Krooninen sairaus

tiivistelmä

DNA: n metylaatio on epigeneettisestä merkkiin liittyy transkription säätelyyn ja genomin rakenne. Näillä merkeillä on tutkittu erilaisissa syövän hoito niiden hyödyllisyys erottamaan normaalia kudosta kasvaimen kudoksesta. Tässä tarkastellaan suoraa korrelaatiota DNA: n metylaation ja potilaan selviytymistä. Huomaamme, että muutokset DNA metylaatio keskeisten haiman kehitykseen geenit liittyvät vahvasti potilaan selviytymisen.

Citation: Thompson MJ, RUBBI L, Dawson DW, Donahue TR, Pellegrini M (2015) Haimasyöpä Patient Survival korreloi DNA metylointi Haima Development Genes. PLoS ONE 10 (6): e0128814. doi: 10,1371 /journal.pone.0128814

Academic Editor: Max Costa, New York University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 05 tammikuu 2015; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2015; Julkaistu: 03 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Thompson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Tiedot tutkimuksen ovat nyt saatavilla Gene Expression Omnibus (GEO) talletusnumerolla koodia GSE67205. Se löytyy täältä: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE67205.

Rahoitus: tuki haiman kudospankkeihin (DWD) toteutettiin jonka Hirshberg säätiön Haiman Research. M.J.T. tukivat apurahan P01 GM099134.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa [1]. 5 vuoden eloonjäämisaste 6% potilaista, joilla haimatiehyen adenokarsinoomat (PDAC) on alhaisin kiinteää syöpää. Varhainen havaitseminen pidetään välttämättömänä, jotta voidaan parantaa potilaiden selviytymistä, sillä useimmat potilaista on kehittynyt, ei-käytettävissä tauti [2, 3]. Viimeaikaiset edistysaskeleet teknologian genominlaajuisten mittaukset nostaa toivoa tunnistamiseksi tällaisten ensimmäisten biomarkkereita, sekä uusia terapeuttisia kohteita.

Useita syviä sekvensointi ponnistelut ovat tunnistaneet suuria määriä erittäin heterogeeninen mutaatioiden (~ 63 keskimäärin) neljä mutaatiota esiintyy korkealla taajuudella (KRAS, CDKN1A /P16, TP53 ja Smad4) in PDAC [4, 5] Nämä keskeiset mutaatioita on osoitettu mekaanisesti ajaa tuumorigeneesiä eläinmalleissa Smad4 liittämällä huonon ennusteen [6]. Geeniekspressioanalyysiä primaarikasvainten on mahdollistanut rakentamisen monen geenin profiileja, voi ennustaa etäpesäkkeitä ja lyhyemmät potilaiden eloonjäämisen riippumaton aineistoja mutta nämä ovat vielä käytetty kliinisissä päätöksenteossa [7, 8]. Yhdistämällä useita sarjaa kliinisten tietojen, kolme molekyyli- alatyyppiä PDAC jotka ennustavat selviytymisen ja hoitovaste kokeellisissa malleissa on kehitetty [9]. Äskettäin 171 geenit ennakoivaa biomarkkereiden potentiaalia tunnistettiin yhdistämällä mRNA ilmaisu, DNA kopioluvun vaihtelua ja miRNA tasolla [10].

Kuitenkin tähän mennessä vähemmän tiedetään muutoksia DNA: n metylaatio poikki haimasyöpä alatyyppejä. DNA: n metylaatio on saanut paljon viime aikoina kiinnostus sen roolista syövän biologian. Poikkeava malleja DNA: n metylaatio tiedetään liittyvän syövän synnyn ja vaikuttamaan sääntelyn genomin vakautta ja geenin transkriptio [11]. Genome laajuiset tutkimukset CpG-saarekkeiden ovat löytäneet tuhansia loci jossa ero metylaatio voidaan eristää haiman kasvainkudoksen normaalista kudoksesta [12, 13]. Tästä edistyksestä huolimatta käytön muutosten DNA: n metylaatio ennustamiseen haiman elossaololuku edelleen tutkimatta.

Tässä tarkastellaan suoraa korrelaatiota PDAC potilaan elinaika ja metylaatio yksittäisten CpG sivustoja saatu alennettua-esitys bisulfiitti sekvensointi ( RRBS). Lukuisat tilastollisesti merkittäviä muutoksia metylaatio korreloivat suoraan potilaan selviytymistä. Havaitsimme vahvan rikastuminen näiden sivustojen joukossa geenien solun kohtalon määrittämiseen haimassa. Toisin sekvensointi pyrkimyksiä, jotka tunnistetaan solun signalointireitteihin, nämä tulokset viittaavat siihen, että solun identiteetti, sanelee kasvaimen epigenome, voi olla kriittinen osa kliinisesti aggressiivisen PDAC. Lopuksi olemme edelleen validoitu kyky muutaman esimerkin auttaakseen eristää potilaita perustuva selviytyminen kertaa, mikä viittaa mahdollisuuteen kehittää kliinistä biomarkkereiden perustuu laajempaan metylointianalyysi.

Tulokset

ennusteeseen viittaavia ominaisuudet näytteiden

taulukossa 1 esitetään yhteenveto tilastoista potilaiden käytetty tässä työssä. Yksittäisen potilaan tiedot löytyvät S1 taulukossa. Kaikilla potilailla oli alkuvaiheen PDAC ja sai adjuvanttihoitoa. Tuolloin analyysin, 9 potilaalla oli uusiutuva sairaus (mediaani tautivapaan elinajan (DFS) 15,0 kuukautta), kun taas 9 potilaat olivat kuolleet tautiin (mediaani tautikohtaisia ​​Survival (DSS) 25,0 kuukautta). DFS viittaa väli hoito tai poisto kasvaimen ja taudin uusiutumista, kun DSS viittaa väli alkuperäisen diagnoosin ja potilaan kuoleman joissa kuolinsyy oli taudin. Tätä työtä varten olemme käyttäneet DSS yksinomaan. Tuolloin Tämän analyysin 9 potilaat olivat kuolleen ja 2 olivat yhä elossa. Nämä ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia ja selviytymisen tulokset ovat samankaltaisia ​​kuin muut julkaistut kohortteja PDAC.

alennetulla esitys bisulfiitti sekvensointi

kartoitus kaikista laatu lukee vertailutasoon ihmisen genomin (hg19) saatiin ~ 5000000 CpG sivustot, joissa varma metylaation taajuus voidaan arvioida vähintään yhden 16 näytettä. Soveltaminen tietojen laadun suodattimet edellä selitetään pienentää tätä lopulliseen useita 251566 metylaatiokohtia käytetään kaikissa myöhemmissä analyysiin.

pääkomponenttianalyysiin Separates Kasvain Vahinkovakuutustoiminnan kasvain

Pääkomponenttianalyysi (PCA ) n metylaation profiileja 16 näytettä suoritettiin. Kuvio 1 esittää projektiota näytteiden päälle kaksi ensimmäistä pääakselit. Pitkin ensimmäinen periaate komponentti on erottaminen kasvain näytteitä. Pitkin Toinen periaate akseli on selkeä erottaminen toisistaan ​​kasvain näytteet ja normaali ja haimatulehduksen näytteitä. Ensimmäinen komponentti selittää 24% varianssi metylaation tietoja, kun toinen komponentti kerrotaan vielä 21%.

perehtyä biologiaa taustalla erottaminen näytteistä pitkin kaksi pääosatekijää, valitsimme 500 suurimman suuruus kertoimia sekä positiivisia että negatiivisia suuntiin kutakin akselia. Koska nämä kertoimet vastaavat CpG sivustoja, me toimitti ne genomialuetta rikastaminen Annotations Tool (GREAT) palvelin huomautus [14]. Ensimmäistä pääakselin (ks S2 taulukko) vahvin negatiiviset osuudet tulevat osallistuvien geenien haiman kehittämiseen (esim ONECUT1, PDX1, SOX9, FOXA2, …). Vahvin myönteistä kuitenkaan eivät tule joukko geenejä niin yhtenäinen toiminnallinen merkintä koska negatiivit paitsi suhteessa insuliinin ihmiskaupan ja erityksen; BACE2 ja PIM-3, joka tunnetaan myös edistää ihmisen haimasyövän kasvua [15].

Toisen pääakselin (ks S3 taulukko) vahvin negatiiviset osuudet tulevat kehityksellisessä geenien suuren määrän kudostyyppien ja elinjärjestelmien. Vahvin myönteiset vaikutukset tulevat transmembraanireseptoriproteiinia kinaasien. Merkittävin panos tulee MST1R joka on ollut mukana KRAS onkogeenin aktivaatio PDAC [16].

Koska erottaminen kesken kasvain näytteet perustuu metyloinnin geenejä tärkeää kehityksen kannalta, muutimme tutkia siellä saattaa olla korrelaatio metyloinnin näiden geenien ja tautikohtaista selviytyminen potilaista.

Määritelmä

Survival +

ja

elossapysy-

ehdot metylaatiokohtia

Havaitsimme, että metylaatiokohtia positiivisia tai negatiivisia Coxin tulokset muodostivat kaksi ryhmää erottuva ominaisuuksia, kuten jäljempänä. Yksinkertaistaa hahmottaminen ja vertailemalla ja näiden kahden ryhmän, määrittelimme ne ”

elossapysy-”

tai ”

selviytyminen +

”, molemmat korreloi merkitsevästi lisääntynyt metylaatio. Sillä

elossapysy-

, lisääntynyt metylaatio liittyi lyhyempiä selviytymisen kertaa. Kääntäen

selviytymisen +

lisääntynyt metylaatio oli yhteydessä pidempään selviytymisen kertaa. Koska meillä suodatus kriteerit ja soveltamalla ap ≤ 0,05 kynnys merkitys, saimme joukon 17251

selviytymisen +

sivustoja ja 3256

elossapysy-

sivustoja.

Yksittäiset CpG metylaatio korreloi elossaololuku

Testasimme onko muita kliinisiä muuttujia tiedetään vaikuttavan DNA metylaatio saattaa selittää korrelaatioita vietämme. Suoritimme saman Coxin kanssa sensurointi kunkin sivuston metylaatio vastaan ​​sekä potilaan ikä ja kasvaimen sisältöä (sellulaarisuus). Sitten otti Cox tulokset perustuvat selviytyminen ja ne perustuvat kunkin muun muuttujien ja laskettiin Pearsonin korrelaatio kahden kertoimien joukossa kaikki sivustot kussakin

selviytymisen +

ja

elossapysy-

sivustoja. Kasvaimen laatu, korrelaatio oli 0,06 ja ikä, se oli 0,08. Käytä vain sivustoja kiinnostaa tämän tutkimuksen (joilla p-arvo 0,05 selviytymisen ja metylaation vertailu) tuotti korrelaatioita 0,16 iän ja -0,12 kasvaimen laadusta. Lisäksi numerot sivustot, joissa korrelaatio oli tilastollisesti merkitsevä sekä metylaation ja iän tai metylaation ja kasvaimen sisältöä olivat melko pieniä (n ~ 10). Yhteenvetona toteamme, että korrelaatioita metylaatiotasoilla ja elossaoloaika eivät vaikuta merkittävästi potilaan iän tai kasvain sisältöä.

Functional analyysi paljastaa avaimet geenien haiman solukohtalo- sitoutuminen

Käyttäen

selviytymisen +

ja

elossapysy-

metylaatiokohtia yksitellen ja koko ~ 250K metylaatiokohtia tausta, käytimme hyvä keino hakea merkittävien yhdistysten erilaiset toiminnalliset luokat ja reitit [17]. Osajoukko merkitseviä saapuvat nämä kyselyt ovat taulukossa 2

elossapysy-

sivustoja ja taulukko 3

selviytymisen +

sivustoja.

elossapysy-

joukko metylaatiokohtia, havaitsimme useita merkittäviä assosiaatioita kehitysprosesseja ja väyliä ominaisia ​​haima, mukaan lukien keskeiset geenit osallistuvat transkription säätelyyn määritettäessä soludifferentiaatiota haimassa. Linkit todettiin myös geenien välillä ja prosesseja hermosolujen erilaistumisen, toteaminen totesi aiemmin on on sekä exome sekvensointi vaivaa [5] ja DNA: n metylaatio tutkimus PDAC [13].

Kuvio 2 on kaavio solu suvusta haimassa mukailtu Zaret,

et al

. [18]. Geenit korostettu punaisella rikastuneet

elossapysy-

asettaa, kuten HHEX, ONECUT1, ISL1, NKX2-2, ja PAX6. HHEX, joka on homeobox-geenin, on kriittinen haiman kehityksen ja ONECUT1 on tarpeen ajoissa ilmentymisen PDX1 ja NEUROG3 sekä selkä- ja haiman Endodermi [19, 20]. NKX2-2 tarvitaan haiman beetasolujen kehittämiseen [21], ISL1 vaaditaan saarekesolujen kehittämiseen [22], ja PAX6 tarvitaan erilaistumiseen alfa-soluihin [22].

Geenit, jotka ovat hyvin -established pelaa keskeinen rooli solun kohtalon on luetteloitu nimen. Nimet korostettu punaisella ovat geenit rikastetaan

elossapysy-

metylaatiokohtia.

Aiemmin on raportoitu, että hypermetylaatiota ISL1 korreloi vähentynyt geenin ilmentyminen ja aggressiivinen eteneminen invasiivisen virtsarakon syövän [23]. Metylaatio NKX2-2 tunnistettiin osana allekirjoituksen glioblastoma multiforme [24]. Lopuksi hypermetylaatiota PAX6 havaittiin korreloivan huonon kliinistä tulosta mahasyövässä [25, 26], kehitystä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [27] ja transkription aktivoinnin invasiivisessa ductal rintasyöpä [28, 29].

elossapysy-

ja

selviytymisen +

ovat eri asennoissa taipumuksia

Kuva 3A piirtää log-kertoimet suhdeluvut

elossapysy-

ja

selviytyminen +

sivustoja eri etäisyyksillä transkription aloituspaikkoja niiden lähimmän geenejä.

elossapysy-

sivustoja, joilla on selkein merkintä tulokset olivat huomattavasti rikastuneet promoottorialueissa geenien. Sen sijaan

selviytymisen +

metylaatiokohtia, joka ryhmänä, on hajanaisempaa yhdessä erityisesti toiminnalliset huomautuksia jaettiin laajemmin ja distaalisesti geenien ”transkription aloitus- sivustoja. Vastaavasti näiden kahden metylaatiokohtia on erilaiset tilastolliset ominaisuudet. Kuvio 3B on histogrammi keskimääräinen metylaation arvojen metylaatiokohtia molempien luokkien. Elossapysy- ja selviytyminen + sivustot näyttävät olevan lähes erilliset jakaumien metylaation arvoja. Vaikka elossapysy- sivustot on yleensä alhainen metylaatio joka kasvaa lyhentää selviytymisen kertaa, selviytyminen + luokka on ylivoimaisesti koostuu CpG sivustoja, jotka ovat hyper-metyloitu. Toteamme, että nämä kaksi jakaumat heijastavat taustalla jakautuminen kaikkien sivustojen (katso S1 kuvio). Runsaus selviytymisen + sivustoja suhteessa elossapysy- sivustoja heijastaa suuremman taustalla jakelua hypermetyloitunut CpG: t. Koska hypometyloidut alueet genomien liittyy yleensä transkription aloituspaikat, on todennäköistä, että elossapysy- sivustot ovat suoremmin liittyvät transkription muutoksiin kuin selviytymisen + sivustot, jotka ovat usein distaalisessa intergeenisessä alueilla, ja on yhtä selkeä suhde transkription sääntelyä.

(A) Enrichment (log

-odds suhde)

selviytymisen +

ja

elossapysy-

sivustoja eri etäisyydellä siiloissa suhteessa transkription aloituspaikat ( TSS) niiden lähimmän geenejä. (B) Histogrammi Keskimääräisen metylaation pistemäärät CpG sivustojen luokitella

elossapysy-

ja

selviytymisen +

.

Kohti biologisten merkkiaineiden kehitystyö

Erityisiä esimerkkejä välisen korrelaation metylaation ja potilaan eloonjääminen on esitetty kuvassa 4. Kuva 4A näyttää kolme geeniä (FAM150A, ONECUT1, ja RASSF10), jotka paikallisesti rikastettiin

elossapysy-

sivustoja. Paneeli esittää kromosomaalisen sijainnin, rakenteen, ja suurennettuna DNA metylaation raidat 11 PDAC potilaalla on niiden selviytyminen kertaa kuukausiin listattu raiteen vasemmalle puolelle sekä kappaleita 2 haimatulehduksen ja 3 normaali näytteitä. Pienin osa kuvion 4A paneeli esittää kappaleita transkriptiotekijän sitova alueet saadaan ENCODE hanke [30]. Kuvio 4B esittää Kaplan-Meier -käyrät kolmen tiettyjä sivustoja-molemmista geenistä välittömästi sen yläpuolella. Ilmainen joukko esimerkkejä käyttäen

selviytymisen +

sivustoja annetaan S2 kuvassa.

(A) Kolme geeneistä jossa kasvoi metylaation promoottorialueella vahvasti korreloi vähentynyt potilaan selviytymistä. Esitetään myös kappaleita, jotka vastaavat transkriptiotekijän sitova todisteita. (B) Kaplan-Meier -käyrät yhdessä paikassa kustakin geenistä ilmenevät transkriptiotekijän sitoutumiskohdassa.

Vertailu tunnettujen PDAC liittyvien geenien

Käyttäen geeni-keskeinen lähestymistapa, laskimme useita merkittäviä metylaatiokohtia (

selviytymisen +

tai

elossapysy-

) esiintyvät tietyssä geenissä plus 5 kiloemästä laajennus ylävirtaan transkription aloituskohdasta. Sitten lajitellaan nämä kaksi listaa ja tutki top 10 merkinnät kussakin. Täydellinen luettelo geenien ja useita merkittäviä metylaatiokohtia jokaiselle annetaan S4 taulukossa.

Lisäksi tarkastelimme päällekkäisiä meidän geenin sarjaa ja sarjaa geenien mutaatioita paljastui kaksi laajaa sekvensointi tutkimuksessa haiman syövät [4, 5]. Meidän geeni luetteloita, otimme vain ne, joissa oli 10 tai enemmän merkittävä metylaatiokohtia (vähentää väärien löytö määrä yksittäisen site). Tämä antoi meille 32 geenit

elossapysy-

asettaa ja 54 geenit

selviytymisen +

setti. Vain yksi (COL5A1) esiintyi molemmissa listan mutatoitunut geeni [4] sekä

selviytymisen +

lista, kun taas ole päällekkäisyyttä Todettiin kanssa

elossapysy-

asetettu. Tämä puute päällekkäisiä geenien rikastettiin elossapysy- ja selviytymisen + metylaatiokohtia ja geenejä, jotka liittyvät haimasyöpä mutanttien selittyy kahdesta tekijästä. Ensimmäinen on, että haimme tiukat kriteerit geenien katsotaan minimoimiseksi vääriä löytö, ja siksi emme ole välttämättä jää kaikki epigeneettiset muutokset. Toinen, ja luultavasti tärkeämpi havainto, että PDAC liittyvä mutantti geenejä ei rikastunut haiman kehitykseen geenejä, vaan pikemminkin signalointireittejä. Siten mutaatiot näille signalointipolkujen todennäköisesti antaa selviytymisen etuja kasvaimia, kun taas kehityshäiriöitä muutoksia, jotka antavat selviytyminen edut voidaan tehokkaammin moduloidaan vaikka epigeneettisellä sijaan geneettisiä muutoksia.

Keskustelu

Perimän muutoksia ja geenin ilmentymisen liittyviä muutoksia haimasyöpä on tutkittu intensiivisesti, ja useita kriittisiä geenejä on tunnistettu [4, 31, 32]. Määrällinen integrointi useita data-lähteistä genomisen muutoksiin, geenien ilmentyminen, ja epigeneettiset sääntelyn kanssa elossaololuku on auttanut luonnehdintaan suhteita PI3K /AKT ja SRC reittejä [10] ja PDAC etenemistä. Toisin kuin aiemmissa tutkimuksissa, olemme ottaneet

elossapysy-

lähestymistapa, joka keskittyy mahdollisten epigeneettisellä sääntelyn kautta DNA: n metylaatio.

Huomasimme, että metylaatio CpG sivustojen korreloivat potilaan eloonjäämisen ~ 20000 tapauksia ulos ~ 250.000 mitattuna. Nämä sivustot putosi kahteen ryhmään vaadimme

elossapysy-

ja

selviytymisen +

edustaa suhdetta lisääntyneen metylaation selviytymiseen. Huomasimme myös, että näiden kahden sivustoja oli selvä sijoitteluun taipumuksia suhteessa transkription aloituspaikat geenien. Vaikka

elossapysy-

sivustoja ryhmittyneet lähelle TSS-vastaava hypermetylaatiota promoottorialueiden,

selviytymisen +

sivustot olivat laajemmin jaettu intragenically. Seurauksena tästä osiointi, ja yleensä ymmärretty ja ominaista promoottorialueille geenien,

elossapysy-

sivustoja tuotti selvemmin talteenotto toiminnallisten huomautusta ja geenien aggregaatin.

Vaikka valtaosa DNA: n metylaatio tutkimukset ovat keskittyneet metylaatiostatuksen promoottorien ja CpG-saarekkeiden, on yhä enemmän näyttöä siitä, että introni-metylaatio ja /tai metylaatiokohtia jotka eivät ole osa CpG-saarekkeiden myös osansa muuntavan geenin ilmentymisen [33, 34] . Uskotaan, että nämä metylaatio näiden sisäisten aiheuttavaa sivustoja vaikuttaa rooli tehostajia transkription [35-37]. Tutkimuksemme antavat aihetta uskoa tätä, koska suurin osa merkittävistä metylaatiomuutokset havaitsimme olivat

selviytymisen +

luokka (ei proksimaalisesti TSS).

Geeni FAM150A oli eniten

elossapysy-

sivustoja. Vaikka ei hyvin tunnettu kirjallisuudessa, tuoreessa tutkimuksessa munuaiskarsinoomia todettiin olevan hypermetyloitunut klusterin potilaiden aggressiivisten syövän ja huono selviytyminen [38, 39]. Rooli ONECUT1 (HNF6) haiman kehitys on vakiintunut. Erityisesti on ajateltu toimimaan fenotyypin kytkin acinar-to-ductal metaplasia, joka voi johtaa haiman intraepiteliaalinen neoplasia ja myöhemmin PDAC [40]. Tutkimukset hiiri osoittaa ONECUT1 on kasvaimia estävä aktiivisuus [41]. Toinen tunnettu tuumorisuppressoriproteiinia meidän top 10 lista on RASSF10. Viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet sitä epigeneettiseltä vaiennetaan kautta promoottori hypermetylaation useissa syövistä [42-52]. RNF207 oli myös hiljattain tunnistettu tuumorisuppressori neuroblastoomat [53]. PCDH9 usein menetetään maksasolukarsinoomat, sen alassäätöä liittyy kasvaimen solujen vaeltamiseen ja PCDH9-syöpäkasvain korreloi huomattavasti lyhyempi eloonjäämisajasta gliooma potilaiden [54, 55]. Samoin menetys yhden alleelin BRF1 liittyy erilaisia ​​kasvaimia [56]. Koska alayksikköä TFIIB, vapauttamiseen tämän geenin todennäköisesti myötävaikuttaa vapauttamisen RNA pol III transkriptio laajalti havaittu syöpäsoluissa [57].

top 10

elossapysy-

geenejä, vain kolme (MAP6, RIN3, ja HIST1H2BI) puuttui selkeä todiste onkogeenisessä tai kasvaimia estävä rooli kirjallisuudessa. RIN3 on negatiivinen säätelijä syöttösolujen vastauksena kantasolutekijä [58], ja se voi olla suppressiivinen rooli kasvaimen invasiivisuus. HIST1H2BI ei näytä olevan tunnetun rooli syövän syrjään yleisestä chromatin rakenteellinen rooli.

Loput geeni meidän top 10 lista koodaa miRNA (MIR96) tiedetään tukahduttaa KRAS ja toimivat tuumorisuppressori haimasyöpä [59]. Tämän seurauksena tutkimme myös muita miRNA näkymisen

elossapysy-

geenin lista. Vaikka ole top 10, löysimme kaksi miRNA geenejä yli 5 merkittäviä metylaatiokohtia. MIR130B säätyy alas haimasyövän kudoksiin ja sen ilme on hyödyllinen ennustetekijöitä haimasyövän potilaille [60]. MIR196A1 on myös todettu ottaa poikkeava ilmaisu liittyy epänormaali apoptoosin, invaasion ja leviämisen haimasyöpäsoluissa [61].

Tarkastellaan 10 geenien kanssa eniten

selviytymisen +

sivustoja saatiin seuraavat havainnot. PTPRN2 on tunnettu jäsen suurten auto-antigeenejä insuliinista riippuvainen diabetes mellitus. On myös todettu olevan hypermetyloitunut biomarkkereiden in okasolusyöpä keuhkosyövän [62]. CDH4 on poikkeuksellisesti metyloitu sen promoottorialueen maha- ja peräsuolen syövän ja voi toimia epigeneettiseltä vaiennettu tuumorisuppressoriproteiinia nenänielun karsinooma [63, 64]. MAD1L1 on hyvin tutkittu solukierron tarkistuspiste geenin mutaatioita osallisena monissa syöpätyypeissä [65]. CBFA2T3 löytyy lapsipotilailla akuuttia myelooista leukemiaa ja osallistuu kromosomitranslokaation ja fuusioproteiinituotteille (CBFA2T3-GLIS2) [66]. Poikkeava metylaatio CBFA2T3 promoottorin on havaittu rintasyöpäkudosnäytteessä verrattuna normaaliin [67]. CBFA2T3 löytyy myös IGH kromosomitranslokaation lapsipotilailla B-solulymfooman [68]. Kollageeni-remontin geeni, COL5A1, käytettiin 10-geenin ilmentymisen allekirjoituksen yhteydessä huonoon elossaololuku korkealaatuista serous munasarjasyövän ja sen ekspressio näyttää edistää etäpesäkkeiden [69]. CAMTA1 on tuumorisuppressorina ehdokas todettu estävän kasvua varhaishermosolukasvaimesta ja näyttää olevan rooli kehitettäessä gliooma kantasolujen [53, 70-72]. H3K9me1 metyylitransferaasi PRDM16 suojaa genomisen koskemattomuuden [73]. Toiselle siirtäminen Tämän geenin löytyy akuuttia myelooista leukemiaa ja myelodysplastista oireyhtymää ja korreloi huonon elossaololuku [74]. SHANK2 on ehdotettu uutena onkogeenin sen yli-ilmentyminen ruokatorven okasolusyöpä liittyy soluproliferaatioon ja suojaa solukuolemaa [75].

kaksi top 10 geenit oli vähän kirjallisuutta huomautus . Korkea tasot RBFOX4 proteiinin on löydetty supratentorial ependymomas. [76], kun on olennaisesti mitään yhteyttä kirjallisuudessa syövän yhdistys TRAPPC9.

Koska löysimme mielenkiintoisia miRNA meidän joukko

elossapysy-

geenejä, etsimme niitä

selviytymisen +

setti, samoin. Vaikka suurempi määrä

selviytymisen +

sivustoja suhteessa selviytymisen sivuston, ei ollut miRNA liittyviä geenejä yli 5 tämän luokan sivustoja.

jälkeen lähemmässä tarkastelussa yksittäisten geenien liittyy useita esiintymiä

selviytymisen +

ja

elossapysy-

sivustoja, huomasimme, että lähes kaikki oli tunnistettu kautta muissa tutkimuksissa muun tyyppisiä tietoja kuin pelissä rooli syövän, vaikka niitä ei ole tutkittu erityisesti liittyen PDAC. Meidän tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten raportointi korrelaatioita promoottorin hypermetylaatio tai transkription inaktivointi useiden keskeisten kehitykseen sääntely- tai geenejä, joilla tuumoria tukahduttavan kapasiteetti muissa syövissä. Polut että rikastetaan

elossapysy-

liittyvät epigeneettisellä muutokset vastaavat joitakin reittejä aiemmin tunnistettu laajassa merkityksessä. Ulkonäkö 3 miRNA geenien meidän

elossapysy-

joukko, jotka kaikki on tunnistettu keskeisiksi transkriptio sääntelyviranomaisten PDAC, on hiukkas- huomautuksen ja antaa meille enemmän luottamusta lähestymistapa olemme ottaneet.

Lopuksi alustava testi mahdollisista ennakoivan hyödyllisyyttä DNA: n metylaatio haimasyövän elossaololuku testasimme 3

elossapysy-

sivustoja esiintyvät 3 geenejä, joissa on useita

elossapysy-

sivustoja paikoissa, joille on näyttöä proteiineihin. Metylointi arvot kutakin näistä sivustot voivat dichotomize potilaille lyhyiksi selviytymisen ja pidemmän selviytymisen tilastollista merkittävyyttä.

tulokset Tämän lähestymistavan osoittavat selvästi, että DNA metylaatiomuutokset keskeisten solun kohtalon määrittämiseksi geenien liittyy vahvasti PDAC etenemistä. Tutkimuksessa pitäisi motivoida kerätä lisää näytedatan vahvistamaan tuloksemme sekä kehittää biomarkkereita perustuu DNA metylaatiomuutokset liittyy näiden keskeisten geenien.

Menetelmät ja materiaalit

Potilaat ja näytteet

kaikki työt suoritettiin hyväksymisestä University of California, Los Angeles (UCLA) Institutional Review Board kanssa kirjallinen suostumus kaikilta potilailta. Näytteitä PDAC kasvaimia ja ei-pahanlaatuisten haima jäädytettiin nopeasti aikaan leikkauksen. Kasvaimen sisältö arvioitiin hematoksyliinillä ja eosiinileikkeissä jota harjoitellaan ruuansulatuskanavan patologi (DWD). Kaikki ennusteeseen viittaavia ja selviytymisen tiedot potilaille oli poimittu prospektiivisesti säilyy UCLA kirurginen tietokanta haiman potilaista. Kokonaiselossaoloaika määritettiin etsimällä Social Security Death Index ja selviytymisen välein laskettiin jona leikkaus mennessä vahvistettu kuoleman tai viime potilaskytkentä.

Tätä tutkimusta varten yhteensä 16 näytettä käytettiin, mukaan lukien 11 PDAC kasvaimet, 2 normaali näytteet ja 3 krooninen haimatulehdus näytteitä. Kliiniset tiedot näiden näytteiden annetaan S1 taulukossa.

Alennettu edustus bisulfiitti sekvensointi

Perimän DNA kaikista näytteistä uutettiin luoda kirjastoja alennettua edustus bisulfiittia sekvensointi (RRBS) seuraava vakioprotokolla [ ,,,0],77]. Digestiot suoritettiin metylaatio erottelua restriktioentsyymillä, MspI, ja fragmentit, jotka vaihtelevat 50-300 emästä valittiin rikastamiseksi CpG rikkaita alueita. Pilkkomisen jälkeen, näytteet liitettiin Illumina sovittimia, koko valittu, denaturoitiin ja käsiteltiin natriumbisulfiitin paljastaa metylaatiotila. Kirjastot sekvensoitiin Illumina Hiseq 2000 sekvenssereitä.

Yhdistelmät lukee kartoitettiin ihmisen viite genomin (hg19) käyttäen BS Seeker2 joukko laskennallisia työkaluja [78]. Kuten vetysulfiittikäsittelyä muuntaa metyloitumattomat sytosiinit tymiiniä, me laskenut metylaatio taso kullakin genomiikan CpG sivuston osa lukee ainutlaatuisesti kartoitettu että sivusto sisältää sytosiini.

Tietojen suodatus

suodattanut joukko metylaatiokohtia myöhempää analyysia käyttäen kahta tilastotietojen perusteella tarkoitus valita biologisesti asiaan sivustoja ja parantaa loppupään laskelmia. Ensinnäkin, kuten metylaatiotila tietyllä sivusto on binomimallia taajuus arvion, me lasketaan luottamusvälit käyttäen Clopper-Pearsonin menetelmällä [79]. Olemme mukana vain kohteissa, joissa metylaation taajuudet kullekin 16 näytteillä oli 95%: n luottamusväli on alle 0,25. Toiseksi, me lasketaan keskihajonta poikki 16 näytettä ja lopetettujen sivustoja keskihajonta = 0.05 tarkempaa analysointia.

Tilastollinen analyysi

pääkomponenttianalyysiin [80] tehtiin metylaatio vektorit muodostuvat kaikista sivustoja, jotka läpäisseet suodattimet kuvatulla tavalla. Coxin [81] kanssa sensurointi käytettiin laskemaan regressiokerroin ja liittyvä p-arvo kunkin toimipaikan erikseen määritellä merkki ja vahvuus suhde Eloonjääntitulokset. Samoin joidenkin nähtävyyspaikoilla esitetty Tulokset ja keskustelu, me lasketaan Kaplan-Meier [82] käyrät ja log-rank p-arvoja dichotomizing näytteet keskiarvon perusteella metylaatio arvoon kunkin sivuston.

Function ja Pathway Analysis

tutkimiseksi toiminnallinen vaikutuksia metylaatiokohtia vahvojen korrelaatio selviytymiseen, käytimme genomialuetta rikastaminen Annotations Tool (GREAT) [17]. Tämä työkalu aggregaattien useita tietokantoja biomolekulaaristen huomautusta ja laskee tilastollista assosiaatioita näistä merkeistä ja tietyn syötejoukon genomista alueilla. Meidän tulo, käytimme osajoukko metylaatiokohtia p-arvot alle 0,05. Taustan, käytimme kaikki sivustot, jotka läpäissyt kahden luokan suodattimet. Suurten syöteparametrit valitsimme yhden lähimmän geenin vaihtoehto ja maksimaalinen laajentaminen 100 kiloemäksen transkription aloituskohdasta kunkin geenin.

Koska suuri määrä CpG sivustoja tarkastellaan tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet soveltamaan Tavanomaisten useisiin testaus korjauksia [83] näihin p-arvot. Seurauksena aliedustusta alhaisen p-arvot meidän data verrattuna yhtenäinen satunnainen odotuksia, vääriä löytö hinnat saimme oli todennäköisesti liioiteltu. Kuitenkin kuten on esitetty Tulokset ja keskustelu, käyttäen korjaamattomia p-arvojen valitsemiseksi loci yhteenlaskettuina (per geeni tai genominen alue) vakuuttavalla talteenotto toiminnallisten huomautusta ja geenien aiemmin korostettu kirjallisuudessa, mikä viittaa siihen, lähestymistapamme on vankka. Lopuksi vertasimme joukko geenejä vahvimmin rikastettu merkittävä metylaatiokohtia luetteloihin geenien havaittiin olevan merkittävästi mutatoitunut laaja exome sekvensointiprojektista [4, 5].

tukeminen Information

S1 Kuva. Taustaa jakelu Sivustokohtaiset Average Metylointi arvot.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0128814.s001

(TIFF)

S2 Kuva. Genome selain visualisointi esimerkin Genes kanssa Survival + Sites.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0128814.s002

(TIFF) B S1 Taulukko. Kliinis ominaisuudet potilaan näytteitä.

Kliiniset muuttujat kerätään haiman adenokarsinooma tutkimuspotilaat.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0128814.s003

(XLSX)

S2 Taulukko. Toiminnallinen perusta Periaate Component 1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0128814.s004

(XLSX)

S3 Taulukko.