Krooninen sairaus

tiivistelmä

Poikkeava ilmentyminen miR-196a on usein raportoitu eri syöpiä, kuten haimasyöpä. Kuitenkin sen tehtävä haimasyövän ei ole täysin selvitetty. Tässä, tutkimme ekspressiomalli ja biologisen roolin miR-196a haimasyövän solulinjoissa, sekä sen vuorovaikutus etäpesäke liittyvän geenin, tumatekijä-kappa-B-estäjä alfa (NFKBIA). Olemme osoittaneet, että miR-196a on säädelty ihmisen haimasyövän solulinjoissa verrattuna kuolemattomaksi haimatiehyen epiteelisoluihin avulla MikroRNA microarray ja qRT-PCR. Lisäksi alas-säätely miR-196a in PANC-1 tukahdutetaan sen proliferaatio ja migraatio kasvun kanssa G

0 /G

1 siirtyminen ja vähentynyt ilmentyminen sykliini D1 ja CDK4 /6. Samaan aikaan kohonneen ekspression E-kadheriinin ja vähentynyttä ilmentymistä N-kadheriinin ja vimentiinista havaittiin myös. Olemme tunnistaneet uuden miR-196a tavoite, NFKBIA, ja alas-säätely miR-196a tehostettu ilmentyminen NFKBIA proteiinia. Lusiferaasianalyysissä vahvisti, että NFKBIA oli välitön ja erityinen tavoite miR-196a. Hiljentäminen NFKBIA in PANC-1-soluissa parantanut proliferaatio ja migraatio. Yhdessä meidän havainnot osoittavat, että miR-196a ilmenee vahvasti haimasyövän solulinjoissa, ja se voi olla ratkaiseva rooli haimasyövän proliferaatio ja migraatio, mahdollisesti sen loppupään tavoite, NFKBIA. Siten miR-196a voi toimia mahdollisena terapeuttisena kohteena haimasyöpä.

Citation: Huang F, Tang J, Zhuang X, Zhuang Y, Cheng W, Chen W, et ai. (2014) MiR-196a Edistää Haimasyöpä tapahtuvaa etenemistä Targeting Nuclear Factor kappa-B-estäjä Alpha. PLoS ONE 9 (2): e87897. doi: 10,1371 /journal.pone.0087897

Editor: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. elokuuta, 2013 Hyväksytty: 03 tammikuu 2014; Julkaistu 4 helmikuuta 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (30973505), tieteen ja teknologian säätiö Guangdong (2009B030801005), säätiö Guangzhou Science and Technology Bureau (2009Y-C011-1) ja säätiön ministeriön Education of China (20120171110075) H. Yao. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on aggressiivinen maligniteetti kanssa pahimpia tulosten kesken kaikista syövistä. Kaikkia vaiheita yhdistetään, 5-vuoden suhteellinen pysyvyys on vain 5% [1]. Korkea kuolleisuus haimasyövän voi johtua osittain kyvystä haimasyöpäsoluissa hankkia invasiivisia ominaisuuksia alkuvaiheissa syövän. Siten on todennäköistä, että jopa vaiheessa näennäisesti paikallinen tauti mikroetäpesäkkeet saattaa olla jo läsnä kaukaisilla elinkohdissa [2]. Tavanomainen kemoterapia harvoin parantava etäpesäkkeitä haimasyövän. Hoito strategioita, jotka kohdistuvat erityisesti ja estää etäpesäkkeiden voisi siten olla mahdollista merkittävästi parantaa ennustetta tämän synkkä taudin.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että MikroRNA (miRNA) on ratkaiseva rooli sääntelyn erilaisten biologisten ja patologisten prosesseja, mukaan lukien metastaasi [3]. Nämä pienet, ei-koodaavilla molekyylit saavat aikaan sääteleviä vaikutuksia sitoutumalla 3′-alueen kohde-mRNA, joka aiheuttaa joko mRNA: n hajoaminen tai estämiseksi niiden käännös funktionaalisia proteiineja. Ilmaus miRNA on tunnustettu erottamaton osa monien normaalien biologisten prosessien, joihin liittyy solujen lisääntymistä, erilaistumista, apoptoosia, ja kestää rasitusta [4]. Vielä tärkeämpää on, se on äskettäin esitetty, että poikkeava säätelyä tai alisäätely erityisten miRNA ja niiden tavoitteet eri syöpätyyppien liittyy kehittymistä ja etenemistä syövän [5]. Poikkeavaan ekspressioon joidenkin miRNA on osoitettu olevan osallisena haimasyövän karsinogeneesissä [6], [7]. Lisäksi miR-196a on havaittu yliekspressoituvan haimasyövän, ja korreloi merkitsevästi huono pysyvyys [8]. Kuitenkin mekanismi sen toiminta haimasyövän jää epäselväksi.

Nukleaaritekijä KB (NF-KB) on merkittävä rooli immuunivasteen säätelyyn [9] ja tulehdus [10]. Se koostuu perheen transkriptiotekijöiden osallisena säätelyssä monenlaisia ​​biologisen prosessin, ja kasvava todisteet osoittivat osallistumisensa kasvainten synnyssä [11] – [14]. Se on yhdistetty moniin tunnusmerkkejä syövän kehittymisen ja etenemisen, mukaan lukien kasvutekijän riippumaton proliferaatio [15], apoptoosin estämisestä [16], ja kudosten ja metastaasit [17]. Myös uusien todisteet viittaavat siihen, että NF-KB: n aktivaatio on tärkeä rooli etenemisen haimasyövän [11], [18] – [20]. NF-KB: n herkistää ihmisen haimasyövän soluja apoptoosin [21]. NFKBIA, joka tunnetaan myös nimellä IκBα, on yksi perheen jäsenten solun proteiineja, jotka estävät NF-KB-transkriptiotekijän. NFKBIA estää NF-KB peittämällä ydinvoiman lokalisointi signaaleja (NLS) NF-KB-proteiinin ja sen pitäminen eristettyä aktiivisessa tilassa sytoplasmassa [22]. Lisäksi, NFKBIA estää kyky NF-KB: n sitoutumisen DNA: ta, joka on välttämätön toiminto NF-KB: n [23]. On osoitettu, että on olemassa rikastuminen tietyn yhden nukleotidin polymorfismien ja haplotyyppien NFKBIA Hodgkinin lymfooma, peräsuolen syöpä ja multippeli myelooma, viittaa siihen, että NFKBIA voi olla tuumorisuppressori [24] – [26].

tässä tutkimuksessa osoitamme, että miR-196a yliekspressoituu haimasyövän solulinjoissa ja ovat tutkineet vaikutusta alas-säätely miR-196a on haimasyöpä solulinja, PANC-1. Olemme selvitetty, että NFKBIA on tavoite miR196a, ja miR-196a on tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen haimasyövän todennäköisesti kohdistamalla NFKBIA.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

neljä ihmisen haimasyövän solulinjoissa PANC-1, Capan-2, BxPC-3 ja SW1990 ostettiin Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, PR Kiina), ja kuolemattomaksi haimatiehyen epiteelisolulinja H6C7 oli ystävällisesti tarjoamia Prof. Ming-äänen Tsao (Ontario Cancer Institute, Toronto yliopisto, Kanada), ja inkuboitiin tässä tutkimuksessa raportoitu aiemmin [27]. Neljä ihmisen haimasyövän solulinjoissa (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, PR China) viljeltiin DMEM (Gibco, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS, HyClone, Logan, UT), 100 yhdistää /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä. H6C7, saatu Prof.Ming-ääni Tsao Ontario Cancer Institute (Ontario, Kanada), viljeltiin 37 ° C: ssa keratinosyyttien seerumivapaassa väliaineessa (K-SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 100 u /ml penisilliiniä, 100 u /ml streptomysiiniä, 0,2 ng /ml rekombinanttia endoteelin kasvutekijä (rEGF) ja 20 ng /ml naudan aivolisäkeuutetta (BPE). Kaikissa kokeissa soluja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä.

GeneChip Microarray of miRNA

miRNA geeniekspressioprofiili neljä ihmisen haimasyövän solulinjojen ja H6C7 määritettiin GeneChip mikrosiruanalyysillä (Affymetrix, Santa Clare, CA, USA). CDNA: n synteesi, hybridisaatio-sirut, ja pesut suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. GeneChips skannattiin 3 mm tiheys kanssa GeneArray Scanner (Affymetrix). Kuvat tarkastettiin sen varmistamiseksi, että kaikki sirut oli matala tausta, mutta kirkas hybridisaatiosignaaleista. Mean fluoresenssi signaalin intensiteetin kunkin koetin oli neljännekseen normalisoitu. Keskiarvo kolmesta keskiarvosta signaalit kaikille miRNA koetin oli normalisoitu varten lisätty kontrollioligonukleotidin ja oli log

2 muuttunut. Kukin miRNA koetin arvioitiin ilmentämiseen perustuu Wilcoxonin Rank-Sum testi miRNA koetinsarjaa signaaleja verrattuna jakeluun signaaleja taustasta. Opiskelijan

t

-testi käytettiin määrittämään merkittäviä eroja miRNA ilmaisun välillä ihmisen haimasyövän solulinjaa ja kuolemattomaksi haimatiehyen epiteelisolulinja H6C7, jossa

P

0,05 tulkittiin merkittävä.

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR (qRT-PCR) B

ekspression analysoimiseksi miR-196a, qRT-PCR suoritettiin neljä ihmisen haimasyövän solulinjoissa (PANC- 1, Capan-2, BxPC-3 ja SW1990) ja kuolemattomaksi haimatiehyen epiteelisolujen linja H6C7. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen TRIZOL (Invitrogen, CA, USA) valmistajan ohjeita. U6 validoitiin kuin normalisoija. Kokonais-RNA käänteisesti transkriptoitiin käyttäen vastaavaa RT Primer ja TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-aluke kypsää miR-196a suunniteltiin seuraavat: miR-196a mielessä 5′-GCT CTG GCT CCG TGT CTT CAC TCC C-3 ’, kääntää, 5’-TGC CCC AGC ACA GCC CCC GTC CCT C-3 ”. Ekspression miR-196 ja sen ohjaus U6 todettiin käyttäen TaqMan-miRNA määritysjärjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

transfektio PANC-1-solujen

Kaksi paria synteettinen, kemiallisesti muunnetut lyhyitä yksi- tai kaksijuosteisia RNA oligonukleotidit: anti-miR-196a ja asianmukaisen negatiivinen kontrolli (anti-miR-NC), miR-196a micmics ja asianmukaisen negatiivinen kontrolli (miR-NC) ostettiin GenePharma (Shanghai, PR China). NFKBIA-siRNA (si-NFKBIA) ja sen asianmukainen negatiivinen kontrolli (si-NC) ostettiin GeneChem (Shanghai, P. R. Kiina). Transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transfektiota 2 x 10

5 PANC-1-solut ympättiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevylle ja inkuboitiin yön yli. Ilmaisu kvantitoitiin 24 tuntia transfektion jälkeen.

Soluproliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio havaittiin WST-8-menetelmällä. Anti-miR-196atransfected PANC-1-soluja ja anti-miR-NCtransfected PANC-1-solut kerättiin ja hajotettiin yksittäisten solujen suspensioksi, 1,2 x 10

3-solut ympättiin 96-kuoppalevylle kuoppaa kohti. Myös si-NFKBIA transfektoitiin PANC-1-soluissa, si-NC transfektoitiin PANC-1-soluissa, si-NFKBIA + anti-miR-196 transfektoitiin PANC-1-soluissa ja SI-NC + anti-NC PANC-1-solut kerättiin ja hajotettiin osaksi yksittäisten solujen suspensioksi, 2 x 10

3-solut ympättiin 96-kuoppalevylle kuoppaa kohti. Soluproliferaatiota tutkittiin eri aikoina (24 h, 48 h, 72 h). WST-8-reagenssia (10 ui per kuoppa) Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani) lisättiin, inkuboitiin 4 h, ja absorbanssi määritettiin kuopan spektrofotometrillä (BioTek, VT, USA) 450 nm: ssä ja 630 nm.

Cell migraatiokokeessa

Solun migraatiokokeessa suoritettiin käyttäen TranswellTM kammio (Corning, New York, USA), jonka huokoskoko on 8,0 um. 72 h transfektion jälkeen, yhteensä 10

5 solut suspensoitiin uudelleen seerumittomassa alustassa ja kylvetään ylempään osastoon kammion. Alempi osasto oli ladattu täyteen elatusaineet, joka sisälsi 10% FBS: ää. Oltuaan inkuboitiin 37 ° C: ssa 8 tunnin ajan, kammio on vahvistettu, 0,1% kristalliviolettia-värjätään ja lasketaan.

Virtaussytometrianalyysi

havaitsemiseksi vaikutuksen säätely alaspäin miR -196a solusyklin ja apoptoosin, virtaussytometria-analyysi suoritettiin. Solusyklin analyysi, anti-miR-196a-transfektoiduissa PANC-1cells kerättiin eri aikoina (24 h, 48 h, 72 h) transfektion jälkeen, ja ne trypsinoitiin ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla 18 h 4 ° C. Kiinnitetyt solut värjättiin 50 mg /ml propidiumjodidilla (BD Pharmingen, San Diego, CA), ja 50 mg /ml RNaasi ja sitten analysoitiin käyttäen virtaussytometriä (BD Pharmingen, San Diego, CA). Apoptoosin analyysi, anti-miR-196a-transfektoiduissa PANC-1cells kerättiin myös eri aikoina (24 h, 48 h, 72 h) transfektion jälkeen, värjättiin FITC-anneksiini V ja propidiumjodidilla (PI) ja sitten analysoitiin käyttämällä -virtaussytometrillä (BD Pharmingen, San Diego, CA). Anti-miR-NC-transfektoiduissa PANC-1cells tehtiin kontrollina.

Immunofluoresenssianalyysi

tutkimiseksi fenotyypin muutokset PANC-1 transfektoitu anti-miR-196a, immunofluoresenssianalyysillä suoritettiin . Havainnointi morfologia Blank, anti-miR-NC ja anti-miR-196a ryhmä suoritti mikroskoopilla. Ilmaisu E-kadheriinin ja vimentiinista, merkkiaineita EMT, havaittiin immunofluoresenssilla 3

rd päivä transfektion jälkeen. Solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydin 15 minuuttia jäissä. Sen jälkeen, kun kaksi fosfaattipuskuroitua liuosta (PBS) pesun jälkeen solut peitettiin 0,5% Triton 100 15 minuuttia jäissä, sitten pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 5% rasvatonta maitoa 1 tunti huoneenlämpötilassa estämään epäspesifisen sitoutumisen IgG. Soluja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen hiiren anti-ihmis-E-kadheriinin (Abcam, MA, USA) tai vimentiinista (Abcam) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin sitten PBS: llä ja inkuboitiin fluorokromilla konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta huoneen lämpötilassa 30 min pimeässä kammiossa. Solut pestiin PBS: llä ja peitetään DAPI värjäämiseksi ytimiä. Otimme satunnainen valokuvia 200-kertainen suurennus.

Western blot-analyysi

pitoisuus kokonaisproteiinia uutettu Blank, anti-miR-NC ja anti-miR-196a ryhmä määritettiin kanssa BCA Protein Assay kit (Pierce, USA). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-kalvoille (Millipore, Bedford, MA, USA) käyttäen mini trans-blot. Hiiren anti-ihmisen sykliini D1 (Abcam), CDK4 (Abcam), CDK6 (Abcam), E-kadheriinin (Abcam), vimentiinistä (Abcam), kanin anti-humaani-N-kadheriinin (Cell Signaling Technology, MA, USA), NFKBIA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), käytettiin ekspression havaitsemiseksi homologisia proteiineja. GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) käytettiin sisäisenä kontrollina. Elektrokemoluminesenssi suoritettiin Chemilmager 5500 kuvantamisjärjestelmä (San Leandro, CA, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

3’UTR lusiferaasireportterigeenin määritys

Ihmisen NFKBIA 3’UTR lusiferaasireportterilla rakentaa (NFKBIA-3’UTR WT) tuotettiin kloonaamalla NFKBIA mRNA 3’UTR sekvenssin alavirtaan pMIR-Report konstruktio (maa, Guangzhou, PR China). MIR-196a kohdesivustoa-mutaatio NFKBIA 3’UTR lusiferaasireportterista (NFKBIA-3’UTR mutaatio) konstruktio käyttämällä suoraan paikan päällä mutageneesillä mutaatio alukkeita, jotka mutatoida miR-196a sitoutumiskohta ACTACCT ja ATCGATC. PANC-1-solut kotransfektoitiin miR-196 plasmidia ja villin tyypin tai mutantti NFKBIA 3’UTR lusiferaasireportterista konstruktio ja lusiferaasin aktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-Glo Luciferase. Data normalisoitiin jakamalla Firefly lusiferaasiaktiivisuus Renillan lusiferaasin.

Tilastollinen

Tulokset esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD), laskettu käyttäen SPSS-ohjelmiston, versio 13,0. Välineet verrattiin sitten käyttämällä yksisuuntaista ANOVA LSD ryhmissä tai opiskelija

t

testiä ryhmien välillä.

P

0,05 osoitti tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

MiR-196a yliekspressoituu haimasyövän solulinjoissa

tutkia roolia asennuspalveli- 196a haimasyövän kehittämiseen, ensinnäkin tutkimme ilmaus miR-196a neljässä haimasyövän solulinjoissa (Capan-2, BxPC-3, PANC-1 ja SW1990) ja kuolemattomaksi haimatiehyen epiteelisolulinja H6C7 mukaan miRNA microarray ja reaali aika RT-PCR. Hierarkkinen klusteri paljasti, että miR-196a ilmaisuja haimasyövän solulinjoissa oli paljon korkeampi kuin H6C7 (kuvio 1A). Samaan aikaan tulos reaaliaikaisen RT-PCR oli mukaisesti microarray. Expression of miR-196a oli (706,4 ± 9,4) kertainen in PANC-1-solut, (310,1 ± 7,5) kertainen in SW1990-soluissa, (7,6 ± 1,1) kertainen in BxPC-3-soluissa ja (204,9 ± 4,8) kertainen in Capan-2-soluissa, verrattuna H6C7 (

P

0,05) (kuvio 1 B). On hiljaista, että miR-196a voi olla rooli inhimillisen haimasyövän.

(A) hierarkinen ryhmittely analyysi miRNA, jotka olivat joko differentiaalisesti ylä- tai vaimentua haimasyövän solulinjoissa ja H6C7. MiRNA että sijoitettiin ero arvo on 1 tai suurempi luokiteltiin differentiaalisesti voimistunut, ja miRNA sijoittuneita arvo -1 tai vähemmän luokiteltiin differentiaalisesti vaimentua. Mittakaavapalkki poikki pohjaan heatmap kuvaa SD muutos keskiarvosta. MiR-196a: n ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi haimasyövän solulinjoissa microarray. (B) validointi miR-196a ekspressiotaso haimasyövän solulinjoissa qRT-PCR. MiR-196a merkittävästi yläreguloituja haimasyövän solulinjoissa. Expression of miR-196a oli (706,4 ± 9,4) kertainen in PANC-1-solut, (310,1 ± 7,5) kertainen in SW1990-soluissa, (7,6 ± 1,1) kertainen in BxPC-3-soluissa ja (204,9 ± 4,8) kertainen in Capan-2-soluissa, verrattuna H6C7 (*,

P

0,05).

vaikutus miR-196a proliferaatioon ja apoptoosiin PANC-1-soluissa

Kuten kuviossa 1 on esitetty, miR-196a: n ilmentyminen oli paljon suurempi haimasyövän solulinjoissa verrattuna immortalisoidut haimatiehyen epiteelisolulinja, erityisesti PANC-1. Arvioidaan tarkemmin biologisen roolin miR-196a haimasyövän, valitsimme PANC-1 seuraamisesta kokeita sen korkean ilmentymisen miR-196a ja tutki vaikutusta kohdennetun knockdovvn miR-196a soluproliferaatioon ja apoptoosiin. Kävi ilmi, että anti-miR-196a on tehokkaasti soluihin (kuvio 2A, kuvio 2B) ja alas-säädellä miR-196a ilmentymisen taso (kuvio 2C). WST-8 määritys paljasti, että solujen lisääntymistä oli merkittävästi heikentynyt PANC-1 transfektoitujen solujen anti-miR-196a 72 h verrattuna kontrolliryhmään anti-miR-NC (

P

0,05) (kuvio 2D), kun taas muuttaminen miR-196a ilme ei ollut merkittävää vaikutusta soluproliferaatioon verrattuna kontrolliryhmään anti-miR-NC 24 h (

P

= 0,987) ja 48 h (

P

= 0,241).

(A) transfektio anti-miR-196a ja anti-miR-NC in PANC-1. (B) vertailu transfektiomenetelmistä välinen kurssi anti-miR-196a ja anti-miR-NC in PANC-1. Transfektio määrä anti-miR-196a oli (88,76 ± 2,25)%, kun taas transfektio määrä anti-miR-NC oli (91,09 ± 1,77)% (

P

0,05). (C) Expression of miR-196a by qRT-PCR. (D) kasvukäyrä keskuudessa anti-miR-196a, anti-miR-NC ja vanhempien PANC-1-soluissa. Solujen lisääntyminen väheni merkittävästi anti-miR-196a ryhmässä verrattiin anti-miR-NC ryhmä 72 h (*,

P 0,05

).

LM

: valomikroskoopilla.

Lisäksi päätimme joko solusyklin tai apoptoosin edistäisi proliferaation esto. Flow-Sytometrinen analyysi suoritettiin. Sen jälkeen hiljentäminen miR-196a anti-miR-196a 72 h, prosenttiosuus G

0 /G

1 lisääntyi merkitsevästi verrattuna kontrolliryhmään anti-miR-NC, (67,20 ± 3,12)% (anti miR-196a) vs (56,07 ± 7,93)% (anti-miR-NC) (

P

0,05), kun taas ei ollut tilastollinen merkitystä G

0 /G

1between anti -miR-196a ryhmä ja anti-miR-NC ryhmä 24 h (

P

= 0,825) ja 48 h (

P

= 0,785) (kuvio 3A, kuvio 3B). Lisäksi olemme havainneet ilmaus sykliini D1 ja CDK4 /6-proteiinia. Oli mielenkiintoista, että vähentynyt ilmentymiä sykliini D1 ja CDK4 /6 havaittiin jälkeen hiljentäminen miR-196a (kuvio 3C). Samaan aikaan, ei ollut merkittävää eroa apoptoosin keskuudessa Blank, miR-NC ja anti-miR-196a ryhmä PANC-1-soluissa (kuvio 3D). Yhdessä tulokset osoittavat, että knockdovvn miR-196a tukahduttaa solujen lisääntymistä, mikä johtuu osittain G

0 /G

1 pidättämisen sykliini D1 ja CDK4 /6 ilmaus väheni, mutta se ei liity induktion apoptoosin .

(A) edustaja virtaussytometria-analyysi solusyklin PANC-1 ja vieroitukseen hiljentäminen miR-196 24 h, 48 h ja 72 h. (B) vertailu solukierron keskuudessa anti-miR-196a, anti-miR-NC ja Blank. Prosenttiosuus solujen G

0 /G

1 vaihe 72 h nostettiin (56,07 ± 7,93)% (anti-miR-NC) ja (67,20 ± 3,12)% (anti-miR-196a) (*,

P

0,05), kun taas ei ollut tilastollinen merkitystä G

0 /G

1between anti-miR-196a ryhmä ja anti-miR-NC ryhmä 24 tunnin ja 48 h. (C) tyypillisen western blot-analyysi osoitti downregulation sykliini D1 ja CDK4 /6 ilmentymisen jälkeen tukahduttaminen miR-196a in PANC-1-soluilla 72 tuntia. (D) vertailu apoptoosin keskuudessa anti-miR-196a, anti-miR-NC ja Blank.

alassäätely miR-196a estää PANC-1 solumigraatio

Sen tutkimiseksi, miR-196a vaikuttanut helpottaa haimasyöpä solujen vaeltamiseen, suoritimme TranswellTM määritys käyttäen PANC-1-soluissa. PANC-1 solun valittiin, koska sen yli-ilmentymisen miR-196a ja jäljitelmä haimasyövän biologian parempi kuin muut solulinjat, erityisesti solujen vaeltamiseen analyysi [28]. TranswellTM määritys paljasti, että siirtyminen kyky PANC-1-soluissa merkittävästi vähennetty alas-säätely miR-196a, noin 28% verrattuna ohjaus (

P

0,05) (kuvio 4A, kuva 4B). Samalla olemme pohti mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen (MET) vaikutti tukahduttaminen PANC-1 solumigraatio jälkeen hiljentäminen miR-196a, ensin havaittu morfologiaa PANC-1 ennen ja jälkeen transfektion anti-miR-196a. Meidän edun solujen morfologia muuttui huomattavasti transfektion jälkeen. Vuonna tyhjä ja anti-miR-NC ryhmä, jotkut solut olivat osittain kara muoto, kun taas anti-miR-196a solut tiukasti sidottu, monikulmio solujen epiteelin fenotyyppi. Samalla havaitsimme MET markkereita (vimentiinista ja E-kadheriinin) ilmentyminen immunofluoresenssilla. Lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin jälkeen havaittiin hiljentäminen miR-196a, ekspression kanssa vimentiinista väheni (kuvio 4C). Lisäksi selvitimme proteiinin ilmentyminen liittyy MET. Silmiinpistävän, että vähentää PANC-1 solumigraatio jälkeen hiljentäminen miR-196a, lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin proteiini havaittiin, sekä vähentynyt ilmentyminen N-kadheriinin ja vimentiinista (kuvio 4D). Nämä tulokset osoittavat, että miR-196a todellakin edistää vaeltavien fenotyyppi haimasyöpäsoluissa, osittain MET.

(A) edustaja siirtokuoppaan määritys osoitti, että siirtyminen kyky PANC-1-soluissa merkittävästi vähennetty alaspäin sääntely miR-196a. (B) vertailu transmembraanisen solujen joukossa anti-miR-196a, anti-miR-NC ja Blank (*,

P

0,05). (C) Morfologiset muutokset ja immunofluoresenssivärjäyksen Met merkkiaineiden joukossa anti-miR-196a, anti-miR-NC ja tyhjä. (D) tyypillisen western blot-analyysi osoitti, että mesenkymaaliset-epiteelin siirtyminen vaikutti tukahduttaminen PANC-1 solumigraatio jälkeen hiljentäminen miR-196a. Vaimentamisen jälkeen miR-196a, E-kadheriinin ilmentyminen kasvoi, sekä ilmentymistä N-kadheriinin ja vimentiinin vähentynyt.

NFKBIA on tavoite miR-196a haimasyövän

sitten tutkittiin molekyylitason mekanismeja, joilla miR-196a säätelee muuttavien fenotyyppi. Mahdollisesti miR-196a tavoite geenien tietokannan analyysi on esitetty taulukossa S1. Online etsiä miR-196a kohdistamista geenien TargetScan, Miranda ja PicTar paljasti, että NFKBIA, proto-onkogeeni liittyy maahanmuuttoon ja invaasio, voisi olla potentiaalinen kohde miR196a (kuvio 5A). Me seuraavaksi määrittää, onko NFKBIA ilmentyminen negatiivisesti yhteydessä miR-196 taso haimasyövän solulinjoissa. Kuten osoitettu kuviossa 1, ilmentymistä miR-196a oli korkein PANC-1-soluissa, ja alhaisin BxPC-3-soluissa. Näin ollen me valitsimme kaksi solulinjat edelleen NFKBIA proteiinin ilmentymisen. Meidän edun NFKBIA proteiinin ekspressio oli suurempi BxPC-3 soluja kuin että PANC-1-soluissa. Lisäksi NFKBIA lisääntynyt jälkeen alas-säätely miR-196a in PANC-1-soluissa, ja laski sen jälkeen säätely ylöspäin miR-196a BxPC-3-soluissa (kuvio 5B). Sen varmistamiseksi suora miRNA-kohde vuorovaikutus, voimme perustaa lusiferaasireport- määritys. Kuten kuviossa 5C, lusiferaasin aktiivisuus PANC-1-soluissa vähennettiin WT konstruktista alas-säätely miR-196a tason, joka voitaisiin osittain palautettu mutantti konstruktioita. Nämä tulokset viittaavat siihen, että 3’UTR NFKBIA on välittömänä kohteena miR-196a.

(A) NFKBIA on mahdollinen kohde geenin miR-196a ennustettu laskennallisen analyysin. (B) tyypillisen western blot-analyysi osoitti suhdetta miR-196a ilmaisun ja endogeenisen NFKBIA proteiinin taso. Esto miR-196a in PANC-1-solujen määrä nousi endogeenisen NFKBIA proteiinin taso, kun taas yli-ilmentyminen miR-196a BxPC-3-soluissa vaimennetaan endogeenisen NFKBIA proteiinin taso. (C) lisääminen NFKBIA3’UTR kohdesekvenssien lusiferaasireportteri- vektori lyijypitoista pienemmästä lusiferaasiaktiivisuuden läsnä miR-196a PANC-1-soluja 24 h kotransfektion jälkeen. Histogrammit osoittivat saaduista arvoista keskimääräisenä ± SD kolmesta itsenäisestä Kotransfektioita (*,

P

0,05).

hiljentäminen NFKBIA edistää lisääntymistä ja migraatiota PANC-1 solut

edelleen määrittää biologisen roolin NFKBIA haimasyövän, tutkimme vaikutus kohdennettujen knockdovvn NFKBIA in PANC-1-soluissa. Samaan aikaan, kuten todistettu aiemmin, NFKBIA on tavoite miR-196a, jotta kumota vaikutuksen anti-miR-196a, me kotransfektoidaan siNFKBIA ja anti-miR-196a in PANC-1-soluissa. Suoritimme WST-8 määrityksessä havaita solujen lisääntymistä. Kävi ilmi, että solujen lisääntyminen on merkittävästi lisääntynyt PANC-1-soluissa, jotka on transfektoitu si-NFKBIA 72 h verrattuna sen kontrolliryhmän si-NC (

P

0,05), välin, soluproliferaatioon oli merkittävästi lisääntynyt PANC-1-solut transfektoitu si-NFKBIA + anti-miR-196a 72 h verrattuna sen kontrolliryhmään si-NC + anti-NC (

P

0,05). Ei ollut mitään tilaston merkitystä välillä si-NFKBIA ja si-NFKBIA + anti-miR-196a (

P

0,05) (kuvio 6A). Kuten edellä on osoitettu, ilmauksia sykliini D1 ja CDK4 /6 jälkeen vähentynyt hiljentäminen miR-196a. Tutkimme lisäksi proteiinin ilmentymiä sykliini D1 ja CDK4 /6 jälkeen hiljentäminen NFKBIA. Meidän edun lisääntynyt ilmauksia sykliini D1 ja CDK4 /6 havaittiin jälkeen hiljentäminen NFKBIA (kuvio 6B). Seuraavaksi siirtokuoppaan määritys ehdotti esto NFKBIA edistää solujen muuttoliikettä. Lisäksi kaksi inhibitio NFKBIA ja miR-196 edistää solujen muuttoliike (kuvio 6C, kuvio 6D), mikä merkitsi, että esto NFKBIA estetty vaikutus anti-miR-196a on solumigraation. Nämä tiedot viittaavat siihen, että esto NFKBIA edistää haimasyövän solujen edistämiseen ja muuttoliikkeen.

(A) Kasvu käyrä joukossa si-NFKBIA, si-NFKBIA + anti-miR-196a ja niiden asianmukaista valvontaa. WST-8 määritys estivät NFKBIA tehostetun PANC-1-solujen lisääntymistä (*,

P

0,05). Samaan aikaan kaksi esto NFKBIA ja miR-196a edistänyt solujen lisääntymistä. (B) tyypillisen western blot-analyysi osoitti säätely ylöspäin sykliini D1 ja CDK4 /6 ilmentymisen jälkeen tukahduttaminen NFKBIA in PANC-1-soluilla 72 tuntia. (C) edustaja siirtokuoppaan määritys osoitti, että siirtyminen kyky PANC-1-soluissa oli merkittävästi heikennetty alas-säätely NFKBIA. Lisäksi esto NFKBIA estetty vaikutus anti-miR-196a on solumigraation. (D) Vertailu läpäisevien solujen joukossa si-NFKBIA, si-NC, si-NFKBIA + anti-miR-196a, ja si-NC + anti-miR-NC (*,

P

0,05) .

keskustelu

MicroRNA profilointi tutkimukset osoittavat, että miR-196a yli-ilmentyy useissa syövissä, kuten rintasyöpä [29], paksusuolen ja peräsuolen syövän [30], mahasyöpä [ ,,,0],31], ja haimasyövän [6], [7]. Mielenkiintoista, yhä useammat raportit osoittavat, että miR-196a on merkittäviä rooleja kehittämiseen ja etenemiseen syövän. Yli-ilmentymisen miR-196a liittyy korkean riskin asteen, etäpesäke ja huono eloonjäämisennustetta ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimiin [32]. MiR-196a on havaittu edistävän proliferaatiota ja hyökkäys ei-pienisoluisen keuhkosyövän solu, joka ilmaisee sen biologisia rooli syövän etenemistä [33]. On todettu, että miR-196a identifioidaan lisääntynyt ilmentyminen oikein erottaa haimasyövän hyvänlaatuisesta haimakudoksesta, ja korkea ilmentyminen miR-196a on todettu ennustavan huono selviytyminen [6]. Samaan aikaan On todettu, että seerumin miR-196a ekspressiotasot leikattavissa haimasyövän (vaiheet III ja IV) potilaat ovat huomattavasti korkeampia kuin kokoisen (vaiheissa I ja II) potilailla [7]. Lisäksi seerumin miR-196a ilmentymistason on havaittu olevan mahdollinen arvo ennustaa mediaani elinaika haimasyövän potilaille. Tutkimuksessamme olemme selvitetty, että miR-196a oli yliekspressoitu haimasyövän ja sen ylössäätöä oli merkitsevästi yhteydessä muuttopotentiaalia, joka voi edistää haimasyövän etenemistä ja johtaa huonoon ennusteeseen. EMT uskotaan olevan olennainen askel syövän eteneminen ja metastaasit [34], [35]. Alentuneen muuttopotentiaalia jälkeen hiljentäminen miR-196a, kohonnut ilmentyminen E-kadheriinin ja vähentynyt ilmentyminen N-kadheriinin ja vimentiinista havaittiin, mikä merkitsi sitä, että mesenkymaaliset-epiteelin siirtyminen vaikutti tukahduttaminen PANC-1 solumigraatio jälkeen hiljentäminen miR-196a. Lisäksi osoitimme, että miR-196a edistänyt haimasyöpä leviämisen kautta G

0 /G

1 pidätyksen ja laski sykliini D1 ilmentyminen ja CDK4 /6 lauseke mutta ei apoptoosin.

Lisäksi olemme tutkineet molekyylitason mekanismi miR-196a haimasyövän kasvainten synnyssä. Kehittyvät todisteita tarkoita, että miR-196a myötävaikuttaa kasvaimen synnyssä kautta kohdentaminen spesifisten geenien [36] – [39]. Tuloksemme osoittivat, että miR-196a osaltaan proliferatiivinen ja muuttavien potentiaalia haimasyöpä, joka edisti tutkimustemme kohde liittyviä geenejä proliferaatio ja migraatio. Nuclear factor-kappa B (NF-KB), tuntomerkki tulehdusvastetta, aktivoituu usein kasvaimia ja voi olla keskeinen rooli yhdistää tulehduksen kasvaimen kehittymisen ja etenemisen [40]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että NF-KB tukahduttaminen syövän estää solujen lisääntymisen, aiheuttaa solusyklin pidätyksen, mikä viittaa siihen, että NF-KB voi olla tärkeä rooli solujen lisääntymisen.