Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kertyvät tiedot osoittivat, että funktionaalisen ekspression Toll-like-reseptorien (TLR) tuumorisoluissa oli mukana syövän etenemiseen. Edellisessä tutkimus osoitti, että TLR9 signalointia voitaisiin parantaa kasvaimen etenemistä ihmisen keuhkosyövän soluja in vitro ja in vivo. Olemme lisäksi osoittaneet, että miR-574-5p oli pääasiassa ajan säädellään miRNA ihmisen keuhkosyövän soluja TLR9 opastinjärjestelmillä miRNA erilaisia ​​analyysi. Täällä tunnettu mahdollista roolia miRNA-574-5p tiiviimpään kasvainprogression aiheuttama TLR9 signalointi ihmisen keuhkosyöpä. Olemme vahvistaneet, että TLR9 signalointi tehokkaasti kohonnut ilmentyminen miR-574-5p ihmisen keuhkosyövän soluja. Erityisesti olemme havainneet, että alas-säätely miRNA-574-5p käyttäen miR-574-5p estäjä in vitro tai miR-574-5p sienellä in vivo merkittävästi kumosi parannettu syövän etenemisen aiheuttamien TLR9 signalointi. Lisätutkimukset osoittivat, että miR-574-5p oli tärkeä pelaaja liittyy tiiviimpi syövän etenemiseen ihmisen keuhkojen syöpäsoluja. Erityisesti tunnistimme tarkastuspiste vaimennin 1 (Ches1) kuin hallitseva suora tavoite miRNA-574-5p suomaan TLR9 signalointi tehostetun syövän etenemiseen. Olemme paljasti, että yli-ilmentyminen Ches1 inhiboi merkittävästi solusyklin alkamista ihmisen keuhkosyövän soluja. Lopuksi paljasti, että ilmentyminen miR-574-5p korreloi positiivisesti TLR9 ja käänteisesti korreloivat Ches1 keuhkosyöpäpotilaiden. Meidän havainnot paitsi helpottanut edelleen ymmärrystä välistä ylikuulumista miRNA ja TLR kasvaindiagnostiikassa, mutta myös uusia mahdollisia ehdokkaita syövän hoitoon.

Citation: Li Q, Li X, Guo Z, Xu F, Xia J, Liu Z, et al. (2012) MicroRNA-574-5p oli avainasemassa varten TLR9 Signaling Enhanced syövän etenemisen kautta alaspäin säätäminen Checkpoint vaimennin 1 Human Lung Cancer. PLoS ONE 7 (11): e48278. doi: 10,1371 /journal.pone.0048278

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 21 syyskuu 2012; Julkaistu: 02 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Fund of Science and Technology Department of Pudong New Area (PKJ2011-Y33), National Natural Science Foundation of China (81071744), Shanghai Pudong New Area Academic johtava Health System (PWRd2010-01), Basic -tutkimusohjelma tukee Shanghai komitean Science and Technology (11JC1410900), ja Qianjiang Talent Project Science and Technology Department of Zhejiang Province (2010R10080). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

löytö sarjan synnynnäisen immuniteetin-reseptorit aktivoituvat taudinaiheuttajista liittyvien molekyylitason kuvioita johtanut uuden ymmärryksen luontaisen immuniteetin mekanismien. Niistä synnynnäisen immuniteetin reseptoreihin, parhaiten tunnettu ovat Toll-kaltaiset reseptorit (TLR: t), jotka tunnistavat erilaisia ​​taudinaiheuttajista liittyvä molekyyli kuvioita, ilmentyvät pääasiassa immuunisolujen ja niillä on tärkeä rooli synnynnäisen ja adaptiivisen immuniteetin [ ,,,0],1] – [3]. Mielenkiintoista, kasvava määrä kirjallisuutta osoitti, että funktionaalinen TLR myös laajalti ilmentyy erilaisten kasvainsolujen kuten rinta-, aivo-, maha- ja keuhkosyövän soluja [4]. Kertyvät tiedot osoittivat, että TLR-agonisti voisi edistää hyökkäyksen ja parantaa metastaattisen potentiaalin kasvainsolujen, mikä osoittaa, että aktivointi TLR: ien signalointia tuumorisoluissa oli mukana kasvaimen edistymistä [5] – [8]. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että CpG oligodeoksinukleotideja (CpG ODN: t), jotka olivat tutkittavana liitännäishoitona terapiassa infektioita vastaan ​​ja syövät, voitaisiin tehokkaasti aktivoida TLR9 signalointireitin ihmisen keuhkosyövän solujen ja siten edistänyt syövän etenemiseen sekä in vitro että in vivo [ ,,,0],3], [4], [9] – [11]. Olemme lisäksi osoittaneet, että säätely ylöspäin sykliiniriippuvaisen kinaasi 2 (CDK2) oli kriittinen TLR9 signalointi kykyä stimuloida ja solusyklin alkamista ihmisen keuhko- syöpäsoluja [4]. Kuitenkin tarkat mekanismit kuinka TLR9 signalointi oli mukana kasvaimen etenemisessä ihmisen keuhkosyöpä oli vielä paljon vähemmän selkeä.

MikroRNA (miRNA) ovat nousseet merkittävästi luokan geeniekspression sääntelyviranomaisten, transkription jälkeen säätelevä geeni ilmaisun emäspariutumisen osittain täydentävien alueiden estämään proteiinin kerääntyminen tukahduta käännös tai indusoimalla mRNA: n hajoamisen, jotka liittyvät useimmat biologisia toimintoja kuten tuumoribiologiassa [12], [13]. Kertyvät tiedot osoittivat, että miRNA olivat tehokkaita ja uusien biomarkkereiden keuhkosyöpään diagnoosin, ennustaminen ja hoito [14], [15]. Samaan aikaan, miRNA myös osallisena säätelyssä biologisten vaikutusten TLR signaloinnin [16] – [18]. Tutkia mahdollisuuksia roolia miRNA kasvaneessa syövän etenemisen ihmisen keuhkosyövän solujen upon TLR9 agonistin stimulaation, suoritimme miRNA microarray määrityksessä havaitsemaan ilmaisun profiilia miRNA in 95D-soluissa hoitoa tai CpG ODN: iä, ja totesi, että CpG ODN stimulaatio vuorotellen mirna ilmaisun profiilin 95D-soluissa ja ero ilmauksia 23 miRNA välillä CpG ODN hoidetussa ryhmässä ja käsittelemättömässä ryhmässä oli vähintään kaksinkertaiseksi, joista miRNA-574-5p oli pääasiassa ajan säädellään miRNA CpG ODN stimuloi 95D soluja verrattiin käsittelemättömän ryhmän [19]. Kuitenkin mahdollinen vaikutus miRNA-574-5p tehostetusta kasvaimen etenemisen aiheuttamien TLR9 signalointi vielä selvittämättä.

Tämän kysymyksen, täällä me tunnettu vaikutus miRNA-574-5p joka oli up-säännellään TLR9 signalointi ihmisen keuhkosyövän soluja. Huomasimme, että miRNA-574-5p oli ratkaisevaa TLR9 signalointi parantaa kasvaimen etenemistä ihmisen keuhkojen syöpäsoluja. Lisätutkimukset osoittivat, että tarkastuspiste vaimennin 1 (Ches1) oli hallitseva suora kohde miRNA-574-5p suomaan TLR9 signalointi tehostetun syövän etenemiseen. Nämä havainnot laajennettiin aiemmat tutkimukset ja saadaan aikaan uusi käsitys ymmärtämistä miRNA funktionaalisen ekspression TLR9 kasvainsoluissa.

(A) 95D-soluja käsiteltiin 10 ug /ml CpG-ODN: t tai ohjaus CpG ODN varten osoitetun ajan ja havaittu niiden leviäminen. (B) ryhmät kahdeksan nude hiiret altistettiin 2 x 10

6 95D soluja. Viisi päivää myöhemmin kasvainta kantavia hiiriä injektoitiin in situ 100 ug CpG ODN: ien 7 päivän välein. Kontrolliryhmä sai yhtä suuri annos ohjaus CpG ODN tai yhtä suuri väliaineen tilavuudesta. Tuumorin koko määritettiin. Kukin pylväs välineet (± SD) kahdeksasta nude hiirtä kussakin ryhmässä. (C) 95D-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella CpG ODN: ien 72 tuntia ja sitten analysoitiin niiden ilmentymisen miR-574-5p. (D) 95D-soluja käsiteltiin 10 ug /ml CpG-ODN: t ja ilmoitettuina ajankohtina ja analysoitiin niiden ilmentymisen miR-574-5p. (E) 95D-soluja käsiteltiin 10 ug /ml CpG ODN: n läsnä ollessa ilmoitettu annos klorokiinin 72 tuntia ja sitten analysoitiin niiden ilmentymisen miR-574-5p. (F) 95D-soluja käsiteltiin 10 ug /ml CpG ODN: n läsnä ollessa ilmoitettu annos MyD88 estävää peptidiä (Pepinh-MyD88) tai kontrollipeptidiä (Pepinh-Control) 72 tuntia ja sitten analysoitiin niiden ilmentymisen miR -574-5p. Virhepylväät osoitti keskihajonta kolminkertaisten mittausten kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki tämän tutkimuksen potilaiden annettiin kirjallinen lupa, ja ihmisen hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Tongji yliopiston (Luvan numero: 20090128). Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Opas hoito ja käyttö Medical Laboratory Animals ja eettisiä hyväksyntää Shanghai Medical Laboratory Animal Care ja käyttö komitean sekä eettinen komitea Tongji yliopiston (Luvan numero: 20110016).

(A) 95D-solut transfektoitiin miR-574-5p estäjän 48 tuntia ja sitten analysoitiin niiden ilmentymisen miR-574-5p. (B) 95D-solut transfektoitiin miR-574-5p estäjän tai kontrollilla, ja stimuloitiin sitten 10 ug /ml CpG-ODN: t ja osoitetun ajan. Virhepylväät osoitti keskihajonta kolminkertaisten mittausten muodostavat kolmen erillisen kokeen. (C) Tehostettu aktiivisuus miR-574-5p-säännellyn toimittaja saavutettiin infektio 95D-solujen kanssa miR-574-5p sienellä. (D ja E) ryhmät kahdeksan nude-hiiret altistettiin 2 x 10

6 95D-solut, jotka transfektoitiin stabiilisti miR-574-5p sieni-vektori tai kontrollivektorilla. Viisi päivää myöhemmin kasvainta kantavia hiiriä injektoitiin in situ 100 ug CpG ODN: ien 7 päivän välein. Kasvaimen koko ja elinaika kasvaimen kantavien hiirten määritettiin. Kukin pylväs välineet (± SD) kahdeksasta nude hiirtä kussakin ryhmässä. * P 0,05.

Potilaat

Kesäkuun 2009 Maaliskuussa 2012 keräsimme kasvain näytteissä potilailta, joilla keuhkosyöpä Itä Hospital, Shanghai, Kiina. Tutkimuksessa (n = 23) koostui kemoterapiaa ja sädehoitoa hoitamattomilla potilailla keuhkosyöpä. Katsaus patologiaraporteista vahvisti diagnoosin. Potilaat, joilla on autoimmuunisairauksia (esim. Nivelreuma, systeeminen lupus erythematosus), krooniset infektiot (esim. Ihmisen immuunikatovirus infektio, tuberkuloosi), luuytimeen, antikoagulantti ja antitromboottinen lääke käytetään, tai ne, jotka olivat saaneet immunosuppressiivista hoitoa suljettiin pois. Tiedot kliinisiä patologisia ominaisuuksia potilailla on esitetty taulukossa 1.

(A) 95D-solut transfektoitiin miR-574-5p jäljittelee tai kontrollilla, ja sitten määritettiin niiden leviäminen ilmoitettuina ajankohtina. (B) 95D-solut transfektoitiin miR-574-5p estäjän tai kontrollilla, ja sitten määritettiin niiden leviäminen ilmoitettuina ajankohtina. Virhepylväät osoitti keskihajonta kolminkertaisten mittausten muodostavat kolmen erillisen kokeen. (C-F) ryhmät kahdeksan nude-hiiret altistettiin 2 x 10

6 95D-solut, jotka transfektoitiin stabiilisti miR-574-5p ekspressiovektori tai miR-574-5p sienellä vektori vastaavasti, ja sitten määritettiin niiden syövän etenemisen nude-hiiriin ilmoitettuina ajankohtina. Elinaika kasvaimen kantavien hiirten määritettiin myös. Kukin pylväs välineet (± SD) kahdeksasta nude hiirtä kussakin ryhmässä.

Hiiret

BALB /c-nude-hiirten välillä 6 ja 8 viikon iässä ostettiin center of Experimental Animals Tongji yliopistossa. Kaikki hiiret pidettiin patogeenivapaassa hiiren pesäke meidän toimielin.

(A) 95D-solut transfektoitiin miR-574-5p estäjän 48 tuntia ja sitten analysoitiin niiden ilmentymistä ilmoitettu geenien käytetään oikeita PCR. (B) 95D-solut transfektoitiin miR-574-5p estäjän 48 tuntia ja sitten analysoitiin niiden ilmentymisen Ches1 käyttäen western blot. Suhteellinen voimakkuus Ches1 proteiinin tason kolmesta itsenäisestä kokeesta näytettiin. (C) 95D-solut ko-transfektoitiin miR-574-5p jäljittelee ja lusiferaasireportteri-, joka sisältää laajan tyypin Ches1 3 ’UTR tai mutatoituja Ches1 3’ UTR. (D) 95D solut trasnfected kanssa Ches1 ilmentämisvektorilla 48 tuntia ja sitten analysoitiin niiden ilmentyminen Ches1 proteiinin tason. (E) 95D-solut kotransfektoitiin miR-574-5p matkii ja Ches1 ekspressiovektorin, ja sitten määritettiin niiden leviäminen. (F) ryhmät kahdeksan nude-hiiret altistettiin 2 x 10

6 95D-solut, jotka transfektoitiin stabiilisti miR-574-5p ekspressiovektoriin plus Ches1 ekspressiovektorin tai sen valvonnassa, ja sitten analysoitiin niiden kasvaimen etenemistä on näkyvä aika. (G) 95D-solut transfektoitiin Ches1 ekspressiovektorilla, ja stimuloitiin sitten 10 ug /ml CpG-ODN: t ja osoitetun ajan. (H) ryhmät kahdeksan nude-hiiret altistettiin 2 x 10

6 95D-solut, jotka transfektoitiin stabiilisti Ches1 ekspressiovektorilla tai kontrollivektorilla. Viisi päivää myöhemmin kasvainta kantavia hiiriä injektoitiin in situ 100 ug CpG ODN: ien 7 päivän välein. Tuumorin koko määritettiin ilmoitettuina ajankohtina. Kukin pylväs välineet (± SD) kahdeksasta nude hiirtä kussakin ryhmässä.

Reagenssit ja Cell Line

CpG ODN2216, hallita CpG ODN, klorokiini ja estävää peptidiä vastaan ​​MyD88 hankittiin InvivoGen. MiR-574-5p matkii ja miR-574-5p estäjä ostettiin Ribobio (Guangzhou, Kiina). Anneksiini V-FITC apoptoosin havaitseminen pakki ostettiin eBioscience. Solusyklin vaihe määritys pakki ostettiin Cayman. Nucleofector kit ostettiin Amaxa. Ihmisen keuhkosyövän solulinjassa 95D-solut saatiin ATCC: n ja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 täydellisessä RPMI 1640-alustassa (GIBCO), joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, jota oli täydennetty 2 mM glutamiinilla, 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiinisulfaattia.

(A) 95D-solut transfektoitiin Ches1 ekspressiovektoriin ja määritettiin niiden leviäminen ilmoitettuina ajankohtina. (B) ryhmät kahdeksan nude-hiiret altistettiin 2 x 10

6 95D-solut, jotka transfektoitiin stabiilisti Ches1 ekspressiovektorilla tai kontrollivektorilla. Tuumorin koko määritettiin ilmoitettuina ajankohtina. Kukin pylväs välineet (± SD) kahdeksasta nude hiirtä kussakin ryhmässä. (C ja D) 95D-solut, jotka transfektoitiin stabiilisti Ches1 ekspressiovektorilla ensin synkronoitava G0 vaiheessa korvaamalla viljelyalusta seerumittomalla alustalla 24 tuntia siten, ja havaittiin niiden apoptoosin käyttämällä anneksiini V värjäystä ja solusyklin käyttämällä solusyklin vaihe määritys kit virtaussytometrialla. (E) 95D-solut transfektoitiin Ches1 ekspressiovektoriin ja analysoitiin niiden CDK2-proteiinia tasolle 48 tuntia myöhemmin. Virhepylväät osoitti keskihajonta kolminkertaisten mittausten kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05.

MTT-määritys

95D-solut ympättiin 3 x 10

3 solua kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin läsnä ollessa tai poissa ollessa CpG ODN: ää (10 ug /ml) 96-kuoppalevyillä 72 tuntia. Arviointi solujen lisääntyminen mitattiin käyttämällä kaupallisesti MTT soluproliferaatiota kit (Cayman) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

(A) Suhteellinen TLR9, miR-574-5p ja Ches1 ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä 23 NSCLC keuhkosyöpä näytteitä. Kukin pylväs edustaa suhteellista suhdetta näiden geenien syöpäkudoksessa verrattuna viereiseen keuhkokudoksessa. Virhepylväät osoitti keskihajonta kolminkertaisten mittausten muodostavat kolmen erillisen kokeen. (B-D) korrelaatio analysoidaan välillä ilmentymisen TLR9 ja miR-574-5p, miR-574 ja Ches1, sekä TLR9 ja Ches1, suoritettiin. Jokainen piste edustaa tuloksia yhdestä potilaasta.

Reaaliaikainen PCR

Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Kaikki alukkeet ja koettimet saatiin Applied Biosystems. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia. cDNA syntetisoitiin kanssa PrimeScript RT-reagenssia (Takara). Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) analyysit tehtiin havaitsemaan mRNA: n ekspression käyttämällä SYBR Esiseos Ex Taq (TaKaRa), ja β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. TaqMan mikro-RNA määritykset (Applied Biosystems) käytettiin määrällisiä ilmentymisen tasot kypsän miR-574-5p, ja pieni nukleaarinen U6-RNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina.

Western-blottaus

solut hajotettiin M-PER Protein Extraction Reagent (Pierce) täydennettynä proteaasinestäjä cocktail. Sytoplastiset ja ydin- uutteet valmistettiin käyttämällä NE-PER Ydin- ja soluliman Extraction reagenssit (Pierce). Kun oli sentrifugoitu 13000 g alle 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan, supernatantit otettiin talteen ja proteiinipitoisuus uutteiden mitattiin BCA Protein Assay (Pierce) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaksikymmentä mikrogrammaa proteiinia ladattiin 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin 90 min ajan 100 V: n päälle polyvinylideenifluoridia kalvoja käyttäen märkää siirtojärjestelmä. Membraanit pestiin 5% rasvatonta maitoa fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa ja 0,05% Tween 20: tä (PBST) 2 tuntia, jotta estämään epäspesifisten proteiinia sitovien kohtien kalvon. Immunoblottaus suoritettiin käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita Ches1 ja CDK2 (Sigma ja Cell Signaling Technology) laimennoksena 1:1000 on rasvaton maito Tris-puskurissa. Membraani pestiin sitten PBST: llä, tutkittiin sekundaarinen anti-kani-vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (Amersham Life Sciences) laimennoksena 1:5000, kehitettiin käyttäen ECL Western Blotting KIT (Pierce), ja altistettiin X-ray kalvo (Kodak).

Plasmidin Hakemisto Rakentaminen

Retrovirusvälitteinen yliekspressio tai eston miR-miR-574-5p synnytettiin perustuu pMX (Invitrogen) kuten aiemmin on kuvattu [21] – [ ,,,0],23]. Lyhyesti, miR-574-5p ekspressiovektori rakennettiin ligoimalla EcoRI /XhoI-polymeraasiketjureaktio (PCR)-fragmenttien pMX-puro retrovirusvektorilla. Retrovirus- miR-574-5p ”sieni” vektori rakennettiin käyttäen ligoimalla kaksi kopiota miR-574-5p täydentäviä oligoja ja pMX-puro vektori. Sekvenssi, joka koodaa mutantti-miR-574-5p kloonattiin samaan vektoriin ja käytettiin kontrollina vektori. Virus tuotettiin ja kohde- solut infektoitiin mukaan käyttäjän käsikirja. Sukupolven Ches1 täyspitkän plasmidi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24].

Luciferase Reporter ja mutageneesi Pitoisuus

lusiferaasireportteri- ja mutageneesi määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. MiR-574-5p jäljittelee tai sen kontrolli oli transfektoida 95D soluihin yhdellä raportin plasmidia (pMIR-Report plasmidiin; Ambion), jotka sisältävät joko villityypin tai mutantit 3 ’UTR: Ches1 joka luotiin käyttäen Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). 48 tunnin kuluttua transfektion, tulikärpäsen ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttäen dual-lusiferaasireportteri- määritystä (Promega).

arviointi Kasvaimen kasvun in vivo

Arviointi tuumorin kasvun suoritettiin kuten kuvattu aiemmin vähäisin muutoksin [3]. Lyhyesti, BALB /c nu /nu-hiiriä (6-8 viikkoa vanhoja) injektoitiin ihon alle 0,2 ml: lla yhden solususpensiota, joka sisälsi 2 x 10

6 kasvainsolujen ja pidetään laminaarisen virtauksen kaapit spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa . Kasvaimet mitattiin joka 5. päivän kuluessa kasvaimen haaste käyttäen noniusmittaharppia. Kasvaintilavuudet saadaan kertomalla mitattu pituus mitatun leveyden lasketulla keskiarvon näiden mitattujen arvojen ja esitettiin keskiarvona ± SEM.

TILASTOANALYYSI

tilastotiedot tiedot olivat jossa käytetään apuna analyysin ohjelmat SPSS12.0 ohjelmisto. Tilastollinen arviointi suoritettiin käyttäen kaksisuuntaista varianssianalyysi (ANOVA, p 0,05) käyttäen ohjelmaa PRISM 4.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Tulokset

TLR9 Signaling Up-säänneltyjen ilmentymisen miR-574-5p Human Lung Cancer Cells

ensimmäinen vahvistettu tehostettua syövän etenemisen ihmisen keuhkosyövän aiheuttama TLR9 signalointi, ja totesi, että CpG ODN hoito 95D-solujen merkittävästi parannettu niiden leviäminen in vitro ja syövän etenemiseen in vivo (kuvio 1A ja B, p 0,05). Valaista mahdollista roolia miR-574-5p in vaikutuksia TLR9 signalointia etenemistä ihmisen keuhko- syöpäsoluja, me validoitu edellisessä mikrosirujen alustalla ja arvioi ilmentymistä miR-574-5p in 95D-soluissa tai ilman CpG ODN käsittely reaaliaikainen PCR-analyysillä. Olemme paljasti, että ilmentyminen miR-574-5p todellakin merkittävästi koholla 95D-soluissa, kun CpG ODN hoidon annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 1 C ja D, p 0,05). Edelleen vahvistaa, että se oli TLR9 /MyD88 signalointi että siirrettävä ylös säädelty ilmentyminen miR-574-5p, The TLR9 signalointi estäjä klorokiini ja MyD88 estävää peptidiä levitettiin estää niiden signalointireitille. Olemme havainneet, että sekä klorokiini ja MyD88 estävää peptidiä voisi merkittävästi kumota kohonnut ilmentyminen miR-574-5p aiheuttama CpG ODN: ien in 95D-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1 E ja F, p 0,05). Meidän havainnot vahvasti osoitettu, että TLR9 signalointi tehokkaasti kohonnut ilmentyminen miR-574-5p ihmisen keuhkojen syöpäsoluja.

Down-regulation of MiR-574-5p kumosi Enhanced syövän etenemisen indusoima TLR9 Signaling in Human Lung syöpä

Valaistaan ​​mahdollista roolia miR-574-5p tehostetussa syövän etenemisen ihmisen keuhkosyövän aiheuttama TLR9 signalointi, 95D-solut transfektoitiin miR-574-5p estäjä ja stimuloitiin sitten CpG ODN. Kuten kuviossa 2A on esitetty, olemme huomanneet, että transfektio miR-574-5p inhibiittori vähentää tehokkaasti niiden ilmentymistä 95D-soluissa (p 0,05). Erityisesti, osoitimme, että transfektio miR-574-5p inhibiittori inhiboi merkittävästi leviämisen 95D-solujen indusoiman CpG ODN: t (kuvio 2B, p 0,5). Edelleen vahvistaa tämän ilmiön in vivo, miR-574-5p sienellä rakennettiin downregulate ilmentymisen miR-574-5p. Tason toiminnallinen knockdovvn miR-574-5p määritettiin reportteri-määritys, jossa ennustettu miR-574-5p-sitoutumiskohta vietiin 3 ’UTR: lusiferaasireport-. Olemme havainneet, että transfektio 95D-solujen kanssa miR-574-5p sienellä aiheutti merkittävän kasvun lusiferaasin aktiivisuuden verrattuna kontrolliin sienellä (kuvio 2C, p 0,05), mikä viittaa siihen, että tehokas inhibitio miR-574-5p aktiivisuus saavutettiin. Näin ollen, ryhmät nude-hiiret altistettiin 95D-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti miR-574-5p sieni, ja sitten stimuloitiin CpG ODN: t. Huomattavaa on, että osoitimme, että alas-säätely miR-574-5p in 95D-soluissa merkittävästi esti tehostetusta etenemisen aiheuttama TLR9 signalointi in vivo (kuvio 2D, p 0,05). Johdonmukaisesti, huomasimme, että alas-säätely miR-574-5p myös pidensi merkitsevästi elinaika kasvaimen omaavien nude-hiirissä (kuvio 2E,

p

0,05). Yhdistämällä nämä tiedot osoittivat, että miR-574-5p siirrettävä vaikutus TLR9 signaloinnin kasvaimen etenemiseen ihmisen keuhkojen syöpäsoluja.

MiR-574-5p edistänyt syövän etenemisen of Human Lung Cancer Cells

luonnehtia mekanismia taustalla avainasema miR-574-5p tiiviimpään kasvainprogression aiheuttama TLR9 signalointi, me arvioidaan edelleen välitöntä vaikutusta miR-574-5p kasvuun 95D-solujen in vitro ja in vivo. Kuten kuviossa 3A on esitetty, olemme huomanneet, että yli-ilmentyminen miR-574-5p in 95D-soluissa johti kohonnutta proliferaatiota in vitro (p 0,05). Johdonmukaisesti, vähentää ilmentymistä miR-574-5p in 95D-soluissa heikentynyt niiden lisääntymistä in vitro (kuvio 3B, p 0,05). Edelleen vahvistaa nämä tulokset in vivo, nude-hiiret altistettiin 95D-solut, jotka transfektoitiin stabiilisti miR-574-5p ekspressiovektori tai miR-574-5p sienellä vektorin vastaavasti. Huomasimme, että yli-ilmentynyt miR-574-5p merkittävästi tehosti kasvaimen etenemistä 95D-solujen in vivo, mukana on alennettu elinaika kasvaimen omaavien hiirten (kuvio 3C ja D, p 0,05). Johdonmukaisesti, alas-säätely miR-574-5p in 95D-soluissa kumottiin niiden kasvua in vivo ja lisäsi elinaikaa aika kasvaimen omaavien hiirten (kuvio 3E ja F, p 0,05). Nämä tulokset viittaavat siihen, miR-574-5p oli tärkeä tekijä liittyy parannettu syövän etenemiseen ihmisen keuhkosyöpää.

Ches1 oli suora Tavoite miR-574-5p edistää kasvaimen etenemistä of Human Lung Cancer

edelleen ymmärtää vaikutusta miR-574-5p sääntelystä taudin etenemiseen ihmisen keuhko- syöpäsoluja, ennustimme tavoitteita miR-574-5p ennustamalla ohjelmiin kuten TargetScan ja Miranda ja valitut 10 mahdollisen kohteen lukien CALCOCO1, RFX4, CD96, CHEX1, FOXI2, DGKG, ZNF589, ZDHHC14, CCDC88C, CLVS1 reaaliaikaiseen PCR-analyysiin. Olemme havainneet, että ilmaus Ches1 osoitti dramaattisesti korkeus 95D-soluissa, jotka on transfektoitu miR-574-5p inhibiittori (kuvio 4A, p 0,05). Vahvistaa tämän tuloksen, teimme Western blot sen ekspression havaitsemiseksi Ches1 in 95D-soluissa, jotka on transfektoitu miR-574-5p estäjä. Olemme havainneet, että proteiini taso Ches1 lisäsi merkitsevästi transfektoimalla miR-574-5p estäjää 95D-soluissa (kuvio 4B, p 0,05). Sitten suoritetaan lusiferaasireport- määritys vahvistaa mahdollisen sääntelyn suhteen. Merkittävästi negatiivinen vaikutus lusiferaasiaktiivisuudeksi havaittu 3 ’UTR Ches1 läsnä ollessa miR-574-5p, kuten tukahduttaminen hävisivät, kun ennustettu kohdepaikkaan 3’ UTR: Ches1 mutatoitiin (kuvio 4C, p 0,05 ). Edelleen havaita mahdollinen rooli Ches1 in TLR9 signalointi tehostettu kasvu 95D-solujen, 95D-solut transfektoitiin Ches1 ekspressiovektoriin ja sitten stimuloitiin CpG ODN: t. Kuten on esitetty kuviossa 4D, olemme huomanneet, että transfektio Ches1 ekspressiovektorilla lisäsivät merkittävästi ilmentymistä 95D-soluissa (p 0,05). Erityisesti olemme havainneet, että transfektio miR-574-5p jäljittelee ei lisätä leviämisen 95D-solut, jotka oli samanaikaisesti transfektoitu Ches1 ekspressiovektorin (kuvio 4E, p 0,05). Olemme lisäksi osoittaneet, että transfektio Ches1 ekspressiovektorilla tehokkaasti kumottu kasvainta edistävää vaikutusta miR-574-5p in vivo (kuvio 4F, p 0,05). Lisäksi olemme paljasti, että säätely ylöspäin Ches1 esti tehokkaasti TLR9 signalointi tehostettu leviämisen 95D-solujen (kuvio 4G, p 0,05). Johdonmukaisesti, huomasimme, että yli-ilmentyminen Ches1 vuonna 95D-soluissa tehokkaasti heikentynyt niiden paremmassa syövän etenemisen aiheuttama TLR9 signalointi nude-hiirissä (kuvio 4H, s 0,05). Nämä tulokset osoittivat, että Ches1 oli bona fide tavoitteeksi miR-574-5p säätelyssä TLR9 signalointi tehostettu syövän etenemiseen ihmisen keuhkosyöpää.

Yli-ilmentyminen Ches1 Inhibioitu solusyklin alkamista of Human Lung Cancer Cells

Valaistaan ​​mahdollista roolia Ches1 kasvaimen etenemisessä ihmisen keuhko- syöpäsoluja, 95D pysyvästi transfektoitujen solujen Ches1 ekspressiovektorilla havaittiin niiden proliferaatiota in vitro ja etenemistä paljaisiin hiiriin in vivo. Olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen Ches1 merkittävästi inhiboivat 95D-soluja (kuvio 5A, p 0,05). Johdonmukaisesti havaittiin, että kasvaimen etenemistä 95D transfektoitujen solujen Ches1 ekspressiovektorilla oli dramaattisesti lievittää kuin kontrolliryhmässä (kuvio 5B, p 0,05). Nämä havainnot ehdottivat, että Ches1 oli estävä pelaaja kasvua ihmisen keuhkosyövän soluja. Edelleen karakterisoimiseksi oleva mekanismi, olemme analysoineet mahdollisia vaikutuksia Ches1 on apoptoosin ja solusyklin ihmisen keuhkosyövän soluja. 95D pysyvästi transfektoitujen solujen Ches1 ekspressiovektorilla tai kontrollivektorilla ensin synkronoitava G0 vaiheessa korvaamalla viljelyalusta seerumittomalla elatusaineella ja sitten jatkuvasti viljeltiin ja kerättiin 24 tunnin kuluttua. Huomasimme, että apoptoosin määrä 95D transfektoitujen solujen Ches1 ekspressiovektorilla oli alhainen ja yleensä verrattavissa kontrolliryhmään (kuvio 5C). Sen sijaan, prosenttiosuus 95D transfektoitujen solujen Ches1 expresson vektorin Go /G1 vaihe oli merkittävästi korkeampi kuin verrokkiryhmässä (kuvio 5D, p 0,05). Sitä paitsi meillä myös paljasti vähentäminen CDK2 ilmentymisen 95D-soluissa transfektion jälkeen Ches1 ekspressiovektorin (kuvio 5E, p 0,05), mikä saattaa osittain selittää tuloksia ja oli yhdenmukainen aiempien tutkimus osoittaa, että säätely ylöspäin CDK2 oli kriittinen for TLR9 signalointi kykyä stimuloida ja solusyklin alkamista ihmisen keuhko- syöpäsoluja [4].

Expression of miR-574-5p korreloi positiivisesti TLR9 ja käänteisesti korreloivat Ches1 in Clinical keuhkosyöpä Potilaat,

tutkimiseksi edelleen mahdollista roolia miR-574-5p in vaikutus TLR9 signaloinnin ihmisen keuhkosyöpäpotilaita, havaitsimme suhde ilmaus miR-574-5p ja TLR9 kliinisissä pienisoluista keuhkosyöpää. Kuten on esitetty kuviossa 6A, ilmentymistasojen TLR9 ja miR-574-5p olivat korkeampia keuhkosyöpä kudoksessa verrattuna viereiseen kudokseen kasvaimen kliinisistä keuhkosyöpä näytteistä (p 0,05). Sitä vastoin ilmaus Ches1 oli merkittävästi pienempi kasvainkudoksissa verrattuna viereisiin kudoksiin (kuvio 6A, p 0,05). Tärkeää on, olemme huomanneet, että ilmentymisen taso miR-574-5p korreloi positiivisesti ilmentymiseen TLR9 kliinisissä tuumorikudoksissa (kuvio 6B, p 0,05). Lisäksi olemme paljasti, että ilmentyminen miR-574-5p on käänteisesti korreloi ilmentymistason Ches1 kasvainkudoksessa (kuvio 6C, p 0,05). Lisäksi ilmaus TLR9 myös käänteisesti korreloi ilmentymistason Ches1 kasvainkudoksessa (kuvio 6D, p 0,05). Nämä löydökset olivat linjassa yli tietoja, jotka osoittivat, että Ches1 oli enemmistönä kohde miR-574-5p antaa parannetun syövän etenemisen aiheuttama TLR9 signalointi ihmisen keuhkosyöpä.

Keskustelu

viime vuosina kertyvät tiedot osoittivat, että TLR: ien oli funktionaalinen ilmaistuna kasvainsoluissa ja osallistuvat kasvaimen etenemiseen [4] – [8]. Olemme aiemmin osoittaneet, että TLR9 signalointia voitaisiin parantaa kasvaimen etenemistä ihmisen keuhkosyövän soluja in vitro ja in vivo [3], [4], [9] – [11]. Tässä laajensimme edellinen tutkimus osoittaa, että säätely ylöspäin miR-574-5p siirrettävä tehostetun syövän etenemisen aiheuttama TLR9 signalointi ihmisen keuhkosyövän soluja. Meidän havainnot ehdotti, että miR-574-5p oli tärkeä toimija TLR9 signalointi ja tuumoribiologiassa.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että TLR9 signalointi merkittävästi kohonnut ilmentyminen miR-574-5p in 95D-soluissa, jotka oli yhdenmukainen aiempien tutkimuksen [19]. Vastatakseen mahdollista roolia miR-574-5p in TLR9 signalointi tehostetun etenemiseen ihmisen keuhko- syöpäsoluja, arvioimme vaikutus alas-säätely miR-574-5p on TLR9 signalointi tehostetun etenemistä 95D-solujen ja totesi, että alassäätöä Mir-574-5p voisi tietenkin vähentää etenemistä 95D-solujen in vitro ja in vivo. Meidän tiedot osoittivat, että luontainen miR-574-5p voitaisiin edistää etenemistä ihmisen keuhkojen syöpäsoluja. Itse asiassa, meidän peräkkäisten tutkimus osoitti, että miR-574-5p voisi edistää etenemistä ihmisen keuhko- syöpäsoluja, mikä osoittaa, että jatkuvaa ilmentymistä miR-574-5p oli ratkaisevaa etenemisen ihmisen keuhkosyövän soluja.