Krooninen sairaus

tiivistelmä

Activation aiheuttama sytidiinideaminaasin (AID) on entsyymi, jota tarvitaan vasta-monipuolistaminen, ja se aiheuttaa DNA mutaatioita ja katkeamisen. Konstitutiivinen AID ilmentyminen hiirissä aina aiheuttanut keuhkovaurioita morfologisesti samanlaisia ​​kuin ihmisen epätyypillinen adenomatoottisen hyperplasian (AAH), joka voi olla edeltäjä bronchioloalveolar syöpä. Samanlainen AAH, hiiren AAH kaltainen vaurio (mall) osoitti merkkejä keuhkorakkuloiden erilaistumisen, päätellen ilmaus keuhkorakkuloiden tyypin II (AT2) solumarkkerille surfaktanttiproteiini C (SP-C). Kuitenkin elektronimikroskoopilla osoitti, että Mall, joka on tietyt ominaisuudet limakalvojen solun, on erotuksena AAH tai AT2 solu. Vaikka MALL kehitetty kaikille yksilöille 30 viikon kuluttua syntymästä, keuhko- kasvaimia oli vain 10%; tämä viittaa siihen, että suurin osa kauppakeskuksissa eivät kasvaa näkyviä kasvaimia. MALL ilmaisi useita äskettäin kuvattu markkereita keuhkojen keuhkorakkuloiden palautuminen, kuten p63, keratiini 5, keratiini 14, leusiinirikkaita toista, joka sisälsi G-proteiiniin kytketty reseptori 5 (Lgr5), ja Lgr6. Lisääntynyt solukuolemaa havaittiin keuhkoissa AID siirtogeenisiä hiiriä verrattiin villityypin hiirillä. Näiden havaintojen perusteella, me spekuloida, että MALL on uudistuva kudos kompensoidaan solujen aiheuttamasta vahingosta AID sytotoksisuutta. AID ilmaisu tällaisissa uudistuva kudos pitäisi altistaa solut pahanlaatuisiksi kautta mutageenista aktiivisuutta.

Citation: Kitamura J, Uemura M, Kurozumi M, Sonobe M, Manabe T, Hiai H, et al. (2015) Krooninen keuhkovaurion ilmentämällä Activation aiheutetun sytidiinideaminaasin Johtaa Focal Limakalvojen risolumuuntumisessa ja syöpä. PLoS ONE 10 (2): e0117986. doi: 10,1371 /journal.pone.0117986

Academic Editor: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, FRANCE

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 04 tammikuu 2015; Julkaistu: 06 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Kitamura et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Grant-in-Aid tutkimusviranomaisen opetusministeriön, Culture, Sports, Science and Technology Japanissa (KAKENHI 23390097) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1,2], ja tupakointi osuus on noin 80% keuhkosyöpää [3]. Toisaalta, keuhkosairaudet, kuten krooninen obstruktiivinen keuhkosairaus, tarttuva keuhkokuume, idiopaattinen interstitiaalinen pneumonia, ja tuberkuloosi-jotka kaikki aiheuttavat tulehduksen keuhkokudoksessa-lisäävät keuhkosyövän riskiä riippumatta tupakan [4]. Kun lasku tupakoinnin, ehkäisyyn tupakan riippumattomien keuhkosyöpä on tullut suhteellisen tärkeä [2,3]. Suurin kysymys vastattava miten onkogeeninen mutaatioita esiintyy tupakka-riippumaton keuhkosyöpää.

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen osallistuminen sytidiinin deaminaaseja kehittämisessä syöpien ruoansulatuskanavan, rintarauhasen, ja eturauhasen [5- 9]. Aktivointi aiheuttama sytidiinideaminaasin (AID), jäsen sytidiinideaminaasin perhe, on olennainen entsyymi somaattinen hypermutaatiolle ja luokka-kytkin rekombinaation vasta-geenejä. Raportoimme aikaisemmin, että tuki on ilmaistu useita ruoansulatuskanavan ja sappiteiden syöpiä, jotka tapahtuvat taustalla kroonisen tulehduksen [5-7]. Siirtogeeniset ilmentyminen AID hiirissä aiheuttaa erilaisia ​​kasvaimia, mukaan lukien keuhkot, maksa ja vatsa ja leukemia [10,11]. AID ilme kuvattiin ihmisen keuhkojen adenokarsinooman [12]. Nämä havainnot viittaavat siihen, mutageenisen rooli tuen tulehdukseen liittyvä syöpään.

Noin 10% AID siirtogeenisiä hiiriä kehittää makroskooppinen keuhkojen kasvain 90 viikon kuluttua synnytyksestä [11]. Kuitenkin kaikki henkilöt (myös ilman keuhkokasvaimia) omistavat mikroskooppiset keuhkomuutoksia morfologisesti samanlaisia ​​ihmisen epätyypillinen adenomatoottisen liikakasvun (AAH), esiaste bronchioloalveolar syöpä [10,13]. Alussa arveltu, että tämä hiiri AAH kaltainen leesio (MALL) on kasvainleesioksi joka lopulta kehittyy adenokarsinooma AID siirtogeenisiä hiiriä. Aloimme analysoida MALL toivoo saavansa käsityksen mekanismi AID aiheuttaman keuhkotulehduksen kasvain hiirillä ja tulehdukseen liittyvä keuhkosyöpä ihmisillä. Kuitenkin meidän tiedot osoittivat, että MALL ei kasvainleesioksi mutta ohimenevä rakenne ilmentävät äskettäin kuvattua merkkiaineiden keuhkojen keuhkorakkuloiden uudistumista. Tässä tutkimuksessa tutkimme syitä ja ominaisuudet MALL, kuvataan, miten AID aiheuttaa MALL ja keuhkojen kasvain hiirillä, ja käsittelemään sen vaikutuksia koskien ihmisen keuhkojen syövän syntymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret

käyttö ehdollisen siirtogeenisten C57BL /6-hiirissä, joilla on yksi kopio siirtogeenin, joka sisältää CAG-promoottorin perustuva Floxed vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) koodaavan sekvenssin, jota seuraa hiiren AID koodaavan sekvenssin (AID CTG) on aiemmin kuvattu [14] . Ylittämällä tämä hiiri kerran Cre siirtogeenisen hiiren ohjaa kudoksen ei-alkalinen fosfataasi (TNAP) promoottori (TNAP-Cre-hiirten sekoitettu taustalla C57BL /6 ja 129 /Sv kolmen backcrosses C57BL /6 [15]), hiiriä ituradan poistamisen GFP segmentin-ja siten konstitutiivista AID lauseke (Aidon) -were saatu. Aidon hiiret C57BL /6 taustalla vähäinen osuus 129 /Sv, laimennettu takaisinristeyttämäl- yli kuusi kertaa, käytettiin. C57BL /6J-hiiret hankittiin Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japani). Kaikki hiiret ruokita vapaasti ja tapettiin katkaisemalla kaula ja sensuroidaan, tai havaitaan heti spontaani kuolema. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin eettisen komitean eläinkokeet ja suoritetaan kohti suuntaviivat eläinkokeet Shiga Medical Center.

geenimutaatio analyysi

Keuhkokudosta leikeltiin, upotettiin OCT yhdiste (Sakura Fineteck Japan Co., Ltd., Tokio, Japani), ja jäädytettiin välittömästi nestemäisellä typellä. Sitten, 10 um: n paksuisia leikkeitä värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE). Yksittäiset MALL eristettiin laser mikrodissektion käyttämällä LMD 6000 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Saksa). Genomi-DNA eristettiin kustakin MALL käyttäen QIAamp DNA Micro (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa).

Trp53

eksonin 5-8,

Kras

eksonin 2, ja

EGFR

eksonin 19-21 monistettiin käyttäen sisäkkäisiä polymeraasiketjureaktiolla (PCR) seuraavia alukkeita :

Trp53

; eteenpäin 5 ’GCG CCA TGG CCA TCT ACA A3’, reverse 5 ’TCT TCT GTA CGG CGG TCT CT 3’, sisäkkäisiä eteenpäin 5 ’TGG CCA TCT ACA AGA AGT CAC 3′, ja sisäkkäisiä käänteinen 5’- CAG GGC AGG CAC AAA CA 3 ’.

Kras

; eteenpäin 5 ’CGG GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG T 3’, reverse 5 ’AGT TGA GTT CTA GGC CGG TCA 3’, sisäkkäisiä eteenpäin 5 ’GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG TAC T 3’, ja sisäkkäisiä käänteinen 5 ’GTT GAG TTC TAG GCC GGT CAG G, 3 ’.

EGFR

eksoni 19; eteenpäin 5 ’CCC TTT CTG CCT TAG CAT GTC 3’, reverse 5 ’GGC ACA TCC CTC AGT CAC TTA ACA C 3’, sisäkkäisiä eteenpäin 5 ’CTC TTG GAT TTG TAA TGT AGA GCC 3’, ja sisäkkäisiä käänteinen 5 ’ATT GGG TGT AAT TTA TTA GTG CAT C 3 ’.

EGFR

eksoni 20; eteenpäin 5 ’GAA GAT AGT GGC ATT TCC TAA ACT C 3’, reverse 5 ’GCA TGA ACA CCA GGC TCG ATG 3’, sisäkkäisiä eteenpäin 5 ’ACA TCC CAC AGT GTA TTA GCA TTT A3’, ja sisäkkäisiä käänteinen 5 ’CTG CTT TTC TTA GTG CTC TTA CCA 3 ’.

EGFR

eksoni 21; eteenpäin 5 ’GCC CAA GGA ACG TGA CGA AAG 3’, 5 ’AGG GTG CTA CTG AAT CCG TGG TCA T3’, sisäkkäisiä eteenpäin 5 ’TTG TCA TTC ATG CCA GAT AAT TCC A3’, ja sisäkkäisiä käänteinen 5 ’TTA CTA CTC CCA CCG AAA TCC A3 ’. PCR-tuotteet puhdistettiin eksonukleaasilla /fosfataasin seos (ExoSAP-IT, USB Corporation /Affymetrix, Inc., Cleveland, OH, USA) ja sekvensoitiin käyttämällä sisäkkäisiä PCR-alukkeita ja Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Sekvensointituotteiden hoidettiin Big Dye Xterminator Purification Kit (Applied Biosystems) ja analysoitiin käyttäen ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Histologia ja immunohistokemia

kudosnäytteitä hiiriä vahvistettu 10% (w /v) formaldehydi, upotettiin parafiiniin ja värjättiin HE histologista tutkimusta varten. Immunohistokemiaa varten kudosnäytteet kiinnitettiin kautta HOPE Fixative (Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA). Näytteet upotettiin parafiiniin. Immunohistokemia suoritettiin käyttämällä avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin (ABC). Monoklonaalisia anti-AID-aineella (MAID-2) kuvattiin [16]. Muut vasta-aineet hankittiin: keratiini 5 (sc-17090; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), Dn p63 (sc-8609; Santa Cruz Biotechnology), Clara solun 10 kD proteiinia (CC-10, SC- 9772; Santa Cruz Biotechnology), epiteelin kadheriinin (E-kadheriinin, 24E10, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), leusiinirikkaita toista, joka sisälsi G-proteiiniin kytketty reseptori 5 (Lgr5, ab75732; Abcam, Cambridge, MA, USA) , pinta-aktiivinen proteiini C (SP-C, sc-13976; Santa Cruz Biotechnology), Lgr6 (sc-99123; Santa Cruz Biotechnology), keratiinin 14 (PRB-155P, Covance, Berkeley, CA, USA), ja podoplanin (53- 5381; eBioscience, San Diego, CA, USA). Kukin jakso oli vasta- värjättiin hematoksyliinillä.

Arvio määrästä kauppakeskuksissa koko keuhkojen

kokonaismäärä kauppakeskuksissa arvioitiin seuraavasti: tiheys mall § (N, senttimetrillä

2) laskettiin keskiarvo 11 osissa 4 um paksuus (T = 0,0004 cm) kerättiin 100-um välein. Määrä ja alue MALL ja alueen alveolien alue kussakin jaksossa mitattiin koko jakson Kuvien ScanScope skanneri ja ImageScope ohjelmistot (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA, USA). Keskihalkaisija MALL (D, cm) arvioitiin 0,005 cm. Kuvitteellinen kudoksen massan tilavuuteen side 1 cm voidaan viipaloitu 1 /T-profiilit. Siksi kokonaismäärä MALL laskee kaikilla 1 /T-profiilit on N /T. Yksittäinen MALL viipaloidaan D /T kappaletta ja laskettiin D /T kertaa. Jakamalla yhteensä MALL count (N /T) tämän redundanssin kerroin (D /T), kolmiulotteinen tiheyttä MALL voidaan ilmaista N /D per cm

3. Käyttäen seuraavia arvoja (N = 4,3, D = 0,005, kahdenvälistä keuhkojen tilavuus 1,0 cm

3) on 37 viikon ikäinen hiiri, kokonaismäärä MALL keuhkoissa lasketaan N /S × keuhkojen tilavuuden = 4,3 /0,005 x 1,0 = 860.

elektronimikroskopialla

elektronimikroskoopilla analyysien Aidon hiiret perfusoitiin oikealta kammiosta fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) poistamaan verta. Niiden keuhkot Sitten perfuusio-kiinnitettiin seosta 1,4% paraformaldehydiä ja 1% glutaarialdehydiä PBS: ssä, ja sen jälkeen leikataan 2 mm: n kuutioita transmissioelektronimikroskoopilla ja upotuskiinnitettiin samalla aine, jota käytetään perfuusiota varten kiinnittäminen 4 ° C: ssa yön yli . Sitten leikkeet kiinnitettiin jälkikäteen 1%: isella osmiumtetroksidilla 0,1 M fosfaattipuskuria 1,5 tuntia. Sitten näytteet kuivattiin porrastetusti etanolisarjassa selvittänyt propyleenioksidin ja upotettiin Epon. Lohkot olivat aluksi leikata niin semithin (1 m) kohdat ja värjättiin toluidiinisinisellä tunnistaa MALL. Ultrathin (60-90 nm) osat värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla ja tutkittava transmissioelektronimikroskoopin, H7650 (Hitachi, Ltd., Tokio, Japani).

apoptoosimäärityksessä

Terminal deoksinukleotidyylitransferaasia (TdT) -välitteisen dUTP nick endlabeling (TUNEL) suoritettiin havaitsemiseksi apoptoottinen DNA katkoksia keuhkojen ja maksan kudoksissa käyttäen TACS 2 TdT-DAB in situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD, Yhdysvallat ). Objektilasit vastavärjättiin 1% metyyli vihreä. Mitata solukuolemaa keuhkoissa ja maksassa, TUNEL-positiivisia ja -negatiivisilla keuhkorakkuloiden seinämän solujen ja maksasolujen laskettiin kunnes saavutetaan yhteensä 1000 solujen 9-24 nonoverlapping, satunnaisesti valittu × 400 kenttiä. Solut laskettiin käyttäen kuva-analyysiä ohjelmiston VH Analyzer (Keyence, Osaka, Japani). Tiedot kerättiin kolmesta yksittäisestä hiirillä.

Proliferaatiomääritys

Aidon hiiret saivat päivittäin vatsaonteloon 1 mg 5-etynyyli-2′-deoksiuridiinia (EDU) 0,4 ml PBS: ää 7 päivää. Sitten hiiret tutkittiin 1 ja 20 päivää viimeisen injektion jälkeen. Solujen lisääntyminen on 10-pm paksun jääleikkeille keuhkojen havaittiin käyttämällä Click-IT edu Alexa Fluor 488 kuvansiirtopaketti (Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR, USA). Osat kiinnitettiin 3,7% (v /v) formaldehydin 10 min. Seuraavaksi kudokset permeabilisoitiin 0,5% Triton X-100 PBS: ssa huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan. Click-IT edu reaktio cocktail lukien Alexa Fluor 488 atsidi valmistettiin valmistajan ohjeiden ja lisätään kattamaan dia ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa pimeässä 30 minuutin ajan. Tumat näkyviksi Hoechst 33342 tahra. Objektilasit tutkittiin DM 5000B fluoresenssimikroskooppia (Leica). Edu positiivisten solujen keuhkojen havaittiin. Tiedot kerättiin kaksi hiirtä kussakin aikapisteessä.

Soluviljely ja proinflammatoristen sytokiinien stimulaatio

Ihmisen keuhkorakkuloiden epiteelisolujen (A549-solulinja) ostettiin RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japani ) ja pidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. 2-ml solususpensiota (1 x 10

5 solua /ml), ympättiin 6-kuoppaisille viljelymaljoille ja niitä inkuboitiin 24 h, jotta solujen kiinnittymistä. Soluja käsiteltiin ihmisen tuumorinekroositekijä α (TNFa PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), interleukiini-1β (IL1B PeproTech), ja lymfotoksiini-α2 /β1 (LTα2 /β1, R AID, aktivointi aiheuttama sytidiinideaminaasin; Tg, siirtogeenisiä; MALL, hiiri AAH kaltainen vaurio.

MALL määrä tutkittiin keskiarvoistamalla tiheys 11 osissa oikea keuhko 100 um välein hiiriä välillä 12 ja 75 viikon iässä (kuvio. 2A ). MALL oli tuskin havaittavissa 12- ja 17-viikon ikäisiä hiiriä, mutta havaittiin 26 viikkoa. Määrä kauppakeskuksissa lisääntyi iän. 37 viikon ajan, MALL tiheys on leikkuun oli 4,3 ± 0,8 /cm

2 (keskiarvo ± keskivirhe, n = 3), joka vastaa arviolta 860 ostoskeskuksia kahden- keuhkoissa (katso laskentamenetelmät). Niistä 64 Aidon hiiret tutkittiin vain 7 (11%) kehittyi makroskooppisesti näkyvä keuhkokasvaimia (3 adenoomia ja 4 adenokarsinoomat), joka on verrattavissa keuhko kasvaimen esiintymistiheys alkuperäisessä linja AID siirtogeenisiä hiiriä [11]. Ottaen huomioon suuri määrä malls vuotiaiden hiiren keuhkoissa, me spekuloida, että useimmat ostoskeskukset eivät kasvaa makroskooppisia kasvaimia.

, vasemmassa paneelissa, keskimääräinen tiheys ostoskeskuksia kohdissa per 1 cm

2 on piirretään hiiret ikää viikkoina. Kiinteä viiva suljettujen symboli ja harmaa viiva on avoin symboli edustaa Aidon ja villityypin hiirille. Virhepylväät edustavat keskivirhe tietoja kolmesta hiirestä, lukuun ottamatta villin tyypin hiiri ja 75 viikon ikäinen Aidon hiiri, joista kukin analysoitiin yksittäin. Alueen pisteviiva suorakulmion laajennettiin oikeassa paneelissa. B, poikkipinta-ala yksittäisten kauppakeskuksissa piirretty. Keskiarvot on merkitty punaisella linjat. P-arvot lasketaan t-testi ryhmien välillä on merkitty suluissa.

erikokoista (perustuen poikkipinta-ala) yksittäisten kauppakeskuksissa hiiristä eri-ikäisille on piirretty kuvassa. 2B. Keskimääräinen koko mall näytti olevan verrattain vakaana. Vaikka tilastollisesti merkitseviä eroja havaittu välillä 26 viikkoa ja 37 viikkoa (P = 0,002), ja välillä 37 viikkoa ja 75 viikkoa (P 0,0001), keskiarvon ero oli pieni, eikä näytä olevan biologista merkitystä. Satunnainen ulkonäkö suuria ostoskeskuksia 75 viikon ikäisiä hiiriä voi osoittaa, että rajallinen määrä kauppakeskuksissa jatkaa kasvuaan, lopulta tulossa näkyvä kasvaimia brutto tarkastusta.

Keuhkosyöpä liittyviä geenimutaatio analyysi kauppakeskuksissa

Human AAH kuulemma ole aivan merkittävästi kohonnut taajuudet mutaatioita kolmessa keuhkosyöpään liittyviä geenejä:

Trp53

,

Kras

, ja

EGFR

[17-23] . Tutkia MALL on mutaatioita verrattavissa AAH mutaatiot analysoitiin hotspot alueilla kolme geeniä:

Trp53

eksonit 5-8,

Kras

eksonin 2, ja

EGFR

eksonit 19-21. Me microdissected 110 ns, josta DNA puhdistettiin yksitellen ja alistettiin geeni-PCR ja suoralla sekvensoinnilla. Vaikka neljä (10,5%) 38 kauppakeskuksissa osoitti viisi missensemutaatioita

Trp53

geeni, ei missensemutaatio on

Kras

tai

EGFR

geenin havaittiin. Mutaatio taajuus

Trp53

geeni oli vertailukelpoisia aikaisemmin julkaistuihin tietoihin ihmisten AAH keuhkoissa [17,18], mutta

Kras

ja

EGFR

mutaatiot olivat paljon vähemmän kuin ihmisen AAH [19-23] (taulukko 1). Neljä viidestä missense

Trp53

mutaatiot ennustetaan vaarantaa proteiinin toiminnan, vaikka on epäselvää, ovatko nämä vahingollisia mutaatioita pelannut joitakin rooleja kehittämiseen kauppakeskuksissa (S1A ja B kuvassa.).

suluissa määrä kauppakeskuksissa geenin mutaatio verrattuna määrä kauppakeskuksissa tutkittiin.

lukien introni mutaatioita, 14, 3 ja 0 yhden emässubstituutiota havaittiin

Trp53

,

Kras

ja

EGFR

geeniä, vastaavasti. Substituutio kuvioita sytosiinin (C) -to-tymiini (T) ja guaniinin (G) -to-adeniini (A) muuttuu tyypillistä sytidiiniin deamination ei määräävältä

Trp53

geeni (14% [2 /14], S1C kuviossa.). Molemmissa tapauksissa mutatoitunut Cs olivat 5′-edeltää G, joka oli yhdenmukainen AID allekirjoitus [24]. Kuten esitetään S1D Fig. 2 ulos 3 vaihtoa nähtävissä

Kras

geeni oli C-to-T muutokseen dinukleotidiosaa yhteydessä C 5′-edeltää T, joka on etuoikeutettu kohde APOBEC3 deaminaatiota [25]. Kuitenkin pieni määrä havaittu mutaatioita kauppakeskuksissa esteenä päättely mutaatioprosessiin.

immunohistokemiaallisesti hengitysteiden epiteelisolujen merkkiaineiden

luonnehtivat erilaistumisen tilasta MALL, suoritimme immunohistokemiallisesti kolmesta spesifisten merkkiaineiden kolme erilaisia ​​distaalinen hengitysteiden epiteelisolujen: podoplanin in keuhkorakkuloiden tyypin 1 (AT1) solut, SP-C keuhkorakkuloiden tyypin 2 (AT2) soluja, ja CC-10 in Clara soluissa. Ostoskeskukset olivat osittain positiivisia SP-C, mutta negatiivinen CC-10 ja podoplanin (Fig. 3A-C). Tämä havainto viittaa siihen, että AT2 solut voivat olla läsnä MALL.

, CC-10, Clara solumerkille ja B, podoplanin, alveolaarinen tyypin I solumarkkerille olivat negatiivisia. C, SP-C, alveolaarinen tyypin II solumarkkerigeenien oli osittain positiivinen MALL soluissa. D, Dn p63; E, keratiini 5; F, keratin14; G, E-kadheriinin; H, Lgr5; ja minä, Lgr6 olivat kaikki positiivisia kauppakeskuksissa. Brown signaali osoittaa positiivista värjäytymistä mukaan diaminobentsii- ja sininen signaali ilmoittaa ydin- laskurin värjäyksen hematoksyliinillä. MALL on merkitty nuolenpää. CC-10, Clara solun 10 kD proteiinia; SP-C, pinta-aktiivinen proteiini C; E-kadheriinin, epiteelin kadheriinin; LGR, leusiinirikkaita toista sisältävän G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien.

lepääviä luonne MALL ja vähäisyys mutaatioiden keuhkosyöpään liittyvien geenien sai meidät spekuloida, että MALL voisi olla regeneratiivisen vaurion melko kuin varhaisessa kasvain. Äskettäin regeneratiivinen merkkiaineiden distaalinen hengitysteiden soluja raportoitu. Hiirimallissa näyttämällä keuhko uudistumista jälkeen H1N1 virusinfektio, p63, keratiini 5, ja keratiini 14 ilmentyvät Uudistava keuhkorakkuloiden soluissa [26]. Toisessa tutkimuksessa käytettiin ihmisen keuhkojen peräisin oleviin soluihin, solut, jotka ilmentävät E-kadheriinin, Lgr5 ja Lgr6 hallussaan kantasolun kaltainen kapasiteetti itseuudistumiseen ja bronchioalveolar eriyttäminen [27]. Immunohistokemia paljasti myös, että MALL ilmaistuna ΔNp63, keratiini 5, keratiini 14, E-kadheriinin, Lgr5, ja Lgr6 (Fig. 3d-I), mikä osoittaa, että MALL säilyttää allekirjoitus keuhkorakkuloiden regeneratiivisen kudosta.

elektronimikroskoopilla havainnot

tarkastella edelleen MALL ominaisuuksia, arvioimme keuhkot Aidonin hiirille lähetyksen elektronimikroskoopilla. MALL koostui yhden kerroksen solujen tyvikalvon. Solut olivat sarakemuotoon pitkänomaisia ​​ytimiä (Fig. 4A). Mielenkiintoista, kaikki solut sisälsivät kypsymättömiä eritysrakkuloiden vuonna kärkiosan sytoplasman ilman lamellikappaleisiin (Fig. 4B). Nämä rakkulat olivat positiivisia PAS värjäystä, että niissä on musiinin (Fig. 4C). Nämä havainnot osoittavat, että MALL solut ovat itse asiassa epäkypsiä limakalvojen soluja. Koska ihmisen AAH sisältää lamellikappaleisiin [28], MALL rakenne eroaa AAH, alkuperäisestä nimikkeistön huolimatta.

Electron mikroskooppisia havaintoja MALL A, yleiskatsaus MALL soluja. B, Suurennettu näkymä apikaalisella osa MALL soluja. Nuolet osoittavat epäkypsä eritysrakkuloiden sytoplasmassa MALL soluja. Tähdellä osoittaa tyvisolusyöpä vieressä MALL soluihin. C, PAS-värjäys osoittaa, että värjäytyivät positiivisesti materiaalit ovat kärjestä MALL soluja (nuolenpäät). D, Electron micrograph osoittaa fagosyyttistä epiteelisolujen sisällä MALL (tähti). Inset, korkeampi voima näkymä fagosytoottisten epiteelisolujen. Nuolet osoittavat tyvikalvon. Arrowheads osoittavat jäljellä elinten solun sisällä. AS, alveolaarinen tila; PAS, määräajoin-happo Schiff.

Lisäksi havaitsimme tyvisolusyöpä kaltaisia ​​soluja, joita ei tavallisesti nähdä distaaliseen keuhkoon hiiren [29], on pohjapinta puolella MALL solujen (Fig. 4A). Voimakas ilmentyminen keratiineista 5 ja 14 viittaa siihen, että MALL peräisin tästä tyvisolusyöpä kaltainen solu. Lisäksi olemme joskus löytyy fagosyyttisoluista sisällä kauppakeskuksissa (Fig. 4D). Nämä solut olivat suorassa kosketuksessa tyvikalvon ja jäljellä elinten sytoplasmassa. Tämän havainnon, päättelimme, että nämä solut olivat todella phagocytic epiteelisolujen. Nämä solut ovat fysiologinen vastaus apoptoosin niiden epiteelisolujen naapurit [30,31]. Siksi tämä havainto viittaa siihen, että puhdistuma kuolleen kudoksen epiteelisolujen esiintyy distaalisessa hengitysteiden epiteelin Aidonin hiirillä.

Tehostettu solukuolemaa kudoksessa Aidonin hiirten

Läsnäolo phagocytic epiteelisolujen kauppakeskuksissa sai meidät spekuloida, että keuhkojen solukuolema tapahtuu useammin Aidon hiirillä kuin WT hiirillä. Vuonna TUNEL määrityksessä, me joskus löydettiin kuolleena solujen kauppakeskuksissa (Kuva. 5A). Kuitenkin kuolleet solut kirjattu jopa ulkopuolella MALL. Esiintyminen kuolleiden solujen ulkopuolella ostoskeskus Aidon hiirillä keuhkoihin (0,43%) oli merkittävästi korkeampi kuin WT hiirillä (0,09%, P = 0,013; Kuva. 5B, taulukko 2). Sen tutkimiseksi, AID sytotoksisuus on erityinen keuhkoihin, suoritimme TUNEL värjäytyminen maksakudosta. Määrä TUNEL-positiivisia hepatosyyteissä kasvoi Aidon hiirissä verrattuna WT-hiirissä (6,0% vs. 4,8%, P = 0,036; kuvio. 5C, taulukko 2). Tämä havainto osoittaa selvästi, että AID-solukuolema ei ole spesifinen keuhkojen.

TUNEL värjäys A MALL; B, Lung AID Tg hiiri; ja C, maksa AID Tg hiiri. Arrowheads osoittavat TUNEL positiivisia soluja. Soluproleferaatiomäärityksessä Edu merkintöjä keuhkosta AID Tg hiirillä ja WT hiiret: D, edustaja luku edu-positiivisten MALL päivänä 1. nuolenkärki osoittaa edu-positiivisten MALL (alue ympäröi katkoviiva). E, edustaja luku keuhkosta AID Tg hiiriin päivänä 20. nuolenkärki osoittaa edu-positiivisten MALL ja nuoli osoittaa edu-negatiivinen MALL. Alueella kunkin MALL ympäröi katkoviivalla. TUNEL, terminaali deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) -välitteisen dUTP nick endlabeling; Edu, 5-etynyyli-2′-deoksiuridiini.

Suluissa suhde TUNEL positiivisten solujen Tunel negatiiviset solut.

Solujakautuminen kauppakeskuksissa

MALL koostuu useista epäkypsiä limakalvojen soluja ja rajoitettu määrä tyvisolujen morfologisesti samanlaisia ​​kuin keuhkoputkien, jotka toimivat kantasolujen keuhkoputkien epiteeliin. Jos epäkypsiä limakalvon solut ovat peräisin näistä tyvisoluissa, voidaan hypoteesi, että sukupolven MALL olisi liitettävä solunjakautumisen. Voit tarkistaa tämän hypoteesin, toteutimme lulisäkasvumäärityksessä 5-etynyyli-2′-deoksiuridiinia (edu) osaksi jäljittelevän DNA. Ensin annetaan kerran vuorokaudessa injektoimalla intraperitoneaalisesti EDU Aidon hiiriä 7 peräkkäisen päivän ajan. Puolet hiiret tapettiin keuhko tarkastusta vuorokauden kuluttua viimeisestä edu injektio (päivä 1). Löysimme muutamia Edu-positiivisten solujen sisällä ns, mikä osoittaa, että nämä muutokset on mahdollista kuljettaa jakautuvat solut. Sen jälkeen kvantitatiivinen analyysi hankittujen kuvien, 91,1% (41/45) kauppakeskuksissa havaittiin sisältävän edu positiivisia soluja (kuvio. 5D).

Seuraavaksi tutkimme keuhkot jäljellä puolet Aidonin hiiriin päivänä 20. Mielenkiintoista, vain 44,2% (19/43) kauppakeskuksissa oli edu positiivisia soluja (P 0,01 chi-neliö testi, Fig. 5E). Tämä lasku edu positiivisuus aikana ensimmäiset 19 päivää voidaan tulkita skenaarioon, jonka kotipaikka kauppakeskuksissa muuttua normaaliin keuhkorakkuloiden kudokseen uusina, leimaamaton kauppakeskuksissa syntyy. Tämä muutos uskotaan alentavan edu positiivisuutta. Toinen skenaario on, että MALL solut läpikäyvät solukuoleman ja eliminoidaan. Nämä kaksi vaihtoehtoa eivät ole toisiaan poissulkevia. Mikä tulos on hallitseva vaiheessa on epäselvää.

Päätellen asteittainen kasvu määrä kauppakeskuksissa (Fig. 2A), näyttää todennäköiseltä, että määrä MALL sukupolven ylittää hieman häviämisnopeutta.

MALL ja keuhkojen kasvain

Tuloksemme viittaavat siihen, että MALL ei kasvain, mutta Lisääntyvä limakalvojen risolumuuntumisessa rajoitetusti pitkäikäisyys. Tutkia suhdetta MALL ja keuhkojen kasvain, joka kehittyy noin 10%: Aidonin hiiristä, meidän ensimmäinen vahvistettu AID ilmentymistä MALL immunohistokemialla (Fig. 6A). Tämä tulos oli yhdenmukainen määrällinen RT-PCR tulos, joka osoittaa 3-kertainen AID ilmaisun MALL kuin ympäröivä alveolaarinen kudokseen (S2 Kuva.). Seuraavaksi tutkimme osat adenooman peräisin Aidonin hiirten keuhkoissa. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että kauppakeskuksissa ovat joskus upotettu kasvainkudos (Fig. 6B ja C). Lisäksi suurin osa kasvainsolujen ilmaisi keuhkojen palautuminen markkereita p63, keratiini 5/14, ja LGR 5/6 (Fig. 6, D-H). Expression näistä palautuminen markkereita on usein rajattu alapopulaatio kasvainsolujen, mikä ilmeisesti heijastaa esimerkki kasvaimeen heterogeenisyys. Läsnäolo MALL sisällä syöpäkasvain ja sen proliferaatiopotentiaali viittaavat siihen, että keuhkojen kasvain voi olla peräisin ostoskeskus AID siirtogeenisiä hiiriä.

, immunohistokemiaallisesti AID kauppakeskuksissa. MALL on merkitty nuolenpää. B, HE-värjäys keuhkosta AID-Tg-hiirten keuhkojen adenooma. Adenooma rajaavat pisteviivalla. Region merkitty suorakulmio suurennetaan C. C, Arrowheads osoittavat ostoskeskuksissa sisällä keuhkojen adenooma. Immunohistokemiaallisesti D, ΔNp63: E, keratiini 5; F, keratiini 14; G, LGR 5; ja H, LGR 6 keuhkojen adenooma.

induktio AID ilmentymisen ihmisen alveolien epiteelisolujen

Jos AID ilmentyminen indusoituu alveolien epiteelisoluissa proinflammatoristen sytokiinien, kuten esitetään ihmisen syöpien ruoansulatuskanavan [5-7], mahdollisuus AID osallistumisesta ihmisen keuhkosyövän syntyisi. Sen tutkimiseksi, onko tulehduksellinen ärsykkeisiin parantaa AID ilmentymistä keuhkorakkuloiden epiteelisoluissa, prosessi analysoitiin kvantitatiivisen RT-PCR ihmisen keuhkojen adenokarsinoomaa johdetut A549-solut. A549-soluja stimuloitiin TNFa, IL1B tai LT α2 /β1 12 ja 24 h. RNA analysoitiin sitten AID mRNA: n ilmentymisen kvantitatiivisen RT-PCR. AID ilmentyminen onnistuneesti aiheuttamaa 12 h sekoituksesta TNFa tai IL1B, kun taas induktion LTα2 /β1 oli marginaalinen (Fig. 7).

Juoni esitetään tulos kvantitatiivisen reaaliaikaisen käänteistranskriptio-PCR tukea mRNA A549 ihmisen keuhkon adenokarsinooma peräisin olevia soluja stimuloitiin tuumorinekroositekijän (TNF) α, interleukiini (IL) 1β tai lymfotoksiini (LT) α2 /β1 12 ja 24 h. Tiedot ovat keskiarvo ± SE; n = 3. SE, keskivirheen.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa ehdotimme, että MALL on limakalvojen risolumuuntumisessa joka kehittää jälkeen AID aiheuttaman keuhkotulehduksen keuhkorakkulavaurio ja voisi olla precancerous vaurion keuhkosyöpään. Lisäksi osoitimme, että AID ilmentyminen indusoituu ihmisen keuhkorakkuloiden soluissa proinflammatoristen sytokiinien, mikä viittaa osallistuminen AID ihmisen keuhkojen syövän synnyn.