Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aktivointi kantasolujen transkription piiri on tärkeä tapahtuma syövän kehittymisessä. Vaikka syöpäsolut osoittaa kantasolun kaltainen geeniekspression allekirjoitus, Epigeneettisiä sääntely pluripotenttisuuden liittyvien geenien syövät edelleen huonosti. Tässä tutkimuksessa olemme luonnehti epigeneettiset sääntelyn pluripotenttisuuden liittyvien geenien

Nanog

,

Oct4

,

c-MYC

,

Klf4

, ja

Sox2

erilaisissa syöpäsolulinjoja ja primaarikasvaimen näytteissä, ja tutki uudelleenaktivointimaksu pluripotenttisuuden sääntelyn piirejä syövän etenemiseen. Differential malleja DNA: n metylaatio, histonimodifikaation, ja geeniekspressio pluripotenttisten geenien osoitettiin erilaisia ​​syöpiä, jotka voivat heikentää niiden kudoksen alkuperästä.

Nanog

promoottori hypometylaatio ja geenin säätelyyn ylöspäin havaittiin metastaattisessa ihmisen maksan syöpäsoluja ja ihmisen maksasolusyövän (HCC) primaarikasvaimen kudoksiin. Ylössäätelyyn

Nanog

yhdessä p53 ehtyminen, oli merkitsevästi yhteydessä kliinisissä myöhäisessä HCC. Pro-metastasoitunut roolia Nanog paksusuolen syöpäsoluissa osoitettiin myös, käyttäen

Nanog

-overexpressing potilaalle tehdä kasvaimen istutuksen hiirimallissa. Demetylaation

Nanog

promoottori havaittiin CD133 +

korkea syöpäsoluja. Mukaisesti, yliekspressio

Nanog

johti kasvuun populaatiossa CD133 +

korkea soluja. Lisäksi olemme osoittaneet rajat sääntelyn välillä

Oct4

ja

Nanog

syöpäsoluissa kautta uudelleenohjelmointi promoottorin metylaation. Yhdessä epigeneettiset kyseeseen

Nanog

voi johtaa hankinnan kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia. Nämä tulokset korostavat palauttaminen pluripotenttisuuden piirien syöpäsoluissa mahdollisena mekanismi syövän etenemisen.

Citation: Wang XQ, Ng RK, Ming X, Zhang W, Chen L, Chu ACY, et al. (2013) Epigeneettiset asetuksen Monipotentin Genes välittää Stem Cell ominaisuudet Human maksasyövän ja Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (9): e72435. doi: 10,1371 /journal.pone.0072435

Editor: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, Intia

vastaanotettu: 02 toukokuu 2013; Hyväksytty: 10. heinäkuuta 2013 mennessä; Julkaistu: 04 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Seed rahoitusohjelma Basic Research at University of Hong Kong (11159149) ja General Research Fund of Hong Kong Research Grant neuvosto (HKU778809M) Wang XQ. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset muutoksia pidetään tehokkaina korvikkeita mutaatioita vapauttamisen kasvua edistäviä geenejä ja kasvaimen synnyssä [1], [2]. On ehdotettu, että prosessi syövän liittyy epigeneettisiä muutoksia kantasolujen /esisolujen ennen gatekeeper-geenin mutaatioita esiintyy [1], [3], [4]. Tämä prosessi voi todennäköisesti vaikuttaa sekä geneettiset ja epigeneettiset plastisuus solun ja mahdollistavat hankinta ”stemness” ominaisuuksia, kuten invaasio, etäpesäkkeitä ja lääkeresistenssi, aikana syövän etenemisessä [1], [2]. Lisäksi genomin epästabiilisuuden aiheuttamista maailmanlaajuinen DNA hypometylaatio todettiin olevan yksi varhaisimmista muutoksia kehittämiseen ihmisen syöpien [2], [5].

Vaikka yli-ilmentyminen

Oct4

,

Sox2

,

Klf4

ja

c-MYC

geenien aiheuttaa pluripotenttisuus somaattisten solujen johtaa sukupolven alkion kantasoluilla (ESC) kaltaisia ​​aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (iPSCs) [6] – [8], se on mielenkiintoista huomata, että TSK kaltainen transkription ohjelma on usein aktivoidaan ihmisen erilaisiin epiteelisyövissä [9], [10]. Tällainen ESC kaltainen geeni moduuli liittyi myös taudin etenemistä, esim. etäpesäke, ja varhainen kuolleisuus rintasyöpään [9] ja virtsarakon syövän [11]. Siksi se ehdottaa yhteistä rakenteisen mukana sekä iPSC johtamista ja syövän kantasolujen (CSC) aloittamisesta [12]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että iPSCs säilyttää epigeneettiset muisti, kuten DNA: n metylaatio allekirjoitusta, niiden kudoksista peräisin [13], [14], mikä osoittaa, kuinka tärkeää on epigeneettiset sääntelyn solukohtalon uudelleenohjelmointi ja kasvaimen kehittymisen [15], [16].

Vaikka kantasolun kaltainen geeni verkko on osoitettu syövissä [11], yhdistys epigeneettiset uudelleenohjelmointi ja CSC ominaisuuksia edelleen huonosti. Täällä, tutkimme epigeneettiset sääntelyn pluripotenttisuuden liittyvien geenien

Nanog

,

Oct4

,

c-MYC

,

Klf4

, ja

Sox2

, ja niiden vastaavuus geenin ilmentymistä syöpäsolulinjoissa ja primaarikasvaimen näytteitä. Olemme edelleen tutki niiden mahdollisia rooleja prosessissa etäpesäke ja aloittamisen CSCS aikana syövän etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteitä

Pariksi kuin kasvain ja kasvainkudoksen yksilöitä maksasolusyövän (HCC) kerättiin viidentoista HCC potilaiden diagnosoitu vaiheessa I-IV patologisen kasvain-solmu-etäpesäke (TNM) tauti [17]. Maksan normaali näytteet saatiin kuolleesta maksan luovuttajilta. Kaikki näytteet tarjoamia Tissue Bank of Sihteeri Maksa ja Haimaleikkauksen ja maksansiirron klo Kirurgian klinikka, Queen Mary sairaalassa. Kerääminen ja varastointi kliinisistä näytteistä varten Tissue Bank on hyväksynyt Institutional Review Board of University of Hong Kong /sairaala Authority of Hong Kong. Normaali maksasolujen ja HCC solulinjoista sisältyvät Miha ja L02 (normaali maksasolujen); PLC (ensisijainen HCC); ja MHCC97L (97L) ja MHCC97H (97H), olivat peräisin metastaattinen HCC [18]. Muut ei-HCC syöpäsolulinjoista sisältyvät HeLa (kohdunkaula adenokarsinooma); MCF7 (rinta adenokarsinooma); AGS (mahalaukun adenokarsinooma); HCT116 (kolorektaalisyöpää); ja K-562 (krooninen myelooinen leukemia). PLC, HeLa-, MCF7, AGS, ja HCT116 linjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). L02 saatiin China Center for Type Culture Collection.

Genominen DNA eristäminen

Yhteensä genominen DNA eristettiin perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC), solulinjat, ja ei-kasvain ja kasvaimeen maksa näytteitä HCC potilailla, käyttäen QIAamp DNA mini kit (Qiagen).

bisulfiittimodifiointi sekvenssianalyysi

Genominen DNA käsitellään bisulfiittikonversion metyloitumattomien sytosiinien käyttäen EpiTect bisulfiittimodifiointi (Qiagen). Bisulfiitti-modifioitua DNA: ta käytettiin PCR, alukkeilla, jotka tunnistavat muunnettu DNA-sekvenssit (kuvio 1A; Kuva S1 File S1, taulukko S1). PCR-tuotteet kloonattiin pGEM-T-Easy -vektoriin (Promega Bioscience). Kymmenen klooneja poimittiin satunnaisesti ja sekvensoitiin. DNA-sekvenssit analysoitiin BIO Analyzer ohjelmisto (https://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de) CpG käsittelyssä. Prosenttiosuus metylaation tarkoittaa määrää metyloitu CpG: t yli kokonaismäärä CpG: t alueella analysoitiin.

(A) Kaaviokuva geenin säätelyalueita

Nanog

,

Oct4

ja

c-MYC

jotka tutkittiin bisulfiitti sekvensointi (BIS) (punaiset palkit) ja siru (vihreät palkit) kokeissa. (I)

Nanog

proksimaalisen promoottorin alue kattaa 10 CpG sivustoja -1449–952. (Ii)

Oct4

promoottorialue kuuluu 8 alukeparia 50 CpG sivustojen -2973-320. (Iii)

c-MYC

geenialueen kattaa BiS alukkeina CpG-saarekkeiden ennen TSS1 ja TSS2, sekä CpG sivustoja eksoni 2 ja 3; ja siru primeri eksoni 3 (B) bisulfiittimodifiointi sekvensointi analyysi

Nanog

promoottori syöpäsolulinjoissa. DNA: n metylaatio taajuus esitetään prosenttiluvut: normaalissa maksassa (L02) ja syöpä maksassa (PLC, 97L, ja 97H) soluja (sininen); normaali PBMC ja leukemiasolujen K-562-solut (oranssi); ja HeLa, MCF7, HCT116, ja AGS syöpäsolujen (vihreä). (C) Clonal

Nanog

promoottori metylaatiovyöhykkeiden 97L, HeLa ja K-562-solut. Avoimet ympyrät edustavat metyloimaton CpG: t; ympyrät edustavat metyloituja CpG: t. (D) metylointi taajuus

Oct4

proksimaalisen promoottorin (-530-+7) in: normaali ja syöpä maksasolut (sininen); ja HeLa ja HCT116-solut (vihreä). (E) DNA: n metylaatio tiheys alku- ja loppupään alueilla

Oct4

normaalissa ja syövän maksasoluja. ”Kaiken” kattaa 50 CpG sivustoja -2973-320; ”5 ’TSS” kattaa 10 CpG sivustoja -530-+7; ja ”3” TSS ”kattaa 12 CpG sivustoja 61-320. (F) metylointi taajuus eksonin 3

c-MYC

(10 CpG sivustot) in: normaali ja syöpä maksasolut (sininen); PBMC ja leukemiasoluja K-562-solut (oranssi); ja HeLa, MCF7, HCT116, ja AGS syöpäsolujen (vihreä).

Kromatiini immunosaostuksella (chip)

siru menettely kuvailtiin Current Protocols [19]. Lyhyesti, kymmenen-kaksikymmentä miljoonaa (1-2 x 10

7) L02, HCT116 ja 97L solut kerättiin ja kiinnitettiin 37% formaldehydiä. Sonikoitua solulysaatit altistettiin immunosaostukselle 5 ug H3K4me3 tai H3K27me3 vasta-aineita (Abcam), ja normaali IgG (tulot kontrollina), vastaavasti, kun läsnä on proteiini-G-Sepharose-helmiä (GE Healthcare) 4 ° C: ssa yön yli. Helmet pestiin peräkkäin FA lyysipuskuria, ChIP pesupuskuria, ja TE-puskuria. Sitoutunut materiaalit eluoitiin siru eluutiopuskurilla. Rikastaminen histonimodifikaation kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttämällä SYBR Green (Applied Biosystems), asiaa ChIP alukkeita (kuvio 1A; Kuva S1 File S1, taulukko S1). Tiedot esitetään kertainen rikastus, käyttämällä ChIP-qPCR analyysi laskentakaava (www.sabiosciences.com); tulot ja mock IP käytettiin normalisointi.

Käänteiskopiointireaktioita ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen RNeasy Mini Kit (Qiagen) ja käsiteltiin DNaasi I , jota seuraa käänteistranskriptio kanssa Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). qRT-PCR-analyysi suoritettiin käyttäen ennalta suunniteltu TaqMan-koettimia

Nanog

(Hs02387400_g1),

POU5F1

(Hs00999634_gH),

MYC

(Hs00153408_m1), ja

18S

rRNA (4333760-0807027), jotka oli valittu TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems). SYBR Green reagenssit (Applied Biosystems tai TaKaRa Biotechnology) käytettiin havaitsemiseen

Oct4

,

MYC

,

Klf4 p53

ja

β-ACTIN

geenien ilmentyminen (pohjamaali tiedot taulukossa S2). Geenien ilmentyminen laskettiin CT ja normalisoitu tasolle

18S

tai

β-ACTIN

.

lentivirustartunnat transduktio

Human

Nanog

(NM_024865) ja

Oct4

(NM_002701) geenien ihmisalkion kantasolujen rivi kloonattiin pWPI vektoriin ja transfektoitiin pCMV-dR8.91 ja pMD2.G plasmidit 293T-pakkaus solulinjassa. Virussupernatantteja kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja saostettiin käyttämällä PEG-se Virus Sateen Solution (System Biosciences). HCT116 p53 – /- solut infektoitiin lentiviruksen joka joko

Oct4

tai

Nanog

läsnäollessa 8 ug /ml protamiinisulfaattia. Cell lajittelu suoritettiin käyttäen FACSAria (BD Biosciences) eristämiseksi transdusoitujen HCT116 p53 – /- solut.

In vivo etäpesäkkeiden määrityksessä ortotooppisten paksusuolen kasvaimen istutuksen

neljä kuuden viikon ikäisiä BALB /Cann-nu (Nude) hiiret saatiin ja ylläpidettiin Laboratory Animal Unit of The University of Hong Kong. Kaikki hiiri kokeet hyväksynyt KÄSITTELY käyttö elävien eläinten University of Hong Kong. Lentivirus tartunnan HCT116 p53 – /- solua injektoitiin ihon alle nude-hiiriin tuottaa ensisijaisen kasvaimia. Primäärikasvaimissa leikeltiin osaksi 1-2 mm

3 kuutiot ja sitten istuttaa umpisuoli muiden nude-hiirten [20]. Colon keuhkojen tuumorietäpesäke tutkittiin 4 viikon umpisuoli istutusta. Koko keuhkoja nude-hiirissä leikeltiin ja värjättiin H 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

Differential DNA: n metylaatio pluripotenttisuuden liittyvien geenien syöpäsoluissa

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet aktivoituminen loppupään tavoitteista

Nanog

,

Oct4

,

Sox2

ja

MYC

geenien aggressiivisesti kasvava ihmisen syövissä [11]. Siksi tutkittiin CpG metylaatio

Nanog

(tunnetaan myös nimellä

NANOG1

),

Oct4

,

Sox2

,

Klf4

ja

c-MYC

ihmisen syövän solulinjoissa bisulfiitti sekvensoimalla lähestymistapa (Kuva 1A; Kuva S1 File S1). Verrattuna normaaliin maksan soluihin L02, joka näkyy vaatimaton metylaatio taso (39%), DNA hypometylaatio

Nanog

(kuvio 1A-i) havaittiin kolmessa maksasyövän solulinjoja, nimittäin PLC, 97L ja 97H ( 18%, 8% ja 14%, vastaavasti), joista metastaattinen maksan solulinja 97L osoitti lähes ilman DNA: n metylaatio (kuvio 1B ja 1C). Vaikka leukeemisissa K-562-solut,

Nanog

metylaatio (39%) osoitti 2-kertaisesti alentunut verrattuna normaaliin perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t) (81%, kuvio 1B ja 1C). Syöpäsolut muista kudoksista peräisin näkyvissä ero

Nanog

promoottori metylointi; Esimerkiksi hypometylaatio havaittiin HeLa (25%), kun taas hypermetylaation osoitettiin MCF7, HCT116 ja AGS (71%, 92% ja 91%, vastaavasti) (kuvio 1 B ja 1 C).

Seuraava tutki

Oct4

promoottori metylaatiokuvion syöpäsoluissa. Proksimaalinen promoottorialue (-503-7, kuviossa 1A-ii) on

Oct4

havaittiin hypermetyloitunut L02 (92%), Miha (90%), HeLa (90%) ja HCT116 (87% -solut), joka on toisin kuin alentuneiden tasojen havaittiin PLC ja 97L-soluja (70% ja 41%, vastaavasti, kuvio 1 D). Olemme laajentaneet metylointianalyysi yhteensä 50 CpG: t, jotka kattavat sekä distaalisen promoottorin ja alavirtaan alueen transkription aloituskohdasta (TSS, -2973-320, kuviossa 1A-ii). Pelkistetty metylaatiokuvion säilytettiin vuoden analysoitu

Oct4

geenialueessa PLC ja 97L soluja (kuvio 1 E). Sillä

c-MYC

geeni, vaikka CpG: t sijaitsevat ylävirtaan TSS1 ja TSS2 ja eksonissa 2 pysyi metyloitumaton sekä normaaleissa ja syöpäsolujen (kuvio 1A-iii; Kuva S2 File S1), metylointi taso eksonin 3 väheni dramaattisesti ja tuli hypometyloidut kaksi maksasyövän solulinjoja, PLC (34%) ja 97L (6%), verrattuna kohtalaisen korkean tason metylaation (51%: sta 82%) normaaleissa maksasolut ( Kuvio 1 F). Sitä vastoin syöpä solut muista kudoksista peräisin, lukuun ottamatta HeLa, näytetään hypermetylaation asema

c-MYC

eksonin 3 (vaihtelevat 72%: sta 99%, kuvio 1F). Toisaalta, CpG saaria promoottorialueiden

Klf4

ja

Sox2

geenien pysyi metyloitumattomia kaikilla tarkasteltavilla solulinjoissa (kuviot S1, S3, S4 File S1). Yhdessä ero mety- pluripotenttisuuden liittyvien geenien havaittiin ihmisen syövän solulinjoissa eri kudoksista peräisin.

Epigeneettiset asetusten pluripotenttisten geeniekspression

seuraavaksi keskittyneet pluripotenttien geeniekspressiossa kaksi syöpäsolulinjoilla, 97L ja HCT116, joka osoitti vastapäätä malleja DNA: n metylaation. qRT-PCR-analyysi osoitti, korkeampi ilmentyminen

Nanog

,

Oct4

ja

c-MYC

geenien 97L soluissa, mutta ei HCT116-soluissa, verrattuna valvoa L02 ja PLC solut (kuvio 2A-C, kuvio S5a-C File S1), mikä viittaa näiden geenien ilmentymistä säätelee negatiivisesti DNA: n metylaation. Sillä

Klf4

, lisääntynyt geenin ilmentyminen havaittiin sekä 97L ja HCT116-soluja (kuvio 2D, kuvio S5d Tiedosto S1) huolimatta siitä, että CpG-saarekkeen mety- ollut erotettavissa normaalin ja syöpäsolujen (kuvio S3 File S1).

Expression tasoja (A)

Nanog

, (B)

Oct4

, (C)

c

–

MYC

, ja (D)

Klf4

geenit määritettiin L02, PLC, 97L, ja HCT116-soluissa qRT-PCR-analyysillä, normalisoitu viitteellä geenin

18S

. Geeni ilmentyminen normalisoida L02 näyte, joka määriteltiin 1. Tiedot ovat keskiarvo ± SD saatu 2-3 kokeiluja kaksoiskappaleet. Rikastaminen histonimodifikaation H3K4me3 ja H3K27me3 on promoottorialueet pluripotenttisuuden liittyvien geenien (E)

Nanog

, (F)

Oct4

, (G)

c

–

MYC

, ja (H)

Klf4

mitattiin L02, 97L, ja HCT116 Chip analyysi. Tiedot edustettuina kertainen rikastaminen ja normalisoitu tulo ja mock IgG valvontaa. Taitteen rikastus oli suhteessa L02 näyte, joka määriteltiin 1. Tiedot ovat edustettuina keskiarvo on saatu kahdesta ChIP kokeiluja virhepoikkeamilla standardipoikkeama.

Epigeneettiset muutostöitä histoniproteiineista osoitti myös vahva yhdessä geenien ilmentyminen. Olemme siksi, määritetään, kun läsnä on kaksi erilaista histonimodifikaation, aktiivinen /salliva tri-metyyli-H3K4 (H3K4me3) ja tukahduttavaa tri-metyyli-H3K27 (H3K27me3), ja 97L ja HCT116 syöpäsoluja. ChIP analyysi osoitti merkittävää rikastumista aktiivisen H3K4me3 tavaramerkin promoottorialueiden

Nanog

ja

Oct4

ja eksonin 3 alueella

c-MYC

in 97L soluissa, kun verrattuna L02 ja HCT116-soluissa (kuvio 2E-G, vasen paneeli). Tämä on toisin kuin alhaista tukahduttavia H3K27me3 merkin havaittu näissä soluissa (kuvio 2E-G, oikea paneeli). Nämä tulokset viittaavat siihen, että sekä histonimodifikaation ja DNA: n metylaation toiminto synergistisesti säätelyssä

Nanog

,

Oct4

ja

c-MYC

geeniekspressiota. Toisaalta, H3K4me3 havaittiin korkeasti rikastettua klo

Klf4

edistäjä 97L soluja, kun taas HCT116-solut osoittivat kohtalainen H3K4me3 mutta suhteellisesti alhaisempi tukahduttavia H3K27me3 (kuvio 2H, oikea paneeli). Tämä voi selittää korkean

Klf4

geeniekspression molemmissa solulinjoissa (kuvio 2D), joka on riippumaton DNA: n metylaatio.

Nanog promoottori hypometylaatio ihmisen HCC kasvainkudoksessa

Koska ero

Nanog

metylaatiokuvion syöpäsolulinjoissa voi olla seurausta

in vitro

viljelemällä sijaan yhdessä niiden kasvainten muodostumiseen

sinänsä

, me siksi tutkittiin

Nanog

promoottori metylaation ensisijainen HCC kasvaimissa pariksi viereisen ei-tuumorikudoksista (n = 15), verrattuna normaaliin maksan näytteet (kuvio 3A). Silmiinpistävän, 73% ei-kasvain tapauksista (11 15: sta) oli yli 50% metyloituja, kun taas 53% kasvaimen tapauksista (8 out of 15) olivat vähemmän kuin 30% metyloitu

Nanog

promoottori (kuvio 3B ja 3C).

Nanog

promoottori metylaatiotasoilla vähensi merkittävästi pariksi HCC kasvaimissa verrattuna viereisiin-tuumorikudoksista (

p

= 0,000), kun taas mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu normaalin tai ei-kasvain maksassa kudokset (

p

= 0,301; Kuva 3D). Mukaisesti alennetun promoottori metylaatio,

Nanog

ilmentyminen havaittiin merkittävästi suurempi kasvainkudoksessa kuin ei-kasvainkudoksessa (

p

= 0,021; Kuva 3E). On syytä huomata, että HCC näytteitä TNM III ja IV, joka on yleensä läsnä verisuoni- invaasiota, imusolmuke ja etäinen etäpesäke [17], oli merkitsevästi yhteydessä korkea

Nanog

(

p

= 0,011) ja alhainen

p53

(

p

= 0,047) lauseke (taulukko 1, taulukko S3). Alhainen

p53

liittyi myös verisuonten tunkeutuminen (

p

= 0,019, taulukko 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kasvaimen etäpesäke edellyttää sekä säätelyä

Nanog

kautta promoottori hypometylaatio ja tukahduttaminen

p53

HCC.

(A) H tiedot ovat keskiarvo ± SD. (E) tilastollinen vertailu

Nanog

geeniekspression pariksi HCC kuin kasvain ja kasvainkudoksen (n = 15). Kukin kasvainkudoksessa normalisoitui sen vastaavat ei-kasvainkudoksessa.

Nanog ilmaisun edistää kasvaimen etäpesäke

jälkeen tunnistamisen

Nanog

säätelyyn ylöspäin metastaattisessa HCC-solut ja tuumorin näytteissä, me edisti Tutkimuksemme tarkastella

in vivo

funktiona

Nanog

syövän etenemiseen. Kuitenkin voimakas ilmaus

Nanog

HCC-soluissa vaikeuttaa tippuu alas tehokkaasti

in vivo

toiminnallisia tutkimuksia (tuloksia ei ole esitetty). Me siis valinnut HCT116 solulinjasta, joka on alhaisen endogeenisen tason Nanog, sillä yli-ilmentymisen tutkimus. Vakaa

Nanog

ilmentävät HCT116 p53 – /- solut (kuvio S6A in File S1) injektoitiin paljaisiin hiiriin kasvainten muodostumiseen. Yllättäen vähintään 1 x 10

4 solut joko HCT116 p53 – /- tai

Nanog

ilmentävät HCT116 p53 – /- (Nanog-HCT116 p53 – /-) solut oli riittävä muodostamaan ihonalainen kasvaimia (Taulukko S4), mikä osoittaa, että korkeampi

Nanog

ilmaisua ei edelleen parantaa muodostumista ensisijainen kasvaimia. Kuitenkin, käyttäen ortotooppisten tuumorin implantaation hiirimallissa, havaitsimme huomattavasti suurempi paksusuolen keuhkojen etäpesäkkeiden istuttamalla ksenograftikasvaimissa on Nanog-HCT116 p53 – /- soluja verrattuna emo-HCT116 p53 – /- soluja (kuvio 4A-C). Tämä antaa vahvan

in vivo

todisteita toiminnon

Nanog

edistämisessä syöpäsolumetastaasi.

(A) HCT116 p53 – /- tai Nanog ilmentävä HCT116 p53 – /- solut (1 x 10

6) injektoitiin paljaisiin hiiriin ihon alle. -ksenografti Kasvainkudoksessa että muodostunut leikattiin ja jakaa osiin 1-2 mm

3 kuutiot jotka sitten istutetaan cecums muiden nude-hiirten. Kasvainten muodostumista umpisuoli havaittiin implantoinnin jälkeen. Nuolet umpisuoli ja vastaperustetun kasvain umpisuoli. (B) Colon keuhkojen tuumorimetastaasit tutkittiin neljän viikon kuluttua istutuksen H kun taas suuret ja useita paksusuolen tuumorileesioissa löytyivät Nanog-HCT116 p53 – /- istutusta ryhmä (oikealla). (C) tilastollinen vertailu keuhkometastaasitestissä taajuus ortotooppisten umpisuoli implantaatiomallissa peräisin HCT116 p53 – /- (n = 8) ja Nanog-HCT116 p53 – /- (n = 11). (D) Virtaussytometrianalyysi of CD133 ilmentymisen HCT116-soluissa osoitti kolmen populaation soluja; nimittäin CD133-, CD133 +

alhainen, ja CD133 +

korkea. Alle 1% soluja pidetään CD133 +

korkea. (E)

Nanog

promoottori metylaatiovyöhykkeiden CD133-, CD133 +

alhainen, ja CD133 +

korkea HCT116-soluissa. CD133 +

korkea solujen osoitettiin merkittävä väheneminen

Nanog

promoottori metylaatio. (F)

Nanog

ilmaisun CD133-, CD133 +

alhainen, ja CD133 +

korkea HCT116-soluissa. CD133 +

korkea solut osoittivat merkitsevästi lisääntynyt

Nanog

ilme.

Nanog

ilmentyminen CD133- määriteltiin 1, ja kertainen CD133 +

alhainen ja CD133 +

korkea (vs. kohteeseen CD133-) laskettiin ΔΔCT. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta kokeiluja kaksoiskappaleet. (G) HCT116-solut infektoitiin

Nanog

GFP lentivirus ja analysoitiin CD133 väestön virtaussytometrialla. Prosenttiosuudet CD133 populaatiot verrattiin toisiinsa HCT116-solut joko endogeenisen taso tai yliekspressio taso Nanog. CD133 +

suuren kannan (R5) lisääntyi soluissa yliekspressioon

Nanog

.

demetylointi Nanog vuonna CD133 +

korkea populaatio HCT116-solujen

korkea ekspressio CD133 on yksi merkkejä CSC väestön erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien paksusuolen syöpä [21], [22]. Koska kolme pluripotenttien geenit

Nanog

,

Oct4

, ja

c

–

MYC

oli hypermetyloitunut peräsuolen HCT116-solut, kysyimme, onko sama kuvio metylaation olisi havaittu harvinainen otaksuttu CSC väestön HCT116-soluissa. Havaitsimme yli 80% HCT116 soluista oli CD133 +, mutta vain 1% soluja pidetään CD133 +

korkea (kuvio 4D). Tärkeää on,

Nanog

promoottori metylaatio säilyi korkealla tasolla sekä CD133- ja CD133 +

pieni HCT116-solut (89% ja 78%, tässä järjestyksessä), kun se oli vähentynyt voimakkaasti 42% vuonna CD133 +

korkea-solut (kuvio 4E). Pelkistetty metylaatio havaittiin myös mukaisesti merkittävää voimistumista

Nanog

ilmentymisen CD133 +

korkea soluja (kuvio 4F). Lisäksi yliekspressio eksogeenisen

Nanog

vuonna HCT116-soluissa johti kasvua CD133 +

suuren kannan (Kuva 4G), mikä viittaa siihen, että demetylaation

Nanog

promoottori edistää aloittamisen CSCS kasvaimen kehitykseen.

pluripotenttisuus sääntelyn piirejä syöpäsoluissa

Oct4

,

Sox2

, ja

Nanog

on osoitettu muodostavat transkription sääntely silmukan talous- ja sosiaalineuvostojen ylläpidosta pluripotenttisuuden [23] – [25]. Kysyimme onko tällainen rajat sääntely on säilynyt syöpäsoluissa poikkeavaan epigenetic kuvioita. HCT116-solut erilaisilla p53 geneettiset taustat käytettiin, koska p53 raportoitiin esteenä uudelleen perustamiseksi pluripotenttisuuden [26]. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen eksogeenisen

Oct4

huomattavasti

Nanog

mRNA-tasoja in HCT116 p53 – /- soluja, mutta ei HCT116 p53 + /+ -soluista (kuvio 5A; kuvio S6b File S1). Induktio

Nanog

ekspressio liittyy vähentyneeseen promoottorin metylaation Oct4-HCT116 p53 – /- soluja (95%: sta 66%; kuvio 5B). Lisäksi yli-ilmentyminen eksogeeninen

Nanog

merkittävästi parannettu

Oct4

mRNA tasot HCT116-soluissa riippumatta p53 asemasta (kuvio 5C). Tämä viittaa siihen, että pluripotenttisuuden sääntelyn piiri on konservoitunut syöpäsoluissa, ja se palautuu osittain syöpäsolujen kautta epigeneettiset mekanismi, joka ohjelmoi

Nanog

promoottorin metylaation.

(A) HCT116 p53 + /+ ja p53 – /- solut infektoitiin

Oct4

GFP-lentivirus. Vahva induktio endogeenisen

Nanog

ekspressio havaittiin Oct4-ilmentävät HCT116 p53 – /- soluja. Geeni ilmentyminen HCT116-soluissa ilman infektiota määriteltiin 1, ja kertaistanut HCT116-solujen infektio laskettiin ACt. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta kokeiluja kaksoiskappaleet. Parilliset Student

t

testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin. (B)

Nanog

promoottori metylaatiovyöhykkeiden HCT116 p53 – /- solut tai ilman

Oct4

yli-ilmentymisen. (C) HCT116-solut infektoitiin

Nanog

GFP-lentivirus. Merkittävä induktio endogeenisen

Oct4

ekspressio havaittiin sekä Nanog-ilmentävien HCT116 p53 + /+ ja p53 – /- soluja. Geeniekspression laskelma oli sama kuin on kuvattu (A). Parilliset Student

t

testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin.

Keskustelu

aktivointi molekyylikohteista pluripotenttisuuden liittyvien geenien (

Nanog

Oct4

,

Sox2

, ja

c

–

MYC

) havaitaan usein huonosti eriytetty syövissä [11], [27].

Oct4

ja

Nanog

ilme on myös todettu liittyvän CSC ominaisuuksia ihmisen syövissä [28] – [33]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet kantasolun epigeneettiset allekirjoitus pluripotenttisuuden liittyvien geenien syöpäsolulinjoissa; erityisesti lisääntynyt ilmentymä

Nanog

metastaattisessa HCC-soluissa ja huonosti prognostisissa ihmisen HCC kasvaimissa (kuvio 1 B, 1C, 2A, 3, taulukko 1), joka oletettavasti liittyy sen promoottorin hypometyloidut aseman ja tukahduttaminen on

p53

. Olemme myös huomanneet, että

NANOGP8

, koodaa proteiinia, jossa on yli 99,5%: n samankaltaisuutta ja aito NANOG1 proteiini, ilmentyy erilaisissa syöpäsoluissa, mukaan lukien HCT116-soluja [34], [35]. On mahdollista, että

NANOGP8

tasolla voivat häiritä havaitsemista

Nanog

ilmaus tutkimuksessamme koska TaqMan käytetty koetin voi erottaa toisistaan ​​kaksi geenisekvenssit. Tärkeää on, meidän data osoitti, että voimakas

Nanog

ilmentyminen liittyi aloittamiseen oletetun CSC populaation (kuva 4D-G) ja edistänyt

in vivo

tuumorimetastaasissa (kuva 4A-C) . Siksi oletamme, että demetylaation

Nanog

tapahtuu kasvainten kehittymiseen ja vastaava ilmaus

Nanog

tarjoaa kasvainsolujen metastaattinen CSC ominaisuuksia.

Syöpäsolut on ehdotettu sopeutua epigeneettisestä allekirjoitus ”stemness”. Eri syöpäsolut näyttö niiden ainutlaatuisen malleja DNA: n metylaatio, histonimodifikaation, ja pluripotentteihin geeniekspressiota että voi heijastaa eri kudoksista peräisin. Mielenkiintoista, iPSCs satama jäljellä DNA: n metylaatio allekirjoituksella somaattisen kudoksen alkuperästä [13] – [16]. Vaikka on vielä määritetty, onko ilmiö epigeneettiset muisti kumppaniaan syövän kehitystä, meidän tiedot viittaavat mahdollisuuteen, että eri kudoksista peräisin syöpiä voisi pitää eri karsinogeeninen potentiaali, kun ne altistetaan epigeneettiset muutokset, joista jotkut ovat alttiimpia uudelleen -Aktivoi pluripotenttien geenit hankkimalla kantasolu epigenetic allekirjoitus.

Oct4 ja Nanog ovat ydinosat proteiinikomplekseille ylläpitämiseksi pluripotenttisuus ja aktivoimalla transkription sääntelyn piirissä. Havaintomme on

Oct4 Twitter /

Nanog

rajat induktioon HCT116-soluissa osoittaa edelleen suojelualueen rajat sääntelyä toiminto välillä pluripotenttien tekijöiden syöpäsoluissa (kuva 5).