Krooninen sairaus

tiivistelmä

maksasolusyövän (HCC) on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Kirurginen resektio ja tavanomaisen kemoterapian ja sädehoidon lopulta epäonnistua kasvaimen uusiutumisen ja HCC vastustuskykyä. Kehittää uusia hoitoja vastaan ​​HCC Näin ollen tarvitaan pikaisesti. Sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) reitit ovat tärkeitä ja vakiintuneita tavoitteita syövän hoitoon. Erityisesti CDK2 on avaintekijä säännellään solusyklin G1-S siirtyminen ja tunnusmerkki syöpiä. Tässä tutkimuksessa käytimme ilmainen ja avoimen lähdekoodin proteiini-ligandi telakointi ohjelmisto, idock, takautuvasti tunnistaa mahdolliset CDK2 estäjät peräisin 4311 FDA-hyväksyttyjä pienmolekyyleillä käyttää repurposing strategia ja kokonaisuus telakointi menetelmiä. Lajiteltu keskimääräinen idock pisteet, yhdeksän yhdisteitä ostettiin ja testattiin

in vitro

. Niistä antipsykoottiset lääke fluspirileeni, osoitti suurinta antiproliferatiivisia vaikutuksia ihmisen maksasyövän HepG2 ja Huh7 soluja. Olemme osoittaneet ensimmäisen kerran, että fluspirileeni hoito lisäsi merkittävästi solujen prosenttiosuus G1 vaiheeseen, ja vähensi ilmaisuja CDK2, sykliini E ja Rb, sekä fosforylaatiot CDK2 on Thr160 ja Rb Ser795. Tutkimme myös syövän vaikutusta fluspirileeni

in vivo

BALB /C nude-hiirissä ihon alle ksenosiirrettyjä ihmisen maksasyövän Huh7 soluja. Tuloksemme osoittivat, että suun kautta fluspirileeni hoito esti merkitsevästi kasvaimen kasvua. Fluspirileeni (15 mg /kg) osoitti vahvaa tuumorin vastaista aktiivisuutta, joka on verrattavissa johtavista syöpälääkkeen 5-fluorourasiilia (10 mg /kg). Lisäksi cocktail hoito fluspirileeni ja 5-fluorourasiilin, osoitti suurinta terapeuttinen vaikutus. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ensimmäistä kertaa, että fluspirileeni on mahdollinen CDK2-inhibiittori, ja ehdokas syövän lääkeaine ihmisen maksasyövän. Ottaen huomioon, että fluspirileeni on pitkä historia turvallisesta ihmisille meidän löytö fluspirileeni mahdollisena anti-HCC lääke voi esittää välittömästi sovellettavia kliinisessä.

Citation: Shi XN, Li H, Yao H, Liu X, Li L, Leung KS, et ai. (2015)

In Silico

tunnistaminen ja

In vitro

ja

In vivo

validointi antipsykoottisen Drug fluspirileeni mahdollisena CDK2 estäjän ja Candidate Anti-Cancer Drug. PLoS ONE 10 (7): e0132072. doi: 10,1371 /journal.pone.0132072

Editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicine University, Taiwan

vastaanotettu: 20 tammikuu 2015; Hyväksytty: 9 kesäkuu 2015; Julkaistu: 06 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Shi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Hsiang-fu Kung akateemikko työasema Kunming Medical University, National Natural Science Foundation of China (NSFC) 81272549, Key Lab hanke Shenzhen (ZDSY20130329101130496) Kiinasta, Direct Grant Kiinan University of Hong Kong, GRF Grant (Project Viitteet 414413, 772910, ja 470911) päässä Research Grants neuvosto Hong Kong.

Kilpailevat edut : kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on yleisin maksasyövän. Vain 30%: sta 40% HCC potilaat ovat oikeutettuja parantavia hoitoja, jotka sisältävät resektioleikkaukselle kuin ensimmäinen vaihtoehto, maksansiirto ja perkutaaninen ablaatio. Kuitenkin on olemassa suuri taajuus kasvaimen uusiutumisen jälkeen kirurgisen resektion, ja useimmat HCCs näyttävät resistenttejä tavanomaisille kemoterapiaa ja sädehoitoa. Siksi kehittää uusia hoitoja vastaan ​​HCC on erittäin vaativat.

syy HCC liittyy useita reittejä. Sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) väyliä tärkeinä terapeuttisina kohteina syövän hoitoon on vakiintunut. CDK ovat entsyymejä osallinen solunjakautumista, ja niiden rooli kasvaimen kasvu on pitkään tehnyt niistä houkuttelevia lääkekohteita. Mutta varhainen teollinen yrityksiä estämällä CDK palauttaa solujen kasvua normaaliksi törmännyt myrkyllisyys kysymyksiä. Ensimmäisen sukupolven CDK-inhibiittorit olivat epäspesifisiä, estämällä monet eri CDK (on yli 20, joista monet ovat osallistuneet eri elimissä), ja tuloksena tyyppi toksisuuksia ja mykistetty tehoa nähty isompien chemotherapies.

Sykliinistä riippuvaisen kinaasin 2 (CDK2) on yksi seriini /treoniini-proteiinikinaasien. Se on keskeinen rooli säätelyssä solusyklin siirtymistä G1: stä S-vaiheeseen, ja siten säätelyssä solujen lisääntymisen. Näin ollen, CDK2-inhibiittorit ovat mahdollisesti tehokkaita syöpälääkkeet. Vaikka useita CDK2-inhibiittoreita on kuvattu kirjallisuudessa [1], ja jotkut ovat tulleet kliinisen tutkimuksen vaiheessa, esim. flavopiridolin [2], roskovitiinilla [3] ja olomousiinia [4], yksikään niistä ei ole hyväksytty kliiniseen käyttöön johtuen useista syistä, kuten myrkyllisyys ja multi-kohdespesifisyyden. Lisäksi mikään raportoiduista CDK2 inhibiittorit ovat hoitoon HCC.

Tässä tutkimuksessa käytimme ilmainen ja avoimen lähdekoodin proteiini-ligandi telakointi ohjelmisto idock [5, 6] näytön FDA-hyväksytty pieni molekyyli huumeita vastaan ​​CDK2, jolloin vältetään myrkyllisyys ongelma. Hyväksyimme

in silico

lähestymistapaan rakenne-pohjainen virtuaaliseulonnan ja kokonaisuus laiteliitännälle repurpose hyväksyttyjä lääkkeitä syöpien hoitoon, joihin liittyy CDK2 asetusta, joiden pääpaino ihmisten maksasolusyövän (HCC). Testasimme yhdeksän laskennallisesti suosi yhdisteitä

in vitro

HCC solulinjoissa HepG2 ja Huh7, ja onnistuneesti tunnistanut antipsykoottiset lääke fluspirileeni mahdollisena CDK2-estäjä. Suoritimme sitten

in vivo

kokeita nude-hiirissä ksenosiirrettyjä kanssa Huh7 soluihin, ja osoitti, että fluspirileeni osoitti vahvaa antituumorivaikutuksen verrattavissa johtavista syöpälääkkeen 5-fluorourasiili, lisäksi perustamisesta fluspirileeni ehdokkaaksi anti- syöpälääkkeen. Osoitimme myös, että cocktail hoito sekä fluspirileeni ja 5-fluorourasiilin voisi tuottaa synergistisen terapeuttisen vaikutuksen. Lopuksi analysoidaan ennustettu sitova konformaatioon fluspirileeni ja paljasti kriittinen molekyylien väliset vuorovaikutukset, jotka mahdollisesti säätelevät fluspirileeni sitoutumisen CDK2.

Menetelmät ja materiaalit

Ethics selvitys

Tutkimus oli hyväksymä koe eettinen komitea Kunming Medical University.

Ensemble telakointi ja yhdisteen valinnan

on peräti 346 ratkaistu röntgensädekristailografjarakenteen rakenteet CDK2 ATE (Protein Data Bank ) [7, 8] kanssa UniProt ID P24941 (S1 taulukko). Niistä keräsimme 44 kiderakenteet CDK2 monimutkainen sitoutuneen ligandin (taulukko 1; S1 Kuva). Nämä 44 ​​rakenteet valittiin, koska ne eivät sisällä metalli-ioneja, jotka voivat vaikuttaa telakointi tarkkuuteen idock [6], ja myös koska ne sisältävät sitoutuneen ligandin, jonka koordinoida auttaa määrittämään haun tilan helposti. Aiemmin kirjoitettu käsikirjoitus [6] käytettiin uudelleen automaattisesti määrittelemään telakka hakua tilaa etsimällä pienin kuutiometriä laatikko, joka kattaa koko yhteistyön kiteytyi ligandia ja sen jälkeen laajennetaan laatikkoon 10a kaikissa kolmessa ulottuvuudessa. 44 CDK2 rakenteet manuaalisesti poimittu niiden vastaavia komplekseja yhteistyössä kiteytyi ligandit ja vedet poistetaan, ja sitten muunnetaan ATE muodossa PDBQT muotoon käyttäen prepare_receptor4.py käsikirjoitus AutoDockTools [9].

testaamiseksi telakoinnin yhteydessä tarkkuutta idock, co-kiteytyi ligandit myös manuaalisesti erotettu niiden vastaavat kompleksit ja muunnetaan ATE muodossa PDBQT muotoon käyttäen prepare_ligand4.py käsikirjoitus AutoDockTools [9]. Nämä ligandit Sitten telakoituna takaisin niiden vastaavat CDK2 rakenne, ja niiden tehollisarvo poikkeama (RMSD) Yhteisrahoitettavasta kiteytyi konformaation laskettiin.

rakenteet FDA-hyväksyttyjä lääkkeitä saatiin dbap ja FDA luettelot sinkistä tietokannan [10, 11], jossa dbap luettelo käsittää hyväksyttyjä lääkkeitä kerätään drugbank tietokannasta [12] ja fDA luettelo käsittää hyväksyttyjä lääkkeitä avulla kerättyä DSSTox (Distributed Structure-hakukelpoinen myrkyllisyys) projekti. Dbap luettelo versio 19.3.2014, jossa 1738 yhdisteiden ja FDA luettelo version 2012-07-25 kanssa 3176 yhdisteiden ladattu. Näistä 4914 yhdisteistä, 4311 olivat ainutlaatuisia kannalta ZINC ID. Nämä 4914 yhdisteet Mol2 muodossa sitten muunnettiin PDBQT muotoon käyttäen prepare_ligand4.py käsikirjoitus AutoDockTools [9].

vapaan ja avoimen lähdekoodin telakointi ohjelmisto idock v2.1.2 [6] Sen jälkeen toteutettiin ennustaa sitova konformaatioita ja sitoutumisaffiniteetit 4914 yhdisteiden telakoituna vastaan ​​44 CDK2 rakenteiden avulla kokonaisuus telakka strategia [13-15]. Kunkin proteiinin rakenne, vapaa energia Ruutukartat hieno rakeisuus 0,08 Å rakennettiin rinnakkain, ja kutakin yhdistettä, 256 Monte Carlo konformationaalisia optimointitehtäviin ajettiin rinnakkain useille ydintä.

Kun telakointi, iDock ulos enimmäismäärä yhdeksän ennustettu konformaatioita kunkin tulon yhdisteen. Siirtyy liitetty konformaatio paras idock pisteet valittiin, koska se oli aikaisemmin osoitettu olevan todennäköisin yksi lähimpänä Crystal konformaation kanssa telakoinnin yhteydessä onnistumisprosentti on yli 50% kolmessa eri vertailuarvoja [6]. 4914 yhdisteet lajitellaan nousevaan järjestykseen niiden ennustetun sitoutumisen vapaa energia keskimäärin yli 44 CDK2 rakenteita, ja top-pisteytys niistä tutkittiin visuaalisesti käyttäen iView [16] yhteydessä CDK2 käyttäen X-ray kiderakenne korkeimman resoluution eli ATE tunnus 1GZ8 tässä tapauksessa (taulukko 1). Seuraavaksi kaupallisesti saatavilla olevista yhdisteistä tiedusteltiin ja osti kautta Chemical Book verkkosivuilla https://www.chemicalbook.com/ja vahvistettu

in vitro

ja

in vivo

.

Chemicals, vasta-aineet, solulinjoja ja soluviljelmä

valittu kemikaalit ja johtava syöpälääkkeen 5-fluorourasiilin ostettiin Sigma-Aldrich, USA. Anti-sykliini D, B1, E, CDK2, Rb, pho-CDK2 (Thr160), pho-Rb (Ser795) ja GAPDH saatiin Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Massachusetts, USA.

hepatoomasolulinja linjat HepG2 ja Huh7 saatiin American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Nämä solulinjat viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen, Rockville, Maryland, USA) 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja 95% kostutettua ilmaa.

Solut maljattiin 96-, 24- tai 6-kuoppaisille levyille 0,125% FBS: ia 24 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten 10% FBS: ia, joka sisältää testaukseen yhdisteitä eri konsentraatioissa 1, 3, 10, 30

μ

M, ja inkuboidaan 24, 48, tai 72 tuntia.

MTT-määritystä

solut maljattiin alkutiheydellä 9 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 0,5 mg /ml 3- (4,5-metyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli-tetratsoliumbromidia 4 tuntia. Sitten väliaine heitettiin pois, ja 200

μ

l formatsaaniksi dimetyylisulfoksidia (DMSO) lisättiin. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm standardin protokollan. IC

50-arvot laskettiin GraphPad Prism 5.

Solusyklianalyysiä

HepG2 tai Huh7 soluja (4 x 10

4) ympättiin 24-kuoppalevyille RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi 0,125% FBS: ää, ja viljeltiin 24 tunnin ajan. Soluja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja eri annoksia fluspirileeni (1, 3, 10, 30

μ

M) 12, 24, 36 tuntia 37 ° C: ssa, sitten kiinteä jääkylmään 70% etanolia ja värjättiin Coulter DNA-Prep Reagenssit kit (Beckman Coulter, Fullerton, Kalifornia, USA). Cellular DNA-pitoisuus 1 x 10

4 solut kustakin näytteestä määritettiin käyttämällä EPICS ALTRA virtaussytometrillä (Beckman Coulter). Solusyklin vaihe jakelu analysoitiin ModFit LT 2.0 -ohjelman (Verity Software House, Topsham, Maine, USA). Kaikki tulokset saatiin kahdesta erillisestä kokeesta, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Cell apoptoosin analyysi

HepG2 ja Huh7-soluja maljattiin 24-kuoppaisille levyille 0,125% FBS: ia 24 tuntia ja sitten 10% FBS: ia, joka sisälsi fluspirileeni pitoisuuksina 3, 10 ja 30

μ

M. Noudattamalla valmistajan ohjeita määrällisesti apoptoottisten solujen esiintyminen apoptoosi määritettiin värjäämällä solut sekä anneksiini V ja propidiumjodidi (PI) (Life Technologies). Lyhyesti, solut trypsinoitiin 0,25% trypsiiniä puuttuessa etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA). Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 500

μ

l: aan sitoutumispuskuria, jonka pitoisuus on 2 x 10

5-10

6 solua /ml. Kaksi mikrolitraa anneksiini V-EGFP ja 5

μ

l PI lisättiin suspensioon, minkä jälkeen 5-15 minuutin inkubaation pimeässä. Sitten solut analysoitiin käyttäen virtaussytometriaa (CyFlow Space /Partec, Saksa).

Western blotting

HepG2 ja Huh7-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille 0,125% FBS: ia 24 tuntia ja sitten 10% FBS: ia, joka sisälsi fluspirileeni pitoisuus 3, 10, 30

μ

M. Solut kerättiin sen jälkeen, kun 6 tunnin inkubaation jälkeen. Solut lyysattiin RIPA-puskurilla, joka sisälsi 1 mM PMSF: ää ja proteaasi-inhibiittoriseosta 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Kun oli sentrifugoitu 13000 rpm: llä 15 minuutin ajan, supernatantit otettiin talteen ja proteiinipitoisuus mitattiin BCA Protein Assay Kit (Thermo). Yhtä suuret määrät solulysaateista erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Sigma). Blokkauksen jälkeen membraaneja inkuboitiin peräkkäin sopivalla laimealla ensisijainen ja toissijainen vasta-aineita. Proteiinit detektoitiin tehostetun kemiluminesenssin tunnistusjärjestelmä (Amersham, Piscataway, New Jersey, USA). Tasapuolisen lastaus näytteistä, kalvot uudelleen koetettiin anti-GAPDH-ainetta (Cell Signalling Technologies).

fluspirileeni käsittely

in vivo

BALB /C nude-hiirten, 4-5 viikkoa vanhoja Vital River Laboratory Technology Co Ltd, Peking, Kiina, pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa. Sillä ksenosiirrettyjä kasvaimen kasvua määrityksessä, 1 x 10

6 /0,2 ml PBS Huh7 solua injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen hiirten. Kasvaimen koko mitattiin päivittäin. Kolme viikkoa ymppäyksen jälkeen, kun kasvaimet kasvoivat tilavuuteen 80-100 m

3, hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmiin, 5 hiirtä ryhmää kohti, ja syötetään letkulla suun kautta 0,5% CMC: tä NaCl fluspirileeni (15 mg /kg) ja injektoimalla vatsaonteloon 5-fluorourasiilia (10 mg /kg) päivässä 21 päivää. Karsinooma tilavuudet mitattiin joka 3-4 päivää sen jälkeen, kun kasvain ulkonäkö. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla

V

=

ab

2/2, jossa

on pisin akseli ja

b

on lyhin akseli. Sitten hiiret tapettiin taittamalla niiltä niskat.

Tilastollinen analyysi

tulokset saatiin ainakin kolmessa eri kokeissa ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tilastollinen analyysi suoritettiin Studentin t-testiä ja erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä, jos p 0,05. Tilastollisesti merkittäviä tuloksia on merkitty symbolilla * kuvioissa.

Tulokset

Telakointi tulokset

44 CDK2 komplekseja, co-kiteytyi ligandit ankkuroitu vastaan ​​vastaavien CDK2 rakenne onko idock voisi ennustaa sitovia aiheuttaa niin konformationaalisesti lähelle yhteistyössä kiteytyi aiheuttaa kuin mahdollista. Tällaiset telakoinnin yhteydessä tarkkuus kvantifioitiin neliöllisen keskiarvon poikkeama (RMSD) ennustetun aiheuttaa Yhteisrahoitettavasta kiteytyi aiheuttaa. Kunkin 44 komplekseja, idock ennustettu yhdeksän aiheuttaa siten yhdeksän RMSD arvoja. RMSD arvot yhdeksän aiheuttaa, että 44 telakoinnin yhteydessä tutkimukset ovat S2 taulukossa.

Kuvio 1 esittää graafisesti jakauma RMSD arvot ensimmäisen asennon (merkitty aiheuttaa 1), joka oli ennustettu on pienin vapaan energian yhdeksästä aiheuttaa, samoin kuin jakelu RMSD arvojen aiheuttaa, että sillä on vähintään RMSD yhdeksästä aiheuttaa (merkitty aiheuttaa m). Yksityiskohtainen selitys ja syyt valintaan näiden kahdenlaisia ​​aiheuttaa löytyy [6]. Semanttisesti, The RMSD arvo aiheuttaa 1 (merkitty RMSD1) ja RMSD arvo aiheuttaa m (merkitty RMSDm) kuvastavat telakoinnin yhteydessä tarkkuutta, jos vain ylin ja top yhdeksän ennustetut aiheuttaa pidetään vastaavasti. Määritelmän mukaan RMSDm ≤ RMSD1 on aina taattu. Niistä 44 telakoinnin yhteydessä tutkimuksissa 10 tutkimuksissa tuotettu RMSD1 2A ja 28 kokeissa tuottanut RMSDm 2A. Nämä telakoinnin yhteydessä tulokset heijastavat jossain määrin, onko asianmukaista käyttää idock telakka yhdisteitä vastaan ​​CDK2 rakenteita.

RMSD jakaumat aiheuttaa 1 ja aiheuttavat m näkyvät musta ja punainen, vastaavasti. 10 ja 28 kohdat ovat alle perusviivasta RMSD = 2a aiheuttaa 1 ja aiheuttaa m, vastaavasti.

Ensemble telakointi tuloksia ja valinta ehdokas estäjien

Totally 4914 FDA-hyväksyttyjä lääkkeitä telakoitiin ja paremmuusjärjestykseen keskimääräinen ennustettu sitoutumisaffiniteetti 44 eri röntgen- kiderakenteet CDK2. Ennakoiduista vapaa energia-arvot annetaan S3 taulukossa. Telakointi ennustaminen tulokset iView visualisointi [16] ovat vapaasti saatavilla https://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock/iview/?1GZ8-dbap ja https://istar.cse.cuhk.edu.hk /idock /iView /? 1GZ8-fDA.

Kuva 2 piirtää jakauman keskimääräisen idock pisteet 4914 yhdisteiden. 15 yhdisteet oli ennustanut vapaa energia -10 kcal /mol tai alhaisempi, jossa paras ottaa -10,46 kcal /mol. Perustuen kaupallinen saatavuus, 9 top-pisteytys yhdisteitä (taulukko 2; kuvio 3, S4 taulukko) hankittiin lisätutkimuksiin.

842 ja 783 yhdisteet olivat valikoimia [-7,5, -8,0) ja [ ,,,0],-7,0, -7,5), vastaavasti, muodostavat kaksi suurinta jäteastioita. 15 ja 63 yhdisteet olivat valikoimia [-10,0, -10,5) ja [-9,5, -10.0), vastaavasti, muodostavat kaksi jäteastioita sopiva valikoima ehdokaslääkeaineita.

Tämä luku luoma RDKit (https://rdkit.org/).

fluspirileeni vähentynyt solujen elinkelpoisuuden maksasolusyövän

ensin arvioitiin syövän vaikutusta yhdeksästä yhdisteet, MTT: llä (kuvio 4). Kaikki yhdeksän yhdisteet laski solujen elinkelpoisuutta HepG2 ja Huh7 soluja, mutta oli poikkeava sytotoksisuutta eri pitoisuuksina. Niistä fluspirileeni oli alhaisin IC

50, ts 4,017

μ

M HepG2 ja 3,468

μ

M Huh7. Fluspirileeni, osoitti suurinta sytotoksisuus verrattuna kontrolliin, jossa tilastollinen merkitsevyys (p 0,05). Tällainen esto vaikutus oli annoksesta ja ajasta riippuvaa. Merkityt esto havaittiin 10

μ

M ja 30

μ

M, mutta mitään merkittävää vaikutusta ei havaittu pienempinä pitoisuuksina 3

μ

M.

(A) yhdeksän yhdisteet oli poikkeava sytotoksisuus HepG2 ja Huh7 solulinjoissa eri concentrationas, jossa fluspirileeni, joilla on korkein sytotoksisuus verrattuna kontrolliryhmään (p 0,05). (B) fluspirileeni ilmeni annoksesta ja ajasta riippuvaa estoa solujen elinkelpoisuutta HepG2 ja Huh7 solulinjat kontrolliin verrattuna (p 0,05).

fluspirileeni hoitoon pidätetty solusyklin G1 vaiheessa

Ymmärtääksemme jos fluspirileeni esti CDK2 toimintaa maksasolukarsinoomassa soluissa, olemme analysoineet vaikutuksen fluspirileeni hoidon pitoisuuksia 3, 10, 30

μ

M 6, 12, 24 tuntia solusyklin profiili HepG2 ja Huh7 solujen virtaussytometrialla (kuvio 5). Fluspirileeni hoito lisäsi merkittävästi solujen prosenttiosuus G1 vaiheessa kontrolliin verrattuna (p 0,05) annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. 30

μ

M tai 10

μ

M pitoisuus, fluspirileeni hoito jatkuvasti lisännyt prosenttiosuutta G1 vaihe 24 tuntia. Sen jälkeen kun 24 tuntia fluspirileeni hoidon lisääntyminen G1 vaiheeseen liittyi samanaikainen lasku S-vaiheessa. Sub-G1 prosentit annetaan S5 taulukossa. Edustaja histogrammit DNA sisällön annetaan S5 kuvassa.

(A) fluspirileeni käsittely ja ajasta riippuvalla prosenttiosuus kasvoi solujen G1 vaiheessa. 30

μ

M tai 10

μ

M pitoisuus, fluspirileeni hoito jatkuvasti lisännyt prosenttiosuutta G1 vaihe 24 tuntia. (B) Cell cycle jakelu 24 tunnin kuluttua fluspirileeni hoidon. Kasvu G1 faasi mukana samanaikainen lasku S-vaiheessa.

fluspirileeni indusoi apoptoosin

Huume, joka voi vain aiheuttaa solukierron pysähtymisen ei ole tarpeeksi hyvä, koska kasvaimet ovat helposti uudelleen kasvaa poistamisen jälkeen lääkkeen. Siksi myös tutki, fluspirileeni voivat aiheuttaa solujen apoptoosia (kuvio 6). Fluspirileeni hoito 30

μ

M tai 10

μ

M pitoisuus huomattavasti prosenttiosuutta apoptoosin Huh7 ja HepG2 solulinjat kontrolliin verrattuna annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (p 0,05). Hajonta tontit PI vastaan ​​anneksiini V annetaan S6 Fig.

fluspirileeni käsittely 30

μ

M tai 10

μ

M pitoisuus huomattavasti prosenttiosuutta apoptoosin Huh7 ja HepG2 solulinjat kontrolliin verrattuna annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (p 0,05).

fluspirileeni hoito vähensi ilmaisuja CDK2, Rb, sykliini E, pho-CDK2 ja pho-Rb, mutta ei sykliini D1 ja sykliini B1

Tutkimme vaikutus fluspirileeni annetun ilmaisuja kriittisten osallistuvien proteiinien G1-to-S siirtymisen HepG2 ja Huh7 solujen western blottauksella (kuvio 7) . Fluspirileeni hoito vähensi ilmaisuja CDK2, Rb, pho-CDK2, pho-Rb ja sykliini E. Sen sijaan ekspressiotasot sykliini D1 ja sykliini B1 pysyi ennallaan. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​sen kanssa, mitä odotetaan CDK2-estäjä.

fluspirileeni hoito vähensi ilmaisuja CDK2, Rb, sykliini E, pho-CDK2 ja pho-Rb, mutta ei sykliini D1 ja sykliini B1.

on myös havaittu, että fluspirileeni hoito aikuinen laski ilmaisun sijaan fosforylaatiota CDK2. Ehdotamme, että nämä erot ovat kohtuullisia siinä mielessä, että kun sitova, CDK2-fluspirileeni kompleksit voivat suoraan hajota, siis johtanut korkeampiin vähentämiseen CDK2 ilmaisun kuin fosforylaatioon. Lisäksi fluspirileeni voi sitoutua CDK2 korkealla affiniteetilla, mutta kun CDK2 fosforyloituu, sitoutuminen fluspirileeni saattaa olla alentunut ja sitoutumisaffiniteettia voidaan näin heikentynyt.

Päivittäinen suun fluspirileeni hoito vähensi kasvainten kasvua

in vivo

arvioitiin vaikutusta fluspirileeni kasvuun maksasolusyövän

in vivo

BALB /C nude-hiiriin injektoidaan subkutaanisesti Huh7 soluissa (kuvio 8). Päivänä 21 hoidon jälkeen, fluspirileeni (15 mg /kg) johti merkittävästi vähentää kasvaimen paino ja tilavuus kontrolliin verrattuna (p 0,05), samalla kun mitään merkittävää muutosta kehon painon. Anti-kasvain aktiivisuus suun fluspirileeni (15 mg /kg) oli verrattavissa 5-fluorourasiilia (10 mg /kg). Tärkeää on, niiden yhteenlaskettu hoito, osoitti suurinta terapeuttinen vaikutus. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ensimmäistä kertaa, että fluspirileeni on mahdollinen CDK2-inhibiittori, ja ehdokas syövän lääkeaine ihmisen maksasyövän.

antituumorivaikutus suun fluspirileeni (15 mg /kg) oli verrattavissa 5-fluorourasiilia (10 mg /kg). Lisäksi niiden cocktail hoito osoitti synergistisen terapeuttisen vaikutuksen.

Rakenteelliset analyysi ennustetun sitoutumisen konformaation fluspirileeni

Kuva 9 piirtää ennustettu konformaatio fluspirileeni monimutkaisissa kanssa CDK2 (ATE ID: 1GZ8) käyttäen iView [16]. Fluspirileeni ennustettiin sitoutuvan sisällä ATP-sitova taskussa CDK2 ja vuorovaikutuksessa CDK2 pääasiassa vetysidoksia, hydrofobiset kontaktit ja kationin-

π

vuorovaikutusta. Oletettavasti, H8 atomi muodostaa vety- sidoksen selkäranka hapen Ile10, ja H32 atomi muodostaa toiset kaksi vetysidoksia selkäranka hapen Leu83 ja His84. Sivuketjut Ile10, Ala31 ja Leu134 luoda hydrofobinen tunnelin hydrofobisen hännän fluspirileeni haudata sisälle. Yksi kaksi aromaattista rengasta, joka sijaitsee hännän fluspirileeni muodostaa kationin-

π

vuorovaikutusta positiivisesti varautuneet sivuketju Lys33. Kaikki nämä otaksuttu vetysidosten, hydrofobiset kontaktit ja kationin-

π

yhteisvaikutuksia jakautuvat pään, keskimmäinen ja pyrstö fragmentteja fluspirileeni näin lujasti fluspirileeni sen ennustettu sijainti ja suunta. Vertailun vuoksi tunnettua CDK2-inhibiittori 2-amino-6- (3′-metyyli-2′-okso) butoxypurine (nimeltään MBP lyhyitä), joka on O (6) -substituoitu guaniini johdannaista, tunnetaan perustaa neljä vetyä sidoksia Lys33, Glu81 ja Leu83 (S2 Kuva).

CDK2 jäämät kääntää myös linjat värittää atomi tyyppi. Fluspirileeni on suoritettu sopimuksen tikkuja värillisiä atomilta tyyppi. Yhteisvaikutteisen atomit ja tähteet on merkitty. Syaani, vihreä ja vaaleanpunainen katkoviivat edustavat vetysidoksia, hydrofobiset kontaktit ja

π

vuorovaikutusta, vastaavasti. Tämä luku luotiin iView [16].

edelleen tarkasti ennustettu konformaatio fluspirileeni läsnäollessa CDK2 molekyylipinnalla (S3 kuvassa). Verrattuna guaniinin johdannaisen MBP (S4 kuvassa), fluspirileeni vie paljon suuremman osan sitova tasku, ja sen muoto asianmukaisesti sovitetaan vastaamaan sitovia ontelon. Tämän perusteella rakenneanalyysiin yhdessä meidän

in vitro

ja

in vivo

kokeissa päättelemme, että fluspirileeni voi fyysisesti sitoutua CDK2.

Keskustelu

solusyklin etenemistä verrattuna ja tiukasti käsitelty vuorovaikutusta CDK ja sykliinien [17]. Erilaiset sykliini-CDK-komplekseja aktivoituvat eri vaiheissa solusyklin. Kun solusyklin menee läpi G1 S-vaiheeseen, sykliini D1-CDK4 /6 ja sykliini E-CDK2: n kompleksit ordinaalisesti aktivoidaan ja retinoblastoomaproteiiniin (pRB) on hyper-fosforyloitiin seriini- ja treoniinitähteitä [18]. Hyper-fosforyloitu pRB edistää vapautumista E2F transkriptiotekijöitä, jotka puolestaan ​​helpottavat transkriptio lukuisia geenejä tarvitaan G1-S siirtymävaiheen ja S-vaiheen etenemisen [19]. Vuodesta lääkkeen näkökulmasta, CDK2 on pitkään ollut klassinen ja tärkeä kohde syövän hoidossa.

Vaikka useat CDK2 estäjien syöttänyt kliinisessä tutkimuksessa vaiheet, mitään ei ole virallisesti hyväksytty kliiniseen käyttöön, luultavasti niiden myrkyllisyyden vuoksi ja multi-kohdespesifisyyden. Koska este, joka kehittää uuden lääkkeen

de novo

on työläs ja kallis ponnistus, repurposing myrkyllisyys vapaa vanhoja lääkkeitä uusia käyttötapoja on suotuisa strategia.

Tehokas synergia

in silico

menetelmiä huumeiden repurposing rakenteen ja perustuvat virtuaaliseulonnan (SBVS) korostettiin useissa viimeaikaisissa julkaisuissa [20]. Muutamia onnistuneita repurposing tapauksissa SBVS, [21] uudestaan ​​2,4-dikloorifenoksi etikkahappoa, tunnettu kasvi auxin, uutena tulehduslääke kautta

in silico

molekyylimallinnuksen ja telakoinnin tutkimukset yhdessä lääkeainekoostumukseen ja

in vivo

tulehdusta tarkastus; [22] yrittivät repurpose FDA-hyväksyttyjä lääkkeitä yhtenäistettyä SBVS lähestymistapaa ja raportoivat löytö piperasilliinin 1 estäjänä NEDD8 aktivoivaan entsyymiin (NAE) soluttomissa ja solu-pohjaiset järjestelmät, joilla on korkea selektiivisyys.

lisäksi SBVS, ligandi-pohjainen virtuaaliseulonnan (LBVS) toteaa myös sen onnistunut sovelluksia repurposing. [23] käytetään Ultrafast Shape Recognition (USR) [24] etsiä yhdisteitä, joilla on samanlainen muoto on aiemmin raportoitu inhibiittorin proteiinin arginiinideiminaasin tyypin 4 (PAD4), uusi terapeuttinen kohde hoidettaessa nivelreumaa, ja tunnistaneet uuden yhdiste, joka on silmiinpistävän erilainen rakenne mallin estäjän vielä osoitti merkitsevän eston entsymaattiseen aktiivisuuteen PAD4.

rohkaisemana nämä menestystarinoita, tässä tutkimuksessa olemme ottaneet repurposing strategian, ja hyödynnetään laskennalliset menetelmät SBVS proteiiniin ligandi telakointi jatkoon ehdokkaita FDA-hyväksyttyjä pienmolekyyleillä. Tarkemmin, käytimme nopeasti telakointiohjelmaa idock [5, 6] yhdistettynä kätevän visualizer iView [16], jonka tehtävänä on rediscovering olemassa olevien lääkkeiden kuten CDK2 estäjiä. iDock on jännittävä kehitys ei vain koska se on voimakkaasti osoitettu [6] outperform state-of-the-art telakointi ohjelmisto AUTODOCK Vina [25] suhteen telakka nopeus vähintään 8,69 kertaa ja enintään 37,51 kertaa säilyttäen vertailukelpoinen telakoinnin yhteydessä menestys hinnat, mutta myös koska se on ilmainen ja avoimen lähdekoodin alla salliva lupa. Jälkimmäinen takaa, että käyttäjiä Sekä teollisuus että tiedeyhteisö voi vapaasti hyödyntää idock omissa hankkeisiin, jotka edellyttävät proteiini-ligandi telakointi.

käytön helpottamiseksi idock, sen tulo argumentteja ja lähdön tulokset tarkoituksella suunniteltu vastaavia kuin AUTODOCK Vina, siksi nykyiset käyttäjät voivat helposti kauttakulkunsa iDock ja hyötyä huomattavan pyörimisnopeuden in SBVS suorituskykyä. Lisäksi edistää mahdollisille SBVS jonka idock, web-palvelin nimeltään ISTAR [6] on kehitetty ja valmistettu vapaasti saatavilla https://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock, jossa on peräti yli 23 miljoonaa Ostettavia pienimolekyylisiä yhdisteitä valmis telakka vastaan ​​proteiinin toimittamista käyttäjälle. Koska 1. toukokuuta 2015 on ollut yli 1000 telakat työpaikka huomautuksia käyttäjien 98 maasta. Molemmat idock [5] ja ISTAR [6] toivottavasti täydentää pyrkimyksiä lääkkeiden kemistit lääkekehityksen tutkimukseen. Lisäksi tutkimusta varten jotkut yliopistot myös käyttää idock opetuksen tarkoitukseen heidän bioinformatiikan kursseja.

Mitä rakenteelliset tiedot käytössä, että tähän mennessä peräti 346 ratkaistu röntgen kiderakenteet CDK2 kanssa UniProt ID P24941 (S1 taulukko). Tilille niiden rakenteellinen vaihtelevuus ja kaivoksen tietoa useista rakenteista CDK2, valitsimme 44 holo rakenteet CDK2 sitoutuneessa tilassa ligandina monimutkaisempia toteuttaa ensemble telakointi. Lopullinen pistemäärä käytetään priorisoimaan yhdisteitä oli tarkoituksella suunniteltu keskimääräinen pistemäärä, joka yhdiste kun telakoituna 44 valitun rakenteita CDK2 kanssa yhteistyössä kiteytyi ligandi poistaa käsin ennen telakointi.