen solulinja (FCN9) ja sen klonaalisesti johdetut alakulttuuri, jossa varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia (2B5) [ ,,,0],20].

KCa3.1

mRNA transkriptio ja proteiinin ilmentyminen havaittiin tehostettava 2B5-soluissa verrattuna FCN9 (1,5 kertaa ± 0,2, p 0,05 mRNA, ja katso kuva 6B immunoblottauksella). Merkittävä ero näiden kahden solulinjojen havaittiin myös virtaussytometrialla (keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus on 1061,97 ja 1716,37 varten KCa3.1 löytyi FCN9 ja 2B5, vastaavasti). Niiden positiivisten solujen olivat myös erilaiset kahden solulinjoista (51.86% vuonna FCN9 ja 70,68% vuonna 2B5). Edelleen, histogrammin muoto (eli päällekkäisten bimodaalinen Gaussin käyrän 2B5 verrattuna Gaussin käyrä FCN9) paljastaa läsnäolo 2B5 solujen alapopulaatio ilmentävät korkeita KCa3.1, joka puuttuu FCN9 (kuvio 6A). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että varsi-like 2B5 johdettu klooni ekspressoi suurempi KCa3.1 tasolla kuin vanhempien FCN9 soluja.

(A) sy- tofluorimetrisillä analyysi KCa3.1 on FCN9 (ylempi paneeli) ja on johdettu 2B5 klooni (alempi paneeli). Solut värjättiin anti-KCa3.1 seurasi AlexaFluor488-konjugoitua vuohen anti-kani. Kymmenentuhatta tapahtumaa tallennettiin ja analysoitiin Cyflogic ohjelmisto. Harmaa histogrammit: cellular autofluoresenssia; vihreä histogrammi anti KCa3.1; musta histogrammi: AlexaFluor488 konjugoitu vuohen-anti Rabbit. (B) immunoblottianalyysi FCN9 ja 2B5 osoittautui paremmaksi ilmaus KCa3.1 kanavien kloonaamalla peräisin alakulttuurissa jossa varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia (2B5). (C) kvantitatiivinen analyysi soluinvaasiota suoritetaan fibronektiinin kuorrutettu Boyden chamber, käyttäen 3 uM TRAM-34. Tulokset, jota edustaa prosentteina motiliteetin inhibitio verrattuna käsittelemättömiin soluihin, olivat tilastollisesti merkitseviä (*** p 0,001). Tangot ovat keskiarvo ± SD.

Merkittävä väheneminen motiliteetin indusoitui 3 uM TRAM-34 molemmissa solulinjoissa. Väheneminen havaittiin 2B5-soluissa (75%) oli kuitenkin paljon suurempi kuin FCN9 soluissa (32%; kuvio 6C).

Keskustelu

Yhdessä useimpien kiinteiden kasvainten, joka koostuu erilaisista syöpäsolujen sekä vasculatures, peruskudoselementeistä ja tulehdussolujen [21], GBM näyttää merkittävä kasvaimensisäisenä heterogeenisyys ja solujen hierarkia. Lisääntyvä todistusaineisto tukee myös ajatus, että alapopulaatio syöpäsolujen kasvain massa on paremmat mahdollisuudet syövän aloittamista ja kannan uudelleen [22] – [27]. Näitä soluja kutsutaan Cancer Stem Cells (CSCS) tai kasvain-aloitus Cells niillä on useita samoja kriittisiä ominaisuuksia tyypillisiä kantasolujen, mukaan lukien kyky itseuudistumisen, monilinjainen erilaistumista ja ylläpitää lisääntymistä [28] – [31] . Uusimpien kirjallisuuden gliooma kantasolut edistävät myös radioresistance, kasvaimen angiogeneesi [32], [33] ja aja etäpesäke [34]. Yksi suuri ongelma GBM-solujen on niiden erittäin infiltratiivinen luonne. Tämän seurauksena, aggressiivinen hyökkäys GBM syöpäsolujen normaaliin aivokudokseen ja selkäytimen estää usein täydellinen poistaminen kasvainsolujen [35]. Muuttoliike alkaa, kun solu reagoi ulkoisen signaalin, joka johtaa polarisaation ja laajentamiseen ”johtava edessä” suuntaan liikkeen [36]. Lisääntyvä todistusaineisto osoittaa, että ionikanavia ovat välttämättömiä komponentteja monimutkaisia ​​koneita vastuussa solujen vaeltamiseen. Erityisesti ionikanavia siirtolaisuus mahdollista osmoottisen virtojen ja siitä kutistuminen ja turvotusta solun kehon. Ne sijaitsevat molemmat takapuolella solun ja johtava edessä, ne uhkaavat myös invasiivisen rooli happamoitumisen ECM alueen ja edistäminen metalloproteinaasi proteolyyttinen aktiivisuus [37]. Rikkominen homeostaattisina epiteelin arkkitehtuurin yhdessä hankinta muuttavien fenotyyppi, on tärkeä tilaisuus kasvaimen etenemistä kaikkien kiinteiden kasvainten. Vielä ei ole selvää, onko se on lähinnä kantasolu komponentti kasvain, jo näyttämällä invasiivisia ominaisuuksia in vivo, joka hankkii vaeltavien fenotyyppi [34]. Limited tieto on saatavilla koskevat muuttavia ominaisuuksia gliooma kasvainsolujen in vitro suhteessa KCa3.1 kanavan aktiivisuutta. KCa3.1 kanava on pääasiassa aktiivinen takareunaan solun [38] ja helpottaa solujen turvotusta ja kutistuu kasvainsoluissa muuton aikana [37]. Lisäksi KCa3.1 kanava on ollut mukana muuttavien vastauksena tilannut CXCL12, kemokiini ligandi CXCR4 [39]. Viime aikoina olemme osoittaneet, että virrantiheys esto sekä KCa3.1 ja kloridikanavia in U87MG lähes täysin estää maahanmuuttoa proliferaatioon vaikuttamatta [40]. Ionikanavia on tutkittu kantasolut eri normaaleissa kudoksissa, kuten KCa3.1 kanavat mesenkymaaliset kantasolut, jotka ovat peräisin hiiren luuytimen [41]. Kuitenkin tieto suhteessa ionikanavia CSCS on sen sijaan hyvin rajallinen [41]. Tämä sai meidät tutkimaan läsnäolo ja toiminta KCa3.1 kanavan ihmisen glioblastooma CSCS ja miten ne liittyvät matka- fenotyyppi näissä soluissa.

Ensimmäinen, osoitamme, että KCa3.1 kanava selostukset ilmaistaan erityyppisiä viljeltyjen solujen kuten pysyvästi vakiintunut ja ensisijainen solulinjoissa. Tasot tallennettu Real Time-PCR jopa 118 kertaa suurempi U87MG, 76 kertaa GL261, ja 318,9, 176, ja 57,6 kertaa kolmen ensisijaisen solulinjoissa, verrattuna normaaliin astrosyytit. Alempi mutta yhtä merkittäviä eroja ei ole havaittu välillä CSCS ja vanhempien vastine U87MG ja ensisijaisen solulinjan FCN9. Erot fluoresenssin voimakkuus KCa3.1 kanavan -bound vasta-ainetta ja osa positiivisia soluja havaittiin myös, että ensimmäisen kerran, jonka cytofluorimetry.

normaalin aikuisen hiiren aivojen KCa3.1 nykyinen on vain on raportoitu aktivoitu mikroglia [42], aivojen hiussuonten endoteelisolujen [43], Purkinjen solujen [44], ja alapopulaatio astrosyyttien mukana neurovaskulaarisiin kytkimen [45] – [47] [8]. Yhdessä nämä tiedot viittaisivat siihen, että hiiren aivojen toiminnallisen ilmentymisen KCa3.1 kanava rajoittuu tiettyihin astrocytic solualipopulaatioissa. Niinpä me täällä kertoa, että normaalin aikuisen hiiren astrosyytit käytännössä eivät ilmaise KCa3.1 nykyinen. Tämä havainto on sopusoinnussa myös hyvin pieni osa (noin 2,5%) KCa3.1 positiivisten solujen saapuvat FACS-analyysi normaalissa astrosyytit. Tutkimme myös läsnä Ca-aktivoidun K-kanavien immunoistochemistry kudosleikkeiden sekä ihmisen normaalia ja kasvainnäytteissä. KCa3.1 kanava esitetään diffuusi ja vahva värjäytyminen vain näytteissä korkealuokkaisesta kasvaimista.

Channel ilmaisu pystyimme tarkastella kysymystä rooli KCa3.1 kanavan solun leviämiskyky by suorittamalla siirtokuoppaan motiliteetti määrityksissä läsnäollessa ja ilman erityistä estäjä kanavan. Striking eroja havaittiin siirtymä kyky alle vaikutuksesta KCa3.1 kanavan estäjä, TRAM-34. Aikaisemmassa paperi huomasimme, että 3 uM TRAM-34 inhiboi U87MG liikkuvuus mukaan 58,5% [40]. Tässä työssä osoitetaan, että saman pitoisuuden kanavan esto vähensi motiliteettia U87MG-NS, varsi kaltainen johdettu alipopulaatio U87MG, 66%.

Käyttämällä patch-clamp tekniikoita olemme pystyneet koetin nykyisen toiminnan erot CD133 positiivisia ja negatiivisia jakeet läsnä U87MG-NS väestöstä. Tämä antoi meille mahdollisuuden arvioida K nykyinen 2,6 kertaa suurempi CD133

+ näyte. Vielä silmiinpistävää oli vähentäminen 2B5 motiliteetin (-75%) vaikutuksesta TRAM-34 verrattuna väheneminen havaittiin FCN9 (-32%). Havaittu lasku liikkuvuudessa hyvin korreloi tasojen KCa3.1 kanavan ilmentymisen kahdessa solulinjassa, koska suurempi herkkyys 2B5 on TRAM-34. Löydetty korrelaatio näkyy enemmän merkitystä, kun otetaan huomioon se, että KCa3.1 kanava on vain yksi useista erityyppisistä ionikanavan edistää solujen liikkuvuuteen. Kaiken kaikkiaan tuloksemme osoittavat, että KCa3.1 kanavaekspression ja toiminta ovat voimakkaampia vähemmän eriytetty populaatiot, suosimalla vaikutusvaltaisempi rooli motiliteettia fenotyyppiin.

erittäin invasiivinen kyky in vivo on tunnusmerkki varren solut. Lisäksi se on myös oletettu, että on olemassa kahdenlaisia ​​CSCS, yksi kiinteä ja toinen liikkuva [48]. Tämä herättää kysymyksen siitä, onko ionin virtauksen vähentäminen liikennöi TRAM-34 muuttaa soluliikkuvuus suoraan tai signaali, joka vaikuttaa fenotyyppiset siirtyminen paikallaan liikkuviin kautta tuntematon sääntelyn kautta. Tämä viimeinen hypoteesi on houkutteleva ottaen huomioon äskettäin havainnot osoittavat, että estämällä solukalvon natrium- kanavan monimutkainen estää leviämisen glioomasoluihin lisäksi maahanmuuttoa, ja että tämä todennäköisesti edellyttää muutoksia geenin ilmentymisen ohjelma mekanismilla ei vielä ratkaistu [49]. Myös KCa3.1 kanavien emme voi sulkea pois linkkinä modulaatio nykyisen toiminnan ja geeniekspression uudelleenohjelmointi. Tämä kysymys on edelleen ratkaisematta.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

perustettu hiiren ja ihmisen glioblastoomasolulinjoissa, (GL261 ja U87MG) kasvatettiin vastaavasti D-MEM F -12 ja D-MEM-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, 1% L-glutamiinia, 100 IU /ml penisilliiniä, 100 IU /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FCS, Flow Laboratories) 37 ° C: ssa 5% CO

2 kostutetussa atmosfäärissä ilmassa. Hiiren ja ihmisen glioblastooma kulttuureissa GL261 ja U87MG saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rochville, MD, USA). Astrosytooman ensisijainen MZC12, CRL8 ja FCN9 (WHO luokka IV) on tehty aikaisemmassa työssä ryhmämme kasvaimen yksilöt potilaista [50]. Tiedot institutionaalisten komitean hyväksyntä ja tietoisen suostumuksen potilailta on ilmoitettu edellä viitaten.