Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ennen microarray tutkimuksia tupakoitsijoista on suuri riski keuhkosyöpään ovat osoittaneet, että heterogeenisuus keuhkoputken hengitysteiden epiteelisolujen geeniekspression vaste tupakointi voi toimia varhaisdiagnostiikan biomarkkereiden keuhkosyöpään. Ensimmäisenä askeleena sovellettaessa toiminnallinen genomista analyysiä väestötutkimuksissa, olemme tutkineet suhdetta geenien ilmentymisen vaihtelua ja geneettistä vaihtelua keskeinen rakenteisen (Nrf2-välitteinen antioksidantti vaste) liittyvät tupakoinnin altistumisen ja keuhkosyövän. Arvioimme globaali geeniekspression histologisesti normaalissa hengitysteiden epiteelisolujen saatu bronkoskopia tupakoitsijoiden jotka kehittivät keuhkosyöpä (SC, n = 20), tupakoitsijoita ilman keuhkosyöpä (SNC, n = 24), ja tupakoimattomia (NS, n = 8) . Functional rikastamiseen analyysi osoitti, että Nrf2-välitteinen, antioksidantti vaste-elementin (ARE) -regulated geenejä, oli huomattavasti alhaisempi SC, verrattuna ekspressiotasoja SNC. Tärkeää on, huomasimme, että ilmaus MAFG (sitovan kumppanin Nrf2) korreloi ilmentymisen ARE geenien, mikä viittaa siihen, MAFG tasot voivat rajoittaa kohdegeenin induktion. Bioinformatically tunnistimme yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) in otaksuttu geenit ja testata vaikutusta geneettinen vaihtelu, me genotyyppi näiden oletettujen sääntely- SNP ja muita tag SNP valituilla Nrf2 reitin geenit. Sekvensoinnin MAFG locus tunnistimme 30 novel SNP ja kaksi liittyi joko geenin ilmentymisen tai keuhkosyövän tila tupakoitsijoiden. Tämä työ osoittaa analyysin lähestymistavan, joka yhdistää bioinformatiikan polku ja transkriptiotekijä sitoutumiskohdan analyysi genotyypin, geenien ilmentyminen ja tautistatuksen tunnistamaan SNP jotka voivat liittyä yksittäisiin eroja geenien ilmentyminen ja /tai syövän tilan tupakoitsijoilla. Nämä polymorfismit saattaa lopulta edistää keuhkosyövän riskiä kautta niiden vaikutus hengitysteiden geenien ilmentymisen vastaus tupakan savu altistumista.

Citation: Wang X, Chorley BN, Pittman GS, Kleeberger SR, Brothers J II, Liu G , et ai. (2010) geneettinen vaihtelu ja Antioksidantit Response Gene Expression keuhkoputkien Airway epiteelin Tupakoitsijat at Riskin Lung Cancer. PLoS ONE 5 (8): e11934. doi: 10,1371 /journal.pone.0011934

Editor: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-University Munich, Saksa

vastaanotettu: 23 helmikuu 2010; Hyväksytty: 06 toukokuu 2010; Julkaistu: 03 elokuu 2010

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tätä työtä rahoittivat Intramural tutkimusohjelma National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (Z01 ES100475) sekä avustuksia Avrum Spira National Institute of Health (U01ES016035, R01CA124640).

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Noin 1,3 miljardia ihmistä polttaa savukkeita maailmanlaajuisesti osaltaan lähes 5 miljoonaa estettävissä kuolemantapausta vuodessa [1]. Tupakointi on merkittävä riskitekijä keuhkosyövän, johtava syy syövän liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa, ja keuhkoahtaumatauti, neljänneksi yleisin kuolinsyy yleistä [2]. Vaikka korkea johtuvat riskit johtuvat tupakansavulle altistuminen, vain 10-15% kaikista tupakoitsijoista keuhkosyövän [3], mikä viittaa siihen, geneettinen vaihtelu voi olla rooli alttiutta keuhkosyöpään. Tiedon puute geneettisen perustan keuhkosyöpään estää tarkan ennusteen tupakoitsijoita on suurin riski. Kuitenkin nopea kehitys korkean suoritustehon genomiikka tekniikoita, varsinkin geeniekspressioprofilointi ja yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) genotyypityksen, lupaavia kuvaavat riskin. Ymmärtäminen geneettinen vaihtelu vaikuttaa tupakoinnin aiheuttamien geenin ilmentyminen keuhkoissa ja hengitysteiden voisi paljastaa herkkyystekijöitä.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tupakansavun altistuminen luo ”alan vamma” hengitysteiden epiteelisoluissa (tarkistetaan [4 ]). Spira

et al

[5] ovat mitanneet koko genomin geeniekspressioprofiilien epiteelisolujärjestelmien harjausta kerätyt bronkoskopian päässä mainstem keuhkoputki terveiden tupakoitsijoiden ja tupakoimattomia ,. Tupakoinnin aiheuttamien geenin ilmentyminen havaittiin osallistuvien geenien säätelyyn oksidanttirasituksen xenobiotic aineenvaihduntaa, ja syövän synnyn, kun taas osallistuvat geenit tulehduksen ja kasvaimen tukahduttaminen polut olivat säädeltiin. Äskettäin käyttäen samanlaista lähestymistapaa, 80-geeni biomarkkereiden on kehitetty auttamaan diagnosoida yksilöiden keuhkosyöpä joukossa ryhmä tupakoitsijoita, joiden keuhkojen vuoksi epäilyn keuhkosyöpään [6], [7]. Profiilit histologisesti normaalia suurten hengitysteiden epiteelisolujen saatu bronkoskopia oli käyttää tehokkaasti varhaisdiagnostiikan keuhkosyöpä biologisten merkkiaineiden, joiden tarkkuus on 83%. Nämä havainnot paljastavat hengitysteiden geeni-ilmentymisen eroja yksilöiden vastauksena tupakointia, mutta eivät viittaa molekyylitason mekanismeja, jotka edistävät heterogeenisyys tämän geenin ilmentyminen vasteen.

Ihmisen geneettinen vaihtelu vastauksena ympäristön altistumista on yleisesti hyväksytty tärkeä tekijä alttiuden syövän [8]. Kuitenkin haastava ongelma assosiaatiotutkimuksiin tulkitsee jos tilastollista näyttöä genotyyppi-fenotyyppi /tauti korrelaatio on biologisesti uskottava. Usein suhde tietyn yhden nukleotidin polymorfismit (SNP: t) ja geenin ilmentymistä tai aktiivisuutta on ollut vaikeaa tutkia

in vivo

. Tutkitaan SNP transkriptiotekijän reittejä ja sanottuna transkriptiotekijän sitoutumiskohtia, suhteutettiin geeniekspression on lähestymistapa, joka voi tuottaa toiminnallisia tietoja [9]. Äskettäin

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT sääntelyn SNP on löydetty käyttäen alueellinen yhdistys lähestymistapa [10], [11]. Ymmärtää paremmin näiden toiminnallisten suhteita, jotka edistävät

in vivo

eroja geenien ilmentyminen ja mahdollisesti keuhkosyöpä herkkyys, olemme käyttäneet kolmiosaisen lähestymistavan testata assosiaatioita: (1) geenien ilmentyminen ja keuhkosyövän tila , (2) SNP genotyyppi ja geenien ilmentyminen, ja (3) SNP-genotyypin ja keuhkosyöpää tila.

käyttäen lähestymistapaa kuvataan Spira

et al

[7], arvioimme globaali geeniekspression in sytologisesti normaaleissa hengitysteiden epiteelisolujen saatu bronkoskopia tupakoitsijoiden kanssa epäillään keuhkosyöpä ja kontrolliryhmän tupakoimattomia. Havaitsimme, että antioksidantti vastereitissä säätelee transkriptiotekijä Nrf2 (Nukleaaritekijä Erytroidispesifiset johdettu 2-kuin 2, tai NFE2L2) poikkesi näistä ryhmistä aiheista. Olemme havainneet, että ilmaus MAFG (sitovan kumppanin Nrf2) korreloi ilmentymisen Nrf2-reitin geenejä. Käytimme bioinformatiikan tunnistamis- otaksuttu sääntelyn SNP Nrf2 sitoutumiskohtia [9], [12], [13] ja valita tag SNP Nrf2-välitteinen geenien. Lisäksi olemme sekvenoinut MAFG locus tutkimuksessamme koehenkilöillä. Geenien ilmentyminen, genotyyppi ja keuhkosyöpä tila integroitiin ja verrattiin, ja tunnistimme SNP jotka liittyivät yksilöllisiä eroja geenien ilmentyminen ja /tai syövän tilan.

Tulokset

Tupakointi, keuhkosyöpä ja keuhkoputken hengitysteiden transcriptome

Koska tavoitteena on tunnistaa mahdolliset toiminnalliset SNP ja /tai haplotyyppien hapettumisenestoaine vastauksena reitit liittyvät tupakoinnin aiheuttamien keuhkosyöpä, käytimme kolmiosaisen lähestymistavan analysoida assosiaatioita: 1) geenien ilmentyminen ja keuhkosyöpää asema; 2) geenien ilmentyminen ja genotyyppi SNP: valitaan useita bioinformatiikan strategioita, ja 3) SNP genotyyppiä ja keuhkosyöpää tila. Yleisenä työnkulku lähestymistapamme on hahmoteltu kuvassa 1.

(A) Arvioimme mikrosirujen geeniekspressioprofiilien histologisesti normaalit hengitysteiden epiteelisolujen saatu bronkoskopia tupakoitsijoiden kanssa epäillään keuhkosyöpä ja kontrolliryhmään koskaan tupakoitsijoita. (B) Havaitsimme, että antioksidantti vastereitissä säätelee transkriptiotekijä Nrf2 erosivat näistä ryhmistä aiheista. Olemme havainneet, että ilmaus MAFG (sitovan kumppanin Nrf2) korreloi ilmentymisen Nrf2-reitin geenejä. (C) bioinformatiikan strategioita käytettiin tunnistamaan otaksuttu sääntelyn SNP Nrf2 sitoutumiskohtia ja valita koodaus SNP Nrf2-välitteinen geenien. (D) MAFG lokus sekvensoitiin tutkimuksessamme koehenkilöillä. Havaitsimme SNP: t, jotka liittyvät yksilölliset erot: (E) geenien ilmentyminen ja /tai (F) syövän tilan integroimalla geeni-ilmentymisen, genotyyppi ja keuhkosyöpä tila.

keuhkoputken hengitysteiden epiteelisolujen saatiin joustavilla bronkoskopia 8 terve koskaan tupakoineet (NS) ja tupakoitsijat ilmoittautunut diagnostisen tutkimuksen kliininen epäilys keuhkosyövän lukien 20 tupakoitsijat keuhkosyöpään (SC), ja 24 tupakoitsijoita ilman keuhkosyöpä (SNC) (taulukko 1). Näiden koehenkilöiden alaryhmä kaksi suurempaa geeniekspressiota projekteja [5], [7], joille voisimme saada riittävästi genomista DNA genotyypitykseen. Expression tiedot 31 koehenkilöllä näistä hankkeista [5], [7] ja tietojen vielä 21 rekrytoitaville potilasta käytettiin. Käyttämällä Affymetrix HG-U133A mikrosirut, löysimme 11285 koetin-setit ilmentyvät mitattavia määriä (havaitseminen p-arvo = 0,05 vähintään 20% ihmisistä kummassakin SC, SNC, tai NS), joka vastasi 8159 proteiini- koodaus RefSeq geenit perustuvat Affymetrix merkintä (HG-U133A.na28.annot.csv, maaliskuu 2009).

tarkastella ero vastauksia vaikutus tupakointi keuhkoputkien hengitysteiden transcriptome, käytimme profiileja ei-tupakoitsijoiden lähtötilanteen ja verrattiin keskimääräistä log2-ilmentyminen arvoja SC tai SNC kanssa, NS t-testiä, jota seurasi useita testaus korjaus (Benjamini-Hochberg vääriä löytö korko, FDR [14]). Verrattuna koskaan tupakoineet, löysimme differentiaalikaavojen (FDR 0,1) ja 846 koetin-sarjaa (774 geenit) tupakoitsijoilla ilman syövän, ja 919 koetin-sarjaa (834 geenit) tupakoitsijoilla, joilla on syöpä. Me seuraavaksi luokiteltu tupakointi riippuva geenejä yli-ilmentynyt (kertainen muutos 1,2) ja alle ilmaisi (kertainen muutos 0,8) geenejä. Tupakoitsijoilla ilman syövän oli 210 koetin-laskee yli-ilmentynyt ja 628 koetin-sarjaa alle ilmaistuna; tupakoitsijoilla, joilla on syöpä, oli 263 koetin-laskee yli-ilmentynyt ja 644 koetin-sarjaa alle ilmaisi, verrattuna ei-tupakoitsijoita. Luettelo koetin-sarjaa, keskimäärin log

2-ilmentymisen arvoja, ja tilastolliset arvot sisältyvät tukeminen Information S1.

Functional rikastamiseen analyysi tupakointi vaikuttaa geenien ilmentyminen allekirjoituksia

tunnistaa sarjaa liittyvien geenien kanssa yhteinen biologinen funktio, analysoimme ilmaisun profiileja Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [15], kekseliäisyyttä koulutusjakson analyysi (IPA), ja Gene ontologia rikastus analyysi (GOEA). GSEA testataan onko

a priori

määritelty kanoninen reittejä rikastettiin joukossa ilmennetty eri geenien ryhmissä. Olimme erityisen kiinnostuneita erot syövän eikä syöpää ryhmiä. Olemme havainneet, että kaksi geeniä sarjaa rikastuneet SNC vastaan ​​NS kello FDR 0.1 tasolle. Ensimmäinen geeniperimä oli ”antioksidantti vaste-elementin geenit” (kuratoi ja julkaistu aiemmin [9]), jossa on normalisoitu rikastamiseen pisteet (NES) 2,04 ja FDR Q-arvo 0,021; Toisen geeniperimä oli ”aktiini Y polku” (NES = 1,87, q-arvo = 0,077). Kaksi geeniä sarjaa rikastuneet NS, mukaan lukien ”Histidiini aineenvaihdunta” (NES = 1,93, q-arvo = 0,082) ja ”RAR /RXR polku” (NES = 1,84, q-arvo = 0,093). Ei geeniperimä rikastettiin klo FDR 0,1 tai 0,25 tason SC verrattuna NS. Havaitsimme myös ei rikastetun geeni asetetaan vertaamalla SNC verrattuna SC FDR 0,1 tasolla, mutta löysimme 4-geenin sarjaa rikastettu FDR 0,25 tasolla merkittävin geeni asetettiin ”antioksidantti elementin geenit” (NES = 1,86, q- arvo = 0,120). Nämä tulokset viittaavat siihen, että joukko ”antioksidantti elementin geenit” merkittävästi rikastettu SNC mutta ei SC.

Käytimme myös IPA testata rikastetun kanoninen reittejä käyttäen luetteloita yliekspressoitujen tai under-ilmaistuna koetin -sets ja määrittämällä suhteellinen painoarvo tunnistettu reittejä eri fenotyypin ryhmiä. Jotta 210 yli-ilmentynyt koetin-sarjaa välillä SNC ja NS, kuusi reitit olivat merkittäviä (kuvio 2A), mukaan lukien ”Nrf2-välitteisen oksidatiivisen stressin vastetta”, ”hypoksia signalointi sydän- ja järjestelmä”, ”TR /RXR aktivointi”, ”aryyli hiilivety-reseptorin signalointi ”,” integriini signalointi ”, ja” eikosanoidien signalointi ”. GSEA ja IPA edustavat kahta erillistä toiminnallista rikastusmenetelmiä, jotka perustuvat riippumattomien tietokantojen ja erilaisia ​​tilastollisia testejä. Sekä tunnistettu Nrf2-reitin kaikkein rikastettua reitissä johdonmukaisella näiden menetelmien. Tärkeintä on, käyttäen IPA, yli-ilmentynyt geenien havaitsimme hyvin selvä ero merkitsevyystasolla ”Nrf2-välitteinen oksidatiivisen stressin polku” välillä SNC ja SC (kuvio 2A). Lisäksi Gene ontologia analyysi tukee myös rooli oksidatiivisen stressin geenien joukossa yliekspressoitujen geenien SNC. Oli 15 GO termejä rikastettu yli-ilmentynyt geenien FDR 0.1 tasolla SNC ja ne kaikki olivat molekyyli- toiminto ehdot antioksidantti muuniresponssigeeneinä (tukeminen Information S1); ei kuitenkaan GO termejä rikastettiin keskuudessa yliekspressoitujen geenien SC. Siten kolme bioinformatiikan analyysit tukevat rooli Nrf2 reitin geenien ryhmässä ilman syövän mutta ei keuhkosyövän ryhmä.

(A) Ingenuity Pathway Analyysi paljasti ero vaikutuksista tupakoinnin tupakoitsijoilla ilman syövän (SNC) ja tupakoitsijat syöpä (SC) suhteessa tupakoimattomien (NS). Kuusi kanoninen väyliä olivat merkittävästi rikastettu 210 yliekspressoitujen koetin-setit verrattaessa SNC NS (siniset palkit). Kolme polkuja merkittävästi rikastettu 263 yliekspressoitujen koetin-setit verrattaessa SC vs. NS (punaiset palkit). Havaitsimme hyvin selvä ero merkitsevyystasolla ”Nrf2-välitteinen oksidatiivisen stressin polku” välillä SNC ja SC. (B) mRNA-tasot on vuorovaikutuksessa, sääntelyn komponentit Nrf2-reitin näytetään boxplots. Boxplot esittää aineisto läpi viiden numeron tiivistelmät: pienin havainto, alakvartiili, mediaani, yläkvartiili, ja suurin havainto. Verrattuna NS, master säädin Nrf2 ei ilmennyt eroja SNC ja SC. Kuitenkin sitoutumiskumppani MAFG oli merkitsevästi pienempi SC, ja kilpailija NRF1 oli huomattavasti korkeampi SC. NRF3, KEAP1, ja BACH1 mRNA ei todettu merkittäviä muutoksia. (C) Havaitsimme, että 22 geenit, joiden tiedetään Nrf2 sitoutumiskohdista osoitti merkittäviä eroja ryhmien FDR 0.1 tasolla. Johdonmukaisesti, ilmentymistä näiden geenien SNC oli korkeampi kuin NS; ja useimmat näistä geeneistä ovat pienemmät ilmaisua SC kuin siinä SNC. Tämä malli on samanlainen kuin MAFG ilmentymismalli.

korrelaatio MAFG ilmentymisen kanssa antioksidantti muuniresponssigeeneinä

Functional rikastusmenetelmiä vahvasti osallisena merkitys Nrf2 reitin (määritelty sisältävien geenien antioksidantti vaste-elementit (ARE) alkupään alueilla). Tämän seurauksena, tutkimme tämän ryhmän geenien tarkemmin. Hapettavissa tai elektrofiilistä stressi, Nrf2 vapautuu sen vuorovaikutusta KEAP1 ja siirtyy tumaan, jossa se heterodimerizes pieniä MAF proteiineja, kuten MAFG, ja sitten sitoutuu ARE-sekvenssit ylävirtaan Nrf2 kohdegeenien [16]. NRF1, NRF3, ja BACH1 voivat kilpailla Nrf2 sitoutuvan MAFG at sivustoja, mahdollisesti johtaen vähentyneeseen ARE-välitteisen geeniekspression [17], [18], [19]. Kuvio 2B näyttää mRNA-tasot vuorovaikutuksessa säätelyproteiini komponenttien Nrf2 kautta. Verrattuna NS, huomasimme merkittävää eroa master säädin Nrf2 välillä joko SNC tai SC. Kuitenkin löysimme merkitsevää eroa kilpailija NRF1 ja sitova kumppani MAFG jotka ovat sopusoinnussa rooli sääntelyn loppupään kohdegeenien (kuvio 2B). NRF1 oli merkitsevästi suurempi (fold muutos = 1,23, p = 0,0115 SC vs. SNC, ja taita muutos = 1,54, p = 0,0084 SC jae NS, t-testi). Muutos NRF1 ilmentyminen tähän prosessiin tukee roolia NRF1 ehdottaman Wang

et al

[20] ja Ohtsuji

et al

[16], joka osoitti, että NRF1 sitoutuminen ARE:

in vivo

tukahdutettu ARE riippuvan geeniekspression ja moduloidaan vastaus oksidatiivista stressiä. Eli NRF1 havaittiin olevan anti-korreloi ilmentymisen Nrf2-reitin geenejä. MAFG oli alhaisempi SC verrattuna NS tai SNC (fold muutos = 0,55, p = 0,0022 SC vs. SNC, ja taita muutos = 0,60, p = 0,0076 SC vs. NS, t-testi). Mitään merkittäviä muutoksia havaittiin NRF3, KEAP1, ja BACH1 mRNA (kuvio 2B). Kuten odotettua perustuu IPA ja GSEA tuloksia, huomasimme, että 22-geenien olivat erilaiset ryhmien välillä, ja korreloivat MAFG tasoa (pienempi SC mutta korkeampi SNC, kuvio 2C). Nrf2 kohdegeenien kuviossa 2C (AKR1C1, AKR1C2, ALDH3A1, CBR1, FTH1, FTL, GCLM, GCLC, GPX2, NQO1, PIR, PRDX1, PSMA3, SAT 1, SLC7A11, SOD1, SQSTM1, TALDO1, TKT, TXN, TXNRD1, ja UGT1A6) indusoitiin keskuudessa SNC mutta olivat jatkuvasti alemmat SC potilailla. Tämä uusi havainto viittaa siihen, että alennettuja MAFG ja korkeamman NRF1 (negatiivinen säätelijä) voi olla tukahduttaa transkriptio nämä ovat geenien tupakoitsijoiden jotka jatkavat keuhkosyövän.

uudelleen tarkastellut suurempi, aiemmin julkaistu aineisto [7] ja totesi myös huomattavasti alhaisemmat MAFG tasoja tupakoitsijoilla keuhkosyöpä (n = 90) verrattuna tupakoitsijoilla ilman syövän (n = 97) (tukeminen Information S1). Lisätodisteita sääntelyn rooli MAFG hengitysteiden epiteelisoluissa on syntymässä. Vuonna liittyvä hanke, tupakansavun aiheuttaman hengitysteiden ilmentymä MAFG on havaittu säänneltävä microRNA miR-218 [21]. Olemme tutkineet vaikutus MAFG ekspressiotason loppupään Nrf2-reitin geenit. Kuva 3A näyttää MAFG siRNA Knockdown että A549 solulinjassa. Kuvio 3B esittää, että MAFG hiljentäminen johtaa heikennetty ilmentymisen GCLC, NQO1, SLC7A11, TXNRD1 (kaikki geenit). Oletamme, että vähennetään MAFG tasoa ja edelleen alentamiseen suojaava oksidatiivisen stressin vastaus voi edustaa geeniekspression tunnusmerkki keuhkoputken epiteelisoluissa tupakoitsijoita, jotka keuhkosyövän. Tässä mallissa on kuitenkin geenien ilmentymisen ajan (kesto tupakointi) voisi olla tärkeä ja viime tupakointi keskuudessa tupakoijilla saattaa vaikuttaa joidenkin malleja, jotka me tarkkailla keuhkoputkien epiteelisolujen.

jälkeen ohimenevän transfektion kanssa MAFG siRNA että A549 hengitysteiden solulinja, geenien ilmentyminen mitattiin käyttäen reaaliaikaista qPCR. Transfektio sekoitetun ohjaus siRNA tuotettu yleinen kasvu Nrf2 reitin geenien (mustat palkit) suhteessa transfektoimattomista soluja (asetettu 100%). (A) MAFG geenin ilmentyminen oli merkitsevästi pienempi (55%) verrattuna ei-spesifisiä siRNA ohjaus. (B) GCLC, NQO1, SLC7A11, ja TXNRD1 geenin ilmentyminen on merkittävästi pienempi MAFG hiljentäminen verrattuna ei-spesifisten siRNA valvontaa. * (P≤0.05, t-testi). Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 3).

SNP valinta, genotyypityksen ja MAFG sekvensoinnin

Jotta voidaan tutkia, jos geneettinen vaihtelu edisti hengitysteiden geeniekspression eroja, käytimme bioinformatiikan strategia tunnistaa SNP mahdollisten Nrf2 sitoutumiskohtia [9], [13] ja myös tunnistaa koodaus SNP useiden geenien mukana Nrf2-välitteinen antioksidanttina vastereitissä. Geeni ja SNP luettelo sisältyy olevat tiedot S1. Sen jälkeen genotyypityksen, noin 77% (348 SNP) tunnistettujen SNP läpäissyt alkuperäisen laadunvalvontakriteerit (genotyypityksen korko = 90%, MAF kynnys = 0,01 ja Hardy-Weinberg tasapaino p-arvo kynnysarvo = 0,001, GenTrain pisteet 0,25), mutta me vain tutkittiin 312 SNP kanssa alleelifrekvenssit ≥0.05 on 52 aiheista.

Expression analyysi viittasi siihen, että MAFG tasot saattavat olla nopeutta rajoittava ilmaus antioksidantti muuniresponssigeeneinä. Arvioida paremmin, jos sekvenssin vaihtelua MAFG geeni vaikuttaa geenien ilmentyminen, sekvensoimme 16,5 kb genomin alueella (CHR 17: 77,467,438-77,483,879) tutkimuksessamme koehenkilöillä. Tämä alue oli 5000-nt ylävirtaan transkription aloituskohdasta 2000-nt alavirtaan MAFG n transkription loppusivustoon kattaa intronit, eksonit ja transloimattomat alueet. Havaitsimme 33 SNP tällä alueella, mukaan lukien 1 koodittavan SNP, 16 SNP 3 ’UTR, ja 3 SNP intronien ja 13 SNP ylävirtaan. Sijainti, alleelin taajuus ja kytkentäepätasapaino- (LD) sisältyy tukeminen Information S1. Vertaamalla tätä tietoa NCBI dbSNP rakentaa 130 (toukokuu 2009), huomasimme, että vain 3 näistä SNP oli aikaisemmin raportoitu.

Association analyysi SNP-genotyypin ja geenien ilmentymisen

suoritettu lineaarinen regressio välinen normalisoitu log

2-transformoituja geeniekspression arvot ja genotyypin SNP jotka olivat lähellä kunkin geenin (SNP kannasta 10 kb geenin alkupään, koodaus, ja alavirran alueet). Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttäen 10000 permutaatiot ilmaisun arvot suhteessa genotyyppien kuten aikaisemmin on kuvattu Stranger

et ai

[22], jossa on korjattu

p

kynnysarvon 0,05. 44 tupakoitsijoita, keskuudesta 338 havaittavaan koettimeen-sarjaa (213 geenit) lähellä valituilla 312 SNP, löysimme merkitsevästi yhteydessä 26 SNP ja 29 koetin-sarjaa (25 geenejä, lueteltu taulukossa 2). Näiden joukossa ovat 21 otaksuttu ARE SNP ja 6 tunnettu geenit, kuten AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, EPHX1, FTL, ja HMOX1. Löysimme klusterin SNP: t ekspressioon liittyviä 3 vierekkäistä Nrf2-geenien, AKR1C1, AKR1C2 ja AKR1C3 (kuvio 4). Me genotyyppi 25 tag SNP tällä genomin alueella. SNP rs12414884 sijaitsee -3792-nt ylävirtaan AKR1C2 ja sen ilmentymiseen liittyvien kaikkien 3 geenejä. Kaksi SNP: t, rs17134158 ja rs10904392, jotka ovat 1768-nt ja 4715 nt: n päässä rs12414884 vastaavasti, joka liittyy ilmentymisen AKR1C1 ja AKR1C2. Edelleen kytkentäepätasapaino- analyysit ovat osoittaneet, nämä 3 SNP olivat sidos (r

2 0,8). Testasimme myös yhdistyksen välillä vastikään havaittuja SNP MAFG ja MAFG geeniekspressiota. Promoottori SNP at CHR 17: 77482956 (-4077, A /C, pienet alleeli taaj = 0,09) liittyi MAFG ilme (p_corrected = 0,0038).

genotyypitetty 25 SNP genomin alueella, joka sisältää AKR1C1, AKR1C2 ja AKR1C3. Kussakin juoni ilmaisun jakeen genetype, ympyrät olivat log2 ilmaisun, ja linjat olivat lineaarinen regressio trendilinjoille. Genotyyppejä SNP rs1241488 liittyy ekspressiotasoja kaikista 3 geenejä. Genotyyppejä SNP rs1090439 liittyy ekspressiotasot AKR1C1 ja AKR1C2. Huom SNP rs17134158 oli vain 2 genotyypit AG ja GG tupakoitsijoilla, mutta ei ole AA genotyyppi NS ja sen yleinen vähäinen alleelifrekvensseiltään 0,05. Kytkentäepätasapaino- osoittivat, nämä 3 SNP olivat sidos (r

2 0,88).

Vaikka painopiste oli yhdistyksen välillä genotyypin ja ilmaisun kaikki tupakoitsijat tutkimuksessa, myös tutkinut ero yhdistysten välillä SC ja SNC ryhmiä. Tämäntyyppinen Tutkimusanalyysi voisi paljastaa SNP vaikutuksia, jotka saattavat liittyä-eroon herkkyys tupakoitsijoilla. Yhdistyksen välillä todettiin ilmaisun ja oletetun ARE SNP rs3753660 at -199-nt epoksidihydrolaasia 1 (EPHX1) geeni (kuvio 5A). Yhdistys oli vahvin SNC ja vaikutus SNP näyttää olevan aivan erilainen ryhmien välillä (kuvio 5A ja taulukko 2). Ihmisen EPHX1 on kahden mahdollisen ARE: (sisältäen polymorfisen ARE), mutta EPHX1 ilmaisu ei noudata kaavaa kuin näytetään monet muut geenit kuvassa 2C. C-alleelin rs3753660 ennustettiin olevan matalammat Nrf2 sitova ja havaitsimme se oli heikompi ilmaisun SNC. Tämä viittaa mahdolliseen vuorovaikutukseen geneettinen variantti, ilmaisun ja ryhmä fenotyypin. DUSP1 oli myös oletetun OVAT SNP rs17658295 liittyy sen ekspressiota (kuvio 5B). Vähäinen alleeli oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan ilme ja merkitsevyystaso oli huomattavampi syöpä ryhmässä.

Jokaisessa juoni, SC, SNC ja NS väritetään punainen, sininen ja musta, vastaavasti. (A) yhdistys oletetun ARE SNP rs3753660 että promoottori EPHX1 geenin näyttöjen selvä trendejä SC ja SNC; (B) DUSP1 otaksuttu ARE SNP rs17658295 liittyy sen ilme. Vähäinen alleeli oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan ilme ja merkitsevyystaso oli huomattavampi syöpä ryhmä; C) GCLC introni SNP rs670548 pieniä alleeli liittyy pienempi ilme kaikilla koehenkilöillä; (D) GCLC 3 ’alavirtaan SNP rs2397146 pieniä alleeli liittyy korkeampi ilme kaikilla koehenkilöillä.

muutama SNP liittyi ilmaisun tunnettujen geenit kaikkien 52 aiheita, mutta ei kaikissa tupakoitsijoita. Esimerkiksi kaksi SNP (rs670548 ja rs2397146) kun glutamaatti-kysteiini ligaasia katalyyttinen alayksikkö (GCLC) -geeni, jotka eivät olleet LD (r

2 = 0,28), olivat itsenäisesti liittyvät ilme (kuvio 5C). Mielenkiintoista on, että pieni alleelin rs670548 (intronissa) liittyi heikkoa ilmentymistä, kun taas vähäinen alleelin rs2397146 5 ’ylävirran alue liittyi korkea ekspressio (kuvio 5D), mikä viittaa siihen mahdollisuuteen kahden erillisen alleeliset fenotyyppiä. Vaihtelu GCLC on aiemmin liittynyt alhainen keuhkojen toiminta kahdessa itsenäisessä populaatioissa [23].

SNP jotka saattavat edistää syövän tilan kautta geeniekspressiota

Tunnistaa SNP, joka saattaa vaikuttaa keuhkojen syöpä kautta geenien ilmentyminen ensin käytettiin logistista regressiota testaamaan suhdetta syöpä tai ei-syöpä asema ja log2 transformoitujen geeniekspressiotasot. Tämä tunnistettu 34 koetin-sarjaa (31 geenit) antioksidantti vastereitissä jotka liittyivät syövän tilan tupakoitsijoiden korjatun p-arvo = 0,05. On huomattava, että MAFG koetin asetettu 204970_s_at liittyi ”ilman syöpä” tila (p = 0,0014) (kuvio 6A). Kuten kuviossa 6, päättelimme, että SNP, joka vaikutti geeniekspressiota voi olla poikkeava taajuus ryhmien välillä. Vaikka tilastollista voimaa tällainen vertailu on alhainen, emme tarkkailla tällainen vaikutus varten MAFG 3’UTR SNP aiemmin mainittiin (CHR 17: 77469864; p = 0,058) (kuvio 6B-C). Kuten kuviossa 6 on esitetty, GG-genotyyppi, joka liittyy ”ilman syöpä” tila tupakoitsijoita (p = 0,0199), ja myös hieman korkeamman ekspressiotason MAFG. Jos nämä taajuus erot voitiin toteen suuremmissa ryhmissä potilaita, he voivat osoittaa suoja- tai riskin alleelien ja voisivat olla hyödyllisiä ennustettaessa riskiä.

MAFG 3’UTR SNP osoitteessa CHR 17: 77469864 saattavat myötävaikuttaa fenotyypin ( keuhkosyöpä tila) kautta geenien ilmentyminen, joka perustuu: (A) ilmentyminen MAFG oli tupakoitsijoilla suurempi ilman syövän kuin tupakoitsijat syöpä; (B) Genotyyppi GG näyttää suuntaus kohti korkeampia ekspressiotasoja MAFG (#, musta viiva); rinteillä genotyypin ilmentyminen tontteja ryhmien välillä (* punainen katkoviiva vs sininen katkoviiva); (C) genotyyppi GG, mikä liittyy suurempiin ilme, oli yleisempää tupakoitsijoilla ilman syövän; (D) Hypoteesi. Yksilöiden genotyyppi GG näytön suurempi MAFG ilmentymistä keuhkoputken epiteelisolujen; MAFG ilmaisu tupakoitsijoilla suurempi ilman syövän jossa ehdotetaan suojaavan keuhkosyöpä; GG-genotyyppi on harvinaisempaa keskuudessa syöpä ryhmä, sopusoinnussa suojaava vaikutus.

Keskustelu

On tärkeä periytyvä komponentti keuhkosyöpään [24] ja ymmärrystä siitä, miten geneettinen vaihtelu muuttaa tupakoinnin indusoituun geeniekspressio voisi tarjota geneettistä biomarkkereita diagnoosiin ja paljastavat geneettinen alttiusalleelien. Lukuisat tutkimukset ihmisen hengitysteissä [5], [7], [25], [26] hiiren keuhkoissa [27] tai

in vitro

soluviljelmässä [28] ovat raportoineet geenien ilmentymisen allekirjoituksia liittyvät tupakoinnin. Spira

et al

tunnistettu geeniekspressioprofiilien in sytologisesti normaalissa suuren hengitysteiden epiteelisolujen, jotka voivat toimia diagnostisen biomarkkeri keuhkosyövän [7]. Tässä työssä tunnistetaan molekyyli ja geneettiset ominaisuudet Nrf2-säänneltyjen reitin, jotka ovat keskeisiä tämän hengitysteiden geeniekspression vaste. Käyttämällä polku analyysityökalut tunnistimme erot Nrf2-välitteisen transkription profiileja keuhkoputken hengitysteiden epiteelisolujen saatu tupakoimattomien, tupakoineita epäluuloisesti keuhkosyöpää, ja ne, joilla on myöhemmin diagnoosi keuhkosyöpään. Olemme paljasti myös mahdollinen rooli MAFG (a Nrf2-sitoutumispartneri) moduloinnissa tupakoinnin aiheuttamien geenin ilmentymistä.

Nrf2 aktivoituu oksidatiivisen stressin ja siirtyy tumaan, jossa se heterodimerizes pieniä MAF proteiinien muodostamiseksi transaktivaation monimutkainen, joka sitoutuu tiettyyn DNA-alueita kutsutaan antioksidantti vaste elementtejä (ARE) [29] ja ajan säätelee antioksidantti ja vaiheen II vieroitus entsyymejä. Tutkimme ilmaus Nrf2 ja sen vuorovaikutuksessa kumppanit (esim MAFG, NRF1, NRF3, ja BACH1) sekä teki uusi havainto, että MAFG ilmentyminen korreloi voimakkaasti ilmaus alavirran Nrf2 kohdegeenien. Tällä hetkellä on olemassa 42 Nrf2 kohdegeenien havaittu erilaisissa ihmisen kudoksissa, ja löysimme 22 niistä korreloi MAFG geeni-ilmentymisen taso ihmisen hengitysteiden epiteelisoluissa. Lisäksi NRF1, negatiivinen ja kilpailukykyinen säätelytekijän, oli anti-korreloi alavirtaan antioksidantti geeniekspressiota. Mahdollisuus, että MAFG ilmaisu saattaa rajoittaa alavirtaan antioksidantti geenin ilmentyminen tutkittiin tarkemmin. Hiljentäminen MAFG siRNA A549-soluissa vaimennetaan ilmentymistä tunnetuimpia ovat geenien (kuvio 3B) ja tämä vastasi julkaistu kokeita MafG hiirien [29]. Samanlainen malli MAFG ilmaisun suhteessa muihin antioksidantin geenien havaittiin, kun me suorittaa Retrospektiivinen analyysi ilmaisun tietojen liittyvä, aiemmin julkaistu, suuren mittakaavan tutkimuksessa [7].