Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Aberrant aktivoitumisen kanoninen Wnt /β-kateniinin reitin esiintyy lähes kaikissa kolorektaalisyövissä ja edistää niiden kasvua, invaasio ja selviytymistä. Phopholipase D (PLD) on ollut mukana etenemisessä kolorektaalikarsinoomasta kuitenkin ymmärrystä tavoitteista ja sääntelyn tämän tärkeän reitin vielä kesken ja lisäksi, välinen suhde Wnt signalointia ja PLD ei ole tiedossa.

Menetelmät /Principal havainnot

Tässä osoitamme, että PLD isotsyymien, PLD1 ja PLD2 ovat suoria tavoitteita ja positiivinen palaute säätelijöinä Wnt /β-kateniinin signalointi. Wnt3a ja Wnt jäljittelijät merkittävästi parannettu ilmaus PLDs at transkriptionaalisen tasolla HCT116 peräsuolen syövän soluja, kun taas hiljentäminen on β-kateniinin geenin ilmentymistä tai hyödyntäminen vallitsevaa negatiivista muotoa T solutekijä–4 (TCF-4) esti ilmaus PLDs . Lisäksi sekä PLD1 ja PLD2 olivat erittäin aiheutettiin paksusuolen, maksan ja mahan kudoksissa hiirten injektion jälkeen LiCI, joka on Wnt jäljittelevää. Wnt3a stimuloi muodostumista β-kateniinin /TCF-kompleksien kaksi funktionaalista TCF-4-sitoutumisen elementit PLD2 promoottorin arvioidaan kromatiinin immunosaostuksella määrityksessä. Tukahduttaa PLD käyttämällä geenien tai selektiivinen estetty kyky β-kateniinin transkriptionaalisesti aktivoida PLD ja muita Wnt kohdegeenien estämällä muodostumista β-kateniinin /TCF-4 monimutkainen, kun taas joukkueen nostaa solunsisäisiä tasoja fosfatidihappoa, tuote PLD toimintaa, parantaa näitä vaikutuksia. Tässä osoitamme, että PLD on välttämätöntä Wnt3a perustuva hyökkäyksen ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua koolonkarsinoomasoluissa.

Päätelmä /merkitys

PLD isoentsyymin toimii uutena transkription kohde- ja positiivista palautetta säätelijänä Wnt signalointia, ja sitten edistää Wnt-ajettu kiinnittymisestä riippumatonta kasvua kolorektaalisyövän soluissa. Ehdotamme, että hoitotoimenpiteiden kohdistaminen PLD voivat antaa kliinistä hyötyä Wnt /β-kateniinin perustuva syöpäsairauksia.

Citation: Kang DW, Min DS (2010) Positiivinen palaute asetuksen välillä fosfolipaasi D ja Wnt Signaling Edistää Wnt- Driven Anchorage-Independent kasvu peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 5 (8): e12109. doi: 10,1371 /journal.pone.0012109

Editor: Sudha Agarwal, Ohio State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 05 heinäkuu 2010; Julkaistu: 12 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Kang, Min. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Koreasta Healthcare Technology R Erityisesti PLD2 ekspressiotaso ja sen yhteydessä kliinis on viime aikoina tutkittu kolorektaalikarsinoomasta [10]. Ekspressiotasot PLD2 korreloivat merkittävästi tuumorin koon ja selviytymistä potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen syöpä [10]. PLD2 pistemutaatio on havaittu myös rintasyövän [11]. Yli-ilmentäviä soluja PLD isoentsyymin parantaa matriksimetalloproteinaasi-2 ilmaisun ja kasvainsolun invaasiota ja muoto etäpesäkkeitä hiirissä [12], [13]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että PLD on tärkeä rooli etenemisessä peräsuolen syöpä, ja se voi olla kohteena syövän hoidossa. Olemme viime aikoina raportoineet merkittävistä co-yliekspressio PLD isoentsyymien kanssa β-kateniinin paksu- ja peräsuolisyövän [14]. Käyttämällä kahta RNA-interferenssi (RNAi) -pohjaisen menettämisestä toiminnon näytöissä onkogeenien moduloivien β-kateniinin-riippuvaisen transkription ja säädellä paksusuolensyöpä solujen lisääntymistä on havaittu [15].

Niistä yksi geeneistä tunnistettu tässä näyttö oli PLD1, ja tukahduttaminen PLD1 merkittävästi estämällä sekä β-kateniinin transkriptionaalisen aktiivisuuden ja paksusuolen syövän solujen lisääntymistä. Tässä tutkimuksessa osoitamme toiminta PLD isoentsyymien uusina tavoitteita ja positiivinen palaute säätelijöinä Wnt signalointia. Siten tunnistaminen Wnt-β-kateniinin-TCF-säännelty PLD akseli tarjoaa uusia mekanistinen oivalluksia syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

paksu- syöpäsolut (HCT116, HCA-7, Colo-741, RKO), ja rintasyövän soluja (Hs578T) hankittiin ATCC: stä (Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin standardimenetelmien mukaisesti. Puhdistettu rekombinantti Wnt3a ostettiin R -1930 /+ 1), transkriboidaan eksoni 2, joukossa kaksi vaihtoehtoista selostukset PLD1 transkriboitava kahdella eri transkriptio sivustoja (eksoni 1 ja eksoni 2). PCR-pohjainen menetelmä käytettiin kloonaukseen sarjaan poistetaan PLD2 promoottorin rakentaa osaksi pGL4-14b reportteri-vektorin KpnI: llä ja Bgl II -kohta. Sekvenssi oligonukleotidien käyttää alukkeina PCR-monistukset on esitetty taulukossa S1.

mutaatiot TCF-4 sitovia elementtejä PLD2 promoottorin muodostettiin käyttämällä Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit, mukaan valmistajan suositusten (Stratagene; taulukko S2). TOPflash ja FOPflash lusiferaasin plasmidit, jotka sisältävät useita kopioita TCF /LEF vaste-elementit käytettiin mittaamiseen TCF toimintaa. Vallitsevasti negatiivinen TCF-4 (ΔN30 TCF-4) luovutti ystävällisesti Dr. Tesshi Yamada (National Cancer Center Research Institute). Konstitutiivinen jatkuvasti aktiivisen mutantin β-kateniinin (S37A β-kateniinin) ja villityypin TCF-4 ekspressiovektorit toimitti ystävällisesti Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University). shRNA varten β-kateniinin luovutti ystävällisesti Dr. H. Clevers (Utrecht,. Alankomaat). SiRNA: t valvontaa, PLD1, ja PLD2 ostettiin Dharmacon Research Inc (Lafayette, Colo). siRNA-sekvenssit PLDs ovat seuraavat: ihmisen PLD1 (nukleotidit, 1571-1591, AAGGUGGGACGACAAUGAGCA) ja ihmisen PLD2 (nukleotidit, 1378-1396, ACAUAAAGGUGAUGCGUCA).

Transient transfektio ja Reporter Gene Assay

noudattamalla valmistajan ohjeita, ekspressioplasmidit tai siRNA transfektoitiin transientisti soluihin käyttäen LipofectAmine Plus (Invitrogen) tai Polyfect (Qiagen) reagenssit. Transfektio ja lusiferaasin määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus saatiin normalisoituminen toiminnan tulikärpäsen lusiferaasi vastaan ​​aktiivisuuden sisäisen valvonnan

Renilla

lusiferaasi.

immunoprecipitation ja Western-blottaus

Solulysaatit analysoitiin immunosaostuksella ja /tai immunoblot-, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Anti-α-tubuliinin (Sigma, MO), anti-vimentiinistä (Sigma, MO), anti-c-Myc (Santa Cruz, CA), anti-β-kateniinin (Santa Cruz, CA), anti-NOS2 (Santa Cruz , CA), anti-TCF-4 (Santa Cruz, CA), anti-β-kateniinin (BD Biosciences, CA), anti-cycinD1 (BD Biosciences, CA), ja anti-fosfo-GSK3p-vasta-ainetta (Cell signalointi, MA ) ostettiin. Polyklonaalisen anti-PLD-vasta-aine, joka tunnistaa sekä PLD1 ja PLD2 luotiin kuten aiemmin on kuvattu [18].

PLD aktiivisuuden määritys

PLD-aktiivisuus arvioitiin mittaamalla muodostumista [

3H] phosphatidylbutanol, tuote PLD-välitteisen transphosphatidylation, kun läsnä on 1-butanolia, kuten aiemmin on kuvattu [17].

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA (1 ug) oli esikäsitelty DNaasia ja käytettiin käänteistranskriptioon M-MLV käänteistranskriptaasia (Invitrogen). Reaaliaikainen Q-PCR suoritettiin Roottorin Gene RG-6000A laite (Corbett Research): 44 sykliä, joissa 94 ° C 10 sek, 60 ° C 10 sekuntia ja 72 ° C 15 sekunnin ajan. Reaktiot (20 ui) sisälsi 2 ui cDNA: ta, kohde-spesifisiä alukkeita, ja Quantitect SYBR green PCR -kittiä (QIAGEN). Lämpötila-alue sulamiskäyrien analysoinnilla oli 55 ° C: sta 99 ° C: seen 30 sek. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kunkin reaktion kolmena kappaleena. Kaikki tiedot olivat normalisoitu GAPDH-geenin ilmentymisen arvoja. Katso taulukko S3 Q-RT-PCR-sekvenssit.

Eläinten ja kudosvalmistuksen

Hiiret varustettu standardin huolto- ja ruokavalion Dae Han Bio Link (Seoul, Korea). Eläinkokeet hyväksyttiin ja suoritetaan ohjeiden Institute of Health suuntaviivat Institutional Review Board of Pusan ​​National University (Busan, Korea). Kaksitoista viikon ikäiset uros FVB hiirille annettiin suonensisäinen injektio LiCl kerran päivässä 2 päivää annoksena 5 mg /kg. Kontrolliryhmä injektoitiin sama tilavuus fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia jälkeen LiCI: injektion jälkeen eläimet (n = 3 /ryhmä) syvä anestesia dietyylieetterillä ja katkaistiin kaula, ja kudokset jäädytettiin välittömästi LN

2 ja varastoitiin -70 ° C: ssa immunoblottauksella. Hiiret (n = 3 /ryhmä) myös nukutettiin ja sen jälkeen perfusoitiin intrakardiaalisesti 4% paraformaldehydillä PBS: ssä, joka sisälsi 0,34% L-lysiiniä (Sigma). Seuraavat fiksatiivi perfuusio, kudokset poistettiin, sijoitettiin 4% paraformaldehydi liuokseen 4 ° C: ssa yön yli, ja siirretään sitten 30% sakkaroosiliuosta. Kudoksia käsitellään koronan kryostaatilla Dulbeccon PBS-liuosta, joka sisälsi 0,1% natriumatsidia käyttäen jäädytys mikrotomilla (-mikromolaarinen, Saksa).

immunohistokemia

Paraformaldehydillä kiinteä 4 um parafiinileikkeitä paksusuolen kudoksiin autoklavoitiin 10 mM natriumsitraattia (pH 6,0). Kun oli salvattu 5% BSA: ta ja 1% normaalia vuohen seerumilla PBS: ssä, leikkeitä inkuboitiin anti-β-kateniinin (BD transduktio) ja PLD-vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa, jota seurasi pesu PBS: llä. Sen jälkeen leikkeitä inkuboitiin Alexa fluor 488 tai Alexa fluor 555-konjugoitua IgG sekundääristä vasta-ainetta (Santa Cruz, 1: 200) huoneenlämpötilassa 1 h, mitä seurasi pesu PBS: llä. Sen jälkeen counterstaing DAPI, ja objektilasit asennettu Permount-peitinlaseilla

® (Fisher Scientific, USA). Kaksivärinen fluoresoiva kuva anti-PLD ja β-kateniinin vasta-värjäys koottiin Zeiss LSM 510 -konfokaalimikroskoopilla (Zeiss, Saksa). Fluoresenssikuvia analysoitiin Zeiss LSM Kuvaselainohjelmisto (Zeiss).

Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritys

ChIP kokeet suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [19], vähäisin muutoksin. HCT116-soluja käytettiin silloittamiseksi 1% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 10 minuutin ajan. Solut kaavittiin ja kerättiin sentrifugoimalla. Solut hajotettiin hajotuspuskuriin (50 mM Hepes, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% deoksikolaatti ja 1,0 mM proteaasiestäjäseostabletit) ja sonikoitiin 20 sekunnin ajan 3 kertaa. Normaali hiiri-IgG, anti-β-kateniinin tai anti-HDAC1-vasta-ainetta lisättiin ja inkuboitiin 6 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Immnunocomplexes uutettiin 3 kertaa 1% SDS, 0,1 M NaHCO 3, ja silloitusta päinvastaiseksi inkuboimalla 65 ° C: ssa yön yli. Tallennettu kromatiinin tulo fraktio käsitellään myös samalla tavalla. Sitten näytteet pilkottiin DNase- ja RNaasi-vapaata proteinaasi K 50 ° C: ssa 4 h, ja se uutettiin fenoli /kloroformi /isoamyylialkoholilla. DNA-näytteet puhdistettiin Qiagen puhdistamiseen saraketta. PLD2 tai NOS2 promoottorialueen analysoitiin Q-RT-PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita (taulukko S4).

Cell Migration and Invasion Analyysit

Solut lisättiin Transwell kalvon kammioihin (huokoskoko, 12,0 pm; Corning). Solujen lukumäärä, jotka kulkeutuivat kalvon läpi alempaan kammioon laskettiin 24 tunnin kuluttua. SiRNA kokeissa solut ympättiin 24 tuntia transfektion jälkeen, jossa siRNA: t ja siirtyminen määritykset suoritettiin vielä 24 tuntia. Sillä invaasio määrityksiä, matrigeelin (1: 5; BD) lisättiin TranswellTM kalvoon kammioihin ja inkuboitiin 5 tunnin ajan; Sitten solut ympättiin. Laajuus muuttoliikkeen ja invaasion ilmaistiin keskiarvona määrä kennoja mikroskooppisen kenttään.

Anchorage riippumattoman kasvun määrityksessä

Anchorage riippumaton kasvu mitattiin käyttämällä CytoSelect ™ 96-Well

In vitro

Kasvaimen Herkkyys Pitoisuus (Cell Biolabs, CA) mukaan valmistajan ohjeiden. Anchorage riippumaton kasvu tutkittiin pehmeä agar; 50 ui emäksen agarmatriisin lisättiin pohjaan kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle. Kun agar oli kiinteä, 75 ui solususpensiota /pehmeä agarmatriisin sisältää 3 x 10

3 solut kerrostettiin alkuun, jonka jälkeen 50 ui 2 x täydellistä väliainetta, jossa Wnt3a ja /tai inhibiittorit. Sen jälkeen, kun 10 päivää inkuboinnin agarmatriisin oli liukoiseksi, ja 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi on tuotettu muodostamalla liukenemattomia formazantuote elinkykyisten solujen kirjattiin 570 nm: ssä.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritetaan itsenäisesti vähintään kolme kertaa, ja samanlaisia ​​tuloksia. Tiedot analysoitiin Studentin

t

testi, ja

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Wnt signalointi edistää ilmentymistä PLD isotsyymien

tarkastella kysymystä, onko Wnt signalointia lisää PLD ilme, HCT116 peräsuolen syövän solut altistettiin Wnt3a tai Wnt3a jäljittelijät (kuvio 1). Kuten määritetään immunosaostuksella ja Western blot, ekspressiota sekä PLD1 ja PLD2 vahvistui ajasta riippuvalla tavalla altistuksen jälkeen puhdistettua yhdistelmä-DNA-Wnt3a (150 ng /ml) (kuvio 1A, ylempi paneeli). Anti-PLD-vasta-aine synnytettiin C-terminaalista peptidiä PLD1 jossa 7 aminohapon joukossa 12 aminohappoa olivat sama kuin PLD2, ja tunnistaa sekä PLD1 ja PLD2 [18]. On osoitettu, että HCT116-solujen on mutaatioita β-kateniinin Ser-45 ja että tämä Ser-45-mutantti alleeli ei riitä tukemaan kasvaimien syntyyn ja HCT116-solujen [20] – [22]. Näin ollen ehdotetaan, että β-kateniinin väylän HCT116-soluissa ei ole täysin aktivoitu mutaatio, ja siksi voidaan stimuloida ylimääräisiä solunulkoinen sanansaattajat, kuten Wnt signalointia, koska se lisää syövän syntyyn. Sitten tutkittiin kysymystä siitä, onko Wnt signalointia aiheuttama PLD ilmaisua voidaan säännellä transkription tasolla. Wnt3a parannettu mRNA tasoilla PLD1 ja PLD2 ajassa riippuvalla tavalla (kuvio S1). Jos haluat sulkea pois, että Wnt-riippuvainen lisäys PLD mRNA vain muutoksista aiheutuvat mRNA vakautta, teimme mRNA rappeutuminen määritys käyttäen aktinomysiini D, joka estää transkription. Ilmentyminen PLD1 ja PLD2 nostettiin ajan vertailukelpoisessa muoti välillä Wnt-käsiteltyjen ja kontrolli solut analysoituna Q-RT-PCR (Kuva S2). Esikäsittely aktinomysiini D merkittävästi tukahdutti sekä perus- Wnt3a aiheuttama PLD mRNA-tasot (kuvio S2). Siten Wnt-riippuvainen lisäys PLD mRNA on todellakin kohonneiden transkription. Jotta vahvistaa edelleen tuloksia, me määritti saarto GSK-3β on PLD ilme. LiCI: n ja BIO perustetaan agonistit, jotka jäljittelevät Wnt-signalointireitin, joka johtaa aktivaatio ja stabilointi β-kateniinin [23], [24]. Kuten analysoitiin immunosaostuksella ja Western blot, LiCI: n (20 mM), BIO (1 uM), ja Wnt3a (150 ng /ml) lisäsi merkittävästi ekspressiota tason PLD-isotsyymien (kuvio 1 B). Wnt jäljittelijät myös lisääntynyt proteiinin taso β-kateniinin, sekä ilmentymistä c-Myc ja NOS2, kohdegeenien Wnt signalointia. Analysoituna Q-RT-PCR: llä, Wnt signalointi merkittävästi koholla ekspressiotasot PLD mRNA: ta (kuvio 1C). Lisäksi Wnt ja sen jäljittelijät tehostaa merkittävästi promoottorin aktiivisuutta sekä PLD1 ja PLD2 (kuvio 1 D); Wnt3a liittyy merkittävä kasvu Geeni-ilmentymisen TCF /LEF erityisiä lusiferaasireportteriplasmidi (TOPflash) käytettiin kontrollina. Lisäksi olemme havainneet, että Wnt3a lisääntynyt ekspressio tasoille PLD isoentsyymien eri syöpäsoluissa, mukaan lukien peräsuolen syöpä soluja (HCA-7, RKO, Colo-741), ja rintasyövän soluja (Hs578T) (kuvio S3). Tarkkailla induktio PLD isoentsyymien vastauksena Wnt signalointia, päätimme syöpäsoluja, jossa tilan Wnt reitti on normaali. Nämä syöpäsolut ovat tunnettuja ilmaista villityypin APC ja β-kateniinin [25] – [29]. Näin ollen on ehdotettu, että Wnt signaloinnin aiheuttama PLD ilmentyminen voi olla yleinen ilmiö. Voimistumista PLDs ilmaisun Wnt3a ja Wnt jäljittelijät voimakkaasti sekaantunut keskeinen rooli esto GSK3p ja kanonisen Wnt-signalointireitin in Wnt-välittyvät vaikutukset. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että induktio PLD isotsyymiä uutena kohteena Wnt-signalointi säädellään sekä transkription ja transkription jälkeisen tasoilla.

(A) HCT116-soluja käsiteltiin puhdistetulla rekombinantti Wnt3a (150 ng /ml) ja osoitetut ajat, ja lysaatit immunosaostettiin ja immunoblotattiin vasta PLD. β-kateniinin analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä ydin- lysaatit (ylempi paneeli). Histogrammit osoittavat suhteelliset proteiinin tasot PLD1 ja PLD2, jotka on normalisoitu vastaavaksi α-tubuliinin arvot (alempi kuva). (B-C) HCT116-soluja käsiteltiin Wnt3a (150 ng /ml), LiCI: n (20 mM) tai BIO (1 uM) 24 tuntia. (B) Protein taso PLDs analysoitiin immunosaostuksella ja immunoblottauksella. c-Myc ja NOS2 ilmentyminen analysoitiin Western blottauksella (ylempi paneeli). Histogrammit osoittavat suhteelliset proteiinin tasot PLD1 ja PLD2, jotka on normalisoitu vastaavaksi α-tubuliinin arvot (alempi kuva). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) mRNA-tasot on esitetty geenien analysoitiin Q-RT-PCR: llä. *

P

0,05

versus

ajoneuvoon. (D) Ilmoitettu promoottorireportterivektori transfektoitiin ja käsiteltiin Wnt3a, LiCl, tai BIO 12 tuntia; lusiferaasiaktiivisuus määritettiin sitten. *

P

0,01

versus

ajoneuvoon. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen.

LiCl indusoi ilmentymisen PLD isotsyymien

in vivo

vahvistaa edelleen tuloksia, tutkimme vaikutus saarron GSK3p on PLD ilmaisun

in vivo

. LiCl ruiskutettiin hiiriin, ja ilmaus PLD tutkittiin useissa kudoksissa käyttäen anti-PLD ainetta, joka tunnistaa sekä PLD1 ja PLD2. Olemme raportoineet spesifisyyden vasta PLD [18], [30]. Kuten analysoitiin immunosaostuksella ja immunoblot-LiCl lisääntynyt proteiinin tasot sekä PLD1 ja PLD2 paksusuolen, mahan, ja maksan kudoksissa (kuvio 2A). Positiivisena kontrollina, taso β-kateniinin ja NOS2, sekä fosforylaatio GSK3p, on lisääntynyt LiCI:-injektoitu kudoksissa. Täydentävä osalta tulos ilmentymisen PLDs levittämisen jälkeen LiCI saatiin myös immunofluoresenssilla paksusuolen kudoksiin (kuvio 2B). Tumat vastavärjättiin mukaan DAPI. Kun taas β-kateniinin osoitti kalvo- värjäyskuvion PBS-injektoitu kontrolli paksusuolen, β-kateniinin lisättiin LiCl: sytoplasmassa ja solujen tumaan. PLD taso oli samanaikaisesti lisääntyi sekä sytoplasmassa ja tumassa solujen LiCl-pistetään paksusuolen kuten β-kateniinin nostettiin (kuvio 2B). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että geenien molempien PLD1 ja PLD2 on parannettu kudoksissa LiCl-käsitellyistä hiiristä.

(A) Hiiret injektoitiin suonensisäisesti LiCl, kuten on kuvattu ”Materiaalit ja menetelmät”. Lysaatit eri kudoksista immunosaostettiin ja immunoblotattiin vasta PLD tunnustetaan sekä PLD1 ja PLD2 (vasen paneeli). Proteiinitasot analysoitiin immunoblot käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. Histogrammit osoittavat suhteelliset proteiinin tasot PLD1 ja PLD2, jotka on normalisoitu vastaavaksi α-tubuliinin arvot (oikea paneeli). (B) Parafiinisektioista paksusuolen kudokset altistettiin immunofluoresenssilla analyysejä käyttäen anti-β-kateniinin (Alexa fluor 488, vihreä) ja PLD (Alexa fluor 555; punainen) vasta-ainetta. Kudokset seurattiin Zeiss LSM 510 -konfokaalimikroskoopilla. Mikroskopia kentät havaittiin × 650 suurennus. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

β-kateniinin ja TCF-4 ylössäätävät ilmentymä PLD isoentsyymien

tarkastellut kysymystä siitä, onko ilmaus PLD isoentsyymien on todellakin kopiointia aktivoidaan β-kateniinin tai TCF-4. Kuten kuviossa 3

, ektooppinen ilmentyminen TCF-4 ja vakaa β-kateniinin mutantti (S37A β-kateniinin), joka ei ole herkkä ubikitinaation ja β-kateniinin, parannettu transkriptionaalista aktivaatiota sekä PLD1 ja PLD2. TCF-4 ja vakaa β-kateniinin mutantti huomattavasti Geeni-ilmentymisen TCF /LEF erityisiä lusiferaasireportteriplasmidi käytettiin kontrollina. Tämä induktio pieneni merkitsevästi lisäämällä hallitseva negatiivinen (dn) TCF-4 ekspressiovektorin (ΔN30 TCF-4) (kuvio 3A). Lisäksi analyysi immunosaostuksella ja immunoblot osoitti, että ektooppinen ekspressio β-kateniinin tai TCF-4 lisääntynyt endogeenisen proteiinin tasot PLD1 ja PLD2 isoentsyymien HCT116-soluissa. TCF-geenien, mukaan lukien c-Myc ja NOS2, lisäsi myös ilmaus β-kateniinin tai TCF-4 (kuvio 3B). Lisäksi transfektio dnTCF-4 tai ehtyminen β-kateniinin käyttäen shRNA vähensi proteiinin tasot sekä PLD isotsyymien ja Wnt kohdegeenien HCT116-soluja (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen PLD-isoentsyymien ylössäädellään sekä β-kateniinin ja TCF-4.

(A) HCT116-solut ko-transfektoitiin pGL4-PLD tai TOP /FOP toimittajat ja osoitetun ekspressiovektorit. *

P

0,01

versus

mock; †

P

0,05

versus

S37A β-kateniinin /TCF-4. (B) Soluja transfektoitiin joko TCF-4 tai β-kateniinin ekspressiovektoriin, ja lysaatit immunosaostettiin tai immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla (ylempi paneeli). Histogrammit osoittavat suhteelliset proteiinin tasot PLD1 ja PLD2, jotka on normalisoitu vastaavaksi α-tubuliinin arvot (alempi kuva). (C) transfektoitiin ΔN30 TCF-4 tai shRNA varten β-kateniinin. Lysaatit analysoitiin immunosaostuksella tai Western blot käyttäen ilmoitettua vasta-aineita (ylempi paneeli). Proteiinin ilmentyminen kvantitoitiin densitometrillä analyysi. Histogrammit osoittavat suhteelliset proteiinin tasot PLD1 ja PLD2, jotka on normalisoitu vastaavaksi α-tubuliinin arvot (alempi kuva). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

β-kateniinin ja TCF-4 sitoutuvat TBE-junia ja PLD2 promoottorin ja parantaa PLD2 ilmaisun

polymorfismin PLD2 geenillä on äskettäin liittynyt esiintyvyys kolorektaalisyöpää [31]. Lisäksi ekspressiotasot PLD2 havaita reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen 97 kolorektaalisyöpää kudoksissa merkittävästi korreloivat kasvaimen kokoa ja selviytymistä potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen syöpä; Näin, ehdotettiin, että PLD2 ilmentymistaso voisi olla prognostinen indikaattori kolorektaalikarsinoomasta [10]. Tämän vuoksi yritimme tutkia alueita, jotka ovat vastuussa Wnt /β-kateniinin /TCF-4-indusoidun PLD2 ilmentymisen.

Kuten kuviossa 4A on esitetty, -2180 /+ 491 PLD2 promoottorin transaktivoidun TCF -4 (4,6-kertainen) tai S37A β-kateniinin (2,3-kertainen) proteiineja. Juokseva 5 ’poistamista, PLD2 promoottori kantoja -1601, -1210, ja -784 eivät vaikuttaneet TCF-4- tai S37A β-kateniinin välittämää transaktivaation PLD2 promoottori (TCF-4, 4,2-kertainen, p-kateniinin 2.2-kertainen aktivoituminen kaikki mutantit); kuitenkin, poistetaan -380 alueiden merkittävästi vähentynyt TCF-4 tai S37A β-kateniinin-stimuloidun PLD-promoottorin aktiivisuutta. Näin ollen on ehdotettu, että oletetun TCF sitova elementti (TBE) asemissa -784 ~ -380 voi olla välttämätöntä PLD2 geenisäätelyn TCF-4 ja β-kateniinin.

(A) poistaminen analyysi pGL4- PLD2 in HCT116-soluissa. Kaavamainen esitys pGL4-PLD2 reportterikonstrukteja on esitetty. Solut kotransfektoitiin pGL4-PLD2 ja merkitty ekspressiovektorit, minkä jälkeen määritys lusiferaasiaktiivisuus. (B) Kaavamainen esitys -2180-491 alueen ihmisen PLD2 promoottori. Numerot edellä linjat viittaavat transkription aloituskohdasta, että

PLD2

geeni (+1). Kahden mahdollisen sitoutumiskohtia TCF-4 on merkitty sekvenssin (nuolet osoittavat suunnan). (C) HCT 116-soluja transfektoitiin lusiferaasireportteriplasmidi, joka sisältää villin tyypin (wt) PLD2 promoottori, yksi tai kaksi TBE mutanttimuodot (mt) ja PLD2 promoottorin, ja käsiteltiin Wnt3a (150 ng /ml) tai BIO (1 uM). Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin. *

P

0,05

versus

wtTBE /Wnt3a; †

P

0,01

versus

wtTBE /BIO. (D) Soluja transfektoitiin yhdessä mainituilla ilmentämis- vektoreita, sekä wt tai TBE mutanttien PLD2 promoottorin. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin. *

P

0,05

verrattuna

transfektoitu wtTBE /β-kateniinin; †

P

0,05

versus

wtTBE /TCF4; **

P

0,05

verrattuna

transfektoitu wtTBE /β-kateniinin /TCF4. (E) Nuolet osoittavat asema käytetyt alukkeet ChIP kokeessa. Siru määritys suoritettiin käyttäen esi-IgG, anti-β-kateniinin tai anti-HDAC1 vasta-aineella ja analysoitiin Q-RT-PCR: llä. Positiivisena kontrollina, ChIP analyysi NOS2 promoottorin, joka sisälsi TBE suoritettiin. *

P

0,05

versus

β-kateniinin /ajoneuvo; †

P

0,05

versus

HDAC1 /ajoneuvo. Tiedot edustavat neljä toisistaan ​​riippumatonta koetta. (F) esittää kaavamaisesti vertailun TBE-junia on PLD2 promoottorialueille eri lajeista. TCF-4 sitovia osia 5′-alueiden ihmisen PLD2 transkription aloitus- päällä (TSS) verrattiin genomien 4 eri lajeista. Ydin

motiivi

, CTTTG (A /T) (A /T) [tai komplementaarinen sekvenssi (A /T) (A /T) CAAAG] TCF sitovat sekvenssit PLD2 promoottori on erittäin

konservoitunut

lajien välillä.

kuten kuviossa 4B, sekvenssianalyysi 5′-reunustavan sekvenssin PLD2 tunnistetun geenin kahden mahdollisen TBE-junia (nimetty TBE1 ja TBE2). TBE1 (ATGAAAG) sijaitsee -512 b ylävirtaan, ja sisältää lähes ylösalaisin ottelun konsensus CTTTG (A /T) (A /T) sekvenssi TCF-4 sitova [32]; TBE2 (CTTTCAT) sijaitsi -497 b ylävirtaan ja lähes Hyväksytty konsensussekvenssi (taulukko S2) [33].

tarkastella toiminnallista merkitystä TBE motiivin säätelyyn PLD2 geenin transkription, site-mutaatio TBE sivustoja syntyi osana PLD2 promoottori. Mutaatio TBE1 tai TBE2 sivuston merkittävästi vähentynyt Wnt3a aiheuttama PLD2 promoottorin aktiivisuutta HCT116-soluissa (kuvio 4C). Mutaatiot sekä TBE1 ja TBE2 sivustoja (TBE1 /2) huomattavasti vaimennetaan Wnt3a-stimuloidun PLD2 promoottorin aktiivisuutta. Lisäksi TCF-4 ja /tai β-kateniinin aiheuttama PLD2 promoottorin aktiivisuus oli myös poistettava, kun TBE1 ja TBE2 mutatoitiin (kuvio 4D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että PLD2 promoottori on tavoite TCF /β-kateniinin monimutkainen kautta konsensuksen TBE.

Lisäksi Suoritimme sitten chromatin immunosaostus (chip) määritystä HCT116-soluissa vahvistaa

vuonna vivo

sitoutumisen β-kateniinin /TCF-4 on PLD2 promoottorin. DNA-β-kateniinin /TCF-4-kompleksit immunosaostettiin vasta-aineilla on esitetty kuviossa 4E, minkä jälkeen käänteinen silloittumisen ja Q-RT-PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka reunustavat sekä TBE1 ja TBE2, jotka sijaitsevat proksimaalisesti asennossa toisiinsa. Kuten on esitetty kuviossa 4E, puhdistettua rekombinanttista Wnt3a parannetun sitoutumisen β-kateniinin /TCF-4 sekä TBE-junia ja PLD2 promoottorin. Nämä tulokset ovat verrattavissa promoottorin määrityksen avulla mutageneesiä. Wnt signalointia tavoitteet β-kateniinin kromatiinin poistoon corepressor HDAC1 (histonideasetylaasi 1) [34]. Kuten odotettua, Wnt3a merkittävästi tukahdutti sitoutumisen β-kateniinin kaksi TBE-junia ja PLD2 promoottorin jälkeen ChIP määritys käyttäen anti-HDAC1 vasta-aine. Lisäksi olemme havainneet, että TCF sitoutumiskohdista PLD2 promoottori ovat säilyneet lajien välillä (kuvio 4F). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että PLD2 geeni on suora transkription kohteena β-kateniinin /TCF signaloinnin in vivo.

PLD isotsyymien tarvitaan muodostumista β-kateniinin /TCF-4 monimutkainen ja edistäminen β-kateniinin /TCF transkriptioaktiviteettia

tutkineet kysymystä siitä, onko Wnt signalointia aiheuttama PLDs voimistumista saattaa moduloida β-kateniinin riippuva TCF transkriptionaalisen aktiivisuuden kautta positiivista palautetta silmukka. Ektooppinen ilmentyminen konstitutiivisen aktiivisen mutantin β-kateniinin lisääntynyt TCF transkriptionaalista aktiivisuutta HCT116 paksusuolen syövän soluja (kuvio 5A). Valikoiva PLD-inhibiittorit ovat viime aikoina kehitetty [35], [36].