Krooninen sairaus

tiivistelmä

Androgeenireseptorin (AR) välittämä signalointi on välttämätön normaalia kehitystä eturauhanen ja myös ajaa eturauhassyövän (PCA) solujen kasvua ja selviytymistä, monet tutkimukset osoittavat korrelaatiota lisääntynyt reseptorin tasojen ja terapia vastus eteneminen kohtalokas kastraatiotason toistuvia PCa (CRPC). Vaikka se on pidetty jo jonkin aikaa, että transkriptiotekijä SP1 on tärkein stimulaattori AR-geenin transkription ja perusteellinen sääntelyn AR-geenin edelleen kesken. Ohessa kuvataan ja luonnehtivat yksityiskohtaisesti kahden uusi vaikuttava sääntely elementtejä 5’UTR ihmisen AR-geenin. Molemmat näistä tekijöistä sisältävät päällekkäisiä sitoutumiskohtia positiivisen transkriptiotekijän SP1 ja repressoriproteiinimu- pur-α. Poikkeavan solun signalointi on ominaista PCa ja transkriptionaalista aktiivisuutta AR-promoottorin PCa soluissa on riippuvainen suhteelliset määrät kahta transkriptiotekijöiden. Yhdessä vahvistuksen hallitsevan aseman SP1, havainnot tukevat perustelut kohteekseen transkriptiotekijän estämään kasvaimen etenemistä. Tämän pitäisi olla erityisen terapeuttista merkitystä CRPC jonka vallitessa repressorin pur-α vähenevät.

Citation: Hay CW, Hunter I, MacKenzie A McEwan IJ (2015) SP1 Moduloitu Regulatory Region Ainutlaatuinen korkeampi Primates säätele ihmisten androgeenireseptorin promoottoriaktiivisuus eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 10 (10): e0139990. doi: 10,1371 /journal.pone.0139990

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 16 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 20 syyskuu 2015; Julkaistu: 08 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Hay et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Johtavan tutkijan toimistoon (CSO) Scottish Government (https://www.cso.scot.nhs.uk/) : CWH (CZB-4-477) ja IH (ETM /382).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhasen syöpä (PCA) on toiseksi yleisin syöpä miehillä ja muodostaa toiseksi suurin syy mies syöpäkuolemista länsimaissa ja kuudes maailmanlaajuisesti vastaavasti [1]. Lisäksi esiintyvyys PCa kasvaa lähes kaikissa maissa, joissa korko uusia tapauksia odotetaan kaksinkertaistuvan vuoteen 2030-1700000 seurauksena 500000 ylimääräisiä kuolemia [2].

kasvua ja erilaistumista normaalin eturauhasen epiteelisolujen soluja, sekä kehittymistä ja etenemistä PCA ohjaavat androgen signalointia, joka välittyy androgeenireseptorin (AR) [3]. Siksi esto Jälleenkytkentätoiminto androgeenien vajaushoidon (ADT) käyttäen antagonisteja tai vähentämisen kivesten tai intratumoraalisesti androgeenisynteesin on tärkein menettely torjumiseksi kehittyneiden ja metastaattinen PCa [4-6]. Aluksi useimmat potilaat kokevat merkittävää parannusta ja remissio, mutta syöpä poikkeuksetta kehittyy itsenäistyä verenkierrossa androgeenien ja sitä kutsutaan kastraatiotason resistenttejä PCa (CRPC) [7]. Tämä myöhään, etäpesäkkeitä on yleensä kuolemaan ja edustaa suurin haaste uusien, tehokkaita hoitoja [8]; edellyttävät useita AR-kohdistettuja hoito (tarkistetaan [9]). Ratkaisevaa on se, CRPC kasvaimet pysyvät riippuvainen AR signalointia; esimerkkinä sekä androgeenien herkkiä (AS) ja CRPC soluihin, joissa vähentynyt AR ilmentyminen indusoi menetystä ja solujen elinkelpoisuuden [10].

androgeenireseptorin toimii androgeenireseptorin-aktivoidun transkriptiotekijän, joka sitoutuu androgeenireseptorin vaste-elementit ( ARE) [4] promoottoreita ja distaalisessa aineet (86%: sta 95% ARE: [11]). Transaktivaatiota kyky reseptorin moduloidaan vuorovaikutus alati kasvava luettelo jaksoihin ja transkriptiotekijöiden (tarkistetaan [12]), jotka toimivat itse reseptoriin tai muuttaa kromatiinin ympäristöön. Esimerkiksi edelläkävijä transkriptiotekijöiden FOXA1 ja GATA2 edistää avointa kromatiinirakenteeseen joka helpottaa AR sitova, ja genomiin leveä tutkimukset osoittavat kolokalisaation sitoutumiskohtien nämä kolme tekijää [13,14]. GATA2 on erityisen tärkeä merkitys, koska sekä lisätä AR sitoutumisen parantajia, se osallistuu chromatin silmukointi ja sitä ylössäätelee AR geeniekspressiota [13,14]. Kohonneita GATA2 PCA korreloivat korkea Gleeson tulokset, ja aktiivisuus on vähentynyt kautta kostutetulla ilmaisun [13,14] tai esto GATA2 käyttöaste Ares kanssa isoflavone curcumin [15] johtaa alhaisempiin PCa solujen lisääntymisen.

valtaosa CRPC kasvaimista yli-ilmentävät reseptoria [16-19] kanssa kloonivalintamenetelmää ylläpitävät ongelmaa [20]. Kohonneet tasot AR sallivat sitoutumisen kromatiinin 100 kertaa pienempi ligandin konsentraatio kuin normaali [21] ja poikkeava AR-ajettu transkription ohjelma CRPC kasvaimet sallii solujen kasvaa pieninä pitoisuuksina androgeenin [22], tai ilmeisestä puuttumisesta hormoni [23-25], mikä kumotaan ADT [26] ja hoidon abirateronin [20].

ihmisillä AR-geeni ulottuu noin 180 kbp X-kromosomin (Xq11.2-Q12) ja synnyttää transkriptio 4,3 kb, joka sisältää harvinaisen pitkä 5 tulkitsemattoman alue (5’UTR) 1,1 kb. Promoottori puuttuu TATA ja CCAAT laatikot ja, kuten monilla TATA-vähemmän geenejä, transkriptio ohjaa pääasiassa sitomalla ekspressoituvat sinkkisormen transkriptiotekijän, erityisyys Protein 1 (SP1) GC ruutuun säätelyelementit. Ydin promoottori välissä -74 ja +87 bp [27] ja aktiivinen GC laatikoita on vahvistettu -46–41 emäsparin samoin kuin 5’UTR- at +429 ja +442 bp [27-29]. SP1 ajettu ilmentymistä AR-geenin helpottaa noin 90 emäsparin mittainen homopuriinijaksojen /homopyrimidiini- välittömästi ylävirtaan promoottori (-150 -60 bp), joka tarjosi runsaat transkriptiotekijän sitoutuvan ytimen promoottori [30 ]. Sitouduttuaan promoottori, SP1 osakkuusyritysten suoraan TATA-sitova proteiini ja TBP liittyvä tekijä 4 (TAF4) [31] perustaa initiaatiokompleksin. Lisäksi, Sp1 voi muodostaa multimeerejä ja useita päällekkäin tetrameerien tarjoaa lukuisia telakointipaikkoina erilaisia ​​muita proteiineja transkription säätelemiseksi sekä suoraan histoni asetylaatio ja kromatiinin remodeling (katsaus [32]). Lisäksi upregulatory GC laatikot, 5’UTR-alue koodaa useita inhiboivia säätelyelementit mukaan lukien yhdistetyn NF-KB: n, B-myb sitoutumiskohta [33], joka on negatiivinen ARE [34] ja androgeenireseptorin vaimennin (ARS) [35 ], joka sitoo pur-α ja hnRNP-K vastakkaisissa säikeiden DNA [36].

AR edustaa selvästi akilleenkantapää eturauhassyövän vielä juoksevien käsittelyyn kuuluvat androgeenireseptorin antagonistit on rajoituksia ja myös johtaa ilmentymiseen vaihtoehtoisen AR-odotuksiin transcriptome vaihteleva PCa tuloksiin [37]. Paljon tehokkaampi ratkaisu olisi vähentää AR aktiivisuuden vähentyneen ilmentymisen tai haittaa olennaista transkriptio kofaktoreita esim pieni molekyyli estäjä GATA2 on osoittautunut tehokkaaksi [13]. Molemmat lähestymistavat riippuvat yksityiskohtaista tietoa vuorovaikutuksesta useiden transkriptiotekijöiden ja säätelyelementtejä mukana AR ilme. Näin ollen, kuten transkriptiotekijän SP1 pidetään yleisesti olevan merkittävä stimulaattori AR-geenin ilmentymisen, olemme tutkineet SP1 toiminto välittömästi promoottorin ja 5’UTR ihmisen AR-geenin. Tässä raportissa kuvataan kaksi uutta aktiivista säätelyelementtejä ihmisen AR 5’UTR- jotka molemmat sisältävät päällekkäisiä sitoutumiskohdat positiivisten ja negatiivisten transkriptiotekijöiden. Transkription tulos PCA soluissa riippuu suhteelliset määrät stimuloivien SP1 ja estävä pur-α. Havainnot myös todistettava hallitseva rooli SP1 ajo AR ilmaisun ja siten vahvistamaan perustelut kohteekseen transkriptiotekijän, koska tämä toiminta edistää sitoutumista kilpailevien pur-α ja estävät syövän etenemiseen. Lopuksi säätelyelementit osoittavat erittäin huono evolutiivinen säilyttäminen havainnollistaa erottuva luonne ihmisen AR geenisäätelyn.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen eturauhasen sinoomasolulinjoja LNCaP ja DU145 saatiin The European Collection of Cell Cultures, ja American Type Culture Collection vastaavasti. DU145 kasvatettiin DMEM taas LNCaP ylläpidettiin RPMI, joka sisälsi 1 mM Na-pyruvaattia ja 10 mM HEPES. Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (PAA) ja pidettiin 37 ° C: ssa ilman antibiootteja: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 95% ilmaa ja 5% CO

2.

Western blotting

solu-uutteet valmistettiin LNCaP ja DU145-soluja, ja western blot suoritettiin, kuten aikaisemmin on yksityiskohtaisesti kuvattu [38]. Ihmisen SP1 pur-α, hnRNP-K, ja GAPDH havaittiin käyttämällä vasta-aineita ab13370, ab79936, ab52600 ja ab36840 (kaikki Abcam) laimennoksina 1: 6000, 1: 60000, 1: 17000 ja 1: 12500 vastaavasti. Anti-AR Santa Cruz Biotechnology (sc-7305) käytettiin 1: 100 laimennus. Antigeeni-vasta-kompleksit detektoitiin käyttämällä piparjuuren peroksidaasiin konjugoitua anti-kani-IgG sekundääristä vasta-ainetta (Sigma), kuten aiemmin on kuvattu. Integrointi analyysi Western blot suoritettiin käyttäen Image J ohjelmisto.

RT-PCR

LNCaP-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 50 nM mitramysiini A (Sigma) 24 tuntia. RNA: n ja RT-PCR-AR ja GAPDH-mRNA: n suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [34].

Plasmidit ja kohdennetulla mutageneesillä

mutaatiot mahdollisia säätelyelementtejä vietiin plasmidiin phAR1. 6Luc, jossa lusiferaasiekspressio ohjaa 1,6 kbp promoottorin ja 5’UTR ihmisen androgeenireseptorin geeni (välillä -741 ja +842 bp) [34], kahdella menetelmiä. Emässubstituutiota luotiin käyttäen QuikChange II -mutageneesitarvikkeissa (Agilent Technologies) käyttäen oligonukleotideja taulukossa A S1 tiedosto, sekä niiden käänteisen täydennykset. Deleetiomutaatioiden tehtiin käyttämällä In-Fusion Advantage PCR kloonaussysteemiä Clontechistä lueteltuja oligonukleotidejä käyttämällä taulukossa B S1 File. Molemmat protokollat ​​suoritettiin mukaisesti valmistajan protokollan ja eheyden kaikkien konstruktien varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Transfektio ja lusiferaasireportterigeenianalyysissä

Kaksikymmentäneljä-kuoppaisille levyille ympättiin LNCaP tai DU145 solut tiheydellä 5 x 10

4 solua /cm

2 ja 1,2 x 10

4 solua /cm

2 vastaavasti. Soluja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa 24 h ajan, sitten transfektoitiin 440 ng /kuoppa tulikärpäsen lusiferaasireportteriplasmidi käyttäen JetPEI polyetyleeni-imiiniä (Polyplus Transfektio) mukaan valmistajan protokollaa. 24 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja soluja viljeltiin vielä 24 tai 48 h.

Plasmidi transfektio suoritettiin vähintään kolmena kappaleena ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin kahtena tai kolmena kappaleena käyttämällä GloMax 96 Microplate luminometrillä (Promega) ja normalisoitu proteiinipitoisuus kuten aiemmin on kuvattu [38].

valmistaminen tumauutteiden

Tumauutteet valmistettiin DU145-solujen läsnä ollessa proteaasi-inhibiittorien (täydellinen proteaasiestäjäseostabletit Rochen ja 1,0 mM PMSF) ja proteiini fosfataasi-inhibiittorit (5 mM β-glyserofosfaatti ja 100 uM aktivoitu Na

3Vo

4) käyttäen menetelmää Dignam

et ai

[39].

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määritykset (EMSAs) B

joko 10 ug LNCaP solun tumaekstraktin tai 120 nM: n puhdistetulla rekombinantilla ihmisen SP1-proteiinia (Active motiivi) inkuboitiin 20 fmol biotiinin 3′-leimattu kaksijuosteinen DNA- oligonukleotideja käyttäen edellä kuvatuissa olosuhteissa [34]. Eteenpäin sekvenssit oligonukleotidit olivat: Sp1-1, 5′-CGGCCCGGTGGGGGCGGGACCCGACTCGCA-3 ’; ARS, 5’-TCTCCACCCCGCCTCCCCCCACCCTGCCTT-3 ’; ja Sp1-3, 5’-TTCTCCCCACCCGCCCCCCCGCCCCCGTCG-3 ’. Leimaamaton oligonukleotidi konsensus SP1 säätelyelementin, Sp1 haittoja, 5’-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3 ’, lisättiin 15 min ennen leimatun koettimen. Sillä supermuutoksena määrityksissä vasta-aineiden ab13370 ja ab52600 (Abcam) ihmisen SP1 ja hnRNP-K, vastaavasti, lisättiin 15 minuuttia ennen kuin lisättiin leimattu koetin.

Saatu DNA: proteiini tuotteet erotettiin jäähdytetyssä 6% denaturoivassa polyakryyliamidigeeleillä ajaa 0,5x TBE-puskurissa, pH 8,3 (45 mM Tris-boraatti, 1 mM EDTA) ja detektoitiin käyttämällä Pierce LightShift Kemiluminesenssiin reagenssit (Thermo Scientific) mukaan valmistajan protokollaa. Luvut koottiin käyttäen autorads EMSAn geelien kanssa järjestystä kaistojen joissakin geelit, muutetaan tukea selkeys ja vertailun helpottamiseksi. Digitaalinen yhdentyminen DNA: proteiini kompleksit suoritettiin käyttäen Vilber Loumat Fusion SL jäähdytetty CCD-kenno huolehtien siitä varmistettava, ettei pikselin kylläisyys tapahtunut.

Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritys

yksityiskohtainen selvitys siru menetelmää on esitelty aiemmin [34]. Lyhyesti, LNCaP-solut transfektoitiin asiaa phAR1.6Luc-pohjainen plasmidi, ja kasvatetaan tavanomaisella tavalla. Solut kiinnitettiin 1% formaldehydiin 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja tumat valmistettiin. Kromatiinin ja plasmidi digestoitiin 200 yksikköä HphI (NEB) 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa; jonka jälkeen hajoamiseen ja poistamalla liukenemattomat jäännökset sentrifugoimalla. Supernatantti laimennettiin ChIP puskuriin ja esiselkeytettiin käyttäen proteiini-G ja proteiini-A-Dynabeadseja (Life Technologies). Näytteitä selvitetty lysaatit säilytettiin tulo (IP) ja loput inkuboitiin vasta-aineita joko SP1 (07-645, Millipore) tai IgG. Immunokompleksit kerättiin magnetointi, pestään kahdesti jokaisessa on: vähäsuolainen; korkea suola; LiCl ja TE puskureita, mitä seurasi eluointi. DNA-proteiini ristisidosten purettu NaCl 65 ° C: ssa ja DNA puhdistetaan. Eristetty DNA kvantifioitiin puolikvantitatiivinen log-vaiheen PCR: llä ja erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla TAE-puskurissa. Eteenpäin (F) ja taaksepäin (R) alukkeet olivat: ARS-F, 5′-GCTGCTAAAGACTCGGAGGA-3 ’; ARS-R, 5’-CTGAGAGTAGCCGACTGAGG-3 ’; Sp1-3-F, 5’-CCCGAGTTTGCAGAGAGGTA-3 ’ja Vect-R, 5′-TCTTCCATGGTGGCTTTACC-3’.

Tilastollinen

tilastollista merkitystä erojen aineistoja DNA : proteiini-kompleksin muodostumisen EMSA kokeissa määritettiin käyttäen kaksisuuntaista ANOVA ja parillista t-testiä varianssianalyysi käytettiin kaikkien muiden väliset vertailut täydentäviä tietoja.

tulokset

ihmisen AR-geenin 5 ’ UTR sisältää kaksi aluetta, joilla on päällekkäisiä säätelyelementit

Examination ihmisen AR koodaava geeni 5’UTR aluetta transkriptin (kuvio 1A) paljasti mahdollisen SP1 sitova GC laatikko (328-332 emäsparia), joka todettiin sijoituttava aiemmin kuvattu androgeenireseptorin vaimennin (ARS) sekvenssi [35] (Kuva 1 B). Ensimmäinen esimerkki ARS säätelyelementtiin, joka voi sitoa ekspressoituvat proteiinin pur-α kuvattiin hiiren AR-geenin 5′-UTR yli 400 bp alavirtaan vastaavasta ihmisen sekvenssin [40]. Koska sekä GC laatikot ja ARS sivustot on korkea GC-pitoisuus, mahdollisuus muita esimerkkejä näistä kahdesta säätelyelementtejä päällekkäisyyttä tutkittiin tarkemmin. Vaikka sitoutuminen pur-α on sekvenssispesifiseksi suosivat toistot (GGN), ei ole selvää yksimielisyyttä tunnistussekvenssiin siis aluetta hiiren ARS suojattu DNaasi I ruoansulatus käytettiin etsiä muita mahdollisia sivustoja ihmisen 5’UTR-. A-alueen ihmisen 5’UTR, distaalisesti ARS-sekvenssi, jolla on 85% identtisyys havaittiin (kuvio 1C), joka on suurempi kuin 70% identtisyys nähty samaa koetinta ja vakiintuneita ihmisen ARS (S1A kuvio). Käyttö on määritelty hiiren ARS-sekvenssi [41] tuotti samanlaisen toteamuksen 75% identtisyys joka taas oli suurempi kuin arvo 67% ihmisen ARS (S1B ja S1C kuviossa), vastaavasti. Mahdollinen uusi vaimentimen alueella päällekkäin Sp1-3 sääntely elementti, jonka tiedetään satamaan kaksi aktiivista GC laatikkoa [29]. Tämä nosti esiin kiehtova mahdollisuus, että nämä kaksi aluetta voivat toimia joko stimuloida tai vähentää AR ilme.

(A) Kaavamainen esitys ihmisen AR-geenin 5’UTR- ja välitön proksimaalinen promoottori pääosin ilmenee säätelyelementit ja alueiden tutkittavana. Bent Nuoli osoittaa transkription aloituspaikan (+1) ja ATG kiinteällä nuolella osoittaa alkua käännöksen. (B) Mahdolliset GC box (vihreä katkoviiva laatikko) sisällä vahvisti ihmisen ARS sääntely elementti (sininen alleviivattu). (C) rinnastus ihmisen AR 5’UTR- ja hiiri AR 5’UTR- vaimennin elementin suojattu DNaasi I ruoansulatus [40] (sininen alleviivattu) kanssa vahvistettu ihmisen GC laatikot (vihreä kiinteä laatikko). Homologiset sekvenssit on merkitty pystysuoraa viivaa.

useita rinnastuksia vastaavat alueet ihmisen AR-geenin 5′-UTR 11 muiden lajien käyttäen julkisesti saatavilla DNA-sekvenssejä (kuvio 2) osoitti, että molemmat sekvenssit ovat huonosti säilytetty. ARS alue on läsnä vain kädellisillä ja järjestyksessä simpanssi, joka poikkesi ihmisillä +6.600.000vuosi sitten [42], on täydellinen homologia ihmisen. Lisäksi ja yli span +42.200.000vuosi eroavaisuuksista ihmisten ja marmosetin, kaikkein poikkeavista kädellisen tutkittiin, että suurin osa sekvensseistä näyttää vain muutaman nukleotidin substituutiot. Sp1-3 alue näkyy jopa vähemmän homologiaa vain simpanssin jakaa molemmat GC laatikot ihmisiin. Sekä kiinnostaville alueille, ei-kädellisten lajien hallussaan hyvin alhainen homologia ihmisen, eikä vastaavaa sekvenssit havaittiin linnun tai piscine lajeja (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi hiiren ARS alue on erittäin heikosti konservoitunut ja ei pur-α sitoutuva sekvenssi on löydetty vastaava genominen alue muiden eläinten, kuten läheistä sukua oleva jyrsijä; rotta (S2 Kuva).

alueet har geenin 5’UTR tutkittavana verrattiin osoitettujen istukan lajeja. (A) ARS (sininen laatikko), ja (B) Sp1-3 säätelyelementti (vihreän laatikon). Erot Humaanijaksossa on merkitty lihavoituna alleviivattuna fontti.

GC laatikko on pääasiallinen SP1 sitoutumiskohta ihmisen AR promoottori

Alustavat kokeet tutkittiin vaikutusta SP1 antagonisti, mitramysiini A on endogeenisen AR-geenin LNCaP. Mitramysiiniä annosriippuvainen väheneminen AR proteiinin tasot havaittiin (kuvio 3A), jonka pitoisuus oli 50 nM mitramysiiniä käytetään seuraavissa kokeissa. RT-PCR-tutkimukset vahvistivat, että lasku AR-proteiinin tasot korreloivat alentunut transkription (kuvio 3B).

LNCaP-soluja inkuboitiin mitramysiini A 24 tunnin ajan ja sitten analysoitiin. (A) Western blot-analyysi arvojen suhteen AR /GAPDH alla. (B) RT-PCR-AR ja GAPDH-mRNA: n. LNCaP-solut transfektoitiin phAR1.6Luc (WT) tai phAR1.6Luc-ΔCG ja käsiteltiin DMSO: ssa tai 50 nM mitramysiini A 24 tunnin ajan ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Data edustaa keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen ja tilastollisen merkitsevyyden ilmoitettu vertailut ovat: * p 0,05; ** P 0,01 ja *** p 0,001.

Vaikka on pitkään katsonut, että transkriptiotekijä SP1 on tärkein ilmaus TATA-puuttuvat ihmisen AR-geeni, suhteellinen merkitys GC laatikko (Sp1-1; -45–40 bp) ytimessä promoottori edelleen epäselvä niistä poistetaan tutkimusten mukaan se on joko välttämätöntä [27] tai ei merkittävä rooli [43]. Mutaatio GC laatikon phAR1.6Luc lusiferaasireportteriplasmidin [34], joka sisältää 1,6 kbp osa har promoottorin ja 5’UTR asemien välillä -741 bp +842 bp johti 80% vähennys lusiferaasin ilmentyminen transfektoiduissa androgeeniresponsiivinen LNCaP-soluja (kuvio 3C). Vastaavasti 46%: n vähennys havaittiin androgeenireseptorin ei-reagoiva PCa solulinja DU145 (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä analyysit osoittivat, että ytimen promoottori GC ruutuun ja SP1 sitova, on keskeinen asema ilmaisemisessa AR-mRNA ja proteiini. Tärkeää on, että mutatoitu reportteriplasmidilla pysyi estettävissä mitramysiini A (kuvio 3C), mikä vahvistaa, että Sp1-välitteistä säätelyä AR-geenin tapahtuu muualla kuin GC-ruutuun.

5’UTR päällekkäiset sääntely elementit voivat ylä- tai downregulate promoottorin aktiivisuutta

jotta valaista toiminnallinen aktiivisuus muita mahdollisia säätelyelementtejä tutkittavan edelleen mutaatioita tuotiin phAR1.6Luc lusiferaasireportteriplasmidin. Transfektio suoritettiin kokeita käyttäen sekä androgeeniresponsiivinen, LNCaP ja ei-reagoiva, DU145 PCa solulinjat, jotka olivat viljeltiin täydellisessä väliaineessa sen varmistamiseksi, että kaikki solun signaalireittien, jotka ovat riippuvaisia ​​alustan komponentit (kasvutekijöiden ja hormonien), olivat toiminnallisia.

jotta voidaan vahvistaa roolia SP1 sitoutumisen mahdolliseen GC laatikko ARS (322-345 vuonna 5’UTR), emässubstituutioita otettiin käyttöön luomaan reportteri phAR1.6Luc-UTRm1 joka johti vähennykset ilmentymisen 29% ja 13% vuonna DU145 ja LNCaP-soluissa (kuvio 4A ja 4B) vahvistaa aktiivisen roolin tätä uutta GC ruutuun upregulating AR ilme. Toisaalta, tämä alue 5’UTR on osoitettu toimivan negatiivisena säätelyelementti kautta sitovan transkriptiotekijän pur-α, joka on raportoitu keskeytyvän mukaisesti EMSA olosuhteissa sisällyttämällä parin kahden emäksen substituutioita [35], ja näiden valmistamiseen käytettiin reportteri phAR1.6Luc-UTRm2. Kuitenkin käyttämällä tätä reportteri transkriptioaktiviteettia väheni 36% ja 20% vuonna DU145 ja LNCaP vastaavasti sen sijaan kasvoi (kuvio 4B), kuten voidaan ennustaa vapauttamalla estäjän. Tarkastus sekvenssin muutokset tuotetaan mutaatio osoittaa, että guaniini ja cyctosine keskellä oletetun GC laatikko korvattiin adeniini analogisella tavalla Sp1-spesifisen mutaation phAR1.6Luc-UTRm1. Siksi menetys SP1 sitovien tässä säätelyelementti on hallitseva tulos, joka tarjoaa lisätodiste siitä, että oletetun GC laatikko voidaan aktiivisesti ylössäätää AR ilme. Todennäköisyyttä, että korvaaminen mutaatio ARS alue oli riitä estämään pur-α ja hnRNP-K sitova fysiologisissa olosuhteissa, koko säätelyelementti poistettiin luoda phAR1.6Luc-UTRΔm1. Tässä tapauksessa promoottorin aktiivisuus voimistuvan 1,27 ja 1,67-kertaisesti DU145 ja LNCaP vastaavasti (kuvio 4B) kanssa ero kahden solulinjoista on merkitsevä (p 0,01).

(A) Kaaviokuva lusiferaasireportteri konstrukti phAR1.6Luc ohjaavat 1,6 kbp har-promoottorin ja 5’UTR mahdollisten transkriptiotekijän sitoutumista kiinnostavilla alueilla. Sp1-3 sisältää kaksi SP1 sitovaa kohtaa. (B ja C) Ilmoitettu PCa solulinjoja, viljellään täydellisessä väliaineessa, transfektoitiin joko phAR1.6Luc sisältävä WT sekvenssin (mustat palkit) tai mutatoitunut versio (harmaat palkit) on esitetty päällekkäin kaavio. Lusiferaasi tiedot ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen ja tilastollisen merkitsevyyden ilmoitettu vertailut ovat: * p 0,05; ** P 0,01 ja *** p 0,001.

Analogiset mutaatioita tuotiin myös kolmanteen säätelysekvenssi kohteisiin (423-446). Ensiksi kaksi GC laatikkoa Sp1-3 mutatoitiin joko yksittäin (phAR1.6Luc-UTRm3 ja phAR1.6Luc-UTRm4) tai yhdessä (phAR1.6Luc-UTRm5). Lusiferaasiaktiivisuus paljasti, että häiriöt GC laatikoiden johti merkitsevää pienenemistä promoottori stimulaatiota. Kaksi yhden mutaatiota laski transkriptioaktiviteettia 42% ja 29% vuonna DU145 soluja ja 29% ja 17% LNCaP, ja kaksinkertainen mutaatio näkyvissä vähennyksiä 34% ja 16% kahdessa solulinjoissa vastaavasti (kuvio 4C). Jälleen vähennykset promoottorin aktiivisuus oli suurempaa DU145 kuin LNCaP. Vaikutukset mutaatioiden eivät olleet kumulatiivisia kuten voitaisiin odottaa kaksi päällekkäistä sitoutumiskohdista. Samalla tavalla samanlainen kuin kanssa 322-345 alueella, emäksen substituution mutaatio mahdollisten päällekkäisten negatiivinen säätelyelementti in phAR1.6Luc-UTRm6 tuotettu tappiot transkriptionaalista aktiivisuutta 9% ja 4% DU145 ja LNCaP vastaavasti (kuvio 4C). Nämä arvot olivat vähemmän niitä nähty 322-345 alueelle edellä on kuvattu, mutta ne olivat yhdenmukaisia ​​sekvenssi muuttuu jolla on vain vähäinen vaikutus SP1 sitoutumiskohdista. Poistaminen koko mahdollisia kielteisiä sääntelyn tekijä phAR1.6Luc-UTRΔm2 johti 1,18 ja 1,50-kertainen säätelyä transkriptionaalista aktiivisuutta DU145 ja LNCaP vastaavasti (kuvio 4C). Kuten phAR1.6Luc-UTRΔm1 deleetiomutaatio, kasvu promoottorin aktiivisuus oli merkittävästi suurempi LNCaP kuin DU145.

sitoutumisaffiniteetti ominaisuudet 5’UTR päällekkäisten säätelyelementit

mahdollisuus, että sp1 sitoutuu kaikkiin kolmeen alueet tutkittavana tutkittiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määritykset (EMSAs). Alustavissa kokeissa puhdistetun ihmisen rekombinantti-Sp1-proteiinia inkuboitiin leimatulla oligonukleotidikoettimia, jotka sisältävät joko ensisijaista GC laatikko (Sp1-1), mahdolliset uudet SP1 sitoutumiskohta ARS alueella tai Sp1-3. Elektroforeettisen resoluutio saatujen tuotteiden kaikkien kolmen leimatuilla koettimilla osoitti yhden suuren molekyylipainon DNA: proteiini-kompleksin yläosassa geelin (kuvio 5A, kaistat 2-4) ja joka on SP1, jonka molekyylipaino on 95 kDa.

Puhdistettua SP1 proteiini (paneeli A), tai ydin- uute DU145-soluja (paneelit (B) ja (D)), inkuboitiin leimatulla oligonukleotidikoettimia jäljempänä esitetään kunkin geelin ja tuotteet erotettiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän analyysi. Lisäykset yläpuolella näkyvät geelit ja olivat: Ab, vasta-aine; PI, immuniteettia edeltävä seerumi; Mith, mitramysiiniä; Sp1 haittoja, konsensus SP1 oligonukleotidi. Kilpailevat merkitsemätöntä oligonukleotidit (100-kertainen molaarinen ylimäärä) tai immunoseerumit lisättiin ennen kuin lisättiin koetin. EMSAs ne edustavat vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. (A) Ilmoitetut leimattuja koettimia inkuboitiin puhdistetulla SP1 proteiinin paitsi kaista 1, joka ei ollut lisäksi. Musta nuoli osoittaa SP1-DNA-kompleksi. (B) Anti-Sp1-vasta-ainetta lisättiin kuten on esitetty, ja kompleksi poissa inkuboinnin jälkeen vasta-aineella on osoitettu nuolella. (C) mitramysiini (120 nM) lisättiin ilmoitettu kaistaa ja monimutkainen köyhdytettyä inkubaation jälkeen lääke on osoitettu yhtenäisellä nuolella. (D) Leimaamaton kilpailevien oligonukleotidi, joka koodaa SP1 konsensus sitoutumiskohdan lisättiin kuten on esitetty.

inkubointi tumauutetta valmistettu eturauhassyövän solulinja DU145 joko Sp1-1, ARS tai Sp1-3 valmistettujen oligonukleotidien useita juovia lähes identtinen elektroforeettinen motilities (kuvio 5B, kaistat 1, 4 ja 6 vastaavasti). Sitoutuminen SP1 vahvistettiin kaikissa tapauksissa lisäämällä anti-Sp1-vasta-aine, joka on tuotettu supersiirtymäanalyysi kanssa Sp1-1 oligonukleotidin ja suuresti vähentynyt kokoonpano, jossa on korkean molekyylipainon DNA: proteiini-kompleksin sekä ARS ja Sp1-3 (kuvio 5B kaistat 2, 5 ja 7 vastaavasti), kun taas esi-seerumia ei ollut vaikutusta (kuvio 5B, kaista 3). Eri tulokset inkubaation anti-transkriptiotekijä vasta-aine voi esiintyä EMSA analysoi esim. CREB-1 CRE sivustoja ihmisen insuliinin ja somatostatiinin promoottorit [44], mikä johtuu useista tekijöistä, mukaan lukien: vahvuus sitoutumisen DNA: ta; spatiaalinen /konformationaalisen järjestämisestä proteiinin säätelyelementtejä, suunta DNA vieressä konsensus ja läsnäolo sitoutuneen kofaktoreita.

Lisätään mitramysiini A, joka häiritsee sitoutumisen SP1 Säännönmukaisten elementin [45 ], vähentää huomattavasti muodostumista korkean molekyylipainon komplekseja kaikki kolme oligonukleotidit (kuvio 5C, vertaa kaistoja 1 ja 2, 3 ja 4, ja 5 ja 6). Vastaavasti, esi-inkubaatio ylimäärän kanssa leimaamatonta oligonukleotidista, joka sisälsi konsensus SP1 sitovan sekvenssin käytännössä eliminoitu DNA: proteiini-kompleksin muodostumisen (kuvio 5D, vertaa kaistoja 1 ja 2, 3 ja 4, ja 5 ja 6). Yhdessä nämä tulokset vahvistavat, sitoutumisen SP1 kaikkien kolmen GC box-sekvenssit sisältävän, tukee johtopäätöksiä reportterigeenin kokeiden aikana (kuvio 4). Edelleen, ero tulosten nähty oligonukleotidit Sp1-1 sivuston ytimessä promoottori verrattuna ARS ja Sp1-3 sivustoja, jotka näkyvät ilmeinen pienempi affiniteetti luonnon SP1, erilaisiin tuloksiin inkuboitaessa anti-SP1 vasta-ainetta ja alempi mutaatio aiheuttama väheneminen Lusiferaasimäärityksiä (kuvio 4), ehdotti, että sitoutuminen SP1 ytimeen promoottori GC laatikko oli vahvempi kuin sen 5’UTR-.

transkriptiotekijä pur-α sitoutuu ensisijaisesti guanine- rikas yksijuosteinen DNA tai vastaava sekvenssit kaksijuosteisen DNA. Inkubointi tumauutetta joko kaksijuosteinen tai G-rikas single käänteisjuoste ARS ja Sp1-3 koettimet tuottivat varsin erilaisia ​​tuloksia. Molemmat yksijuosteisten koettimien tuotettu DNA: proteiinikompleksi (merkitty nuoli open), jotka kulkeutuivat hieman ennen SP1: DNA ja muiden korkean molekyylipainon komplekseja yleensä nähty kaksijuosteinen anturi (kuvio 6A). Yhdenmukainen kyky pur-α sitoa myös dsDNA, sekä ARS ja Sp1-3 kaksijuosteisen oligonukleotideja tuotti vaimean DNA: proteiini monimutkainen, jotka kulkeutuivat hyvin samankaltainen asema tuotteeseen nähty yksijuosteinen antureista. Tärkeää on, että DNA: proteiini-kompleksin, joka on muodostettu G-rikas juoste Sp1-3 käyttäytyi samalla tavalla kuin vastaavat ARS oligonukleotidi, jonka tiedetään sitoutuvan pur-α [36]. Mielenkiintoista, pur-α sitoutuu DNA dimeerit ja multimeerien [46], joka selviäisi ei-denaturoivissa olosuhteissa EMSAn jolloin näennäinen korkean molekyylipainon muuttoliike ominaisuudet DNA: proteiini kompleksit. Kaupallinen anti-pur-α-vasta-ainetta ei saada vaikutusta ja puhdistettiin proteiini ei ole saatavilla. Kuitenkin täydentävä sytosiini-rikas eteenpäin säikeiden ARS ja Sp1-3 oligonukleotidien täysin epäonnistunut tuottamaan DNA: proteiini monimutkainen vahvistetaan spesifisyys sitoutumisen G-rikas lohkon (kuvio 6B; vertailla kaistat 1 ja 7, ja 4 8).

Nuclear uute DU145-soluja inkuboitiin leimatulla oligonukleotidikoettimia jäljempänä esitetään kunkin geelin ja tuotteet erotettiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän analyysi. Lisäykset yläpuolella näkyvät geelit ja olivat: Ab, vasta-aine; PI, pre-immuuni seerumi. EMSAs ne edustavat vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. (B).