Krooninen sairaus

tiivistelmä

Geeniterapia on houkutteleva strategia ei-invasiivisia eturauhassyövän hoitoon, jossa nykyinen kliinisiä interventioita näyttää rajoitettu tehoa. Täällä arvioida käytön hyönteisten virus, bakulovirus (BV), kuten uusi vektori ihmisen eturauhassyövän geeniterapiassa. Koska eturauhasen kasvaimet edustavat heterogeenisessa ympäristössä, terapeuttinen lähestymistapa, joka saavuttaa pitkän aikavälin regressio on voitava kohdistamalla useita transformoidun solun populaatioissa. Lisäksi syrjintä kohdentamisessa pahanlaatuisten verrattuna ei-pahanlaatuisia soluja olisi arvoa minimoimaan sivuvaikutuksia. Käytimme useita eturauhassyövän malleja analysoida mahdollisuuksia BV näiden tavoitteiden saavuttamiseksi.

In vitro

, sekä perinteisiä eturauhasen solulinjoissa sekä ensisijaisena epiteelin tai stroomasoluissa peräisin potilaasta eturauhasen koepaloja, kaksi- tai kolmiulotteisten viljelmiä, käytettiin. Olemme myös arvioineet BV

in vivo

hiiren eturauhassyöpäksenograftista malleja. BV kykeni ensisijaisesti transdusoimaan invasiivisen pahanlaatuisen eturauhassyövän solulinjoissa verrattuna alkuvaiheen syöpien ja ei-pahanlaatuiset näytteitä, rajoitus, joka ei ole funktio ydinvoiman tuonnin. Enemmän kliinistä merkitystä, ensisijainen potilaasta peräisin eturauhassyövän solut myös tehokkaasti transduktio BV, luotettavalla hinnat havaittiin epiteelisolujen pohjapinta fenotyypin, joka ilmaistaan ​​BV-koodattuja siirtogeenien nopeammin epiteelisolujen eriytetympää, luminal fenotyyppi. Suurin transduktiokapasiteetin havaittiin stroomasoluissa. BV pystyi läpäisemään kolmiulotteisia rakenteita, kuten

in vitro

palloset ja

in vivo

potilaalle tehdä ksenograftit. BV vektorit sisältävät nitroreduktaasi siirtogeenin geeni-suunnatun entsyymi pro-lääkehoito lähestymistapa kykenivät tehokkaasti tappaa pahanlaatuiset eturauhasen tavoitteita antamisen jälkeen aihiolääke, CB1954: tä. Näin ollen, BV pystyy transdusoimaan suuri osa eturauhasen solutyyppeihin heterogeeninen 3-D eturauhassyövän, voi helpottaa solukuolemaa käyttäen pro-drug lähestymistapaa, ja lupaava vektorina varten eturauhassyövän hoitoon.

Citation: Swift SL, Rivera GC, Dussupt V, Leadley RM, Hudson LC, MA de Ridder C, et al. (2013) arvioiminen bakuloviruksella vektorina Human eturauhassyöpä Gene Therapy. PLoS ONE 8 (6): e65557. doi: 10,1371 /journal.pone.0065557

Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugali

vastaanotettu: 01 helmikuu 2013; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2013; Julkaistu: 06 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Swift et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ suoritettiin EU: n rahoittaman yhteistyöhankkeet: Eturauhasen aloite Gene Therapy ”PIG” (FP5), Baculogenes (FP6) ja Gene Therapy: yhdennetty lähestymistapa Neoplastiset Treatment ”GIANT” (FP6), lisätukea Yorkshire Cancer Research . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yhdistyneessä kuningaskunnassa yli 40000 uutta tapausta eturauhassyövän diagnosoidaan vuosittain ja 11000 potilaat kuolevat suoraa seurausta tästä taudista (Lähde: Office for National Statistics). Ihmisen eturauhanen on heterogeeninen ympäristö, koostuu pääasiassa epiteelin ja strooman solutyyppejä. Epiteeli- osasto koostuu kaksikerroksisen soluja: jatkuva tyvikerroksen erilaistumattomien solujen, jotka ovat kosketuksissa tyvikalvon, peitettiin eriytetty onteloerityssolut [1]. Pohjapinta epiteelin kerros edustaa kaikkein proliferatiivinen osaston [2]. Vaikka suurin osa kaikkein eturauhasen kasvaimia käsittää solujen epiteelin alkuperä [3], useita solutyyppejä on kyky edistää maligniteetin, ja on kitkettävä, jotta saavutetaan tehokas kliinisen tuloksen.

Tyypillisesti vaihe eturauhasen sairaus ja reagointikykyä kasvaimen androgeenit ovat kaksi keskeistä tekijää, jotka suoraan hoitostrategioita. Vaikka paikallinen eturauhasen kasvaimia voidaan kirurgisesti resektoitiin kautta eturauhasen, tämä liittyy usein ei-toivottuja sivuvaikutuksia. Vaihtoehtoinen lähestymistapa, androgeeniablaatio hoito, poistaa tarjonnan androgeenien että monet eturauhasen kasvaimia luottaa kasvua ja selviytymistä; kuitenkin, toistumisen aggressiivisempia kastraation kestävä eturauhassyöpä (CRPC) on yleinen tulos. Koska CRPC on lopulta vastustuskykyinen sädehoidon ja kemoterapia, uudet strategiat ovat välttämättömiä tarjota parempia tuloksia eturauhassyövän potilaille. Geeniterapia on yksi mahdollinen ratkaisu, ja ihannetapauksessa sijoitettava kohdistaa sekä ensisijaisen että toissijaisen eturauhaskasvaimissa systeemisen annostelun jälkeen.

Vaikka monia erilaisia ​​vektoreita on arvioitu turvallisuutta ja tehoa geeniterapiakokeissa [4] käyttö ei-ihmisen, ei-patogeenisten virusten, kuten bakuloviruksen,

Autographa californica

Multiple NucleoPolyHedrovirus (

Ac

MNPV), on suhteellisen tutkittu ilmiö alueella. BV on kaksijuosteinen DNA-virus, joka luontaisesti infektoi hyönteisten isännät, ja vaikka BV voi tehokkaasti transdusoida nisäkässoluissa, tuottava replikointi ei ole mahdollista, koska vaatimus hyönteisten erityisiä solukoneisto [5], [6]. Kuten geeniterapiavektoria, BV on useita luontaisia ​​etuja. Suurin osa ihmisen väestöstä ei ole aiempaa altistumista BV ja on siten immunologisesti naiivi. BV kapsidi pystyy laajenee mahtuu suuria siirtogeenin insertit, ja luonnollinen tropismi bakulovirus helppo muuttaa. BV pystyy transdusoimaan sekä aktiivisesti-raja ja lepotilassa nisäkässoluissa, ominaisuus, joka on erityistä merkitystä eturauhassyövän hoitoon, hitaasti kasvava kasvain [7]. Läsnäolo bakuloviruksen, jopa suurella infektiokertoimella (MOI), ei ole toksinen eikä vaikuta solujen kasvun ja erilaistumisen potentiaalin [8], [9]. Lopuksi laaja pitkäaikaisturvallisuus tutkimusten toteutettu 1960-luvulla, kun bakulovirus noussut tärkeäksi näköpiirissä biologisena hyönteismyrkky, ovat osoittautuneet bakuloviruksen vaaraton ihmiselle [10].

Kyky BV toimittaa toiminnallisesti kestävä siirtogeenin nisäkässoluissa osoitettiin ensimmäisen vuonna 1995 [11]. Sen jälkeen,

Ac

MNPV on osoittautunut, joka kykenee transdusoimaan monenlaisia ​​nisäkässolutyypeissä, mukaan lukien ihmisen ensisijainen neuronit [12], maksan [11], mesenkymaaliset kantasolut [13] ja alkion kantasolut [9] . Vaikka aikaisintaan yrittää saavuttaa BV geeninsiirto

in vivo

epäonnistui vektori inaktivoitumisen seerumin komponentit, kuten komplementti [14], tehokas baculovirus transduktio voidaan saavuttaa läsnäollessa kemian- tai proteiini- pohjainen täydennys estäjiä, joko yhteistyössä siirrosten [15], [16], [17] tai yhtiöittämisten osaksi BV vaippaproteiinin [17], [18], [19]. BV on menestyksekkäästi käytetty prekliinisen geeniterapiavektoria

in vivo

[12], [20], [21], [22], [23], ja yhteydessä syöpä on onnistuneesti hoidettu hiiren mahan ksenografteja [24].

Tässä, arvioimme BV geeniterapiavektorilla hoitoon ihmisen eturauhasen syöpä. Kuvaamme käyttöä BV ensisijaisesti transduce ja toimittaa sekä toimittaja ja solu-tappavia geenejä pahanlaatuinen eturauhas- näytteet solulinjan ja potilaan alkuperää, lisäksi kolmiulotteisia kulttuureissa ja

in vivo

hiiren kasvaimia, joilla on suuri tehokkuutta.

Materiaalit ja menetelmät

Insect Cell Line Maintenance

Sf21- ja Sf9 (Invitrogen) solulinjoja (eristetty munasarjakudoksen lasku tarhayökkönen,

Spodoptera frugiperda

) ylläpidettiin spinner roikkuu sekoitussauvalla pulloissa 27 ° C: ssa Gracen alustaa, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (PAA Laboratories) ja 0,1% (v /v) Pluronic F-68 (Invitrogen). Yksikerrosviljelmiä pidettiin ilman Pluronic.

Human Prostate Cell Line Maintenance

LNCaP (androgeenistä-herkkä, hyvin erilaistunut syöpäsolujen peräisin imusolmuke etäpesäke) ja PC-3 (androgeenista riippumaton, huonosti erilaistunut syöpäsolujen peräisin luumetastaasipotilailla) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, USA). PC346C (androgen-herkkien, hyvin erilaistunut syöpäsolujen peräisin ensisijainen eturauhasen kasvain) perustettiin Erasmus Medical Centre, Alankomaat [25]. P4E6 (epiteelisolut peräisin hyvin erilaistunut ensisijainen eturauhasen kasvain kuolemattomiksi transfektoimalla HPV E6), PNT1A ja PNT2C2 (ei-pahanlaatuisia eturauhasen solujen erilaisista potilaista, kuolemattomiksi transfektiolla SV40) perustettiin vuonna laboratoriossamme [26] , [27]. Kaikki solut käsiteltiin alle hyvän laboratoriokäytännön olosuhteet määritellään passage ikkunat olivat kuukausittain sertifioitu mykoplasmaa ja genotyypattiin (käyttäen ATCC-hyväksytty Powerplex 1,2 järjestelmä, Promega) varmistaa aitous. Soluja siirrostettiin rutiinisti alle aiemmin kuvattu olosuhteissa [28].

Ensisijainen Cell Culture

Patient eturauhasessa otettiin tietoon ja kirjallinen suostumus ja hyväksyntä York Research eettinen komitea potilailta, joille suoritetaan höyläysleikkaus eturauhasen, cystectomy tai eturauhasen. Epiteelisolut eristettiin kuten aiemmin on kuvattu [29] ja valitaan α

2β

1

hi ilmaisua käyttäen nopeaa sitoutumista tyypin I kollageeni levyillä (BD Biosciences). Soluja viljeltiin yh- päälle Kollageeni I plasticware säteilytettyä STO hiiren syöttösoluja kunnes kasvu oli vakiintunut, vuonna KSFM lisätty 5 ng /ml EGF, 50 ng /ml naudan aivolisäkeuutteella ja 2 mM L-glutamiinia (KSFMsup). Erilaistumisen indusoimiseksi, soluja viljeltiin 50:50 (v /v) seosta DMEM ja Hamin F12, johon oli lisätty 10% FCS: ää, 10 nM DHT ja 2 mM L-glutamiinia (DH10) ja 4-6 päivää. Eristetyt strooman soluja kasvatettiin T25-pulloissa RPMI: ssä, jota oli täydennetty 10% FCS: ää ja 2 mM L-glutamiinia.

bakuloviruksen valmistus

Rekombinanttinen bakulovirus-vektorit konstruoitiin käyttäen BacVector 1000 Kit (Novagen), mukaan valmistajan ohjeiden, jossa mittatilaustyönä pBAC64: CMV-EGFPCAT, pBAC64: CMV-EGFP tai pBAC64: CMV-NTR-EGFP siirto plasmidien. Nämä plasmidit on selkäranka pBAC4X-1 (Novagen), jossa insertiot

polh

promoottorin ja

gp64

-geenin koodaavien sekvenssien pBACsurf-1 (Novagen) ja sytomegaloviruksen (CMV) välitön varhainen promoottori ajo transkription EGFP, joka on EGFPCAT fuusioproteiinia (BD Biosciences Clontech) tai mNitroreductase (NTR) -IRES-EGFP ekspressiokasetit. Rekombinanttiviruksia tehtiin kolme plakkipuhdistuskierroksella ja korkea titteri varastot kasvatettiin infektoimalla Sf21-hyönteissoluissa MOI = 0,1 plakkia muodostavaa yksikköä (PFU) per solu ja korjuu viruksen supernatanttia jälkeen 5 päivää. Virus sisältävä solu supernatantti konsentroitiin ultrasentrifugoimalla 24000 rpm 90 minuuttia 4 ° C: ssa Beckman SW28 roottoria ja puhdistettiin edelleen ultrasentrifugoimalla läpi sakkaroosigradientissa 24000 rpm Beckman SW41 roottorissa. Viruspartikkelit pestiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään (noin 1/500 alkutilavuudeksi) ja titrattiin käyttämällä plakkitestillä Sf9. Hiukkanen: PFU-suhde oli yleensä alueella 100-300 [30], [31], [32]. Transduktioon eturauhasen solujen, virus laimennettiin seerumia tarvittaessa kunkin solun tyyppi, ellei toisin mainita.

konfokaalimikroskopialla Analyysi Yksikerrokset ja bilayers

Sekä yksikerroksinen ja kaksikerroksinen konfokaali kokeet solut ympättiin 8-kuoppaisille kammion dioja peitelasi emäksen (Lab-Tek) alkutiheydellä 2-5 x 10

4 solua kuoppaa kohti (pre-päällystetty 0,1 mg /ml poly-L-lysiini for LNCaP). Muodostamaan kaksikerroksinen, väliaine vaihdettiin joka 2. päivä, kunnes kaksikerroksinen epiteelin kasvu saavutettiin. BV- [CMV-EGFPCAT] tai BV- [CMV-EGFP] hiukkasia lisättiin 500 PFU /solu tietyn ajan, jonka jälkeen solut pestiin poistamaan sitoutumaton virus ja kiinnitetty välittömästi 4% (w /v) paraformaldehydillä . Solut permeabilised 0,5% (v /v) Triton-X 100 (Sigma) tai 70% EtOH, estettiin sitten 10% seerumia. BV kapsidiproteiinista, vp39, havaittiin käyttäen ensisijaisena monoklonaalinen vasta-aine (P10C6), kohteliaisuus tohtori L. E. Volkman, University of California, Berkeley, USA [33] ja vuohen anti-hiiri Alexa Fluor 568 sekundaarinen vasta-aine (Invitrogen). Vuonna kaksikerroksinen kokeissa vasta-aineen laimennokset valmistettiin 0,1% (w /v) Fraction V BSA: ta (Sigma) tukeen levinneisyys pohjapinta kerroksia, kun taas yksikerroksisessa kokeissa vasta-aineen laimennukset valmistettiin PBS: ään. Analyysiä varten ensisijaisen solun erilaistumisen, HMWCK (Dako) vasta-ainetta lisättiin sen jälkeen soveltanut sekundäärisen vuohen anti-hiiri-Alexa 568-vasta-ainetta (Invitrogen). Toinen primaarista vasta-ainetta (CK18-FITC: tä (Sigma)), levitettiin sitten. Vectashield sisältävät DAPI (Vector Lab) lisättiin ennen visualisointiin soluja fluoresenssi käyttäen Zeiss LSM 510 meta konfokaalimikroskoopilla.

virtaussytometria

Solut maljattiin tiheydellä 0,2-1 x 10

5 kuoppaa kohti 48-kuoppaiselle levylle ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli. Solut pestiin kerran PBS: llä, ennen kuin lisättiin viruksen laimennettu seerumittomassa väliaineessa sopivat kullekin solutyypille. Kun haluttu aika, virus imettiin pois, solut pestiin kerran seerumittomalla alustalla ja peitettiin seerumin sisältävään kasvualustaan. Solut irrotettiin käyttäen trypsiiniä: EDTA ja resuspendoitiin 0,02% (paino /tilavuus) EDTA, joilla on vähintään 10000 singlet tapahtumista laskettiin käyttäen syaania ™ ADP -virtaussytometrillä.

PC346C Sferoidiviljelmiä TRANSDUKTIO

muodostuu spontaanisti sferoidit kerättiin pinnalta T25-pulloon, joka sisälsi PC346C soluihin ja inkuboitiin 10 minuuttia 37 ° C: ssa täydellisessä elatusaineessa, joka sisälsi BV- [CMV-EGFP] pitoisuutena 8,6 x 10

9 PFU /ml . Palloset laimennettiin 2,5 ml: ssa alustaa ja uudelleen maljataan T12.5 pulloon. Fluoresenssikuvia otettiin käyttäen Nikon Eclipse TE300 mikroskoopilla kolme päivää infektoinnin.

Orthotopic ksenoqraftit

Kasvaimet perustettiin ruiskuttamalla 1 x 10

6 PC346C solujen ortotooppisesti osaksi dorsolateral eturauhasen Kateenkorvattomien nude-hiirten (NMRI nu /nu, Taconic M BA /S, Ry, Tanska) kuten aiemmin on kuvattu [34] ja eettisten menettelyjen ja alle hyväksyntää Erasmus Experimental Animal Centerin eettinen komitea. Kasvainten kasvua seurattiin transrektaalisella ultraäänikuvauksella käyttämällä mukautettu suonensisäinen ultraääni järjestelmä [35]. Tuumorin koot välillä 80 ja 120 mg: n, kaksi annosta (3 x 10

7 tai 1 x 10

8 pfu) BV- [CMV-EGFP] annettiin kasvaimensisäisesti nukutuksessa. Eläimet tapettiin 3 päivää myöhemmin, kasvaimet kerättiin kiinteät 2 tuntia 2% (w /v) paraformaldehydillä PBS: ssä, viipaloitu vibratomilla (Campden Instruments, Loughborough, UK) otetaan 70 pm paksuisia leikkeitä ja asetettiin lasilevyille vuonna Vectashield (Vector Lab). EGFP ilmentyminen visualisoitiin konfokaalimikroskopiaa (Carl Zeiss, Benelux).

arviointi solujen elinvoimaisuuden MTS Pitoisuus

Solut maljattiin tiheydellä 1 x 10

4 solua kuoppaa kohti 96-kuoppaiselle levylle ja annettiin kiinnittyä yön yli. BV- [CMV-NTR-EGFP] lisättiin kolmeen rinnakkaiseen koloon MOI = 500: ssa 4 tunnin ajan, pestiin ja inkuboitiin vielä 20 tuntia ennen kuin lisättiin CB1954: tä (20 uM kaikki ensisijainen näytteiden ja solulinjojen lukuun ottamatta PC-3, jota varten 40 uM käytettiin). Sen jälkeen vielä 48 h solulinjoja tai 30 h primäärisiä soluja, solujen elinkykyisyys mitattiin käyttämällä CellTiter 96® Aqueous Assay Reagent (Promega) mukaan valmistajan ohjeiden ja levyt lukea käyttämällä BMG Labtech Polarstar Optima levylukijalla. Osuus kuolleet solut laskettiin vertaamalla elinkelpoisille soluista trandusoidun hyvin. Kaksoiskappale joukko kaivoja käytettiin virtaussytometriaa edellä kuvatulla määrittää taajuuden positiivisesti transdusoidut solut.

Tulokset

BV transduktio on tehokkaimmillaan Pahanlaatuinen eturauhasen solulinjoihin verrattuna ei-pahanlaatuinen Ohjaimet

jotta voitaisiin määritellä kyky BV differentiaalisesti transduce pahanlaatuinen vs. muu pahanlaatuinen eturauhas- tavoitteet, arvioimme alttius paneelin vakiintuneita ihmisen eturauhasen solulinjojen BV transduktio. Soluja inkuboitiin rekombinantti BV vektori muunnettu kuljettaa EGFPCAT siirtogeenin (BV- [CMV-EGFPCAT]) käyttäen kiinteää MOI 500 ja inkubointiaika 48 tuntia. Pahanlaatuisten solulinjojen korkea metastaattinen potentiaali, kuten LNCaP, PC3 ja PC346C, olivat erittäin transdusoitiin (-80% EGFP-positiivisia soluja), kun taas ei-pahanlaatuisten solulinjojen PNT1A ja PNT2C2 oli vähintään transdusoitiin (jopa 10% EGFP-positiivisia soluja) (kuvio 1A). P4E6, solulinja, joka on johdettu aloitettu, mutta aikaisessa vaiheessa kasvain, oli välialueella, noin 20% EGFP-positiivisia soluja (kuvio 1A). Siten taajuus solujen positiivisesti transduktio BV korreloi pahanlaatuisen ja metastaattista potentiaalia.

(A) Prosenttia EGFP-positiivisten solujen seuraavat transduktion paneelin korkealuokkaisesta pahanlaatuinen (punainen), huono laatu pahanlaatuinen (black ) tai ei-pahanlaatuinen (sininen) eturauhasen solulinjoissa BV- [CMV-EGFPCAT] MOI = 500: ssa 48 tuntia. Virhe palkit kuvaavat – /+ yksi standardipoikkeama. (B) Suhteellinen ekspressiotasot EGFP seuraavista transduktion BV- [CMV-EGFPCAT] klo kyllästää MOI (500 LNCaP, PC3 ja PNT1A, 1000 PNT2C2). Prosenttiosuus EGFP-positiivisten solujen normalisoitiin saavutetut seuraavat 48 h inkuboinnin läsnä viruksen kunkin solutyypin (asetettu 1). Pahanlaatuisten solulinjojen: PC3 (▴), LNCaP (▪); Non-pahanlaatuisten solulinjojen: PNT2C2 (♦), PNT1A (▾). Virhe palkit kuvaavat – /+ yksi standardipoikkeama. (C) Konfokaalimikroskopia kuvien (yksi viipale tai Z-pino) BV transdusoimattomien LNCaP, PC3 tai PNT1A soluja 8 tuntia transduktion jälkeen (MOI = 500). Punainen fluoresenssi osoittaa BV kapsidin (anti-vp39), tumavärjäystä sininen (DAPI) ja BV-ajettu EGFP ilmentymistä vihreänä.

Tutkiakseen optimaaliset transduktio olosuhteet erittäin alttiita (LNCaP, PC 3) verrattuna vähemmän altis (PNT1A ja PNT2C2) eturauhasen solulinjoissa, analysoimme sekä MOI tarvitaan saavuttamaan transduktion kylläisyyttä ja kinetiikka transduktion tällä MOI. Soluja inkuboitiin 1 h, kun läsnä oli kasvavia annoksia BV- [CMV-EGFPCAT], ja osuus EGFP-positiivisten solujen analysoitiin 24 tunnin jälkeen. MOI saavuttaminen edellyttää suurinta taajuutta transdusoidut solut oli 500 PFU per solu LNCaP, PC3 ja PNT1A, 1000 PFU per solu PNT2C2 (tuloksia ei ole esitetty). Käyttämällä näitä kyllästää kuukautta, kinetiikka transduktion tutkittiin ajan myötä. Pahanlaatuisia eturauhasen solulinjoissa (LNCaP-ja PC-3) osoitti nopean ja tehokkaan oton BV- [CMV-EGFPCAT], jotka vaativat vain lyhyitä inkubointiaikoja (~45 tai ~90 min, vastaavasti), jotta saavutetaan 50%: n tasoilla kirjataan 48 h (kuvio 1 B). Toisaalta, ei-pahanlaatuisen eturauhasen solulinjoissa (PNT1A ja PNT2C2) tarvitaan laajennettu inkubointiaikoja (~ 10 h tai ~8 h, vastaavasti) saavuttaa 50%: n tasolle 48 h (kuvio 1 B).

Yksi tulkita näitä eroja transduktio on, että ydinvoima tuonti BV kapsidi on puutteellinen joissakin solutyypeissä (katsaus [36]). Arvioida tämän hypoteesin meidän eturauhasen solulinjaan malleissa solunosasijaintia BV capsids tutkittiin käyttäen konfokaalimikroskopia 8 h transduktion jälkeen on erittäin herkkä pahanlaatuinen LNCaP-ja PC-3-solulinjojen ja vähemmän altis ei-pahanlaatuisten PNT1A solulinja . BV capsids havaittiin tumassa kaikkien kolmen solutyypeissä (kuvio 1 C), ja visuaalisen analyysin useiden näkökentät ei ilmennyt eroja tasojen ydinvoiman kapsidin lokalisointi. Kuitenkin, PC-3-solut oli korkeampi pinta-sitoutuneen BV, kun taas PNT1A soluilla oli korkeampi BV sytoplasmassa (kuvio 1C).

soluja Basal (Eriyttämätön) fenotyyppi Transdusoidut helpommin kuin Luminal (Differentiated) solut ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen Cultures

jotta laajentaa arviointiin BV osaksi biologisesti relevantti tilanteessa, käytimme ensisijainen potilaan biopsialla peräisin eturauhasen epiteelisolujen kulttuureissa. Koska suurin osa ihmisen eturauhasen kasvaimia käsittää solujen epiteelin alkuperä, sekä eriytymättömiä (perustaso) ja hyvin erilaistunut (luminal) fenotyypit hetkellä meillä selvitettävä, BV kykeni kohdistamaan sekä epiteelisolujen populaatioita eri vaiheissa erilaistumista. Ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen peräisin kolmesta potilaan kasvainbiopsioissa (Gleason pisteet 6, 7 ja 8/9) viljeltiin kahdessa eri olosuhteissa: in KSFMsup keskipitkällä ylläpitää solujen pohjapinta tila tai DH10 keskipitkällä erilaistumisen indusoimiseksi, joka perustuu työhön by [37]. Muutokset erilaistumiseen asema näissä selvä viljelyolosuhteissa vahvistettiin immuunifluoresenssivasta analyysin klassisen Differentiaatiomarkkerien (pohjapinta merkkiaineet: sytokeratiineja (CK) 1, 5, 10 ja 14; luminal merkki: CK18), joka perustuu työhön [38] (Täydennyskuvio 1). On potilasta kohti, solut viljeltiin KSFMsup tai DH10 inkuboitiin BV- [CMV-EGFPCAT] lisäämiseksi pituisiksi ajoiksi ja analysoitiin virtaussytometrillä 48 tuntia. Epiteelin erilaistuminen vähensi transduktio taajuuksia yleistä, kun soluja inkuboitiin viruksella alle 10 h: esimerkiksi solut peräisin Gleason 6 kasvain, enimmäismäärä infektion saavutettu perustason (KSFMsup) solujen 4 h (45.33 ± 3,55 %) oli huomattavasti suurempi kuin huippu tartunnan luminal (DH10) soluja (21,69 ± 1,78%) 8 h (kuvio 2A). Pidemmällä BV Inkubaation ero transduktio tasojen KSFMsup- ja DH10-viljeltyjä soluja lieventyivät, mutta pysyi pienempi eriytetty (DH10) solupopulaatioiden (kuvio 2A).

(A) Prosenttia EGFP-positiiviset solut 48 tuntia transduktion jälkeen kanssa Bv- [CMV-EGFPCAT] MOI = 500 lisätä pituudet kertaa kolmeen ensisijainen pahanlaatuisen eturauhasen epiteelisolujen näytteistä (Gleason 6, 7 tai 8/9), ylläpidetään pohjapinta tilassa viljelemällä KSFMsup (▪), ja viljellyt erottamaan olosuhteissa DH10 (▴). Virhe palkit kuvaavat – /+ yksi standardipoikkeama. (B) lokalisointi BV capsids primaarisissa epiteelisoluissa peräisin Gleason 8/9 kasvain kasvanut kaksikerroksiseen joko 1 h tai 16 h inkubaation jälkeen Bv- [CMV-EGFPCAT] MOI = 250. Punainen fluoresenssi osoittaa BV kapsideista havaittu anti-vp39, ydinvoiman DAPI värjäytyminen näkyy sinisenä ja BV-ajettu EGFP ilmentymistä vihreänä. Confocal kuvia ylemmän kerroksen soluja (luminaalisen kaltainen; keskimääräinen z-etäisyys 14,58 um vatsanpuoleisesta asentoon) ja alemman kerroksen (pohjapinta-like, keskimäärin z-etäisyys 6,47 um vatsanpuoleisesta asennossa) ovat esitetty. (C) tiheys (normalisoitu pilkattaa = 1%) tai fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo EGFP-positiivisia ensisijainen stroomasolujen, jotka ovat peräisin pahanlaatuista tai hyvänlaatuista koepaloja 24 h jälkeen, transduktion Bv- [CMV-EGFPCAT] MOI = 500

jotta voitaisiin edelleen tutkia nopeasti transduktion pohjapinta epiteelisolujen kanssa BV, me palveluksessa

in vitro

solussa kaksikerroksinen malli, joka jäljittelee solurakenne eturauhanen. Kaksikerroksisen käsitti konfluentti kerros tyvi- epiteelisolujen (CK1 /5/10/14 +) päällä on epätäydellinen ylemmän kerroksen solut eriytetympää, luminal fenotyyppi (CK18 +) [28], [38]. Ensisijainen pahanlaatuiset eturauhasen epiteelisolujen peräisin Gleason pisteet 7 kasvainten annettiin muodostaa kaksoiskerroksen, sitten inkuboitiin BV- [CMV-EGFPCAT] 1 h tai 16 h ja visualisoitiin konfokaalimikroskopialla. Inkubaation jälkeen BV 1 h, virus capsids visualisoitiin Tyvisolukerroksessa on pistemäinen värjäyskuvion, mutta ei havaittu luminal kerros (kuvio 2B). Seuraavat pidempi inkubaatio (16 h), virus capsids havaittiin sekä perus- että luminaalinen kerrokset: kuitenkin merkittäviä alueita luminaalisessa kerros pysyi puuttuu viruksen kapsidit (kuvio 2B).

BV voi nopeasti ja tehokkaasti transduce Ensisijainen eturauhasen stroomassoluihin

Epithelial ja strooman väestön kaksi suurta solukomponenttien eturauhasen kasvaimia. Vaikka epiteelisolut käsittävät tyypillisesti suurimman osan pahanlaatuinen solupopulaatio, stroomasolut ovat sekaantuneet vastavuoroisesti takaisinkytkentäsilmukka, joka tukee kasvua ja ylläpitoa kasvainsolujen [39], [40]. Tämä viittaa siihen, että onnistunut eturauhassyövän hoito tulee kuuluttava kohdennettuja hävittämiseksi pahanlaatuisen liittyvän strooman lokero. Siksi tutkittiin kykyä BV transdusoida soluja strooman alkuperää. Stroomasolut, jotka ovat peräisin pahanlaatuista tai ei-pahanlaatuinen ensisijainen eturauhasen koepaloja inkuboitiin BV- [CMV-EGFPCAT] 1, 16 tai 24 tunnin ajan ja analysoitiin virtaussytometrialla. 1 h kuluttua, noin 30% soluista oli transduktio BV, kun taas sen jälkeen, kun 16 tunnin inkuboinnin, joka stroomasolujen positiivisesti transduktio BV (kuvio 2C). Eroa ei havaittu taajuus positiivisesti transdusoimattomien stromasoluja perustuu pahanlaatuisiksi; kuitenkin, per-solun perusteella, stroomasolut, jotka ovat peräisin pahanlaatuista eturauhasen biopsia näytteet omasivat suurempi fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti kuin ne, joita saadaan hyvänlaatuisia koepalojen varhaisessa aikapisteissä (kuvio 2C). Stroomasolut olivat näin ollen erittäin herkkä BV transduktio.

BV voi onnistuneesti transdusoida 3-D Eturauhasen Pallot ja Orthotopic ksenoqraftit

On ehdotettu, että tehokas geeniterapiavektoria on kyettävä läpäisemään useita solukerroksia, jotta saavutetaan kliinisesti merkittävää vastetta kiinteiden tuumorien hoidossa. Luonnehtia kyky BV kautta muuttaa solun kerroksen, käytimme molemmat

in vitro

ja

in vivo

kolmiulotteisessa kulttuureissa. Sillä

in vitro

mallinnus, ontto pallosia pahanlaatuisten PC346C eturauhasen soluja, mikä käsitti ”kuori” 2-3 solukerrosten ja spontaanisti irrottaa yksikerroksia rutiinikäytössä kulttuuri, inkuboitiin BV- [CMV-EGFP] . 72 h jälkeisen inkubaation, erittäin tehokas malli solujen transduktio havaittiin, jossa tunkeutuminen BV kaikkien solukerroksissa (kuvio 3A).

(A) PC346C sferoidit transdusoidaan Bv- [CMV-EGFP] (tai mock transdusoitu) 3 päivää infektoinnin. (B) PC346C kasvaimet kerätty ksenosiirrettyjä hiiristä 3 päivää infektoinnin kanssa BV 3 x 10

7 (yksi edustaja kuva kuvassa) tai 1 x 10

8 (kaksi edustavaa kuvissa) pmy per rokotus. Punainen fluoresenssi osoittaa soluytimet (Hoescht), kun taas BV-driven EGFP ilmentyminen näkyy vihreällä. Nuolet osoittavat paikalle intratumoraalisesti BV injektion.

i

n vivo

mallinnus, hiiren eturauhassyöpäksenograftista malleja, avulla luotua potilaalle tehdä injektointi PC346C solulinjan osaksi dorsolateral eturauhasen kateenkorvattomiin nude-hiirissä, injisoitiin kasvaimensisäisesti kanssa BV- [CMV-EGFP] kahdessa eri pitoisuuksilla (3 x 10

7 tai 1 x 10

8 pfu). 72 h, kasvaimia resekoitiin ja analysoitiin fluoresenssimikroskopialla. BV havaittiin onnistuneesti tunkeutumaan kasvain, ja siirtyä pois alkuperäisestä pistokohdassa. Tämä oli erityisen selvää antamisen jälkeen suurempi annos viruksen (kuvio 3B). Siten jopa kolmiulotteinen kulttuureissa, BV kykeni saavuttamaan korkean solun transduktion.

pahanlaatuiset Eturauhasen Solut voidaan tehokkaasti tapettu BV vektorit nitroreduktaasi-pohjainen GDEPT Approach

jotta voidaan testata kykyä BV saavuttaa solu- kuolisi, käytimme geenin ohjaama entsyymi pro-lääkehoito (GDEPT) keskittyvän lähestymistavan bakteerin

nitroreduktaasi

(NTR), joka muuntaa pro- huumeiden CB1954: tä (5- (atsiridin-1-yyli) -2,4-dinitrobenzamide) tulee voimakas DNA silloitusainetta [41]. Siksi rakensimme BV, joissa ekspressiokasetin, jossa vahva nisäkkään CMV-promoottorin ajoi ilmentymisen mNTR-IRES-EGFP (BV- [CMV-NTR-EGFP]). Paneeli pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten eturauhasen solulinjat transdusoitiin BV- [CMV-NTR-EGFP], ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin antamisen jälkeen aihiolääke, CB1954: tä. Osuus elottomia soluja mitattuna MTS-määritys 48 tunnin kuluttua, oli merkittävästi suurempi pahanlaatuinen näytteissä korkea metastaattinen potentiaali (PC346C, PC3 ja LNCaP) verrattuna ei-pahanlaatuinen näytteistä (PNT1A ja PNT2C2) (P 0,001) (kuvio 4A). Varhaisvaiheen pahanlaatuinen näytettä (P4E6) putosi välialueella elinkelpoisuuden. Lisäksi solujen elinkykyä seuraava pro-lääkkeen antamisesta liittyi suoraan nopeuden BV transduktion (kuvio 4A). Tämä analyysi laajennettiin ensisijaisesti potilaasta peräisin epiteeli- soluviljelmiä. Kolme pahanlaatuiset ja kaksi ei-pahanlaatuinen näytteet transdusoitiin BV- [CMV-NTR-EGFP] ja käsiteltiin CB1954: tä. 30 h jälkeisen pro-lääkkeen annon, solukuolemaa näissä kulttuureissa vaihtelivat 10%: sta 50%, riippumatta tautinsa (kuva 4B).

(A) Prosenttia elottomia soluja 48 h post-transduktion BV- [CMV-NTR-EGFP] (MOI = 500) ja käsittely CB1954: tä paneelissa eturauhasen solulinjojen, esitetään suhteessa taajuuden transdusoidut solut ja oikaistu käsittelemättömiä kontrolleja. Pahanlaatuisten solulinjojen: PC346C (♦), PC3 (▴), LNCaP (▪), P4E6 (x); Non-pahanlaatuisten solulinjojen: PNT1A (+), PNT2C2 (•). Tilastot ovat t-testin välillä PC346C /PC-3 /LNCaP vs. PNT1A /PNT2C2. (B) Prosenttia elottomia soluja 30 h jälkeisen transduktion BV- [CMV-NTR-EGFP] ja käsittelemällä CB1954: tä yksittäisissä ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen näytteitä (n = 3 pahanlaatuiset ja n = 2 ei-pahanlaatuinen), oikaistu käsittelemättömiä kontrolleja.

keskustelu

Useita malleja taudin ovat osoittaneet, että baculovirus on suuria mahdollisuuksia uutena vektorin geeniterapiaa varten. Tässä olemme tutkineet sen käyttöä hoidettaessa ihmisen eturauhasen syöpä. BV kykeni tehokkaasti transdusoimaan erilaisia ​​eturauhasen solujen peräisin useista lähteistä, kuten

in vitro

ja

in vivo

malleissa. BV osoitti ero transduktio pahanlaatuisten verrattuna ei-pahanlaatuisia eturauhasen soluja, havainto, joka näytti riippumaton kasvu, koska solulinjoja kyseessä näytteillä samanlainen proliferatiivinen kapasiteetti (kaksinkertaistamalla kertaa: PNT2C2 (39 h), LNCaP (34 h) PC- 3 (30-34 h) ja PNT1a (30 h) [26], [42], [43]). Vaikka ensisijainen nisäkkään solun reseptorin BV kiinnitys on tuntematon, spekuloida, että pahanlaatuisuuteen liittyvän ylössäätely heparaanisulfaatin-modifioitu proteoglykaanien (HSPGs) kasvaimen solujen pinnalla [44], [45], joiden tiedetään olevan osallisena BV sitovia [16], [46], on merkitystä tämän tuloksen.