Krooninen sairaus

tiivistelmä

maksasolusyövän (HCC) on kolmanneksi suurin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti. Vallitsevat käytännöt hoitoon HCC ovat vähemmän kuin tyydyttävä, koska syövän kantasoluja (CSCS) -välitteisen leikkauksen jälkeiset toistumisen. Tästä syystä suunnattu CSCS tai syöpäsolut CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia on tullut uusi lähestymistapa hoitoon HCC. GLA on anti-kasvain vaikutuksia, koska se vaimentaa proliferaatiota, migraatiota, invaasio ja angiogeneesi ihmisen syöpäsoluja. Kuitenkin toiminnot GLA säätelyssä CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa, ja molekyylitason mekanismeista on hämärän peitossa. Täällä huomasimme, että GLA heikensi CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia, joita microRNA-148a (miR-148a) -välitteisen esto transformoivan kasvutekijä beeta (TGF-β) /Smad2 signaalireitin HCC solulinjoissa (HepG2, Huh-7, ja MHCC97H). Todellakin, GLA esti aktivoinnit /ilmaisuja sekä TGFp aiheuttama ja potilaan oman Smad2. Edelleen, GLA parannettu ilmaus miR-148a annoksesta /aika-riippuvaisella tavalla. MiR-148a, joka oli suunnattu

Smad2

-3’UTR, vähensi ilmentymistä ja toimintaa Smad2. Knockdovvn miR-148a poisti GLA inhiboivan vaikutuksen TGF-β /Smad2 signaalireitin ja CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa. Tutkimuksemme löytyi uudella mekanismilla, joka GLA estää CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC solujen miR-148a-estoa TGF-β /Smad2 signaalireitin, jotka voivat auttaa tunnistamaan mahdolliset tavoitteet hoitoja HCC.

Citation: Jiang F, Mu J, Wang X, Ye X, Si L, Ning S, et al. (2014) tukahduttava vaikutus miR-148a on TGF beta-Smad: ien Signal Pathway osallistuu Glabridin inhiboivan vaikutuksen Cancer kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia maksasolukarsinoomassa solut. PLoS ONE 9 (5): e96698. doi: 10,1371 /journal.pone.0096698

Editor: Lian-Yue Yang, Xiangya sairaala Keski Etelä yliopisto, Kiina

vastaanotettu: 02 tammikuu 2014; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2014; Julkaistu: 7. 2014

Copyright: © 2014 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (81171987, 30972507) ja rahoittama Priority Academic ohjelmasuunnitteluosastolle Jiangsun korkeakouluista (papD). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on yleisin maksan maligniteetti ja kolmas johtava syy syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [1]. Vallitsevat käytännöt hoitoon HCC, kirurginen resektio ja kemoterapia ovat vähemmän kuin tyydyttävä, koska etäpesäkkeiden ja leikkauksen jälkeisen uusiutumisen [1]. Käsite ehdotti ominaisuuksia selittävät neoplastisten kudosten on olemassa itseuudistuvien, varsi kaltaisia ​​soluja, kutsutaan syövän kantasolut (CSCS) [2]. CSCS on tunnistettu useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien HCC. Sisällä kasvain, CSCS, jotka ovat pieni osa neoplastiset solut, määritellään niiden kyky tuottaa uusia kasvaimia [3]. Tästä syystä kohdistamista syöpäsolut kanssa CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia on tullut uusi tapa hoitoon ihmisen maksan syöpien.

Juuri

glycyrrhiza glabra

(lakritsi) on käytetty vuosisatojen ajan Aasiassa ja Euroopassa antioksidanttina, antidote, demulcent, yskänlääke ja lääke allergisen tulehduksen, sekä maku- ja makeutusainetta [4]. Glabridin [GLA, (

R

) -4- (3, 4-dihydro-8, 8-dimetyyli) -2

H

, 8

H

bentso [ ,,,0],1, 2-

b

: 3, 4-

b

’] dipyran-3-yyli) -1, 3-bentseenidioli-] on polyphenolic flavonoidi ja tärkein osatekijä hydrofobisessa osa lakritsi ote [5]. Lisäksi estrogeenisiä vaikutuksia, GLA esittelee monenlaisia ​​biologisia vaikutuksia mukaan lukien neuro-suojaava, sydän–suojaava, tulehdusta, jne [5] – [7]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että GLA esittelee antituumorivaikutuksia, jossa vaimennus lisääntymisen, migraation /invaasion ja angiogeneesiä ihmisen syöpäsoluja [8], [9]; Kuitenkin vaikutukset GLA on CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa, ja molekyylitason mekanismeista on hämärän peitossa.

Transforming kasvutekijä beeta (TGF-β) on kriittinen säädin mukana solujen kasvua, erilaistumista ja kehitys [10]. Se on myös tehokkain maksan pro-fibrogenic sytokiini pääasiassa tuottavat aktivoidut mesenkymaalisten solujen kroonista maksavaurion [11]. Aloittamisen ja kehittämisen erilaisten kasvainten, TGF-β indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka on kriittinen solun tapahtuma acquirement CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia [12], [13]. Näin ollen, TGF-β-inhibiittoreita on kehitetty syövän hoitomuotoja [14], [15]. Nykyinen tutkimus osoittaa, että inhibitio TGF-β estää sukupolven CSCS, joka parantaa kemoterapia kanteen triple-rintasyöpä [16]. Esillä olevassa tutkimuksessa käsittelimme HCC solulinjoissa (HepG2, Huh-7, ja MHCC97H) mukaan GLA määrittää aikaisin molekyylimuutoksia, jossa painotukset on CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia ja TGF-β-reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

HCC solulinjoja (HepG2 ja Huh-7) ja Ihmisen normaali maksan solulinjasta (L-02) saatiin Shanghai Institute of Cell Biology, Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). MHCC97H solulinja (HCC-soluissa, joilla on korkea vaeltavia potentiaali) saatiin Maksa Cancer Institute, Zhongshan sairaala, Fudanin yliopiston, Shanghai, Kiina. Soluja ylläpidettiin 5% CO

2 37 ° C: ssa Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies /Gibco, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Life Technologies /Gibco), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). GLA (≥98.0%: n puhtaus) ostettiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Kaikki muut käytetyt reagenssit olivat analyyttistä laatua tai korkein arvosana käytettävissä.

käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioanalyysillä polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Kokonais-RNA (2 ug) cDNA: ksi käyttäen AMV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, USA). Käytetyt alukkeet ovat taulukossa S1. PCR-reaktio arvioitiin tarkastamalla PCR-tuotteiden 2% w /v agaroosigeeleillä. Bändit normalisoitiin käyttämällä

Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH)

korjaamaan erot lastaamista cDNA.

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR)

Kokonais-RNA (1 ug) cDNA: ksi käyttäen TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) miRNA-erityisiä liu’utetaan taaksepäin alukkeita. Reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: 42 ° C 15 min ja 85 ° C: ssa 5 s. qRT-PCR suoritettiin käyttäen TaqMan-PCR kit Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems) 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min.

U6

snRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. Kertainen ilmentymisen muutosten kunkin geenin laskettiin vertaileva kynnyksen (Ct), jossa käytetään kaavan 2

– (ΔΔCt).

Western blotit

Solulysaatit erotettiin natrium- (SDS) -polyacrylamide geelielektroforeesi ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, USA); immuunikompleksien havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Vasta-aineita käytettiin Smad2 ja p-Smad2 (Ser 465/467, Cell Signaling Technology); GAPDH (Sigma). Blotteja normalisoitiin käyttämällä GAPDH korjaamaan eroja lastaus proteiinien.

Sferoidiviljelmiä muodostumista

tarttumattomat 24-kuoppiin (Costar, USA), käsitellyt solut (2 x 10

3) suspendoitiin määritelty, seerumia, joka koostuu DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml ihmisen rekombinantti-fibroblastien kasvutekijä (bFGF, R jälkeen 14 päivää, pesäkkeet laskettiin mikroskoopilla (Olympus).

Solun transfektio

Anti-con, anti-miR-148a, Con-matkivat ja miR-148a-matkivat oli syntetisoitiin RiBoBio Co. Solut transfektoitiin ohimenevästi käyttämällä Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, USA) 12 tuntia, mukaan valmistajan protokollaa. Geenien talteenotto määrityksessä, kun MHCC97H solut transfektoitiin anti-miR-148a: ssa 12 h, ne viljeltiin tuoreessa DMEM, jossa oli 10% FBS: ää (Gibco), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Gibco ) vielä 24 tuntia, jonka jälkeen transfektoitiin Con-matkivat tai miR-148a-matkivat 12 tuntia.

lusiferaasireporttiterilla määritys

pGL3-

Smad2

-3 ’UTR-Luc-konstrukti hankittiin Shuntian Biology (Shanghai). Plasmidi phRL-tk (käytettiin sisäisenä kontrollina transfektion tehokkuuden ja sytotoksisuuden testi kemikaaleja), joka sisälsi Renilla lusiferaasi-geeni hankittiin Promega. Lyhyesti, HepG2-solut maljattiin 24-kuoppaisilla soluviljelymaljoille. Solut lisääntyivät 60 80% konfluenssiin 24 tunnin viljelyn. Anti-con tai anti-miR-148a on ko-transfektoitiin toimittaja rakentaa vastaavasti, käyttämällä Lipofecamine 2000 reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Inkubointiajan jälkeen 12 h transfektion väliaine korvattiin. Sitten, sen jälkeen kun solut käsiteltiin 0 tai 20 uM GLA: ssa 24 tuntia, ne otettiin talteen, pestiin PBS: llä (pH 7,4). Solut hajotettiin passiivista hajotuspuskuria (Promega). Solulysaatit analysoitiin välittömästi 96-kuoppaisen levyn luminometriä (Berthold Detection System, Pforzheim, Saksa). Määrät lusiferaasi ja Renillan lusiferaasin mitattiin Dual-Luciferase Reporter Assay System Kit (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Arvot lusiferaasiaktiivisuuden kutakin lysaattia normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Suhteellinen aktiivisuus muunnettiin kertaiseksi induktio yläpuolella ajoneuvon ohjaus arvo.

Tilastollinen

Johdetut arvot esitettiin keskiarvoina ± SD. Student n

t

testi, ja yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Dunnettin

t

testiä käytettiin arvioimaan merkittäviä eroja ryhmien välillä.

P

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

GLA vaimentaa CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa

pitoisuuksien määrittämiseksi GLA käyttämällä meidän tutkimuksessa olemme alttiina HepG2 tai L-02-soluja 0, 5, 10, 20, 40, tai 80 uM GLA 24, 48 tai 72 h. Kuten on esitetty kuvioissa. S1A ja S1B, ei ollut havaittavaa vaikutusta 10 tai 20 uM GLA on elinvoimaisten solujen ei HCC-soluissa (HepG2) eikä normaaleissa maksasolut (L-02). Joten päätimme nämä pitoisuudet jatkotutkimuksia varten.

Lisääntynyt näyttely CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia on keskeinen rooli aloittamisen, kehitys, ja tuloksista monipuolinen syövän, mukaan lukien HCC [2].

CD44

,

CD90

,

CD133

, ja

EpCAM

ovat solun pinnan markkereita maksasyövän kantasoluja [17] – [19] lisäksi,

Oct-4

ja

BMI-1

ovat keskeisiä ”stemness” geenien CSCS eri syövistä [13], [20]. Tässä, kuten on esitetty kuviossa. 1A ja 1B, GLA vähentynyt ilmaisut näiden geenien HepG2-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla; välin vähentynyt ilmaisuja

CD44

ja

EpCAM

havaittiin myös kaksi muuta HCC-solut (Huh-7 ja MHCC97H).

(A) HepG2-solut käsiteltiin 0, 10 tai 20 uM GLA: ssa 72 tuntia. RT-PCR-analyysejä

CD44

,

EpCAM

,

CD133

,

CD90

,

Oct-4

, ja

BMI-1

; (B) Huh-7 ja MHCC97H soluja käsiteltiin 0 tai 20 uM GLA: ssa 72 tuntia. RT-PCR-analyysejä

CD44

ja

EpCAM

; (C ja D), HepG2 ja Huh-7-soluja käsiteltiin 0 tai 20 uM GLA: ssa 72 tuntia. (C) Vapaasti kelluva, kannattava palloja muodostuu soluista (bar = 250 nm); (D) Sphere määritysrajan (keskiarvo ± SD, n = 3); (E ja F) HepG2 ja MHCC97H soluja käsiteltiin 0 tai 20 uM GLA: ssa 72 tuntia. (E) Pesäkkeenmuodostusta pehmeässä agarissa (bar = 250 nm); (F) Colony numerot (keskiarvo ± SD, n = 3). ** P 0,01 verrattuna keskipitkän säätökennoja (opiskelijan

t

testi).

muodostaminen pallosia osoittaa kapasiteetin solujen itsensä uudistamista ja aloittamisen /kehittäminen kasvaimia [2]. Sitten kapasiteetti HCC-solujen muodostumista pallosia aikana GLA hoito oli määritetty. Kuten on esitetty kuvioissa. 1C ja 1D, GLA vähentynyt muodostuminen rakeita HepG2 ja Huh-7-soluissa. Ankkuroinnista riippumaton kasvu on tyypillistä pahanlaatuisten solujen [21]. Olemme edelleen määritelty vaikutukset GLA on pahanlaatuinen ominaisuudet HCC-soluissa. Kuten on esitetty kuvioissa. 1E ja 1F, GLA vähensi kiinnittämisestä riippumaton kasvu HepG2 ja MHCC97H soluja.

TGF-β /Smad: ien signaalireitin osallistuu kohoaminen CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HepG2-soluissa

TGF -β /Smad: ien reitin on osoitettu lisäävän varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia ihmisen syöpäsoluissa [22]. Täällä olemme huomanneet, että TGF-β paransi ilmauksia CD44 ja EpCAM (kuva. 2A). Edelleen TGF-β-käsiteltyjen HepG2-soluissa, kyvyt sferoidien muodostumisen ja ankkurista riippumaton kasvu oli tehostettu (kuviot. 2B ja 2C). Kuitenkin Smad2 (klassisessa alas-stream tekijä säätelee TGF-β, [16]) pudotus HepG2-soluissa, tällaista ilmiötä aiheuttama TGF-β oli heikennetty (kuviot. 2D-2F).

(A -C) HepG2-solut käsiteltiin 0 tai 10 ng /ml TGF-β: ssa 48 tuntia. (D-F) jälkeen HepG2-solut transfektoitiin 10 nM Smad2-siRNA: ssa 12 h, se käsiteltiin 10 ng /ml TGF-β: ssa 48 tuntia. (A ja D) RT-PCR-analyysit

CD44

ja

EpCAM

; (B ja E, vasen) Vapaasti kelluva, kannattava palloja muodostuu soluista (bar = 250 nm); (B ja E, oikealla) Sphere määritysrajan (keskiarvo ± SD, n = 3); (C ja F, vasen) Pesäkkeenmuodostusta pehmeässä agarissa (bar = 250 nm); (C ja F, oikealla) Colony numeroita (keskiarvo ± SD, n = 3). * P 0,05 verrattuna väliaineen ohjaus solujen tai Con-siRNA-transfektoiduissa soluissa käsitelty TGF-β (opiskelijan

t

testi).

GLA estää TGF-β /Smad2 signaali väylän HCC-soluissa

tutki vaikutuksia GLA on TGF-β aiheuttama aktivointi Smad2. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, GLA esti TGFp aiheuttaman fosforylaatiota Smad2 ja ilmaus

Etana

(loppupään geenin Smad2, [23]); mielenkiintoisesti, GLA vähenee myös ekspression koko Smad2 mRNA: ta ja proteiinia läsnä ollessa tai ilman TGF-β. Joten seuraavan kerran määritetty vaikutuksia GLA on ilmauksia endogeenisen Smad2. Kuten on esitetty kuvioissa. 3B ja 3C, GLA väheni ilmaus ja aktivointi endogeenisten Smad2 HCC-soluissa (HepG2, Huh-7, ja MHCC97H). Se, että

Smad2

mRNA väheni GLA, me arveltu, että tämä tukahduttava vaikutus saattaa välittyä miRNA.

(A) jälkeen HepG2-soluja esikäsitellään 0 tai 20 uM GLA: ssa 12 h, ne altistettiin 0 tai 10 ng /ml TGF-β: ssa 24 tuntia. (Top) Western blot analyysit p-Smad2 ja Smad2, (alhaalla) RT-PCR-analyysit

Smad2

ja

etana

; (B) HepG2-solut käsiteltiin 0, 10, tai 20 uM GLA: ssa 72 tuntia. (Top) Western-blotit analyysit p-Smad2 ja Smad2, (alhaalla) RT-PCR-analyysit

Smad2

ja

etana

; (C) Huh-7 ja MHCC97H soluja käsiteltiin 0 tai 20 uM GLA: ssa 72 tuntia. RT-PCR-analyysejä

Smad2

ja

etana

.

GLA parantaa ilmentymistä miR-148a HCC-soluissa

Käyttämällä TargetScan 6,2 (www.targetscan.org), olemme havainneet, että miR-148a ennustettiin sitoutuvan

Smad2

-3 ’UTR. Kohdepaikat Mir-148a in

Smad2

mRNA esiteltiin kuvassa. 4A. Sitten määritetään vaikutukset GLA ilmentymistä koskevat miR-148a in HCC-soluissa. Kuten on esitetty kuvioissa. 4B ja 4C, GLA parannettu ilmaus miR-148a annoksesta /aikariippuvainen tavalla HepG2-soluissa. Samaan aikaan, GLA myös kohonnut ilmaus miR-148a in Huh-7 ja MHCC97H soluja (kuvio 4D).

(A) tavoitteena sekvenssit miR-148a 3′-UTR

Smad2

; (B) HepG2-solut käsiteltiin 0, 10, tai 20 uM GLA: ssa 24 tuntia. qRT-PCR-analyysit ilmentymisen miR-148a (keskiarvo ± SD, n = 3); (C) HepG2-solut käsiteltiin 0 tai 20 uM GLA 0, 8, 16, 24 tai 48 h. qRT-PCR-analyysit ilmentymisen miR-148a (keskiarvo ± SD, n = 3); (D) Huh-7 ja MHCC97H soluja käsiteltiin 0 tai 20 uM GLA: ssa 24 tuntia. qRT-PCR-analyysit ilmentymisen miR-148a (keskiarvo ± SD, n = 3). ** P 0,01 verrattuna keskipitkän säätökennoja (opiskelijan

t

testi).

GLA estää Smad2 by miR-148a HCC-soluissa

Perustuen ennustaa, että on olemassa tavoite sivustoja miR-148a in

Smad2

mRNA ja että GLA kohonnut ilmentyminen miR-148a, me arveltu, että miR-148a voisi olla mukana GLA aiheuttama vähentynyt ilmentyminen Smad2 . Täällä knockdovvn miR-148a (kuvio. 5A) johti merkittävään kasvuun lusiferaasiaktiivisuuden (kuvio. 5B), ja esti GLA aiheuttama vähentynyt ilmentyminen ja aktivaatio Smad2 HepG2-soluissa (kuvio. 5C). Samaan aikaan yli-ilmentyminen miR-148a (kuvio. 5D) in Huh-7-solujen väheni ilmaisu ja aktivointi Smad2 (kuva. 5E). Lisäksi käytimme geeni elpyminen määrityksessä edelleen vahvistaa johtopäätöksemme. Vuonna MHCC97H soluissa, knockdovvn miR-148a kohonnut ilmaus

Smad2

kuitenkin palauttaminen miR-148a by matkivat poistettava tällaista vaikutusta (kuva. 5F ja 5G).

(A- C) Kun HepG2-soluja esi-transfektoitiin anti-con tai anti-miR-148a: ssa 12 h, ne altistettiin 0 tai 20 uM GLA: ta 72 tuntia. (A) qRT-PCR-analyysit ilmentymisen miR-148a (keskiarvo ± SD, n = 3); (B) lusiferaasireporttiterilla määritykset analyysi vaikutuksista miR-148a on

Smad2

3’UTR; (C) RT-PCR-analyysit

Smad2

ja

etana

(ylhäällä), ja Western blotit analyysit p-Smad2 ja Smad2 (alhaalla). ** P 0,01 verrattuna keskipitkän ohjaus soluihin, ja

## p 0,01 verrattuna HepG2-soluissa hoidetaan GLA yksin tai anti-con-transfektoitujen HepG2 soluista käsiteltiin GLA (ANOVA seurasi Dunnettin

t

testi). (D ja E) Huh-7-solut transfektoitiin con-matkivat tai miR-148a-matkivat 12 tuntia. (D) qRT-PCR-analyysit ilmentymisen miR-148a (keskiarvo ± SD, n = 3); (E) RT-PCR-analyysit

Smad2

ja

etana

(ylhäällä), ja Western blotit analyysit Smad2 (alhaalla); ** P 0,01 verrattuna Huh-7-solut transfektoidaan con-matkivat (opiskelijan t-testi). (F ja G) jälkeen MHCC97H solut transfektoitiin anti-miR-148a: ssa 12 h, ne viljeltiin tuoreessa DMEM, jossa oli 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä vielä 24 tuntia, jonka jälkeen transfektoidaan con-matkivat tai miR-148a-matkivat 12 tuntia. (F) qRT-PCR-analyysit ilmentymisen miR-148a (keskiarvo ± SD, n = 3); (G) RT-PCR-analyysit

Smad2

. ** P 0,01 verrattuna MHCC97H soluihin transfektoitiin anti-con,

## p 0,01 verrattuna MHCC97H soluihin transfektoitiin anti-miR-148a plus con-matkivat (ANOVA seurasi Dunnettin

t

testi).

GLA vaimentaa CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa miR-148a

koska TGF-β /Smad2 parantaa CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia, ja koska miR-148a tavoitteet Smad2, me arveltu, että GLA vaimentaa CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia miR-148a in HCC-soluissa. Täällä knockdovvn miR-148a esti GLA aiheuttama vähentynyt ilmauksia

CD44

ja

EpCAM

mRNA (kuva. 6A). Sillä HepG2-soluissa, knockdovvn miR-148a esti GLA aiheuttama vähentynyt muodostuminen pallosia (kuviot. 6B ja 6C). Sillä Huh-7-soluissa, yli-ilmentyminen miR-148a heikennetty kapasiteetin kiinnittämisestä riippumaton kasvu (kuviot. 6D ja 6E). Sitten käytimme geenin hyödyntämistä määrityksessä edelleen vahvistaa johtopäätöksemme. Vuonna MHCC97H soluissa, knockdovvn miR-148a kohonnut ilmaus

CD44

ja

EpCAM

, ja paransi muodostuminen pallosia; kuitenkin, palauttaminen miR-148a by matkivat poistettava tällainen vaikutus (Kuva. 6F-6H).

(AC) jälkeen HepG2 tai Huh-7-solut ennalta transfektoitiin anti-con tai anti-miR-148a 12 h, ne altistettiin 0 tai 20 uM GLA: ssa 72 tuntia. (A) RT-PCR-analyysit

CD44

ja

EpCAM

; (B) Vapaasti kelluva, kannattava palloja muodostuu HepG2 solut (bar = 250 nm); (C) Sphere määritysrajan (keskiarvo ± SD, n = 3); ** P 0,01 verrattuna keskipitkän ohjaus HepG2-soluissa, ja

## p 0,01 verrattuna anti-con-transfektoitujen HepG2 soluista käsiteltiin GLA (ANOVA seurasi Dunnettin

t

testi). (D ja E) Huh-7-solut transfektoitiin con-matkivat tai miR-148a-matkivat 12 tuntia. (D) Pesäkkeenmuodostusta pehmeässä agarissa (bar = 250 nm); (E) Colony numerot (keskiarvo ± SD, n = 3). ** P 0,01 verrattuna keskipitkän ohjaus Huh-7-solut tai Huh-7-solut transfektoidaan con-matkivat (ANOVA seurasi Dunnettin

t

testi). (F-H) MHCC97H solut käsiteltiin kuten on kuvattu kuviossa. 5F. (F) RT-PCR-analyysit

CD44

ja

EpCAM

; (G) Vapaasti kelluva, kannattava palloja muodostuu MHCC97H soluja (bar = 250 nm); (H) Sphere määritysrajan (keskiarvo ± SD, n = 3); ** P 0,01 verrattuna MHCC97H soluihin transfektoitiin anti-con,

## p 0,01 verrattuna MHCC97H soluihin transfektoitiin anti-miR-148a plus con-matkivat (ANOVA seurasi Dunnettin

t

testi).

Keskustelut

Nykyinen kemoterapiaa vastaan ​​HCC yleensä kohdistuu pääosa väestöstä kasvain suoraan, joka pystyy kutistua primaarikasvaimen kuitenkin se ei johdonmukaisesti hävittämiseksi vauriot . Löytö CSCS on muuttanut käsitystämme syövän synnyn ja kemoterapiaa. CSCS, myös nimitystä ”kasvain aloittamista solujen, on kyky tuottaa uusia kasvaimia. Tämän ratkaisun, CSCS ovat vastuussa muodostumista ja kasvua kasvainkudoksessa ja kestävät kemoterapia-aineiden, miksi perinteisiä lääkkeitä voidaan aluksi kutistua kasvain, mutta ei sen kitkemiseksi, jolloin uusiutuminen [24]. Täällä me valitsimme HepG2, Huh-7, ja MHCC97H solulinjat tutkia vaikutuksia GLA on CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia, koska nämä solulinjat osoittivat CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia, ja niitä on käytetty vaikutusten tutkimiseksi phytochemicals on CSCS kaltaista ”puoli väestö” soluihin [24] – [27].

GLA, joka on isoflavonoidi on

G. glabra L. juuret

, estää tyrosinaasi-riippuvaisen melaniinin biosynteesin tehokkaasti, mikä viittaa siihen, että se voi toimia ehdokkaaksi iho-vaalentamiseen aineet [5]. Sitä paitsi, se on myös liitetty erilaisia ​​biologisia ominaisuuksia, kuten antioksidantti, anti-inflammatorisia, estrogeenisiä, neuroprotektiivisia, etc [5] – [7]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat syövän aiheuttamia vaikutuksia GLA, että se estää oksidatiivista DNA pirstoutuminen UVB-säteilytettyjen ihmisen keratinosyytti HaCaT soluihin [28]; Samaan aikaan, se estää proliferaatiota ihmisen rinta- syöpäsolujen [8]; Lisäksi se estää siirtymisen, invaasio, ja angiogeneesiä estämällä FAK /Rho-signalointireitin [29]; edelleen, se myös lisää tehoa kemoterapian estämällä P-glykoproteiinin ja monilääkeresistenssiin proteiini 1 synteesi [30]. Täällä tunnistettu että GLA heikennetty (a) ilmaisuja CD44, CD133, CD90, ja EpCAM, (b) kapasiteettia pallosia muodostumisen (markkeri itseuudistumiseen), ja (c) kyky kiinnittymisestä riippumattoman kasvun ( merkin pahanlaatuisia soluja) HepG2, Huh-7, ja MHCC97H soluja, mikä viittaa siihen, uusi toiminto, joka GLA voi säädellä CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa.

maksan, TGF-β on tärkeä linkki keskuudessa pysyviä vammoja, maksakirroosi, ja HCC, ja voidaan toiminut keskeisenä kohteena HCC hoito [15], [31]. TGF-β signalointi aloitetaan TGF-β TGF-β-reseptorin II (TGF-RII), jonka jälkeen aktivointi TGFp-RI, Smad2 /3 fosforylaation, ja muodostumista Smad2 /3/4-komplekseja [ ,,,0],10]. On suhde TGF-β ja CSCS, jossa näyttöä siitä, että TGF-β indusoi EMT, joka johtaa acquirement CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia [12], [13]. Täällä huomasimme, että (a) TGF-β hoidon aiheuttama otaksuttu syövän kantasolujen markkereita ja lisääntynyt ankkurista riippumaton kasvu ja muodostumista rakeita HepG2-soluissa ja (b) knockdovvn Smad2 päinvastainen näitä vaikutuksia, mikä viittaa siihen, että TGF-β signaloinnin tärkeä rooli parantamisessa CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa. Kuitenkin välisestä assosiaatiosta TGF-β ja GLA-säännelty CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia ei ole tutkittu aikaisemmin. Esillä olevassa tutkimuksessa, GLA vähensi TGF-β-indusoitua fosforylaatiota Smad2. Tärkeää on, GLA vaimennettu ilmaisun ja aktivointi endogeenisten Smad2 HCC-soluissa, mikä osoittaa, että TGF-β /Smad2 saattaa olla mukana GLA aiheuttama tukahduttavaa vaikutusta CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa.

miRNA ovat ei-koodaavan pieniä RNA-oligonukleotidejä, jotka säätelevät geenin ilmentymistä [32]. Useita kasvaimia Joissakin miRNA ilmentyvät differentiaalisesti suhteessa normaaleissa kudoksissa [33]. Kuitenkin miRNA verkot ja niiden sääntelyä mRNA käännös ja proteiinin ilmentymistä CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC soluista on selvittämättä. MiR-148a on pro-apoptoottisten miRNA kohdistamalla Bcl-2 [34]. Lisäksi esto miR-148a by hyper-metylaatio liittyy etäpesäkkeitä monissa kasvaintyypeissä ja jopa sääntelyn etäpesäkkeiden liittyvien geenien [35]. Maksassa, miR-148a ensin osoitettu moduloivan tasot P450 3A4 kautta transkription jälkeen säätelemällä 3’UTR pregnaani X-reseptorin (

PXR

) mRNA [36]. Edellinen tutkimus osoittaa, että miR-148a on mukana anti-etäpesäkkeiden HCC soluissa estoja Wnt1 välittämän EMT ja acquirement CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia [24]. Täällä, käyttämällä TargetScan 6,2, huomasimme, että miR-148a ennustettiin sitoutuvan

Smad2

-3 ’UTR. Lisäksi knockdovvn miR-148a johtanut huomattavaan lisäämiseen ilmentymisen /aktivointi Smad2 ja CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia GLA-käsiteltyjen HepG2-soluissa. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-148a väheni ilmaus /aktivointi Smad2 ja CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia Huh-7 ja MHCC97H soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että inhibitio Smad2 by miR-148a voi välittää GLA-heikennettyjä CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa.

Lopuksi, GLA vaimensi CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia estämällä TGF-β /Smad: ien kautta. Todellakin, GLA parannettu ilmaus miR-148a, joka oli suunnattu SMAD2-3’UTR ja alas-säännelty Smad2 lauseke /aktivointi. Knockdovvn miR-148a poisti GLA inhiboivan vaikutuksen TGF-β /Smad2 ja CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa (kuvio. 7). Ymmärtäminen uudella mekanismilla, jolla GLA estää CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-solujen, meidän tutkimus voi auttaa tunnistamaan mahdolliset tavoitteet hoitoja HCC.

tukeminen Information

Kuva S1.

vaikutukset GLA elinkelpoisuudesta ja CSCS merkkiaineiden HepG2 ja L-02-soluissa. (A ja B) HepG2 tai L-02-soluja käsiteltiin 0, 5, 10, 20, 40, tai 80 uM GLA: ssa 24, 48 tai 72 h, vastaavasti. Solut elinkykyisyyksiä arvioitiin WST-8 hydrolyysillä käyttäen Cell Counting Kit-8 määrityksessä. Suhteelliset solujen elinkelpoisuus määritettiin vertaamalla solujen alttiina ei GLA. (C) L-02-soluja käsiteltiin 0 tai 20 uM GLA: ssa 72 tuntia. qRT-PCR-analyysit ilmentymisen

CD44

,

EpCAM

, ja

CD133

(keskiarvo ± SD, n = 3).

doi: 10,1371 /journal .pone.0096698.s001

(TIF) B Taulukko S1.

käytetyt alukkeet RT-PCR: llä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0096698.s002

(DOCX)