Krooninen sairaus

tiivistelmä

Potilaat, joilla on haimasyöpä on synkkä ennusteet, ja uusia hoitoja tarvitaan kipeästi. Mutaatiot KRAS onkogeenin esiintyy usein haimasyövän ja edustaa houkutteleva kohde. Kohdistaminen suoraan hallitseva KRAS väyliä ovat olleet haastavia ja tutkimusta hoitostrategioita on nyt kohdennettu uudelleen polkuja alavirtaan KRAS, fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK [MEK]). Oletimme, että samanaikainen estäminen PI3K ja MEK reittejä johtaisi synergististä antituumorivaikutus koska se kiertää korvaavista takaisinkytkentäsilmukan välillä väyliä. Olemme tutkineet yhdistetty vaikutus PI3K estäjän, GDC0941 ja MEK estäjä, AZD6244, solujen elinkelpoisuuden apoptoosin ja solusignalointia paneelissa haimasyövän solulinjoissa.

in vivo

analyysi tehtiin haimasyöpä ksenograftien. Vaikka BxPC-3 (KRAS villityypin) ja MIA PaCa-2 (KRAS mutatoidun) solulinjat olivat herkkiä GDC0941 ja AZD6244 yksittäisinä aineina, synergistinen tuumorin solujen kasvua ja apoptoosin induktio havaittiin molemmissa solulinjoissa, kun kahta lääkettä yhdistettiin. Mielenkiintoista, fosforylaatio korkki riippuvan translaation komponentteja, 4E-sitova proteiini (p-4E-BP1) ja S6 todettiin olevan tiiviisti herkkyys GDC0941 ja AZD6244. In BxPC-3 solujen ksenografteissa, selviytymisen eroja havaittiin kontrollin ja AZD6244, GDC0941, ja yhdistelmä ryhmiä. Tutkimuksemme tarjoaa perustelut samanaikaista kohdentamista PI3K ja MEK polkuja, riippumatta KRAS asemasta, ja ehdottaa, että fosforylaatio 4E-BP1and S6 voi toimia ennustavan biomarkkeri hoitovasteen.

Citation: Zhong H , Sanchez C, Spitrzer D, Plambeck-Suess S, Gibbs J, Hawkins WG, et al. (2013) synergiavaikutuksen Samanaikainen piirityksen PI3K ja MEK Pathways in Haimasyöpä prekliinisissä. PLoS ONE 8 (10): e77243. doi: 10,1371 /journal.pone.0077243

Editor: Adriano Angelucci, University of L’Aquila, Italia

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 30 elokuu 2013; Julkaistu: 09 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Zhong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: julkaisu tukivat Washington University Institute of Clinical and Translational Sciences Grant UL1TR000448 National Center for edistäminen Translational Sciences (MCATS) ja KL2TR000450. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten ja naisten Yhdysvalloissa. Arviolta 43140 ihmistä oli diagnosoitu ja 36800 kuoli haimasyövän 2013 [1]. Puute seulontamenetelmien ja tehokkaita terapeuttisia aineita tekevät havaitsemiseen ja hoitoon haimasyövän vaikea ongelma. Vaikka kohdennettuja aineet ovat valtavirtaan muiden syöpien, tällä hetkellä vain kasvutekijän reseptorin estäjä Erlotinibin on saanut hyväksynnän Food and Drug Administration hoitoon haimasyövän [2]. Valitettavasti kliininen hyöty erlotinibin rajoittuu lähinnä johtuu sen melko vaatimaton kliinistä hyötyä, mikä jatkuva kiire kehittää kohdennettuja tekijöille haimasyövän.

Läsnäolo KRAS mutaatio nähdään 30% syöpää edeltävät leesiot [3] ja jopa 90% haimasyövän kasvain yksilöt [4], mikä viittaa siihen, että KRAS-mutaatio on hallitseva tunnettu ominaisuus haimasyövän molekyylitason synnyssä. KRAS on GTPaasina, ja se muuntaa solunulkoisia signaaleja solunsisäisiä signaaleja pyöräily välinen aktiivinen (RAS-GTP) ja aktiivinen (RAS-BKT) toteaa. Mutatoitunut KRAS tulokset jatkuvassa aktivointi RAS reitin lukitsemalla RAS aktiiviseksi GTP-sitovaa tilaan ja edelleen käynnistää useita alavirran signalointireittien myös solujen jakautumista, apoptoosia, erilaistuminen ja eloonjääminen [5]. Kohdistaminen suoraan KRAS ei ole onnistunut, jos potilaalla on haimasyöpä [6], joten nykyinen tutkimus ponnistelut ovat kohdennettu uudelleen kaksi myötävirtaan polkuja, fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /AKT-reitin [7] ja RAF /MEK-reitin [8 , 9].

Koska soluviestitykseen verkot ovat monimutkaisia, yksinkertaisesti estämällä yksi sovittelija ei todennäköisesti johda merkittävään kliinisen vasteen, ellei geneettinen vaihtelu tekee kohdennettu ”efektori” olla oncologically ajettu tapahtuma. Tämä tuskin pitää paikkansa KRAS loppupään reittejä, havainnollistaa erittäin alhainen esiintyvyys PIK3CA tai BRAF mutaatioita haimatuumorien [10]. Siksi on oletettu, että samanaikainen salpaus kahdessa rinnakkaisessa väyliä kuten PI3K ja MEK lisää merkittävästi mahdollisuus onnistuttu saavuttamaan kliinisesti merkittävää vastausta. Todellakin, synergistinen anti-kasvain vaikutuksia ei ole havaittu, kun PI3K /AKT ja MEK reitit sekä esti prekliinisissä kasvainmuodoista [11], mukaan lukien KRAS mutatoitunut keuhkosyöpä malli [12].

GDC0941 on suullinen agentti kehitetty estämään kaikki neljä luokan І PI3K-isoformien [13]. Se on annoksesta riippuvainen tuumorin vastaista aktiivisuutta glioblastoma ja ihmisen munasarjasyövän ksenografteja [14]. GDC0941 on osoittanut lupaavia antituumorivaikutuksen prekliinisen ympäristössä, ja se on parhaillaan testattavana varhaisessa vaiheessa kliinisissä tutkimuksissa [14]. AZD6244 on voimakas, selektiivinen toissijainen sukupolvi MEK1 /2-estäjä, joka estää MAPK /ERK käytettäessä ATP-kilpailukyvyttömän muoti [15]. Yhdessä muiden MEK estäjien, AZD6422 on tällä hetkellä alkuvaiheessa kliinisissä kokeissa [16-18]. Prekliiniset arvioinnit yhdistämällä PI3K /AKT-estäjällä ja MEK estäjää haimasyövän on syntymässä [19], ja meidän tutkimus vahvistaa, että synergistinen vaikutus ilmenee, kun estää näitä kahta väylää. Lisäksi olemme edelleen havainnollistettu, että hyöty samanaikainen saarto ei KRAS genotyypin rajoitettu. Lisäksi meidän tutkimus osoittaa, että sitä prosessia, erityisesti, aktivointi 4E-sitovan proteiinin 1 (4E-BP1) ja S6 näyttää liittyvän haimasyöpäsoluissa ”fenotyyppisen vasteen kohti estäjiä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja estäjät

Haimasyöpä solulinjoissa, BxPC-3 (KRAS villityypin), MIA PaCa-2 (KRAS mutantti), PANC-1 (KRAS mutantti) ja Capan -2 (KRAS mutantti) saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja viljeltiin kasvualustassa joko DMEM (PANC-1, MIA PaCa-2), RPMI-1640 (BxPC-3) tai McCoyn 5A-alustassa (Capan-2), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 1 mM natriumpyruvaattia, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. PI3K-estäjä GDC0941 ja MEK-inhibiittori AZD6244 hankittiin Selleck Chemicals LLC (Houston, TX, USA) ja liuotettiin dimetyylisulfoksidiin. Molemmat inhibiittorit säilytettiin -20 ° C: ssa.

solunelinkykyisyysmääritys

haimasyöpä solulinjoja ympättiin tiheydellä 3000 solua per kuoppa 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle kasvualustaan ​​ja annetaan kiinnittyä yön yli. GDC0941 tai AZD6244 annos-vaste määritettiin käsittelemällä haimasyöpäsoluissa linjat 5 pitoisuuksilla lääkkeitä perustuu 10-kertainen laimennossarja. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 72 tuntia myöhemmin Alamar Blue (Invitrogen, NY, USA) (570λ

Ex /580λ

Em) fluoresoivalla mikrolevylukijalla, ja ilmaistaan ​​prosenttiosuutena lääkkeen käsiteltyjä soluja suhteessa kontrolliin ( ilman lääkettä) soluja. Tiedot analysoitiin käyttäen GraphPad Prism 5 -ohjelmaa (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA), ja annos-vaste-käyrä, joita käytetään laskettaessa lääkkeen konsentraatio johtaa 50%: n inhibition solujen elinkelpoisuuden (IC

50) käyttäen neljän muuttujan logistista mallia. Kaikki määritykset toistettiin viisi kertaa.

lääkeyhdistelmä tutkimuksia, synergistisen vaikutuksen arvioitiin yhdistelmän indeksi (CI), menetelmän mukaisesti Chou Talalay jossa synergia on määritelty CI 1, kun taas antagonismi on CI 1, ja additiivinen vaikutus pidetään CI = 1 [20]. Solulinjoja käsiteltiin GDC0941, AZD6244 tai yhdistelmä GDC0941 ja AZD6244, ja elävien solujen lukumäärä oli laskennassa käytetty CI-arvot käyttäen CalcuSyn-ohjelmisto (Biosoft, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta).

Apoptosis Assay

Noin 2 x 10

5-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla GDC0941, AZD6244 tai yhdistelmä GDC0941 ja AZD6244 72 tuntia. Solut otettiin talteen 0,25% trypsiiniä, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja kerätään yhdessä sentrifugoimalla. Sitten solut värjättiin anneksiini V-FITC ja PI-liuosta (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) valmistajan ohjeiden ja analysoitiin FAC scan virtaussytometrillä (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) . Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western blot -määritys

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille

in vitro

analyysejä. Kun solut tuli 70-80% konfluentteja, niitä inkuboitiin GDC0941, AZD6244 tai molemmat GDC0941 ja AZD6244 24 tuntia. Sitten solut pestiin kylmällä PBS: llä, ja lyysattiin RIPA-puskuriin (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, proteaasi-inhibiittorit ). Supernatantit kerättiin sen jälkeen ultraäänellä ja sentrifugoimalla ja yhtä suuret määrät proteiineja ajettiin elektroforeesilla 4-12% Bis-Tris-geelillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa yli yön inkuboinnin kanssa, sopivan primaarisen vasta-4 ° C: ssa. Kaikki primaaristen vasta-aineiden inkuboitiin 5% naudan seerumin albumiinia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Kalvot pestiin 3 kertaa poistamiseksi sitoutumattoman vasta-aineen ja sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kalvot käsiteltiin tehostetun kemiluminesenssin reagenssit mukaan valmistajan protokollan (GE Healthcare Life Science, PA, USA). Primaaristen vasta-aineiden mukana anti-fosfo-AKT (Ser473), anti-Akt, anti-fosfo-ERK (T202 /Y204), anti-ERK, anti-fosfo-S6 (S240 /244), anti-S6, anti-fosfo- 4E-BP1 (S65) ja anti-4E-BP1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). ImageJ (freeware) käytettiin vertaamaan tiheyden bändejä ja loppuun densitometrinen analyysi.

In vivo tutkimukset

Nude hiiriä, 4 tai 5-viikkoa vanha, hankittiin National Cancer Institute. Ne totutettu 1-2 viikkoa ennen niiden alistettiin mitään koetoimenpiteet. BxPC-3-solut (1×10

6) injektoitiin ihon alle (s.c.) osaksi hiiri kylkiin. Tuumoritilavuudet mitattiin kahdessa ulottuvuudessa (pituus ja leveys) jarrusatulat ennen hoitoa ja kaksi kertaa viikossa kerran hoito aloitettiin. Myös hiiriä punnittiin näinä aikoina, ja painon muutokset laskettiin seuraavien vakiomuotoinen: [1- (uusi paino /alkupaino)] x 100. Kasvaimen kokoa laskettiin vakiokaavalla kasvaimen koon = pituus x leveys

2 x 0,5. Hiiret, kehittyi kasvaimia saavuttaa 100-150 mm

3 kooltaan satunnaistettiin neljään ryhmään 8 hiirtä kussakin ryhmässä: ajoneuvo, GDC0941, AZD6244, tai yhdistelmähoito. Molemmat lääkkeet annettiin kerran tai kahdesti vuorokaudessa suun kautta letkulla tilavuutena 10 ml /kg kehon painoa. Lääkkeet liuotettiin ajoneuvoon 0,5% (w /v) metyyliselluloosa /0,2% Tween 20 antoon. PI3K-estäjä annettiin päivittäin loppupitoisuudeksi 50 mg /kg [14], kun taas MEK inhibiittoria annettiin kahdesti päivässä, lopullinen pitoisuus on 25 mg /kg [15]. Kontrollieläimet saivat vastaavan määrän 0,5% metyyliselluloosa /0,2% Tween 20 ainoastaan, kaksi kertaa päivässä letkulla suun kautta. Hoidon kesto oli 18 päivää. Jos hiiren kasvain halkaisija tuli yli 15 mm: n hoidon aikana tai hiiren painoa laski 20% verrattuna alkuperäiseen painoon, hiiren olisi lopetettiin CO

2 yliannostus. Kaikki tutkimukset suoritettiin pöytäkirjan mukaisesti hyväksymän Washington University Institutional Animal Care Facility (Protocol numero: 20100114).

TILASTOANALYYSI

Solun elinkelpoisuus tiedot olivat edustettuina keskiarvo ± standardi poikkeama (SD). Apoptoosia tiedot ja kasvaimen kasvun kokeissa olivat edustettuina keskiarvo ± keskivirhe keskiarvo (s.e.m.). Kaplan-Meier -käyrät käytettiin selviytymisen analyysejä. Tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä ANOVA (yksittäinen tekijä) ja t-testin (pariksi kaksi näytettä varten keinoja ja pariton t-testi), kuten on osoitettu. P-arvo on 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

samanaikainen estäminen PI3K ja MEK on synergistinen vaikutus haimasyövän solulinjoissa kasvu

in vitro

määrittää kasvainten vastainen aktiivisuus PI3K ja MEK-inhibiittoreita yksinään ja yhdistelmänä

in vitro

, neljä haimasyövän solulinjoissa, valittiin tutkimukseen. BxPC-3 on KRAS villityypin haimasyöpä solulinja, kun taas muut kolme solulinjat satama KRAS mutaation. Kaikki neljä solulinjat eivät ole tiedossa kuljettaa joko PI3K tai BRAF mutaatioita [21]. Anti-proliferatiivista vaikutusta PI3K tai MEK-inhibiittori yksin BxPC-3, MIA PaCa-2, PANC-1 ja Capan-2-soluissa mitattiin Alamar Blue. Vain kasvun BxPC-3 ja MIA PaCa-2-soluissa vaikutti GDC0941. Pitoisuudet GDC0941 tuloksena 50%: n inhibition solujen elinkelpoisuuden (IC

50) 72 tunnin jälkeen, olivat 376,4 nM BxPC-3-soluissa ja 754,6 nM MIA PaCa-2-soluja (kuvio 1A). AZD6244 yksin myös tukahdutetaan solujen kasvua IC

50 arvoon 599 nM ja 375 nM BxPC-3 ja MIA PaCa-2-soluissa, vastaavasti (kuvio 1 B). IC

50 ei saavutettu PANC-1 ja Capan-2-solujen linjat ja sen seurauksena niiden katsottiin olevan vastustuskykyisiä solulinjoja. Teimme tarkkailla hieman enemmän PANC-1 solujen kasvua GDC0941at 1 nM, 10 nM, ja 100 nM, mutta muutokset eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (vertailuryhmä vs. 1 nM, p = 0,32, ohjaus vs. 10 nM, p = 0,17, ohjaus vs 100 nM , p = 0,22). Lisäksi vertasimme ohjaus vs 1 nM AZD6244 in PANC-1 ja MIA PaCa-2-soluissa, eikä merkittäviä eroja ei havaittu (p = 0,20, p = 0,64, vastaavasti) B

Soluja käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla of GDC0941 (A) tai AZD6244 (B) yksinään 72 tunnin ajan. Annokset vaihtelivat 1 nM 10 uM.

anti-proliferatiivista vaikutusta yhdistämällä PI3K ja MEK-inhibiittori mitattiin BxPC-3 ja MIA PaCa-2-soluissa laskemalla yhdistelmä-indeksi (CI) mukaan Chou-Talalay menetelmä (20) käyttäen kiinteää annosta suhde. Molemmat GDC0941and AZD6244 esiteltiin soluviljelmiin 0,25 ×, 0,5 ×, 1 ×, 2 x ja 4 × niiden IC

50s vuonna BxPC-3 ja MIA PaCa-2 solulinjoissa. Solujen kasvua sekä solulinjoissa oli merkittävästi vähentynyt seuraavan yhdistelmän hoidon useilla pariksi pitoisuuksina verrattuna joko monoterapiana yksin. Tiedot arvioitiin saada CI asianmukaiseen tehokas annos (ED) in BxPC-3 ja MIA PaCa-2 solulinjoissa (kuvio 2) mukaan CalcuSyn- ohjelmisto. Sillä BxPC-3 solulinja seuraavat CI-arvot saatiin: 0,4101 (ED50), 0,0112 (ED75) ja 0.0003 (ED90). Sillä MIA PaCa-2 solulinjan CI-arvot olivat 0,02052 (ED50), 0,0295 (ED75) ja 0,0440 (ED95). CI-tulokset viittaavat siihen, että GDC0941 ja AZD6244 toimi synergisesti tuottamaan antiproliferatiivista vaikutusta BxPC-3 ja MIA PaCa-2 solulinjoissa (kuvio 2A-B).

BxPC-3 (A) ja MIA PaCa-2-solut (B) käsiteltiin GDC0941 yksin, AZD6244 yksin tai GDC0941-AZD6244 yhdistelmänä. Tulokset analysoitiin mukaan Chou-Talalay menetelmä [18]. Yhdistelmä-indeksi (CI) arvot laskettiin käyttäen CalcuSyn-ohjelmisto. PANC-1 (C) ja Capan-2-solulinja (D) käsiteltiin GDC0941 400 nM, AZD6244 200 nM tai yhdistelmänä. * P-arvo 0,05 verrattuna valvontaa tai ainoana lääkkeenä yksinään.

Mielenkiintoista, kun taas GDC0941 tai AZD6244 yksinään ei vaikuttanut PANC-1 ja Capan-2 solujen kasvua, hallitsee näitä kahta lääkettä samanaikaisesti lievästi esti solujen kasvua. Solujen kasvu aleni 71,4% ja 67,0% vuonna PANC-1 ja Capan-2 solulinjoissa vastaavasti annostelun jälkeen lääkkeitä yhdistelmänä (p 0,05, yhdistelmä verrattuna käsittelemättömän ryhmän tai ainoana lääkkeenä yksinään) (Kuva 2C D).

samanaikainen PI3K ja MEK esto indusoi apoptoosia haimasyövän solulinjoissa

in vitro

määrittämiseksi apoptoottisen vaikutuksen yhdistetyn hoidon kahta eri pitoisuuksia GDC0941 ja AZD6244 käytettiin yksinään ja yhdistelmänä. Vaikka apoptoosin määrä BxPC-3-soluissa lähtötilanteessa oli 17,0%, se kasvoi merkittävästi 34,0% ja 47,8% antamisen jälkeen GDC0941 380 nM ja 1520 nM, vastaavasti (p 0,05, GDC0941 yksin vs. käsittelemätön ryhmä). AZD6244 yksin 600 nM ja 2400 nM lisäsi apoptoosin määrä BxPC-3 solujen 26,5% ja 27,2%, vastaavasti (p 0,05, AZD6244 yksin vs käsittelemätön ryhmä). Yhdistelmä GDC0941 ja AZD6244 johti paljon korkeampi apoptoosin BxPC-3-soluissa verrattuna kontrolliryhmään tai inhibiittorin. Yhdistelmä GDC0941 380 nM ja AZD6244 600 nM tai yhdistelmä GDC0941 at 1520 nM ja AZD6244 2400 nM lisäsi BxPC-3-solujen apoptoosin korko 63,3% ja 82,8% vastaavasti (p 0,05, yhdistelmä vs. käsittelemätön ryhmä tai ainoana lääkkeenä yksinään) (kuvio 3A). Nopeus apoptoosin lähtötilanteessa MIA PaCa-2-soluissa oli 8,0%, ja se nousi 17,4% ja 24,7% kanssa GDC0941 annettiin 400 nM ja 1600 nM, vastaavasti (p 0,05, GDC0941 yksin vs. käsittelemätön ryhmä). AZD6244 yksinään 200 nM tai 800 nM lisäsi apoptoosin korko 22,7% ja 36,9%, vastaavasti (p 0,05, AZD6244 yksin vs. käsittelemätön ryhmä). Yhdistelmä GDC0941 400 nM ja AZD6244 200 nM tai yhdistelmä GDC0941 at 1600 nM ja AZD6244 800 nM lisäsi MIA PaCa-2 apoptoosin korko 49,5% ja 55,6%, tässä järjestyksessä, ja tämä oli tilastollisesti merkitsevä ero verrattuna ja käsittelemättömän ryhmän tai yhden aineen yksinään (p 0,05) (kuvio 3B). Resistenttien solulinjojen PANC-1 ja Capan-2, kun taas kumpikaan aine yksinään oli merkittävä vaikutus apoptoosiin, yhdistelmä PI3K ja MEK estäjä johti apoptoosin osuus 31,8% vuonna PANC-1-solut; Tämä oli tilastollisesti merkitsevä verrattuna 14,0% apoptoosin korko näissä soluissa ilman hoitoa tai yhdellä estäjän (p 0,05) (kuvio 3C). Yhdistäminen GDC0941 ja AZD6244 myös lisäsi merkittävästi apoptoosin kurssi Capan-2 solujen 41,3% verrattuna 12,2% ilman hoitoa tai ainoana lääkkeenä yksinään (p 0,05) (kuvio 3D).

Haimasyöpä solu linjat käsiteltiin GDC0941 yksin, AZD6244 yksin tai GDC0941-AZD6244 yhdessä 72 tuntia. Apoptoosia havaittiin virtaussytometrialla. A, B: yhdistelmät vs. hoitamaton ryhmiä (* p-arvot 0,05), yhdistelmiä vs. yksittäisillä aineilla (* p-arvot 0,05), yksittäisillä aineilla vs. hoitamaton ryhmiä (* p-arvot 0,05). C, D: yhdistelmät vs. hoitamaton ryhmiä (* p-arvo 0,05) ja yhdistelmät vs. yksittäisinä aineina (* p-arvo 0,05).

vaikutukset PI3K ja MEK estoja solun signalointi

arvioida molempien huumeiden myötävirtaan efektorien PI3K ja MEK polkuja, käytimme Western blot-analyysi tarkkailla kokonaisproteiinin ilmaisun ja fosforylaatio tila. Proteiinin kokonaismäärän tasot ERK, S6 ja 4E-BP1 pysyi muuttumattomana sen jälkeen, kun hoidon GDC0941 ja AZD6244 kussakin solulinjoissa (kuvio 4). p-ERK, p-S6 ja p-4E-BP1 näytti tukahduttaa GDC0941 ja AZD6244 yhdistelmähoito. Olemme kuitenkin havaittu muutoksia AKT ilmentymisen seuraavista yhdistelmistä lääkehoidot, ja densitometrinen analyysi on käytetty määrällisesti ekspressiotasoja. Käytimme suhde p-AKT /AKT tuotetaan kunkin annoksen vertailua varten. Sen jälkeen p-AKT /AKT tasot hoitoryhmien normalisoituivat suhde käsittelemättömän ryhmän, yhdistelmähoitoa havaittiin tukahduttaa p-AKT-pitoisuutta 90% vuoden BxPC-3 solulinja, 6% vuonna MiaPaca-2 solulinja, 29% vuonna PANC-1-solulinjassa, ja 8% vuonna Capan-2 solulinjassa. Yhdistelmä molempien lääkkeiden pienentää p-ERK (T202 /Y204), p-AKT (S473), p-S6 (S240 /244) ja p-4E-BP1 (S65) ilmentyminen verrattuna lähtötilanteeseen kaikissa testatuissa solulinjoissa. Kun taas p-AKT ja p-ERK-tasot ilmentyvät differentiaalisesti neljä solulinjoissa, tutkimuksemme osoitti, että lähtötasolle p-AKT ei ennustanut vastaus PI3K-estäjä, eivätkä perustason p-ERK tasot ennustavat vastaus MEK estäjä.

Kaikki neljä haimasyövän solulinjoissa hoidettiin GDC0941-AZD6244 yhdistelmä 24 tunnin ajan, solulysaatit sitten talteen havaita p-AKT (S473) /AKT, p-ERK (T202 /Y204) /ERK, p-S6 (S240 /244) /S6 ja p-4E-BP1 (S65) /4E-BP1.

Ymmärtääksemme fenotyyppiset erot nähdään MIA PaCa-2 (herkkä ja GDC0491 ja AZD6244) ja PANC-1 (resistenttejä GDC0491 ja AZD6244) solulinjat, jotka molemmat satama KRAS mutaatio, tutkimme eroja niiden alavirran efektoreja seuraavat GDC0941 ja AZD6244 anto (kuvio 5). Molemmissa solulinjoissa, GDC0941 tukahdutti fosforylaatiota AKT, AZD6244 laski p-ERK tasolla, ja näiden kahden yhdistelmä lääkkeiden tukahdutti sekä p-AKT ja p-ERK tasoilla. GDC0941 ja AZD6244 oli samanlainen vaikutus AKT ja ERK kahdessa solulinjoissa. Mielenkiintoista, vaikutus molempien estäjien p-S6 ja p-4E-BP1 tasoilla oli vaihtoehtoisesti solulinjassa erityisiä. Esimerkiksi, GDC0941 ja AZD6244 yksinään ja yhdistelmänä, inhiboitui merkittävästi p-S6 ja p-4E-BP1expression tasot MIA PaCa-2-soluissa, verrattuna vähäinen vaimennus havaitaan PANC-1-soluissa (kuvio 5). Kumpikaan GDC0941 eikä AZD6244 yksin tukahdutettu p-S6 ja p-4E-BP1 in PANC-1-soluissa, mikä viittaa siihen, että molemmat effektorit voivat toimia biomarkkereita liittyy hoitovastetta. Ilmaisu tasot p-S6 ja p- 4E-BP1 merkittävästi tukahdutti yhdistelmähoitoa MIA PaCa-2-soluissa, ja tämä oli sopusoinnussa solulinjan n fenotyyppinen vasteita kohti yhdistelmähoidon.

Molemmat MIA PaCa -2 ja PANC-1-soluja käsiteltiin 400 nm GDC0941, 200 nM AZD6244 tai yhdistelmä näillä annoksilla 24 tuntia. Soluproteiinijäämiä kerättiin sitten havaita p-AKT (S473) /AKT, p-ERK (T202 /Y204) /ERK, p-S6 (S240 /244) /S6 ja p-4E-BP1 (S65) /4E-BP -1.

Anti-kasvain vaikutukset PI3K ja MEK estoja

in vivo.

havaitsemiseksi vaikutuksen GDC0941 ja AZD6244 kasvaimen kasvuun

in vivo

, käytimme GDC0941, AZD6244, ja yhdistelmä GDC0941and AZD6244 hoitoon BxPC-3-ksenografti hiirille 18 päivää. Kontrolliin verrattuna (ajoneuvo) ryhmä, kasvaimen laskivat merkittävästi AZD6244 ja yhdistelmä ryhmät (p = 0.037 ja p = 0,032, vastaavasti) mutta ei GDC0941group verrattuna kontrolliin (kuvio 6A). Perustuu Kaplan-Meier -käyrät (kuvio 6B), oli tilastollisesti merkittävä ero selviytymisen joukossa neljään ryhmään (p = 0,005).

V: 1 x 10

6 BxPC-3 haimasyöpä solut injektoitiin sc oikeaan kylkeen naisten nude-hiirissä. Hiiret saivat vehikkeliä (0,5% metyyliselluloosa /0.2% Tween-20), 50 mg /kg GDC0941 QD, 25 mg /kg AZD6244 BID, tai 50 mg /kg GDC0941 QD plus 25 mg /kg AZD6244 BID suun kautta 18 päivää. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. * P-arvot määritettiin pariton t-testi. B: Kaplan-Meier eloonjäämiskäyristä ksenograftien vastaanottaa ajoneuvon GDC0941 yksin, AZD6244 yksin ja GDC0941-AZD6244 yhdistelmänä.

Keskustelu

Vaikka täsmähoitoihin on tullut valtavirran lähestymistapa syövän hoidon kliininen kehittäminen kohdennettujen aineiden haimasyövän ei ole onnistunut. Koska tiheä KRAS mutaatioiden haimasyövän, KRAS on ollut suoraan prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa, mutta tulokset ovat olleet pettymys. Valossa näiden haasteiden tutkimus ponnistelut ovat kohdennettu uudelleen kohdistaminen KRAS loppupään polkuja, PI3K ja MEK. Hyöty estää yksittäisen reitin on suurelta osin rajoitettu läsnäolo korvaavana takaisinkytkentäsilmukan välillä PI3K ja MEKin. Esimerkiksi, inhibitio MEK reitti johtaa aktivoinnin PI3K-reitin [11], ja PI3K aktivointi välittää MEK inhibition [22]. Tämän kiertämiseksi korvaavia palautetta, samanaikainen salpaus kahden reitin on testattu, ja synergiaa antituumorivaikutuksia havaittiin, tarjoamalla perustelut vaiheen I kliinisissä kokeissa. Lisäksi ensimmäisiä merkkejä kliinisen hyödyn on raportoitu pitkälle kehittynyt syöpä retrospektiivisellä analyysi saavilla potilailla aineita, jotka kohdistuvat sekä reitit [23].

Toisin työskennellä muun tyyppisiä kasvaimia, prekliinisen arvioinnit vähen- tämisessä sekä reittejä haimasyövän ovat rajoittuneet [19,24]. Tutkimuksemme on tärkeä monessa suhteessa. Ensimmäinen, olemme osoittaneet, että herkkyys haimasyövän solulinjoissa joko kohti PI3K tai MEK-inhibiittoreita ei ole KRAS riippuvainen. Vaikka eroavat KRAS tila, BxPC-3 ja MIA PaCa-2-solut ovat villityypin PI3K ja PTEN, ja molemmat olivat herkkiä sekä estäjiä, joka on sopusoinnussa aiemmin julkaistu raportteja [22,25]. Toiseksi, meidän tutkimus osoitti, että PI3K ja MEK inhibitio joko yksin tai yhdessä voi indusoida apoptoosin. Aiemmin huumeita kohdistaminen PI3K tai MEK ajateltiin olevan enemmän sytostaattinen vaikutus, mutta tuoreessa raportissa ehdotetaan, että tämä vaikutus on apoptoottinen [26] Kolmanneksi, meidän tutkimus on osoittanut synergiaa tukahduttaminen solujen kasvua ja apoptoosin induktio kahdessa herkillä solulinjoja (BxPC-3 ja MIA PaCa-2) yhdistelmällä hoito. Lisäksi lievä inhibointi solujen kasvua ja apoptoosin induktio havaittiin lääkeaineen yhdistelmän resistenttejä solulinjoja (PANC-1 ja Capan-2). Vaikka aste hyötyä yhdistelmähoito oli vaatimatonta sekä vastustuskykyisiä solulinjoja, lisää ymmärrystä tämän edun takuuaika on tuhoisan taudin. Tutkimuksemme tukee vastaavaa prekliinisen tutkimuksen haimasyövän, joka osoitti, että hoito hyöty MEK estäjän tehostettiin AKT- estäjällä [24].

Keskeinen tekijä täsmähoitoihin kehitys on määrittää molekyylimarkkereina ennustavia hoitotuloksiin. PI3K koulutusjakso muutoksia kuten HER2 vahvistus, PI3KCA mutaatioita tai PTEN menetys on havaittu olevan yhteydessä herkkyys GDC0941 rintasyövän solulinjoissa

in vitro

ja

in vivo

[27]; Kuitenkin edellä geneettinen alternations ovat harvoin läsnä haiman kasvaimissa [21]. Tutkimuksemme osoittaa, että alavirtaan p-AKT tukahdutti GDC0941 ei ennusta solun herkkyyttä, eikä vaimentua p-ERK ennustaa herkkyys AZD6244. Tämä havainto on yhdenmukainen aikaisempien raporttien [27].

edelleen ymmärtää molekyylitasolla jälkeisiä tapahtumia samanaikaisen salpauksen molemmissa KRAS muuntunut solulinjoissa, vertasimme proteiinin ilmentymistä PANC-1 (kestävä) ja MIA PaCa- 2 (herkkä) solulinjat. Nämä kaksi solulinjat eroavat fenotyyppisen vastauksena PI3K ja ERK inhibiittoreina huolimatta kätkeminen samanlaisia ​​suuria geneettisiä alternations. Molemmat solulinjat raportoidaan sisältävän KRAS mutaatioita p53 mutaatioita, villityypin P16 ja villityypin DPC-4 [21]. Vaikka meidän tutkimuksessa osoitimme, että suppressio p-AKT, että PI3K-inhibiittori ja p-ERK jonka MEK estäjä saavutettiin molemmissa solulinjoissa, PANC-1-soluja ollut vain vähäinen vaimennus p-S6 ja p-4E-BP1 kun hoidettiin joko PI3K tai MEK estäjä yksin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että PI3K tai MEK inhibiittorit yksinään pystyvät tukahduttaa niiden välittömässä vastaavan loppupään välittäjien (AKT ja ERK) in PANC-1-solut, mutta eivät pysty downregulate edelleen myötävirtaan välittäjien (p-S6 ja p-4E-BP1 ). Molemmat markkerit ovat näin tiiviisti herkkyys sekä PI3K ja MEK estäjiä. Monimutkaisessa signalointiverkolla kohdennettuna agentin kykyä estää fosforylaatiota prosessi sen loppupään tavoitteita usein ei kääntää fenotyyppiset muutokset. Esimerkiksi Serra et al ovat raportoineet tunnistaminen muutamia geenejä, jotka saattavat edistää solujen eloonjäämistä yhteydessä PI3K saarto, ja joukossa geenejä, ribosomaalisen S6-kinaasien RPS6KA2 (RSK3) ja RPS6KA6 (RSK4) ollaan edelleen validoitu edistää PI3K vastus

in vitro

ja

in vivo

kautta vaimeneminen apoptoottisen prosessin ja säätelyä proteiinin käännös [28]. Havaintomme resonoi kehittyvien todisteita siitä, että alavirtaan cap-riippuvaisten käännös saattaa olla parempi indikaattori vastaus näihin kohdennettuja tekijöille [29,30].

4E-BP1 on merkittävä rooli cap-riippuvaisten käännös. Se sitoutuu elF4E-mRNA cap kompleksi estää cap-riippuvaisten käännös- ja fosforyloitu 4E-BP1 sitten putoaa translaatiokompleksin, joten aloittaminen kääntämisen voi aloittaa [31]. mTORC1, efektori alavirtaan PI3K-reitin, voi fosforyloida 4E-BP1 aloittaa käännös prosessi [32]. Ratkaiseva rooli 4E-BP1 kuin avainefektori että AKT ja ERK signalointireitteihin kasvaimissa on tyylikkäästi tutkineet Hän et al [29]. Lisäksi korkeat ekspressiotasot 4E-BP1 on todettu olevan ennusteen arvioinnissa useissa kasvaintyypeissä [33-37]. Siksi tutkia tarkemmin kohdistaminen 4E-BP1 olisi tutkittava jatkossa useita kasvain tyypit, mukaan lukien, ja erityisesti, haimasyöpä.

Yhteenvetona olemme tutkineet hyödyksi samanaikaisten reitin salpauksesta PI3K ja MEK inhibiittorit yksinään ja yhdistelmänä haimasyövän. Synergy laskeva solujen kasvua havaittiin ja vaikutukset eivät olleet KRAS riippuvaisia. Pysyvät fosforylaatiota S6 ja 4E-BP1 näyttivät liittyvän resistenssin PI3K ja MEK estäjiä. Tulevaisuuden tutkimuksia vaihtoehtoisin 4E-BP1 fosforylaation ja kohdistamista 4E-BP1 haimasyövän ovat perusteltuja.