Krooninen sairaus

tiivistelmä

Levyepiteelisyöpä keuhkosyöpä (SCC) ja adenokarsinooman ovat

yleisin

histologisia alatyyppejä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), ja on perinteisesti hoidettu klinikalla yhtenä kokonaisuutena. Lisääntyvä todistusaineisto kuitenkin havainnollistaa biologisen monimuotoisuuden näiden kahden histologista alaryhmää keuhkosyöpää, ja tukee tarvetta parantaa ymmärrystämme molekyylitason perustan pidemmälle eri fenotyyppejä jos pyrimme kehittämään tarkempia ja yksilöllisiä täsmähoitoihin. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää microRNA (miRNA): sta riippuvainen transkription säätelyyn eroja SCC ja adenokarsinooma histologisia keuhkosyöpää alatyyppejä. Tässä työssä pariksi miRNA (667 miRNA by TaqMan Low Density Array (TLDA)) ja mRNA profilointi (Whole Genome 44 K array G112A, Agilent) suoritettiin Tuumorinäytteissä 44 NSCLC potilaiden. Yhdeksän miRNA ja 56 mRNA: t havaittiin ilmentyä erilailla SCC versus adenokarsinooma näytteitä. Yksitoista näistä 56 mRNA ennustettiin kohteina miRNA identifioitu eri ilmaistaan ​​näissä kahdessa histologisia olosuhteissa. Heistä 6 miRNA (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a ja miR-708) ja 9 kohdegeenien (CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1 ) todensi kvantitatiivinen PCR riippumattomalla kohortin 41 keuhkosyöpäpotilaita. Lisäksi käänteinen korrelaatio mRNA: t ja MikroRNA ilmentyvän myös validoitu. Nämä tulokset viittaavat siihen, miRNA-riippuvaisen transkription säätelyyn erot tärkeä rooli päätettäessä keskeisten tunnusmerkkejä NSCLC, ja voi tarjota uusia biomarkkereita yksilöllisten strategioiden.

Citation: Molina-Pinelo S, Gutiérrez G, pastori MD, Hergueta M, Moreno-Bueno G, García-Carbonero R, et al. (2014) MicroRNA riippuvaisen transkription säätelyyn in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (3): e90524. doi: 10,1371 /journal.pone.0090524

Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Ranska

vastaanotettu: 29., 2013 Hyväksytty: 03 helmikuu 2014; Julkaistu: 13 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Molina-Pinelo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: LPA on rahoittama Fondo de Investigación Sanitaria (PI081156, PI1102688 ja R12 /0036/0028), Proyecto de Excelencia de la Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Andalusian (P08-CVI-04090), ja Roche Fellowship 75 vuotta, Espanja. SMP rahoittaa Fondo de Investigación Sanitaria (CD1100153), Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cancer, Consejería de Salud, Servicio Andaluz de Salud (PI-0224/2009 ja PI-0046/2012), ja Fundación mutua Madrileña (2009 ). MDP rahoittaa Fondo de Investigación Sanitaria (CD0900148). RGC rahoittaa Fondo de Investigación Sanitaria (PI10 /02164). GMB rahoittaa SAF2010-20175 ja Madrid aluehallituksen (S2010 /BMD-2303). AC lab tukivat apurahoja Espanjan talousministeriö ja kilpailukyky, ISCIII (PI12 /00137, RTICC: RD12 /0036/0028), Consejería de Ciencia e Innovacion (CTS-6844) ja Consejería de Salud ja Andalusian (PI-0135-2010 ja PI-0306-2012). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on ensisijainen syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti, vastaten miljoona kuolemaa vuodessa [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus 80% kaikista keuhkotuumoreita, ja se sisältää useita histologisia alatyyppejä kuten suuri cell carcinoma (LCC), levyepiteelisyöpä (SCC), ja adenokarsinooma. SCC ja adenokarsinooma ovat

yleisimpiä

tyyppisiä NSCLC, osuus 25% ja 40% kaikista tapauksista, vastaavasti [2], [3]. SCC juontuu dysplastic monikerroksinen epiteelin

Keski

hengitysteihin, kun taas adenokarsinooma peräisin ensisijaisesti prekursorisoluista mono- tai kaksikerroksisen pintakudosta keuhkojen reuna [4].

NSCLC riippumatta histologinen alatyyppi on

on perinteisesti käsitelty klinikalla yhtenä homogeenisena kokonaisuutena. Kuitenkin yhä enemmän näyttöä valaisee suuren biologisen monimuotoisuuden tämä tauti, joka vähitellen johtaa tarkempia diagnostisia ja terapeuttisia strategioita riippuen histologiset alatyypin kyseessä. Itse edistysaskeleet kohdennettua keuhkosyövän hoidossa nyt vaativat tarkkaa luokittelua NSCLC [5]. Esimerkiksi EGFR mutaatiot ovat yleisempiä potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooma, ja Näiden mutaatioiden läsnäolo liittyy herkkyys EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorit [6]. Samoin ALK traslocations, esiintyy vain 4% adenokarsinoomat, ennustavat korkea herkkyys ALK-hoitojen, kuten crizotinib. Sen sijaan FGFR1 vahvistus on yleisesti havaittu SCC, ja nyt sitä pidetään mahdollisesti käytännöllisiä kohde kliinisissä tutkimuksissa FGFR estäjien [7]. Siksi suuremman tiedon molekyylitason mekanismeja synnyssä, etenemistä ja levittää eri alatyyppeihin NSCLC on välttämätöntä kehittää erityisiä diagnostisia menetelmiä ja suunnittelun sopivampi, yksilöllisiä ja tehokkaita hoitostrategioita.

suuri edistysaskeleet genomista teknologiat ovat tuottaneet monta ehdokasta biomarkkereita mahdollisten kliinisten arvoa NSCLC. MikroRNA, kuten transkription jälkeinen modulaattorit, ovat keskeisiä toimijoita säätelyssä monissa biologisissa prosesseissa. Dysregulaatio fysiologisten roolien vaikuttaa monia patologisia tiloja, mukaan lukien taudin alkamisen ja etenemisen syöpä. Tässä yhteydessä useat tutkimukset ovat arvioineet roolia miRNA allekirjoitusten syrjiä histologinen alatyyppi tai ennustaa uusiutuminen tai eloonjäämistä NSCLC potilaiden [8], [9], [10], [11], [12], [ ,,,0],13], [14], ja miRNA profilointi on ehdotettu erittäin luotettava strategia luokittelemiseksi NSCLCs [11], [15], [16]. Kuitenkin korkea monimutkaisuus transcriptome asetuksen mutkistaa täyttä ymmärrystä geenin säätelyverkostojen mukana näissä prosesseissa.

Tämän kysymyksen tavoitteena oli selvittää arvioida miRNA-riippuvaisen transkription säätelyyn eroja SCC ja adenokarsinooma histologisia keuhkosyöpä alatyyppejä. Tätä tarkoitusta miRNA ja mRNA pariksi ekspressioprofiileja analysoitiin NSCLC kasvain näytteissä, ja mahdolliset yhteisvaikutukset joukossa tutkittiin. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet ja validoitu osajoukko vapautetuilla miRNA ja kohde- geenejä, jotka pystyvät määrittelemään erillisiä molekyyli- piirteitä näiden kahden suuren histologisia alatyyppejä NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja kasvain näytteet

Potilaat mukana tässä tutkimuksessa oli oltava histologisesti varmennettu alkuvaiheessa SCC tai adenokarsinooma NSCLC. Kasvain näytteitä 85 potilaista prospektiivisesti kerättiin kirurgisen toimenpiteen aikana ja välittömästi snap-jäädytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Viereinen kuin kasvain keuhkojen kudosta kerättiin myös potilailta sisältyvät validointi kohortissa. Tutkimuksen protokolla hyväksyi institutionaalisten tarkastuslautakunta osallistuvien keskusten [Hospital Universitario Doce de Octubre (Madrid) ja Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla)] ja kaikki potilaat jos kirjallinen lupa ennen tutkimukseen osallistumista. Kliiniset ja patologinen tiedot poimittiin potilastiedot ja keskitetysti tarkistettu Tämän tutkimuksen tarkoituksena. Tutkimusjoukko jaettiin koulutus kohortin (N = 44), jota käytettiin profiilin kehittäminen ja itsenäinen validointi kohortin (N = 41). Pääpiirteet tutkimusväestöstä esitetään yhteenveto taulukoissa 1 ja 2.

Microarray geeniekspressioprofiilien

Microarray kokeet tehtiin käyttäen ihmisen koko genomin 44 K array G4112A (Agilent Technologies , Wilmington, DE). RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen) ja RNAesy Extraction Kit (Qiagen, Saksa), kuten on esitetty valmistajien. RNA leimattiin ja array hybridisoitiin käyttäen Low RNA Linear -monistustarvikesarjaa ja In situ -hybridisaatio Kit Plus (Agilent Technologies, Wilmington, DE) vastaavasti. Hybridisaation jälkeen ja pesun jälkeen levyt skannattiin käytettäessä Axon GenePix Scanner (Axon Instruments Inc., Union City, CA) ja analysoitiin käyttäen Feature Extraction Software 6.1.1 (Agilent Technologies, Wilmington, DE). RNA kasvainnäytteestä leimattiin Cy5-dUTP, ja hybridisoitiin vastaan ​​keuhkosyöpä viitekorin (leimattu Cy3-dUTP) koostuu ensisijaisen kasvainkudoksen potilaista, joilla on eri histologisia alatyyppejä keuhkosyöpään. Kontrollina kymmenen ylimääräistä hybridisaatiot suoritettiin käyttäen vastavuoroinen fluorokromi- merkintöjä.

havaitsemiseksi differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä histologinen alatyyppi, kahdentyyppisiä analyysi tehtiin kanssa MIDAW työkalulla [17]. Ensin t-testi suoritettiin vääriä löytö määrä (FDR) kontrolli arvioitiin käyttäen yksivaiheista Bonferroni menettely. Geenit, jotka läpäissyt t-testiä suodatin altistettiin toisen suodattimen. Vain geenit esittää log-keskiarvo-suhde pienempi arvo, joka -0,3 tai suurempi kuin 0,3 (joka vastaa 2-kertaista muutosta) valittiin ilmentyvät differentiaalisesti. Toiseksi erotteluanalyysi tunnistamiseksi joukon paras markkerigeeni suoritettiin perustuen Prediction analyysi Microarray (PAM) algoritmia. Microarray raakadataa taulukot on talletettu Gene Expression Omnibus tulonumerolla on GSE42998.

MicroRNA qRT-PCR-määritys

Yhteensä RNA, jotka sisältävät pieniä RNA uutettiin kasvain kudosnäytteistä by Mirvana miRNA eristyspakkausta (Ambion, Austin, TX, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA: n saanto määritettiin käyttäen Nanodrop ND-1000 spektrofotometrillä (Nanodrop Tech, DE, USA). Agilent 2100 Bioanalyzer käytettiin määrittämään määrä ja laatu on RNA-näytteet (Agilent, Palo Alto, CA). Aikuinen ihmisen miRNA ilmentymistä havaittiin ja kvantitoitiin käyttäen TaqMan Low Density Array (TLDA), joka perustuu Applied Biosystems ”7900 HT Micro Fluidic kortit (Applied Biosystems, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Human MicroRNA Card Set v2.0 array (Luettelonumero 4400238) on kahden kortin sisältävän sarjan 384 TaqMan MicroRNA Analyysit per kortti mahdollistaa tarkan kvantifiointia 667 ihmisen MikroRNA, kaikki luetteloitu miRBase tietokantaan. TLDAs suoritettiin kaksivaiheisessa prosessissa. Lyhyesti, ensimmäisen vaiheen aikana, 450 ng kokonais-RNA: olivat käänteistranskriptio käyttäen Megaplex RT alukkeita ja TaqMan miRNA käänteistranskriptio kit kokonaistilavuudessa 7,5 ui. 7,5 ui reaktiot inkuboitiin G-Storm Thermal Cycler (Gene Technologies, Essex, UK) 2 minuutin ajan 16 ° C: ssa, 1 min 42 ° C: ssa, ja 1 min 50 ° C: ssa 40 sykliä, pidetään 5 min 85 ° C: ssa, ja pidettiin sitten 4 ° C: ssa. Toisessa vaiheessa, 6 ui cDNA näytteestä ja TaqMan Universal PCR Master Mix lastattiin fill porttien TLDA -mikronestekorttia. Kortti sentrifugoitiin lyhyesti 1 min ajan 331 g jakaa näytteitä useita kaivoja liitetty täyttö- satamien ja suljetaan sitten, jotta well-to-hyvin saastumista. Reaktioita inkuboitiin 384-kuoppalevyllä 50 ° C: ssa 2 sekunnin ajan ja 94,5 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 30 s 97 ° C: ssa ja 1 min 59 ° C: ssa. Lopuksi korttien käsiteltiin ja analysoitiin koskevasta ABIPrism 7900 HT Sequence Detection System. TLDA raakadataa taulukot on talletettu Gene Expression Omnibus tulonumerolla of GSE43000. Expression of tavoite miRNA normalisoitiin ilmaus RNU48. Yksi ei-ihmisen miRNA, käytettiin kussakin kokeessa negatiivisena kontrollina. Cycle kynnys (Ct) arvot laskettiin käyttäen SDS-ohjelmiston v.2.3 automaattisen lähtötilanteen asetukset ja kynnys 0,2. Suhteellinen kvantitointi miRNA ilmentymisen laskettiin 2

-ΔCt menetelmää (Applied Biosystems käyttäjän bulletin no. 2 (P /N 4303859)). Vain miRNA havaittavissa vähintään 80% näytteistä otettiin huomioon arvioinnissa. Merkitys miRNA ilmaisun välisistä eroista kaksi histolofical alaryhmää (adenokarsinooma ja SCC) arvioitiin t-testin.

mRNA ja miRNA Expression Korrelaatio Assessment

arvioimaan mahdolliset yhdistyksen välillä ilmentyvät eri mRNA ja miRNA havaittu tutkimuksessamme olemme etsineet transkription tavoitteita tunnistettu miRNA kolmessa web tietokannoissa miRNA tavoite ennustus: Miranda [18], TargetScan vapauta 6.0 [19], ja miRWalk [20]. Otaksuttu kohdegeenien joka sovittaa ne todettiin säätelemätön meidän potilasryhmässä valittiin edelleen validointi qPCR.

validointi Microarray geeniekspressioprofiilien tekijänä qPCR

Yksitoista ilmentyvät eri geenien joukossa kaksi opiskeluolosuhteita (SCC ja adenokarsinooma NSCLC), tunnistettiin otaksuttu tavoitteet useista dIS-säännelty miRNA, valittiin edelleen validointi qPCR alkuperäisessä koulutuksessa kohortti ja itsenäisessä validointi kohortin. RNA käänteistranskriptio cDNA: ksi kanssa High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Lyhyesti, yksijuosteinen cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: ta 10 ul: n reaktiotilavuudessa, mukaan valmistajan protokollaa. Reaktiota inkuboitiin 25 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 120 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja inaktivointi 85 ° C: ssa 5 min. TaqMan Gene Expression Assay järjestelmän (Applied Biosystems) käytettiin kvantitoimiseksi transkriptiotasoja valitun geenin (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DMRT2, DSC3

ja

KRT6A ).

Kolme endogeenisen kontrolligeenin (

B2M

,

ACTB

ja

GAPDH

) ja yksi ei-template-ohjaus (NTC) ajettiin myös kunkin RNA näyte. Valitsimme

B2M

normalisoinnin eri geenejä kuin tämä geeni osoitti eniten suhteellisen vakiona ilmaisun eri kudosnäytteistä (tuloksia ei ole esitetty). Geenin ilmentyminen Kunkin geenin määritettiin käyttäen mediaani ekspressiotaso kolmesta teknisestä toistojen. PCR-reaktiot suoritettiin Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection järjestelmän 10 ui tilavuutta 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 1 min. Ct-arvoja saatiin SDS-ohjelmiston v.2.3 (Applied Biosystems). Suhteellinen kvantitointi mRNA ilmaisun laskettiin 2

-ΔCt menetelmä (Applied Biosystems käyttäjä tiedotteessa no. 2 (P /N 4303859)).

validointi miRNA TLDA Expression Profiles by qPCR

Expression yhdeksän valittujen miRNA (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a, miR-483-5p, miR-494, miR-601 ja miR-708) arvioitiin vuonna itsenäinen validointi kohortti erityiseen TaqMan MicroRNA määrityksissä mukaan valmistajan ohjeiden (Applied Biosystems). Lyhyesti, 2 ng /ui kokonais-RNA: ta muutettiin cDNA: ksi käänteistranskriptaasin reaktio, joka suoritettiin peräkkäin inkuboitu 16 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 42 ° C: ssa 30 min ja 85 ° C: ssa 5 min. PCR-reaktioseos (10 ui) sisälsi 0,66 ui RT tuotteen, 5 ui TaqMan 2X Universal PCR Master Mix, ja 0,5 ui sopivaa TaqMan MicroRNA Assay (20X), joka sisälsi alukkeet ja koetin miRNA kohteisiin (Applied Biosystems). Seosta aluksi inkuboitiin 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 60 sekunnin ajan. MicroRNA ilmentyminen kvantifioitiin vertaileva 2

-ΔΔCt menetelmä, normalisoi Ct arvot RNU48. Vuonna validointi kohortin kasvain ilmaisu arvot olivat lisäksi normalisoitiin ilmaisun arvoja pariksi viereisen normaalissa keuhkokudoksessa.

3′-UTR Reporter määritys miR Target Validation

Vahvistus miR-149-sitova 3′-UTR: ABCC3 ja miR-378 ja miR-422-sitoutumisen 3 ’UTR: TMEM45B. HEK 293-solut 80%: n konfluenssiin kotransfektoitiin kanssa lusiferaasireportteri plasmidit täydellinen 3’-UTR halutun geenin (kytkentälaite Genomics) yhdessä 100 nM kutakin miR-matkivat tai miRNA-ohjaus (Sigma). DharmaFECT Duo (Thermo Scientific) käytettiin transfektioon reagenssina

Opti-MEM

(Life Technologies). Luminenssi määritettiin 24 tuntia myöhemmin käyttäen LightSwitch määritysreagenssit (kytkinlaitteet Genomics) mukaan valmistajan ohjeiden. Knockdown arvioitiin laskemalla lusiferaasin signaalisuhteet tiettyjen miRNA /ei-kohdistuksen ohjaus, käyttämällä tyhjän toimittaja vektoria kontrollina epäspesifistä vaikutuksia. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. t -testi suoritettiin kaivojen useista kokeista, ja vertasimme matkivat transfektoidut solut matkivat käyttölukituksen geenin vektorin.

Diagnostic Performance Assessment of Selected Genes

Diagnostic suorituskyky parametrit laskettiin valittujen geenien 2×2-virhematriiseja. Luottamusväli näiden muuttujien laskettiin Pearsonin menetelmällä, joka perustuu F-jakauman. Kuten herkkyys, spesifisyys, positiivinen ennustearvo (PPV) ja negatiivinen ennustearvo (NPV) ovat tilastollisia toimenpiteitä suorituskykyä kaksijakoinen luokittelu testi, geenien ilmentyminen arvot muutettiin binary muuttujia mediaanin ilme arvo viitearvon (huipulla heikkoa ilmentymistä). Nämä parametrit laskettiin kullekin validoitu miRNA /kohde-mRNA pari. Samanaikainen esiintyminen korkea miRNA ilmaisun ja alhainen kohde-mRNA ilmaisun sopiva histologiseen ehto (SCC tai adenokarsinooma) pidettiin tosi positiivinen testi. Herkkyys tai tosi positiivisia toimenpiteitä osuus todellinen positiivisten jotka tunnistetaan oikein. Spesifisyys tai todellinen negatiivinen korko mittaa osuus negatiivit jotka tunnistetaan oikein. PPV kuvaa todennäköisyyttä, jolla ehto antanut positiivisen seulontatuloksen tulos analysoidaan väestön. NPV kuvaa todennäköisyyttä, jolla ei ole ehto antanut kielteisen seulontatestin tulos analysoidaan väestön.

Tulokset

Profiili Development

geeniekspressioprofiilien histologiset alatyypin.

Koko genomin ilmaisu taulukot tehtiin tuumorinäytteissä potilaiden koulutuksen kohortin, ja ilmaisun profiilit SCC ja adenokarsinooman kasvaintyypeissä verrattiin yhtä geeniä kerrallaan käyttäen yhden otoksen

t

– testata. Sen jälkeen yksivaiheinen Bonferroni säätö, 727 geeniä tunnistettiin ekspressoitua eri yli kaksinkertaisesti joko histologisia alatyypin suhteen viitekorin (taulukot A, B, C ja D taulukossa S1). Näistä 727 geenit, viisi oli säädelty ja 195 alassäädetty potilailla, joilla adenokarsinooma, ja 13 säädelty ja 516 alassäädetty potilailla, joilla SCC.

Lisäksi toinen riippumaton arviointi mRNA differentiaalikaavojen suoritettiin erotteluanalyysi microarray data-analyysi minimoimaan väärät positiiviset tulokset. Ennustaminen analyysi Microarray (PAM) algoritmia tunnistettiin 61 geeniä, jotka määritellään molekyyli- allekirjoituksen kykenee erottamaan adenokarsinooma mistä SCC näytteistä (kuvio 1). Näistä 61 geenit, 56 Hyväksytty vapautettu geenien löytämät aikaisemmin suoritettu yhden otoksen t-testi, ja sen vuoksi valittiin lisäanalyysiä ja validointi.

ennustaminen analyysi Microarray algoritmin tunnistettu 61 geenejä, jotka määritellään molekyyli- allekirjoituksen jokaiseen histologista alatyypin. Modulaattorit ”Dendrogrammi edustaa valvomattoman hierarkkinen klusterointi analyysi 19 adenokarsinooma ja 25 SCC perustuu niiden geeniekspressioprofiili. Lämpö kartta oli väri koodataan punainen ylössäätöä ja vihreä alassäätöä peräisin keuhkosyöpään viitekorin. Valitse

aateliin kartan,

värit vastaavat geeniekspressioprofiilien SCC näytteistä (sininen) verrattuna adenokarsinooma näytettä (punainen).

MicroRNA mentymisprofiili histologiset alatyypin.

MikroRNA TLDA taulukot tehtiin tuumorinäytteissä potilaiden koulutuksen kohortissa. Yhdeksän miRNA (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a, miR-483-5p, miR-494, miR-601 ja miR-708) havaittiin ilmentyä erilailla välillä SCC ja adenokarsinooma histologinen alatyyppi, jonka FDR korjattu kynnys 0,05. Kahdeksan näistä 9 miRNA oli yli-ilmentynyt SCC verrattuna adenokarsinooma, ja yksi (miR-375) oli yli-ilmentynyt adenokarsinooma verrattuna SCC (taulukko 3).

MicroRNA kohde ennustaminen.

Yksitoista 56 geenien (20%) todettiin vapautettu kasvaimen tyypin tutkimuksessamme todettiin olevan oletetun tavoitteet ainakin yhden 9 miRNA myös identifioitu ekspressoituu differentiaalisesti tutkimuksessamme mukaisessa populaatiossa histologinen alatyyppi (SCC vs. adenokarsinooma). Jotta 8 yliekspressoitujen miRNA SCC, 8 mRNA (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B

ja

MUC1

) ennustettiin kohteiksi useita algoritmeja. Nämä geenit havaittiin säädellä vähentävästi SCC verrattuna adenokarsinooma tutkimuksessamme (taulukko 2). Kolme näistä 8 geenien (

CEACAM6, MLPH

ja

TMEM45B) B ennustettiin tavoitteet useamman kuin yhden näistä miRNA (kuva 2). Kuten taulukosta 2, kolme geeniä (

DSC3, KRT6A

ja

DMRT2

) ennustettiin kohteina miR-375, Mirna yläreguloituja adenokarsinooma, ja nämä geenit olivat johdonmukaisesti alassäädetty tässä histologisia alatyypin.

kaavio osoittaa transkriptionaalista tavoitteet eri ilmaistu miRNA SCC ja adenokarsinooman kasvain tyypit käytetään kolmea web tietokantoja miRNA kohde ennustuksen (Miranda TargetScan ja miRWalk). Oletuksena väritys käytetään edustamaan ekspressiotaso on punainen /sininen (punainen yli-ilmentyminen mRNA: iden tai miRNA SCC versus adenokarsinooma ja sininen alas-ilmentymisen mRNA: iden tai miRNA SCC versus adenokarsinooma).

nuolet

osoittavat mRNA tukahduttamistoimet

kytketty miRNA

. Neliöt edustavat vapautettu mRNA: t ja suorakaide edustavat ilmennetty eri miRNA keuhkojen adenokarsinooma ja SCC.

Profiili Validation

validointi geenin differentiaalikaavojen kvantitatiivisen RT-PCR.

yksitoista vapautettu geenit (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DSC3, DMRT2

ja

KRT6A),

tunnistettiin otaksutun kohdegeenien vapautetuilla miRNA tutkimuksessamme , valittiin sitten edelleen validointi rtPCR sekä koulutukseen kohortti ja riippumattomalla kohortin potilaista.

koulutus kohortin 9 11 geenien testattu varmistettiin ekspressoitua eri histologiset alatyypin kvantitatiivisen PCR: llä (kuvio 3).

CEACAM5

,

CLDN3, CGN, ABCC3, MUC1, ACSL5

,

MLPH

ja

TMEM45B

olivat merkittävästi säädellä vähentävästi SCC, ja

KRT6A

merkittävästi säädellä vähentävästi adenokarsinooman.

validoida geenien tunnistettu differentiaalisesti ilmaisema kasvainhistologiaa on microarray data, suhteelliset ekspressiotasot mRNA kvantitoitiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen ACt menetelmää by

B2M

kuin taloudenhoito geeni. Tontit osoittavat mediaani ACt arvot validoitu geenien potilailla, joilla adenokarsinooma verrattuna SCC. Tiedot saatu RT-qPCR esitetään log

2 2

-ΔCt arvoja.

P

arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

perusteella saatujen tulosten koulutukseen kohortin 9 mRNA ja 9 miRNA valittiin edelleen validointi Taqman-RT-qPCR in kasvain ja sovitettu normaalia kudosta riippumattoman kohortin keuhkosyöpäpotilaiden. Tässä kohortissa, ilmaus kuviot mRNA olivat yhdenmukaisia ​​määrällisesti koulutus kohortissa. Expression kuviot histologiset alatyypin kaikista 9 mRNA: iden testattu muistuttivat havaittiin koulutus kohortin ja eroista kesken alaryhmät olivat kaikki tilastollisesti merkitsevä (kuvio 4). Mitä tulee 9 miRNA, viisi (miR-149, miR-205, miR-378, miR-422a ja miR-708) havaittiin olevan huomattavasti-ilmaistuna SCC ja miR-375 oli merkittävästi yli-ilmentynyt adenokarsinooma (kuvio 5).

Expression yhdeksän mRNA: iden validoitu reaaliaikaisella PCR riippumattomalla kohortin NSCLC potilaiden. mRNA: n ilmentymisen tasot määritettiin tuumorin näytteiden ja pariksi normaalin keuhkokudoksen keuhkosyöpään potilaiden ja suhteellinen ekspressio histologiset alatyypin arvioitiin. Mediaani ΔΔCt arvot määritettiin vuonna validoitu geenien potilailla, joilla adenokarsinooma ja SCC. Tiedot saatu RT-qPCR esitetään 2

-ΔΔCt arvoja.

P

arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Expression of vapautetuilla miRNA arvioitiin validointi kohortissa. MicroRNA ilmentymisen tasot määritettiin kasvaimen ja pariksi normaalissa keuhkokudoksessa keuhkosyöpäpotilaiden ja suhteellinen ekspressio histologiset alatyypin arvioitiin. Mediaani ΔΔCt arvot määritettiin yhdeksässä miRNA potilailla, joilla adenokarsinooma verrattuna SCC. Tiedot saatu RT-qPCR esitetään 2

-ΔΔCt arvoja.

P

arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

korrelaatio miRNA ja mRNA: n ilmentymisen.

Tutkia toiminnallista merkitystä miRNA säätelyssä spesifiset mRNA tunnistettiin mahdollisina biomarkkereita, analysoimme validoinnissa kohortin korrelaatio miRNA ja ennakoi maalin-mRNA: iden ilmentymistä kullekin potilaalle (kuva 6). Käänteinen korrelaatio ei havaittu

ABCC3, MUC1

ja

CEACAM6

ja miR-149 ekspressiotasot. Lisäksi korkeampi

CEACAM6

liittyi alhaisempi miR-205 ja miR-708, on korrelaatio merkittäviä miR-708 (r = -0362; p = 0,030).

ACSL5

ja

KRT6A

oli tilastollisesti merkitsevä korrelaatio miR-205 (r = -0,475, p = 0,003) ja miR-375 (r = -0,311, p = 0.065), vastaavasti .

Kun kyseessä

TMEM45

B merkittäviä korrelaatioita havaittiin miR-378 ja miR-422a (r =

–

0,394, p = 0,016 ja r =

–

0,413, p = 0,015, tässä järjestyksessä).

Nämä tulokset viittaavat mahdolliseen rooliin miRNA säätelyssä näiden geenien. Sen jälkeen, jotkut näistä tavoitteista testattiin käyttämällä lusiferaasireportterigeenianalyysissä. Olemme saavuttaneet, että yli-ilmentyminen miR-149 HEK 293-solut alas säätelee lusiferaasiaktiivisuus reportteri-konstrukti, joka sisältää ABCC3 3-UTR (kuvio 7). Tämä osoittaa, että miR-149 sitoutuu suoraan tämän tavoitteen RNA ja estää niiden ilmaisua. Lisäksi, yliekspressio miR-378 ja miR-422a estävät merkittävästi TMEM45B ilmentymistä (kuvio 7).

Expression of 6 validoitu miRNA ja että niiden oletetun kohdegeenien mitattiin kunkin potilaan validointi kohortissa. Merkitys käänteistä yhdistyksen kunkin kyseessä miRNA /mRNA parit arvioitiin Spearmanin korrelaatiokerrointa. P-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. A) väliset suhteet

ABCC3

,

MUC1

ja

CEACAM6

kanssa miR-149. B) väliset suhteet

ACSL5

ja

CEACAM6

kanssa miR-205. C) suhde

TMEM45B

ja miR-378. D) välinen suhde

TMEM45B

ja miR-422a. E) suhde

CEACAM6

ja miR-7018. F) välinen suhde

KRT6A

ja miR-miR-175.

HEK 293-solut transfektoitiin lusiferaasireportteri- vektori, joka sisältää 3 ’UTR-alueen ABCC3 ja TMEM45B. Reportterivektoreita kotransfektoitiin kanssa miRN matkivat tai ohjaus miRN matkivat. Seuraavat 24 h inkubaation, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. * P 0,05 ** p 0.001

t

-testissä.

Diagnostic Performance of Selected Genes erottamaan SCC alkaen Adenokarsinooma Histologinen NSCLC Alatyypit

Lopuksi , arvioimme spesifisyys ja herkkyys näiden kuuden validoitu miRNA yhdistettynä niiden ennustettu mRNA: t erottamaan SCC ja adenokarsinooma (kuvio 8). Paras suorituskyky havaittiin

KRT6A,

tavoitteeksi asetettiin miR-375, jossa herkkyys ja spesifisyys arvot 94,1% ja 88,9%, tässä järjestyksessä. Hyvä diagnostinen suorituskyky havaittiin myös

CEACAM6, ACSL5 y MLPH,

kohteina miR-205, jossa on alempi spesifisyys arvojen (71,4-76,2%), mutta suurempi herkkyys (100%). Lopuksi

TMEMB45B,

koska kohteena miR-378, osoitti herkkyys 87,5% ja spesifisyys 57,7%. Toinen miRNA /mRNA parit paljasti pienempi herkkyys ja arvot, vaikka ne olivat yli 75% ja 50% kaikissa tapauksissa (taulukko S2).

Plot osoittaa spesifisyyttä ja herkkyyttä validoitu miRNA yhdistettynä ennustettu mRNA: t erottamaan SCC ja adenokarsinooma. Värit edustavat alassäädetty mRNA kuudesta vapautuneilla miRNA SCC tai adenokarsinooman.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa analysoitiin mRNA ja miRNA ilmaisun allekirjoitukset potilailla, joilla on eri alatyyppejä NSCLC . Tämä antoi meille mahdollisuuden rakentaa vankka transkription profiilia keuhkoadenokarsinooma ja SCC. Tuloksemme paitsi osoittaa, että kyseessä on mRNA ja /tai miRNA ilmaisu kuvioita, jotka pystyvät erottamaan SCC ja adenokarsinooma, mutta myös, että muuttunutta geeniekspressiota allekirjoitus johtuu osittain erityisiä miRNA vapauttamisen.

Ensimmäinen, me analysoitiin kaksi lähestymistapaa koko genomista ilmaisun microarray data minimoimiseksi vääriä positiivisia. Tutkimme ero geeniekspressiotasot syrjiä microarray tietojen analysointi ja yhden näytteen

t

-testi. Viisikymmentäkuusi geenien havaittiin merkittävästi vapautettu sekä analyysejä, ja sen vuoksi edelleen arviointia varten valittua ja validointi. Merkillistä, useat niistä oli aiemmin sekaantuneet asiaan biologisissa prosesseissa (mukaan geeni ontologian) keuhkosyövän hoidossa. Esimerkiksi jotkut geenit

KRT

perhe, jotka säädellä vähentävästi adenokarsinooma, ovat mukana useita kriittisiä solujen toimintoja, kuten solujen vaeltamiseen, kasvua ja lisääntymistä [21]. Toiseksi miRNA profilointi tunnistettu 9 miRNA jotka ilmentyvät eri joukossa kaksi histologinen alatyyppi NSCLC tutkittu. Kuusi heistä (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a ja miR-708) on edelleen validoitu riippumattomalla kohortin NSCLC potilaiden biomarkkereina pystyy erottamaan adenokarsinooma ja SCC. Sen arvioimiseksi, onko nämä miRNA voisi olla suoraan sääntelevät joidenkin 56 vapautetuilla geenit tunnistettu, useat yleisesti käytetyt algoritmeja käytettiin. Yksitoista näistä 56-geenien (20%) oli ennustetaan siten oletetun tavoitteet ainakin yhden kuudesta miRNA havaittu ilmentyä erilailla SCC verrattuna adenokarsinooma.