Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on merkittävä syy sairastuvuutta ja kuolleisuutta korostettu, turvallinen ja tehokas chemopreventive strategioita. Kohdistaminen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) on houkutteleva, koska se on varhainen kriittinen tapahtuma HNSCC synnyssä. Kuitenkin nykyinen aineita ole tehoa tai on hyväksyttävää myrkyllisyyttä. Useat ryhmät ovat osoittaneet, että over-the-counter lääkitys, polyetyleeniglykoli (PEG) on merkittävä chemopreventive tehoa vastaan ​​paksusuolen syövän synnyn. Tärkeintä, on raportoitu, että tämä vaikutus välittyy EGFR sisäistämisen /hajoamista. Nykyisessä tutkimuksessa tutkimme chemopreventive tehosta aineena HNSCC käyttäen sekä hyvin validoitu eläinmallin 4-NQO (4-nitrokinoliini 1-oksidi) rottamallissa ja soluviljelmä ihmisen HNSCC solulinjaa SCC-25. Olemme osoittaneet, että päivittäin paikallisesti 10% PEG-8000 suuontelon (kielen ja seinät) jälkeisen 4NQO aloittaminen johti merkittävään vähenemiseen tuumorikuorma (molemmat, kasvaimen koon ja kasvainten /kasvain rotta) ilman mitään näyttöä myrkyllisyydestä . Immunohistokemialliset tutkimukset kuvattu vähentynyt proliferaatio (lukumäärä Ki67-positiivisten solujen) ja vähensi ilmentyminen EGFR ja sen loppupään efektoreja sykliini D1 kielen limakalvon 4NQO-rotilla, joita hoidettiin PEG. Osoitimme, että EGFR myös merkittävästi vaimentua SCC-25 soluihin PEG-8000, jossa on samanaikaisesti induktion G1-S-vaiheessa solukierron pidätyksen, joka mahdollisesti välittyvät voimistunut p21

CIP1 /waf1. Lopuksi osoitamme, ensimmäistä kertaa, että PEG on lupaava tehoa ja turvallisuutta kuin chemopreventive tehoa vastaan ​​suun syövän syntymistä.

Citation: Wali RK, Kunte DP, De La Cruz M, Tiwari AK, Brasky J Weber CR, et ai. (2012) ajankohtaisista polyeteeniglykoli uutena chemopreventive Agent for Oral Cancer kautta kohdentaminen kasvutekijän Response. PLoS ONE 7 (6): e38047. doi: 10,1371 /journal.pone.0038047

Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 syyskuu 2011; Hyväksytty: 02 toukokuu 2012; Julkaistu 4. kesäkuuta 2012

Copyright: © 2012 Wali et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus National Institute of Health U01CA111257, R21CA141112, 1R21CA156944-01, RO3CA139528, RO1CA156186. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: RKW, SS ja HKR ovat mukana perustamassa Pegasus Biosolutions LLC. On yksi vireillä väliaikainen Yhdysvallat patentti. Ei ole niin kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Okasolusyöpä pään ja kaulan alueella (HNSCC) on kuudes yleisin syöpä maailmassa, eli 3% kaikista syövistä [1]. Vuonna 2010 pelkästään Yhdysvalloissa oli arviolta 49.000 uutta HNSCC tapausta ja 11500 HNSCC liittyvien-kuolemat [2]. Mikä tärkeintä, nämä luvut eivät ota huomioon vakavia sairastavuuden kasvojen epämuodostumista ja aerodigestive dysfunktio liittyy leikkaukseen /sädehoidon. Ehkäisy Tämän maligniteetin vuoksi on merkittävä terveydenhuollon välttämätöntä. Muutokset tiettyjen elämäntapaa riskitekijöitä olisi ihanteellinen, mutta vaikea toteuttaa huolimatta merkittävä kansanterveydellinen pyrkimyksiä tupakan käytön (sekä savustettu ja pureskella), pähkinä pureskelua, alkoholin kulutus ja HPV (infektio) tila.

Siksi kiinnostus on keskittynyt kemopreventiossa koska riskiryhmiin ovat hyvin määriteltyjä primaariehkäisyn ponnisteluja; joilla varhainen neoplastisen transformaation (suullinen valkotäpläisyydestä), joka voidaan tunnistaa tavallisella fyysinen tentti. Yhtä tärkeä sovellus olisi toissijainen kemopreventiossa (estää toisen esivaaleissa HNSCC potilailla, joilla on aiemmin ollut syöpä).

On huomattava, että jopa sen jälkeen onnistuneen kasvaimen resektion (histopatologisesti kirkas marginaalit); -20% Potilaista saattaa silti olla uusiutumisen HNSCC eri kohtaan (noin 2% vuodessa) [3]. Tämä on suurelta osin johtuvan ”kentän cancerization” et [4]. Todellakin, klassinen tutkimukset ovat osoittaneet, että useat mutaatiotapahtumaa vuonna mikroskooppisen normaali limakalvo voi olla ennakoivaa toistuvia HNSCC ja eloonjäämiseen [5]. Tämä ”tuomitsi limakalvo” käsite on vankka paitsi uusiutumisen ehkäisyssä (sekundaariehkäisyssä) vaan se tarjoaa myös potentiaalinen kohde ensisijaisen kemopreventiolle (potilaat ilman syöpä, mutta joilla syöpää edeltävät vauriot).

siis löytää molekyyli tavoitteet premaligni limakalvolla on ollut yleisenä teema HNSCC ehkäisy epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) vastaanottaa jonkin verran huomiota. EGFR on kriittinen varhainen tapahtuma HNSCC ja yli-ilmennetään 80% HNSCC. EGFR yli-ilmentymisen ja lisääntynyt kopiomäärä suun syöpää edeltävät vauriot on erinomainen ennustaja riskiä etenemisen HNSCC [6]. Lisäksi, EGFR yli-ilmentyminen on havaittu histologisesti normaalin limakalvon HNSCC potilaista osoittaa, että muutettu EGFR signalointi osallistuu alan cancerization näillä potilailla havaitusta [7]. Tärkeää on, kohdistaminen EGFR on roteva anti-HNSCC hoitojen korostumisena tämän reitin. Kuitenkin, kuten useimmat muut molekyylitason kohdennettuja lääkkeitä, suuret kysymykset käyttää anti-EGFR aineita (monoklonaalisia vasta-aineita, pienmolekyylisalpaajien ym) kemopreventiolle ovat niiden korkeat kustannukset pitkäaikaiseen käyttöön ja liittyvää toksisuutta, etenkin kun otetaan huomioon, että suurin osa potilaista tarjotaan kemopreventiivisiä aineita ei ole syöpä. Siksi löytää edullinen, hyvin siedetty mekanismi kohdistaa EGFR suun limakalvojen olisi suuri edistysaskel HNSCC kemopreventatiivisesti vaivaa.

Ryhmämme on tutkinut over-the-counter laksatiivinen (PEG) varten sen huomattava teho on vähen- tämisessä EGFR ja mikä tarjoaa potentiaalia selityksen paksusuolensyöpä chemopreventive tehon (dokumentoitu useiden ryhmien useissa prekliinisen mallit) [8], [9], [10], [11], [12 ], [13]. Vuodesta mekanistinen näkökulmasta, havaitsimme, että PEG johti nopeaan sisäistämisen kalvoon sitoutuneiden EGFR samanaikaisen proteosomal hajoamista. Tämä johtaa vähentyneeseen sykliini D1 ja SNAIL (osallisina sekä peräsuolen syöpä ja HNSCC) siten transdusoimaan antineoplastisia vaikutuksia PEG [13].

Siksi arveltu, että paikallisesti PEG voi olla tehokas chemopreventive aineena HNSCC . Näitä tutkimuksia varten käytimme validoitu hyvin karsinogeeni, 4-nitrokinoliini 1-oksidi (4-NQO) -käsitellyssä rottamallissa HNSCC ja squamous syöpäsolun linja, SCC25 soluja. Koska huoli siitä, että PEG voi häpeään vaikutus suoralla karsinogeeni-suun limakalvon vuorovaikutus, käytimme jälkeistä aloittamisesta suunnittelun avulla kasvaimen koon ja moninaisuus ohjelmistoalustaan ​​ensisijaisena päätepisteitä ja hyvin validoitu väli- biomarkkerit leviämisen toissijaisena päätepisteenä. Me, tässä ensimmäistä kertaa, osoittaa, että päivittäinen paikallisesti suun kautta PEG-8000 lyhyen aikavälin vähensi merkittävästi oraalisen kasvaintaakkaa (sekä kasvaimen koko ja määrä).

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet Tutkimukset ja syöpäkasvainten

Kaikki eläin protokollat ​​tarkistettiin ja hyväksyttiin Institutional animal Care ja käyttö komitean NorthShore University HealthSystem (IACUC Assurance # A3444-01; protokolla # 07-230). Kaksikymmentäneljä uros Fisher rottia (F 344, 150-200 g, Harlan, Indianapolis, IN) pidettiin ilmapiirissä kontrolloidussa ympäristössä (25 ° C lämpötilassa, 60% kosteus ja 12 tunnin valo /päivä sykli). Kuusitoista eläimet edellyttäen

halun

rotan ruokaa ja juomavettä täydennettiin 4-nitrokinoliini 1-oksidi (4NQO, 20 ppm Sigma Chemicals). Tuoreita 4NQO täydentää vettä jaettiin rotille valoa läpinäkymätön pulloihin, jotka oli täydennetty kaksi kertaa viikossa. Loput 8 Rotat edellyttäen puhdasta juomavettä (kontrolliryhmä). Kuluttua 14 viikon 4NQO täydentää vettä korvattiin tavallista vettä ja rotat satunnaistettiin kahteen hoitoryhmään. Ensimmäinen ryhmä (8 rottaa) sai päivittäin paikallisesti 10% (W /V) PEG-8000 (annos /muotoilu tehokas paksusuolensyöpä kemopreventiossa) maalaamalla bukkaalisen lattia /katto rotan suuontelon käyttäen soopeli harja (# 4) enintään 3-4 minuuttia. Näistä hoidoista, rottia lievästi rauhoitettiin hyvin säännelty isofluraani /happea anestesia kammioon. Toinen ryhmä (8 rottaa), joka toimii valvonta, oli huijausta maalattu harjalla kastettu suolaliuosta vain. Tätä hoitoa jatkettiin 14 ylimääräistä viikkoa. Ruumiinavauksessa rotan kieliä leikattiin irti ja alistettiin makroskooppisen kasvaimen arvioinnin. Kielen osat leikattiin, formaliinilla, parafiiniin, leikattiin ja sille tehtiin histologisia ja immunohistokemiallista käsittelyä.

Tumor lukumäärä ja volyymi

leikattiin kielet tutkittiin läsnäolon ilmeistä kasvaimia. Kokonaismäärä kasvaimet ( 0,2 cm) kunkin kielen laskettiin ja kasvaimen tilavuus (koko) mitattiin kaavalla leveys x pituus x korkeus x π /6 [14]. Histologinen arvioinnit läsnäolo epiteelin atypia ja dysplasiaa että sivullisten kielen kudos tehtiin värjäyksen jälkeen hematoksyliinillä ja eosiinilla.

immunohistokemiallinen (IHC) Analysis

kielen osat tehtiin IHC analyysiä vaikutuksen määrittämiseksi PEG ilmenemistä leviämisen merkkiaineiden Ki67, EGFR ja sykliini-D1. Neljän mikronin parafiiniin upotetut leikkeet kiinnitettiin Superfrost

+ diat (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ja parafiini ensimmäisen paistaminen 55-60 ° C: ssa 1 tunti ja sitten suorittamalla kaksi 5 minuutin pesua ksyleenissä. Kudos jälkeen leikkeet hydratoitiin luokiteltujen sarjojen etanolia rinses. Epitooppi haku suoritettiin altistamalla kudos liukuu paineen mikrouuniin (NordicWare, Minneapolis, MN) antigeenin paljastumista liuokseen (Vector Laboratories). Endogeeninen peroksidi aktiivisuus pysäytettiin käsittelemällä 3% H

2O

2 metanolissa 10 minuutin ajan, ja epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla kudosleikkeet 5% hevosen seerumia 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Leikkeitä inkuboitiin sitten 4 ° C: ssa 4-6 tuntia primaarisilla vasta-aineilla [anti-Ki67 (1:250; Abcam, Cambridge, MA), anti-EGFR (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ja anti-sykliini D1 (1:100; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)], jota seuraa sopiva biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita. Antigeeni-vasta-komplekseja ei havaittu Vectastatin Elite ABC -kittiä (Vector Laboratories) käyttämällä 3, 3 ’-diaminobenzidine (DAB), kuten kromogeenina (Vector Laboratories). Negatiivisia kontrolleja, leikkeet käsitellään ilman ensisijaisen vasta-aineita. Näytteet vastavärjättiin vuonna Gillin hematoksyliinillä ratkaisu ja sininen väri vakiintui 20 sekunnin pesu tyydyttyneitä litiumkarbonaattiliuosta (1 g /100 ml). IHC teki patologi (CW) ilman aiempaa tietoa hoitosuunnitelman. Puolikvantitatiivista mittakaavassa käytettiin arvioimaan immunoreaktiivisuus tyvi- squamous epiteelisolujen. Laajuus värjäys luokiteltiin ja pisteytettiin 0, negatiivinen värjäys; 1+, 10% reaktiivisuus, 2 + 10-50% reaktiivisia, ja 3+ varten 50% positiivista reaktiivisuus [15].

Cell Culture

SCC-25-soluja saatu American Type Tissue Culture (ATCC), Rockville, MD. Nämä ovat huonosti eriytetty okasolujen saatuja ihmisen kieli. Identiteetti ja laatu näitä soluja todistaa oikeaksi ATCC. Soluja viljeltiin DMEM /F-12 Media (joka sisälsi 2,5 mM L-glutamiinia, 15 mM HEPES, 0,5 mM natriumpyruvaattia, 1200 mg /ml natriumbikarbonaattia), jota oli täydennetty 400 ng /ml hydrokortisonia (Sigma /Aldrich), 10% FBS (ATCC), ja 0,5% Pen /Strep (ATCC). Vaikutuksen arvioimiseksi PEG, näitä soluja käsiteltiin joko PEG-8000 tai vehikkeliä (PBS) 24 tuntia. Sitten solut otettiin talteen ja altistettiin Western blot ja virtaussytometrinen analyysit.

proliferaatiomääritystä

Solujen lukumäärä määritettiin WST-1 (4- [3- (4-jodifenyyli) -2 – (4-nitrofenyyli) -2H-5-tetrazolio] -1, 3-bentseenidisulfonaatti) mukainen määritys valmistajan ohjeiden (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Lyhyesti, SCC-25-soluja kasvatettiin 96-kuoppaisissa levyissä lopullisessa tilavuudessa 100 ui ja inkuboitiin sitten 10 ui WST-1-reagenssia 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Muuntaminen tetratsoliumsuolaa osaksi formatsaanin määritettiin spektrofotometrisesti aallonpituudella 440 nm absorbanssi (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Cell Cycle Analysis

SCC-25-soluja inkuboitiin ajoneuvon (fosfaattipuskuroitu suolaliuos; PBS) tai 10% PEG: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solut pestiin sen jälkeen PBS /naudan seerumin albumiinia (BSA), trypsinoitiin, suspensoitiin uudelleen tuoreeseen PBS /BSA: ta ja kiinnitettiin 70% etanolilla -20 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun 2 pesun jälkeen soluja inkuboitiin 3 h (huoneenlämpötilassa) PBS /BSA-liuosta, joka sisältää propidiumjodidia (PI; 40 ug /ml, Sigma) ja RNaasi A: ta (200 ug /ml; Sigma). Solut altistettiin DNA-pitoisuuden mittaus virtaussytometrialla (Becton Dickinson Labware). Tiedot ilmaistiin prosenttiosuutena solujen G

O-G

1 kautta G

2-M väestön ja CellQuest 3,1 ohjelma käytettiin kehittämiseen DNA sisällön frekvenssihistogrammien.

Western Blot analyysi

Western blotting sovellettiin käyttäen standarditekniikoita. Lyhyesti, 30 ug proteiinia tehtiin SDS-PAGE, siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), blokattiin 5% BLOTTO: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden, mukaan lukien proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA), P21

CIP1 /waf1, sykliini D1, epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR). Xerograms kehitettiin parannettu kemiluminesenssin (Santa Cruz Biotechnology). Kuvat otettiin kautta UVP Bio-imaging Järjestelmät ja analysoitiin Labworks 4.6 ohjelmistoa. Yhdenmukaisuuden Proteiinilisäyksen saavutettiin normalisoinnin jälkeen tutkimalla kalvoja anti-β-aktiini (1:1000).

tilastolliset menetelmät

Arvot ilmaistiin keskiarvona + SE kuten. Quantitative densitometrian verrattiin pari-Studentin testiä. Erot p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

PEG Estää 4NQO aiheuttama Oral kasvain aloittaminen ja Progression

Rotan 4NQO aiheuttaman suun syövän synnyn malli on rutiininomaisesti käytetyt malli HNSCC kemopreventiolle tutkimuksiin, joka jakaa useita piirteitä ihmisen HNSCC karsinogeneesin kannalta monivaiheinen molekyyli tapahtumia ja juokseva muutokset histopatologisia piirteitä suuontelon limakalvon [16], [17]. Yksi muista eduista tämä malli on suhteellisen korkea spesifisyys kohti pään ja kaulan kasvaimet sekä vähäinen heikentävä vaikutus yleisen terveyden rottia. Kuten on esitetty kuviossa 1 (A), ruumiinavauksessa (14 viikkoa lopettamisen jälkeen karsinogeeni hoidon), 4NQO-käsiteltyjen rottien kehitetty useita suuria kasvaimia suuontelossa, enimmäkseen peräisin kielen ja osa siitä suun ja nielun limakalvoon. Annettu PEG-8000 14 viikon suoritettuaan 4NQO hoidon osoitettiin kaksi merkittävää muutosta: 1) PEG-8000 käsiteltyjen rottien kehittynyt merkittävästi pienempiä kasvaimia (kasvaimen tilavuus) kuin niiden ikä- ja 4NQO hoito-täsmäsi kollegansa (~58% lasku; p = 0,02); 2) yleinen kasvain numero (kasvaimia /kasvain rotta) PEG-8000 käsitellyillä rotilla oli myös alempi kuin iän ja 4NQO hoito yhteensopivaa rottaa, jotka eivät saaneet PEG-8000 missään vaiheessa (-25%: n lasku; p = 0,05 ) (kuvio 1 B). Nämä tulokset merkitsevät sitä, että PEG-8000 sovellus voidaan tehokkaasti vähentää muodostetaan uusia kasvaimia (esto aloittamisesta) sekä pysäyttää etenemisen ennestään kasvaimet kohti kehittyneitä HNSCC (etenemisen estämiseksi).

Ensimmäinen ryhmä sai päivittäin (3-4 min) paikallisesti 10% PEG-8000 suun kautta maalaus ja toinen ryhmä oli huijausta maalattu (PEG-kontrolliryhmä). Tätä hoitoa jatkettiin 14 ylimääräistä viikkoa ennen euthanization. Rotat lopetettiin sen jälkeen, kun 14 viikkoa ja suuontelon suoritettiin makroskooppinen kasvaimen arviointi yhteensä kasvaimia (≥0.2 cm). Kuten on esitetty, 4NQO saaneilla rotilla kehittänyt useita suuria kasvaimia suuontelon enimmäkseen peräisin kielen ja muutaman seinästä suuontelon. PEG vähensi koko kasvain numero (kasvaimia /kasvain rat) (p = 0,05) ja kasvainten kasvua (kasvaimen tilavuus) verrattuna niiden samanikäisiin kollegansa (p = 0,02). Kasvaimen tilavuus (koko) mitattiin kaavalla leveys x pituus x korkeus x π /6.

PEG vaimentaa Premalignit epiteelikasvaimet liikakasvuun

tarkka ajallinen ja paikallinen sääntely hajanainen soluproliferaatioon on tärkeä ominaisuus alkuvaiheen HNSCC syövän synnyn, ja toimii tärkeänä välineenä arvioitaessa kemopreventiivisten tehokkuuden aineita. In 4NQO-käsitellyn rotan HNSCC karsinogeneesin, yleistynyt soluhyperproliferaatio kielessä epiteelissä on aiemmin kuvattu [18]. Mikroskooppinen arviointi limakalvon 4NQO saaneilla rotilla havaittiin monia paikallisia alueita lievästä kohtalaiseen epiteelin dysplasiaa morfologisesti normaali kielen ja suun limakalvon normalisoitiin PEG (kuvio 2A). Lisätutkimuksia vaikutuksista PEG-8000 sovellus leviämisestä kielen /suun limakalvon 4NQO saaneilla rotilla, tutkimme immunohistokemiallinen ilmaus ydin- antigeenin Ki67, hyvin määritelty merkki leviämisen. Tätä varten yhteensä 1000 epiteelisolujen arvioitiin 6-7 aloilla 400 x suurennus ja kaikki arvot olivat pakkausmerkinnät indeksit. Kuten kuviossa 2A ja B, 4NQO-hoito lisäsi merkittävästi proliferaatiota morfologisesti normaali kielen limakalvon kuten on kuvattu (lukumäärä Ki67-leimatun epiteelisolujen /per optinen kenttä: 30 + 8 4NQO-hoitoryhmässä vs. 14 + 6 Hyväksytty valvontaa; p 0,01). Ajankohtainen soveltaminen PEG-8000 dramaattisesti normalisoitu leviämisen indeksien 4NQO saaneilla rotilla (lukumäärä Ki67-leimatun epiteelisolujen /per optinen kenttä: 30 + 8 rottia altistettiin 4NQO-alone vs. 17 + 4 4NQO saaneilla rotilla, joita hoidettiin PEG-8000; ~43% vähennys; p 0,01). Limakalvon epiteelissä 4NQO-käsitellyillä rotilla, verrattuna normaaliin levyepiteeli, joissa proliferaatio on rajoitettu pohjapinta osastoon, leviämisen vyöhyke laajennetaan supra-pohjapinta osastoon kerrostunut suomuinen kielen epiteelin. Kuitenkin PEG-8000 sovellus sisälsi proliferatiivinen vyöhyke takaisin pohjapinta osastoon kerrostunut levyepiteeleissä, mikä osoittaa vahvaa antiproliferatiivisia vaikutuksia tämän ajankohtainen agentti.

Kuten (yläpaneeli, kuvio 2A), 4NQO- käsitelty rotta kohdat paljasti monia paikallisia alueita lieviä tai kohtalaisia ​​epiteelin dysplasiaa morfologisesti normaaleilta vaikuttavien limakalvon normalisoitiin PEG [korkeampi suurennus (63 ×; rajattu kuva) sisäkkeet osoittavat läsnäolo mitoosi luvut 4 NQO hoidetussa ryhmässä yksin]. Lisätutkimuksia vaikutuksista PEG limakalvon hyper-leviämisen, suoritimme immunohistokemiallinen analyysi tuma-antigeeni Ki67, hyvin määritelty merkki leviämisen. Yhteensä 1000 epiteelisolujen arvioitiin 6-7 kentät. Kuten on esitetty (alapaneeli, kuva 2A-B), 4NQO-hoito lisäsi proliferaatiota morfologisesti normaali kielen limakalvon kuvailema lisääntynyt määrä Ki67-leimatun epiteelisolujen /per optisen alan verrattuna iältään vastaaviin karsinogeeni ilmaiseksi valvontaa. (P 0,01). Ajankohtainen soveltaminen PEG toisaalta dramaattisesti vähensi Ki67-leimatun epiteelisolujen /per optisen alan (p 0,01).

PEG Downregulates Tongue Limakalvorokotteita EGFR ja sykliini D1 Expression 4 NQO- käsitelty Rotat

EGFR yli-ilmeneminen premalignien pään ja kaulan vaurioita korreloi suurentunut eteneminen HNSCC ja huono selviytyminen [19], [20]. Moduloiva EGFR voi siis olla keskeinen osatekijä chemopreventive strategiaa. Useat ryhmät, myös meidän ovat aiemmin osoittaneet, että antiproliferatiivisia ja chemopreventive vaikutukset PEG vastaan ​​peräsuolen syövän synnyn ovat EGFR-välitteisen, koska annettu PEG-gavages in karsinogeeni käsiteltyjen rottien vähensi lisääntymistä paksusuolen limakalvon kautta downregulation EGFR [13]. Siksi, selvitettävä, jos samanlainen mekanismi osallisena chemopreventive toimia paikallisesti PEG-8000 vastaan ​​HNSCC. Kielen leikkeet kiinnitettiin formaliinilla ja tutkittiin immunovärjäyksellä arvioida muutoksia ekspressiotasot EGFR. Kuten kuviossa 3A ja B, paikallisesti PEG-8000 alensi merkittävästi intensiteetti sekä alueiden määrä yli-ilmentävät EGFR 4NQO saaneilla rotilla, jossa lähtötilanteen EGFR oli paljon suurempi kuin kielen /suun limakalvon terveistä kontrolleista rotilla. Tämä implicates downregulation EGFR yhtenä mahdollisten mekanismien PEG-indusoidun kemopreventioon HNSCC. Olemme lisäksi osoittaneet, että PEG vähensi ilmentymisen sykliini D1, alavirtavaikuttajainhibiittorit EGFR, joka yli-ilmentyy HNSCC [21] ja mukana aiheuttaa resistenssin terapeuttisten lääkkeiden, kuten sisplatiinin [22]: n ja gefitinibin [23].

Kuten (vasen paneeli – kuvio 3A ja 3B), perustason EGFR kielessä limakalvolla 4NQO-rottien oli korkeampi kuin kontrollirottien (p 0,00001). Ajankohtainen soveltaminen PEG aiheuttivat kuitenkin merkittävä väheneminen ilmaus EGFR (p 0,005). Lisäksi paikallisesti PEG sovellus 4-NQO rotille aiheutti samanlaisia ​​vaikutuksia ilmaus sykliini D1, yksi alavirran efektorien EGFR (oikea paneeli – kuvio 3A ja 3B).

PEG Estää soluproliferaation ja indusoi solukierron pysähtymisen SCC-25 Cells

ymmärtää mekanismia PEG toimia solujen proliferaation HNSCC; käytimme

in vitro

soluviljelymalli (levyepiteelikarsinoomasolu linja, SCC-25) tutkia vaikutus PEG leviämisen ja solusyklin jakelu. Kuten kuviossa 4A on esitetty, WST-1 runsaudenmäärityksessä paljasti annoksesta riippuvainen lasku SCC-25 solujen kasvu, kun niitä käsitellään PEG 24 h, maksimaalinen väheneminen 43% saadaan 10% PEG-8000. Siksi seuraavissa kokeissa 24 h hoidot 10% PEG-8000 käytettiin. Immunoblot-tulokset osoittivat, että PEG on myös aiheuttanut ~ 50% laskun proliferaatiossa merkki, PCNA (kuvio 4B). Solusyklin pysähtymisen on yksi tärkeimmistä mekanismeista kemopreventiivisiä aineita. Vaikutuksen tutkimiseksi PEG-8000 on solu- jakautuminen suoritimme virtaussytometria-analyysin PI leimattuja soluja. Tuloksemme osoittavat, että 24 tunnin hoito SCC-25-solujen kanssa 10% PEG-8000 johti merkittävään vähenemiseen S-vaiheessa (proliferatiivinen) soluja (62% ajoneuvon hallinnan; p 0,002) ja merkittävä kasvu G2-M faasisoluja (138% auton hallinnan; p 0,001) (kuvio 4C). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että PEG hoito indusoi solukierron pysähtymisen hyperproliferatiivisissa soluissa, ja voi näin ollen auttaa palauttamaan solun homeostaasin muuttamalla muuttaa määrien syöpäsolujen kasvua ja kuolema.

Kuten kuvassa (kuva 4A), oli annoksesta riippuvainen lasku solujen kasvua, enimmäislaskun 43% saadaan 10% PEG-8000. Kuvio 4B esittää -50% laskua ilmenemistä leviämisen merkki PCNA PEG. Kuvio 4C esittää vaikutusta PEG solusyklin jakautuminen. 24 h PEG käsitellyt solut värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla. PEG estetty solujen S-vaiheen (62%) ja vastaavasti kasvattaa solut G2-M vaihe (38%).

hoito SCC-25 Cells PEG Vähentää EGFR ja sykliini D1 ja moduloi Expression solusykliä säätelevien Protein p21

CIP1 /waf1

meidän

in vivo

4NQO rotta kokeita, EGFR ja sykliini D1 olivat kaksi tärkeää tavoitteiden vaimentua PEG; halusimme tutkia, jos samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin HNSCC solulinjoissa. Ensin suoritetaan immunoblottauskokeissa arvioimiseksi ilmaus EGFR ja sykliini D1 päälle 24 h hoito PEG-8000 SCC25 soluissa. Sopusoinnussa

in vivo

kokeissa olemme huomanneet, että hoito SCC25 solujen PEG-8000 aiheutti merkittävän laskun EGFR (~45% verrattuna ajoneuvon hallinnassa; p 002) ja sykliini D1 (~57% verrattuna kontrollivehikkelillä; p 0,005) lauseke (kuvio 5 A). PEG aiheuttama paksusuolensyöpä kemopreventiossa olemme aiemmin osoittaneet, että solusyklin pysähtymiseen aiheuttama PEG-8000 syytöksiä EGFR-välitteisen säätelyä on sykliiniriippuvainen estäjät, p21

CIP1 /waf1 [24]. Vastaavalla koesuunnitelma, olemme huomanneet, että PEG-8000 todellakin aiheutti ~54% kasvu p21 ilmentymistä (p 0,001) SCC25 soluissa (kuvio 5B). Lisätutkimukset ovat käynnissä luonnehtimaan alkupään reittejä osallisena modulaatiota näiden solukierron sääntelyviranomaisten SCC25 soluissa upon PEG hoitoon.

Kuten kuviossa 5A, sopusoinnussa

in vivo

kokeita Peg aiheutti merkittävä lasku EGFR (~45% verrattuna ajoneuvon hallinnassa; p 002) ja sykliini D1 (~57% verrattuna ohjata ajoneuvon; p 0,005) ilmaisua. Vastaavalla kokeellinen protokolla (kuvio 5B), PEG-8000 aiheutti ~54% lisäys p21 ilmentymistä (p 0,001).

Keskustelu

tässä osoittamaan, että ensimmäinen aika, että yhdisteen PEG-8000 tarjosi tehokkaan suojan suun syövän kehittymisen. Meidän soluviljelmissä, jotka osoittavat antiproliferatiivisia vaikutuksia PEG SCC-25-solujen täydentää laski tuumoritaakka hyvin validoitu 4-NQO-rotan HNSCC malli (annettuna jälkeisessä alkuvaihe). Vuodesta mekanistinen näkökulmasta osoitamme downregulation EGFR samanaikaisen estämällä sykliini D1-leviämisen akselin.

HNSCC olisi ilmeisen chemopreventable koska riskiryhmiin ovat helposti tunnistettavissa sekä primaaripreventiossa (tupakka pureskelua, alkoholi, HPV jne) ja sekundaariprevention. Tämä johtuu siitä, HNSCC potilaalla on vain yksi ensisijainen kasvain on merkittävä riski sairastua toisen primaarikasvaimia tulevina vuosikymmeninä. Myös potilailla, joilla on suun kautta valkotäpläisyydestä (esiintyvyys -0,5%), joka synnyttää pahanlaatuinen muutos osuus -5% vuodessa voivat hyötyä tästä kemopreventiossa [25]. Siten PEG HNSCC ehkäisyyn edustaa mahdollisesti kliinisesti käyttökelpoinen strategia.

Tässä suhteessa useita kemopreventiivisiä aineita, kuten NSAID: t [26], E-vitamiini [27] ja retinoiinihappo [28] on testattu HNSCC mutta ovat epäonnistuneet johtuu joko tehon puutteesta tai myrkyllisyyden [29]. Esimerkiksi tuoreessa satunnaistetussa vaiheen II tutkimuksessa selekoksibia 100 tai 200 mg kahdesti vuorokaudessa havaittiin olevan tehoton kontrolloinnissa suun syöpää edeltävät vauriot ja oli merkittävää systeemistä toksisuutta kuten sydän- sivuvaikutuksia [30]. Samoin retinoidit havaittiin tarjoavat vain vaatimaton suojan kehittämistä SCC leukoplakia potilailla, ja kohtuuttomia sivuvaikutusprofiiliin [31]. Ainoa muu aine, joka on osoittanut rohkaisevia tuloksia asti tähän mennessä ollut vihreän teen uutetta (GTE), joka tosin ei saavuta tilastollista merkittävyyttä kliinisissä vaste suun kautta premalignien vaurioiden edelleen lisääntynyt mediaani pituus etenemisen (27,5-46,4kuukautta ) [32].

puute pakottavia tulosten standardin kemopreventiivisten aineiden on johtanut kiinnostusta käyttämällä molekyylitasolla määritellään ehdolla oleva aine lähestymistapa [33]. On ollut kaksi viime kattavia tutkimuksia arvioidaan mutaatiostatuksesta maisemaa HNSCC [34], [35]. Nämä tutkimukset paljastivat useita geenejä, jotka ovat yleisesti muuttuneet HNSCC. Kuitenkin suurin osa oletetun alussa tapahtumia (esim., P53 ja Notch1) näyttävät olevan tuumorisuppressorigeeneille jotka eivät yleensä ole ”druggable” (esto todennäköisemmin on hyötyä proto-onkogeenien). Siksi syövän ehkäisyä, eivät ainoastaan ​​Ehdokaskohteiden tarvitse olla esikasvaintekijät mutta nämä muutokset täytyy olla hajanaisesti läsnä suun limakalvojen ja korkean riskin potilailla, erityisesti suun kautta syöpää edeltävät vauriot (OPLs, pääasiassa koostuu valkotäpläisyydestä). EGFR on osoitettu olevan tavoite hoidossa HNSCC sekä monoklonaalisia vasta-aineita ja pienmolekyylisalpaajien avainosina terapeuttisen armamentarium. Sitä paitsi, meidän tiedot osoittavat selvästi syvällinen säätelyyn ylöspäin EGFR että histologisesti normaalissa suun /kielen limakalvon 4NQO saaneilla rotilla. Tärkeys EGFR alussa karsinogeneesissä painottavat hiljattain kliininen tutkimus, joka osoitti, että useimmissa OPLs, EGFR säätelyä (sekä kopiomäärä ja ilmaus) korreloi suuri riski etenemisen Frank maligniteetin [36], [37]. Vuodesta chemopreventive näkökulmasta EGFR voi olla tärkeä tavoite kuin paljasti mekanistinen arviointi vihreän teen uutetta syövän kemopreventiossa.

Tuloksemme osoittavat, että PEG voi aiheuttaa dramaattisen downregulation EGFR sekä soluviljelmässä ja premalignien suun limakalvon, vastaa meidän laajoja tietoja PEG peräsuolen syövän synnyn. Todellakin, PEG on yksi voimakkaimmista chemopreventive aineena peräsuolen syöpä [8], [38]. Tehoa PEG paksusuolen syöpä on tuettu alustavat epidemiologiset tiedot [39]. Vuodesta mekanistinen näkökulmasta, meidän laboratorio on aiemmin osoitettu, että EGFR säädeltiin vähentävästi PEG soluviljelmässä ja paksusuolen syöpää aiheuttavaksi aineeksi (azoxymethane) -käsitellyssä rottamallissa, [13]. Tämä vaikutus osoittautui kautta kalvo sisäistämisen myöhempiin proteosomal hajoamista. Loppupään seuraukset näyttävät noudattavan paradigma EGFR → SNAIL → E-kadheriinin → β-kateniinin → Tcf transkription säätelyyn [13]. Tärkeää on, että olennainen luonne EGFR osoitettiin sen osoittaminen, että EGFR taintumisen (via shRNA) tasapäiseksi chemopreventive tehoa PEG tässä mallissa paksusuolen syöpä. Tutkimukset ovat parhaillaan käynnissä määrittää tarkka mekanismi, jonka avulla PEG sisäistää EGFR. Lisäksi yhdenmukainen nykyisen tietojen HNSCC, olemme aiemmin osoittaneet, sekä soluviljelmissä ja eläinmalleissa paksusuolisyövän, että PEG aiheuttama EGFR downregulation tukahdutetaan leviämisen mahdollisesti kautta sykliini D1. Lisäksi G1 → S-vaiheessa solusyklin pysähtymisen havaittu voi välittää, ainakin osittain, induktion kautta p21

CIP1 /waf1, sykliinistä riippuvaisen kinaasin estäjä, joka voi tarjota toisen liikennemuodon tukahduttaa leviämisen [24].