Krooninen sairaus

tiivistelmä

kuolleisuus eturauhassyöpään (PCA) johtuu muodostumista etäpesäkkeitä. Ymmärtäminen, että prosessi on säännelty on siksi ratkaisevan tärkeää. Olemme aiemmin osoittaneet, että endogliinin, tyypin III transformoiva kasvutekijä β (TGFP) superperheen reseptorin, estää ihmisen PCa invaasio ja metastaasi. Endogliini välittämää tukahduttaminen invaasio myös osoittaneet meidän olevan riippuvainen tyypin I TGF-reseptoriin, activin reseptorin kaltainen kinaasi 2 (Alk2), ja alavirtavaikuttajainhibiittorit, Smad1. Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että kaksi tyypin II TGF reseptoreita tarvitaan endogliini välittämää tukahduttaminen invaasio: aktiiviinimolekyylien Reseptori tyyppi II A (ActRIIA) ja luun morfogeneettinen proteiini-reseptorin tyypin II (BMPRII). Alavirran signalointia näiden reseptorien kautta välittyy pääasiassa mukaan Smad1. ActRIIA stimuloi Smad1 aktivointi on kinaasi-riippuvaisella tavalla, ja tämä edellyttää tukahduttamista hyökkäystä. Toisin BMPRII säätelee Smad1 kaksivaiheisesti tavalla edistää Smad1 signalointi kautta kinaasialue vaan tukahduttaa sen kautta sytoplasminen häntä. BMPRII n Smad1-säätelyvaikutukset riippuvat sen ekspressiotason. Lisäksi sen kyky tukahduttaa hyökkäys on riippumaton joko kinaasin funktion tai häntää domain. Osoitamme, että ActRIIA ja BMPRII fyysisesti vuorovaikutuksessa, ja että kukin toimii vuorovaikutuksessa endogliini. Nykyinen havainnot osoittavat, että molemmat BMPRII ja ActRIIA ovat välttämättömiä endogliini välittämää tukahduttaminen ihmisen PCa soluinvaasiota, että niillä on ero vaikutuksia Smad1 signalointi, että he tekevät erillisiä maksuja sääntelyn hyökkäystä, ja että ne toiminnallisesti ja fyysisesti vuorovaikutuksessa.

Citation: Breen MJ, Moran DM, Liu W, Huang X, Vary CPH, Bergan RC (2013) Endoglin välittämää Suppression Eturauhassyöpä Invasion säätelee aktiviinilla ja luun morfogeneettinen proteiini tyypin II reseptorit. PLoS ONE 8 (8): e72407. doi: 10,1371 /journal.pone.0072407

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 syyskuu 2012; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2013; Julkaistu: 13 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Breen et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health RCB, CA122985. Työtä tukee osittain Malkin Tutkijat ohjelmia Robert H. Lurie Kattava Cancer Center of Northwestern University kautta palkinnon MB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus USA miehillä [1], jossa olennaisesti kaikki kuolemat johtuvat etäpesäkkeitä [2]. Etäpesäke on erittäin tehoton prosessi, jossa solut on voitettava lukuisia esteitä, ensimmäinen joista yksi on paeta syntypaikalla hankkimalla invasiivisen fenotyypin [3]. Signalointi kautta TGFp superperheen ja siihen liittyvien reseptorien on keskeinen säätelijä tämän prosessin lukuisissa syöpätyypeissä [4], mukaan lukien Eturauhassyövän [5].

TGFli on prototypical perheeseen ekstrasellulaarisen ligandien – josta on 33 nisäkkäillä – jotka säätelevät lukuisat kehitys- ja homeostaattisia prosesseja, ja näin ollen poistaa suhteellisen konservoituneen signalointimekanismin [6]. Jossa kanoninen TGFli signalointi, ligandin sitoutuminen indusoi oligomerisaatioon dimeerejä seriini /treoniini-kinaasi tyypin I ja tyypin II reseptorien (RIS ja Riis, vastaavasti), jossa konstitutiivisesti aktiivinen Riis sitten fosfory- Ris. Nämä aktivoidaan RIS sitten fosfory- myötävirtaan reseptoriin liittyvän Smad: ien (R-Smad: ien). Fosforyloidun R-Smad myöhemmin sitoutuu yhteiseen välittäjänä, Smad4, ja tuloksena kompleksit vaikuttaa geenin transkriptiota. Yleisesti ottaen signalointi kautta superperheen voidaan jakaa TGFli kaltaisia ​​ligandeja joiden sukulais RIS yleensä activin kaltaista reseptoria kinaasi (ALK) 4, 5 tai 7, joka pyrkii aktivoimaan R-Smad: ien Smad2 tai 3, ja luun morfogeneettinen proteiini (BMP) kaltaisia ​​ligandeja signalointi sukulais ris ALK1, 2, 3 tai 6, ja R-Smad: ien Smad1, 5 tai 8

Endoglin (kutsutaan myös CD105) on homodimeerinen transmembraaniproteiini joka toimii ylimääräisenä TGF-superperheen reseptorin, ja sitä pidetään tyypin III reseptori [7] – [9]. Endogliini moduloi signalointi alavirtaan TGFp ja BMP ligandeja, jotka pyrkivät edistämään signalointi ensisijaisesti BMP-kuten polkuja, kun taas estämällä TGFli kaltainen reittejä [10] – [14]. Lisäksi endogliini säätelee lukuisten solun prosesseja kuin Smad riippuvainen reittejä. Olennaisia ​​solujen invaasiota, endogliini vuorovaikutuksessa kautta sytoplasmadomeenissa kanssa LIM-domain sisältävät proteiinit zyxin ja zyxin liittyvä proteiini 1 säädellä fokaalisen adheesion koostumuksen ja aktiinisytoskeletonin [15], [16]. Lisäksi endogliini säätelee integriinin aktivaation ja signalointia useita soluprosesseja [17] – [21]. Endogliini voi myös moduloida muuttamassa potentiaalia H-Ras [22].

rooli endogliinin syövässä on monimutkainen, koska ero ilmentymistä ja toimintaa kaikkialla solutyyppejä [23], [24]. Useimmissa tutkimuksissa endogliinin toiminto on suoritettu endoteelisoluissa. Ituradan mutaatioita endogliini aiheuttaa geneettinen sairaus perinnöllinen aivoverenvuotoon telangiektasian [25], jossa korostetaan endogliini roolia keskeisenä säätelijänä endoteelisolujen liikkuvuuden, invaasio, ja leviämisen. Useita syöpiä, kuten PCa, endogliini yliekspressoituu endoteelisolujen mikroverisuoniston ja se on yhdistetty angiogeneesiin [26] – [28]. Se on myös hyvin ilmaistu strooman mikroympäristössä [29]. Siten on yleistä kudoksen tasolla endogliini usein yli-ilmentynyt syövän. Sen sijaan ja erittäin tärkeää, epiteelisoluissa useita kiinteitä kasvaimia – ja eturauhasen epiteelissä erityisesti – me ja muut ovat osoittaneet, että endogliini ilmentyminen menetetään sairauden etenemisen [30], [31]. Olemme osoittaneet, että tämä menetys edistää solujen irtoaminen [31], solujen invaasiota [14], [32] ja etäpesäkkeiden [33]. Mekanistisesti olemme osoittaneet, että endogliini estää invaasio tavalla, joka riippuu RI Alk2 ja loppupään R-Smad Smad1 [14]. Kuitenkin Riis mukana tässä prosessissa ovat edelleen tuntemattomia.

Koska roolia Alk2 ja Smad1 in endogliini välittämää tukahduttaminen invaasion (EMSI) PCA, me arveltu, että yksi tai useampi Riis ovat mukana tässä prosessissa. Tässä raportissa tunnistamme ActRIIA ja BMPRII tarvitaan. Mielenkiintoista, niillä on päinvastainen vaikutus loppupään Smad1 signalointi. ActRIIA edistää aiemmin tunnistettu signalointi akselilla, kun taas BMPRII on bimodaalinen toiminto, edistää Smad1 riippuvaisen signaloinnin kautta sen kinaasiaktiivisuuden, samalla kun estetään se kautta suuri soluliman hännän domain. Yhdessä nämä havainnot ovat ensimmäinen tunnistaa ActRIIA ja BMPRII tärkeinä säätelijöinä EMSI ja osoittaa, että ne toimivat läpi erillisen vielä toisiinsa mekanismeja. Nämä tulokset avaa uusia mahdollisuuksia farmakologisen kohdentamiseen PCa metastaattisen potentiaalin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture Transfektio

alkuperä ja viljelyolosuhteet PC3-M ihmisen PCa soluja on kuvattu [34]. PC3-M linja on erittäin metastaattinen PC3-johdannainen solulinjassa. Ne pidettiin RPMI 1640-alusta täydennettynä 2 mM L-glutamiinia, 10 mM HEPES-puskuria, 50 yksikköä /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (Life Technologies, Grand Island NY). DU145 solut ovat ihmisen PCa soluja johdettu aivometastaasi ja saatiin ATCC (Manassas, VA). Nämä solut ylläpidettiin DMEM täydennetty edellä mainittujen tuotteiden lisäksi 1 mM natriumpyruvaattia (Life Technologies). Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% hiilidioksidia ja 95% ilmaa alle subkonfluentteja eksponentiaalisen kasvun olosuhteissa triweekly muutoksia keski-, ja korvattiin kiinteä-kanavan solujen säännöllisesti.

solulinjoja todennettu kuvattujen menetelmien mukaisesti American Type Culture Collection Technical Bulletin nro 8, Cell Line Verification Test suositukset [35]. Erityisesti solut varhainen (ts. 15 kohtia) jäädytetyt varastoja käytettiin ja saivat täydennystä jälkeen 20 kohtia; solut tehtiin rutiini mikroskooppinen tutkimus vahvistaa yhtenäinen ja vakio matkapuhelinarkkitehtuurin eikä mikrobi-infektion; ja solut testattiin (kolmen kuukauden kuluessa) ja selvinnyt mykoplasmatulehduksen.

Ohimenevä transfektio solujen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [36]. Lyhyesti, 24 tunnin kuluttua pinnoitus, solut transfektoitiin TransIT-LT1 transfektioreagenssi (Mirus Bio LLC, Madison, WI) ja invaasio määrityksissä, joihin liittyy plasmidi-DNA vain, jossa Dharmafect Duo (Thermo Scientific, Lafayette, CO) ja invaasio määrityksissä, joihin liittyy samanaikainen toimitus plasmidi-DNA ja siRNA, tai Dharmafect2 (Thermo Scientific, aiemmin Dharmacon) ja invaasion ja lusiferaasin kokeista, joissa toimituksen siRNA yksin. Immunosaostukseen kokeissa solut transfektoitiin plasmidi-DNA: lla käyttäen Lipofectamine LTX (Life Technologies). Sitten soluja käytettiin osoitti määrityksissä 24-48 tuntia transfektion jälkeen. Kaikki reagenssit käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Joissakin kokeissa, kuten edellä, solut pestiin kahdesti PBS: llä, seerumin puutteessa väliaineessa, joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinia 3 tunnin ajan, ja käsiteltiin 2 ng /ml TGF, 5 ng /ml BMP7, tai 20 ng /ml BMP9 30 minuuttia ennen lyysiä.

Reagenssit

neutraloivat vasta-ActRIIA, Fc-ActRIIA ja Fc-BMPRII ligandin ansat, ja yhdistelmä-humaani-TGFp hankittiin R Thermo Scientific) PBS: ssä. Silloittamalla Reaktio pysäytettiin lisäämällä Tris, pH 7,5-20 mM. Sitten solut hajotettiin, kuten edellä käyttäen puskurissa, joka koostuu seuraavista: 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 145 mM NaCl; 10% glyseroli; 0,5% NP-40; proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit, kuten edellä. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla ja proteiinikonsentraatio määritettiin Bradfordin menetelmällä, kuten edellä. Yhtä suuri määrä proteiinia esikirkastettiin agaroosihelmien konjugoitu yhdistelmä-DNA-proteiini-A (Life Technologies, käytetään kani-IgG) tai Protein G Plus (Thermo Scientific, käytetään hiiren IgG) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa rotaatiossa. Esiselkeytettiin lysaatit siirretään uusiin putkiin ja inkuboitiin lgG: n kanssa yön yli 4 ° pyörimisen. Vasta-aine-antigeeni-kompleksit kerättiin talteen 2 tunnin inkuboinnin proteiini A tai proteiini G, yhdenmukaiset kanssa preclearance askel. Helmet otettiin talteen ja supernatantti poistettiin ja tallennetaan. Helmet pestiin kolme kertaa jääkylmällä lyysipuskuria. Näytteet tasapainotettiin 1X Laemmli, joka sisälsi 5% β-merkaptoetanolia (Sigma-Aldrich) ja inkuboitiin 95 ° C lämpö lohko 6 min, vähentää ja denaturoidaan näytteet ja lohkaistaan ​​silloitteen. Näytteet olivat Länsi blotattiin kuten edellä on kuvattu.

Tilastollinen analyysi

analysoimiseksi invasion määritykset yksisuuntainen parittomia Studentin t-testejä lasketaan arvioitu fenotyyppi kääntää tukahduttamista hyökkäystä. Lusiferaasin määrityksiä ja qRT-PCR, Opiskelijan kaksisuuntainen parittomia Studentin t-testejä käytettiin. P values≤0.05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Endoglin välittämää tukahduttaminen Invasion Vaatii ActRIIA ja BMPRII

Endoglin välittämää tukahduttaminen invaasion (EMSI) PCA edellyttää RI, eli Alk2 [14]. Lisäksi, kanoninen signaloinnin TGFp-superperheen reseptorien edellyttää ligandista riippuvan aktivaation RI, jonka RII [6]. Siksi arveltu, että EMSI vaatisi yhden tai useamman Riis. Arvioimme tämän trans- PC3-M ja DU-145 ihmisen PCa solujen endogliinin yhdessä siRNA yksittäisiin RII alatyyppejä: aktiiviinimolekyylien Reseptori tyyppi II A (ActRIIA), aktiiviinimolekyylien Reseptori tyyppi IIB (ActRIIB), luun morfogeneettinen proteiini-reseptorin tyyppi II (BMPRII), tai transformoiva kasvutekijä β-reseptorin tyypin II (TGFpRII). Sekä PC3-M ja DU-145-soluja, endogliini suppressoi merkittävästi invaasio 60% ja 50% kontrollisoluja, vastaavasti, ja tämä on kumottu siRNA kohdentamalla ActRIIA tai BMPRII mutta ei ActRIIB tai TGFpRII (kuvio 1A). Jotta edelleen tutkia mekanismia ActRIIA ja BMPRII vaikuttaen EMSI, tutkimukset keskittyneet ihmisen PC3-M PCa soluissa. Ne muodostavat metastaattinen fenotyyppi [34] ja tiedetään ilmaista hyvin alhainen lähtötasolle endogliinin [14].

) vaikutus tyypin II reseptorien endogliini välittämää tukahduttamisesta invaasion (EMSI). PC3-M (vasen) tai DU-145 (oikealla) soluja transfektoitiin ohimenevästi tyhjällä vektorilla (Vec) tai endoglinistä yhdessä siRNA, kuten on osoitettu. Seuraavia siRNA: t käytettiin: siNeg – ei-kohdistaminen negatiivinen kontrolli, si2A – kohteena ActRIIA, si2B – tavoitteet ActRIIB, siBMP – tavoitteet BMPRII, siTGF – tavoitteet TGFpRII. 48 tunnin jälkeen, solujen invaasiota mitattiin. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta kukin replikaattia 3. *, p≤0.05 verrattuna Vec /siNeg. Micrographs edustavat kuvia solujen ovat tunkeutuneet läpi Matrigel, värjättiin Pgal, ja kuvaamisen (suurennus 100X). B) ActRIIA ja BMPRII siRNA on erityinen. PC3-M-soluja transfektoitiin ohimenevästi endogliini yhdessä ilmoitettu siRNA: t, kuten (A). 48 tunnin kuluttua mRNA ilmentyminen arvioitiin kautta qRT-PCR, normalisoitu GAPDH, ja ilmaistu suhteessa siNeg-transfektoiduissa soluissa (normalisoitu 1,0). Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD yhden kokeen, suoritetaan toistojen N = 2; samanlaisia ​​tuloksia saatiin erillisellä kokeella (N = 2 toistoa). *, P≤0.05 verrattuna siNeg. C) ActRIIA ja BMPRII siRNA estää kohdeproteiiniin. PC3-M-solut transfektoitiin ActRIIA-myc (ylempi paneeli) tai BMPRII-lippu (alempi paneeli), sekä jossa on esitetty siRNA: t, jonka jälkeen Western blottauksella osoitti proteiineja. Tiedot ovat edustavasta kokeesta (N = 2 erillistä koetta). D) estäminen ActRIIA tai BMPRII ligandin sitoutuminen inhiboi EMSI. PC3-M-soluja transfektoitiin väliaikaisesti tyhjällä vektorilla tai endoglinistä kuten edellä. 2 päivän jälkeen solut esikäsiteltiin 5 tuntia ligandin ansat koostuu ActRIIA tai BMPRII solunulkoisen domeenin fuusioituna immunoglobuliinin Fc-alueesta (Fc-A2 tai Fc-B2 vastaavasti). Hoito jatkui myöhemmän toiminnan soluinvaasiota määrityksissä. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta kukin toistomäärityksiä N = 3. *, p≤0.05 verrattuna Vec /-.

On lähellä homologia keskuudessa TGF superperheen reseptorit. Siksi on erityisen tärkeää käsitellä siRNA spesifisyys, jota osoittaa kuviossa 1B. Käyttämällä sekvenssin spesifisiä alukkeita kunkin reseptorin osoitamme qRT-PCR joka reseptorispesifisellä siRNA merkittävästi kaataa kohteena reseptoriin ≥60% kussakin tapauksessa, jossa ei ole merkittävää modulaatio muiden kuin kohde-reseptoreihin. Tehokkuus ja spesifisyys siRNA kohdistaminen ActRIIA ja BMPRII sen vieressä osoittaa mittaamalla vaikutuksia proteiinin tasolla. Tyypillinen ongelma alaan liittyy siihen, että vasta-aineet kohdistuvat tiettyyn TGFp-superperheen reseptorin alatyypin on yleensä suhteellisen korkea ristireaktiivisuuden. Olemme käsitelleet tätä transfektoimalla solut joko myc-merkitty ActRIIA tai FLAG-merkitty BMPRII yhdessä siRNA yksittäisille Riis, jota seuraa tag-spesifisten Western blot (kuvio 1 C). Tällä tavoin osoitamme reseptorispesifisen siRNA-välitteisen tukahduttaminen proteiinin ilmentymisen lähes huomaamaton tasolle sekä ActRIIA ja BMPRII.

Sitovat solunulkoisen ligandien ActRIIA ja BMPRII muodostaa tärkein tekijä niiden signaaleina. Siksi arveltu, että jos ActRIIA ja BMPRII ovat todella tärkeitä säätelijöitä EMSI, niin niiden modulaatio tämän prosessin pitäisi olla riippuvainen sukulais ligandeja, ainakin osittain. Olemme todenneet, että tämä on itse asiassa kyse transfektoimalla soluja endogliinin, jonka jälkeen mittaamalla vaikutus invaasio kun solunulkoinen sukulais ligandit estetty reseptoriin sitoutumisen (kuvio 1 D). Tämä saatiin aikaan käsittelemällä soluja rekombinanttiproteiinin konstruktien, Fc-A2 tai Fc-B2, joka koostuu ActRIIA tai BMPRII solunulkoiset domeenit, tässä järjestyksessä, fuusioidaan immunoglobuliinin pysyvän domeenin, mikä toimii ligandina ansa. Kuten voidaan nähdä kuviosta 1D, estää ligandin sitoutumisen joko reseptoriin kääntää EMSI. Nämä ligandi-esto tutkimukset täydentävät knockdown tutkimuksia. Yhdessä meidän Pääteltiin ActRIIA ja BMPRII tärkeinä fysiologisia säätelijöinä EMSI.

ActRIIA ja BMPRII on päinvastaiset vaikutukset muuhun Smad1 Signaling

Olemme aiemmin osoittaneet, että endogliini lisää fosforylaatiota Smad1, että Smad1 estää solujen invaasiota, ja että Smad1 on tarpeen EMSI [14]. Siksi arvioitiin vaikutusta ActRIIA ja BMPRII sääntelystä Smad1 fosforylaation. Tämä tehtiin kaatamalla ActRIIA tai BMPRII kautta transfektointi PC3-M solujen siRNA taas kotransfektoimalla tyhjällä vektorilla tai endoglinistä. Fosforylaatio Smad1 arvioitiin sitten Western blot (kuvio 2A). Riippumatta endogliinin tilan, knockdovvn ActRIIA pienenee fosfo-Smad1 tasoilla. Yllättäen knockdovvn BMPRII on päinvastainen vaikutus; se lisää fosfo-Smad1. Kuten edellisessä tutkimuksessa [31], endogeeninen endogliini ilmentymistä PC3-M-soluissa on niin alhainen, että se lähestyisi toteamisrajan.

PC3-M-solut transfektoitiin väliaikaisesti tyhjällä vektorilla tai endoglinistä ja ilmoitetusta siRNA kuin kuviossa 1. Kaksi päivää myöhemmin solut lysoitiin Western blot (A) tai lusiferaasin promoottori määrityksessä (B). A) ActRIIA ja BMPRII differentiaalisesti säädellä Smad1 proteiinin fosforylaatio. Western tahran tuloksena solulysaattia suoritettiin Smad1, fosfori-Smad1 /5 (pSmad1 /5), endogliini ja GAPDH. Tiedot ovat edustavasta kokeesta (N = 4 koetta). B) ActRIIA ja BMPRII differentiaalisesti säädellä BRE

2-lusiferaasin aktivoitumisen. Soluja lisäksi ko-transfektoitiin BRE

2-lusiferaasi ja

Renilla

lusiferaasi-rakenteet, ja lusiferaasin aktiivisuus (normalisoitu

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus) mitattiin. Tiedot ovat keskiarvo ± SD samasta kokeesta suoritettiin rinnakkaisnäytettä N = 2, suoritettiin kolme erillistä kertaa samanlaisilla tuloksilla (myös N = 2). *, P≤0.05 välillä osoitetaan ryhmiin. C) BMP7- ja BMP9 stimuloiman Smad1 fosforylaation säädellään eri tavalla mukaan ActRII ja BMPRII. Solut transfektoitiin kuten edellä, seerumin puutteessa, ja käsiteltiin BMP7 tai BMP9 kuten on osoitettu. Western tahran tuloksena solulysaattia suoritettiin fosfo-Smad1 /5 (pSmad1 /5) ja yhteensä Smad1. Tiedot ovat edustavasta kokeesta (N = 2 koetta).

Olemme aiemmin osoittaneet samassa järjestelmässä tällä hetkellä käytössä, että ensisijainen indusoimaa kasvua endogliini ilmentymistilanne aiheuttaa nousua sekä Smad1 fosforylaatioon sekä kuten Smad1 transkription aktiivisuus, mitattuna lusiferaasireportterigeenin määritys käyttäen Smad1 reagoivan BRE

2-lusiferaasireportteri konstrukti [14]. Tärkeää on, tässä samassa järjestelmässä, olemme myös osoittaneet, miten monella eri häiriöt ovat ristiriitaisia ​​vaikutuksia upon Smad1 fosforylaation ja sen toiminnallinen transkriptioaktiviteettia. Kuitenkin kaikissa tapauksissa muutokset Smad1 transkription toiminto heijastuu yhtäpitävät vaikutukset, kun biologinen funktio, arvioituna niihin liittyvien Smad1 Knockdown tutkimuksia sekä hyökkäys määrityksiä [14], [32]. Vaikka mekanismia taustalla tämä ilmiö ei ole täysin selvä, se näyttää heijastavan sitä, että ihmisen eturauhasen solut sisältävät erittäin korkeita hapan fosfataasi, ja että solun hajotessa sillä on proteiini-konkreettisia vaikutuksia, joita ei voida riittävästi tuonut kurissa suuriakin tasot fosfataasin estäjät [43]. Sen vuoksi pidämme arviointi Smad1 transkriptionaalisen toiminnon olevan informatiivinen määritys. Sinänsä olemme jatkoi vaikutuksen arvioimiseksi ActRIIA ja BMPRII knockdown päälle BRE

2-lusiferaasin aktivoitumisen (kuvio 2B). Jälleen osoitamme, että riippumatta endogliini asemasta, knockdovvn ActRIIA merkittävästi vähentää Smad1 toiminto, kun knockdovvn BMPRII lisää merkittävästi sitä. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​Smad1 fosforylaation tiedot kuviossa 2A, ja osoittaa, että muutokset Smad1 fosforylaatio liittyy muuttunut Smad-välitteisen transkription. Ne kuitenkin osoittavat myös, että BMPRII aiheuttama johtuvat vaikutukset Smad1 transkription toiminta eivät ole yhteneväiset BMPRII n vaikutus EMSI.

Tutkitaan BMPRII tarkemmin, tutkimme vaikutukset, kun signalointi olosuhteissa luun morfogeeninen proteiini (BMP) ligandia stimulaatiota . ActRIIA ja BMPRII tippuu alas kuin kuviossa 2A, solut seerumin puutteessa, simuloitu joko BMP7 tai BMP9, ja Smad1 /5 fosforylaatio määritettiin Western blot (kuvio 2C). Joko BMP7 tai BMP9, knockdovvn ActRIIA vaimentaa ligandin stimuloimaa Smad1 /5 fosforylaation, kun taas knockdovvn BMPRII täydentää sitä. Osoittamalla samanlainen signalointi vasteprofiilin olosuhteissa BMP-ligandin stimulaation verrattuna standardin viljelyolosuhteissa, että on tärkeää BMP on edelleen tuettu. Nämä havainnot tukevat näitä kuviossa 1D, jotka osoittavat, että BMP-ligandin on tarpeen EMSI.

Kumpikaan BRE

2-lusiferaasi promoottori järjestelmässä eikä tällä hetkellä saatavilla fosfo-Smad vasta pystyvät täysin erottamaan Smad1 , Smad5 ja Smad8 isoformit. Siksi arvioitiin, missä määrin näitä muita Smad isoformit voitaisiin selittää tällä hetkellä havaitut vaikutukset. Erityisesti koska BMPRII Knockdown yllättäen johtanut mikä näytti lisättävä Smad1 signalointi, halusimme tutkia mahdollisuutta BMPRII Knockdown lisääntyi Smad5 tai Smad8 signalointi, mahdollisesti peittää toiminnallisesti tärkeä lasku Smad1 signalointi. Käyttämällä geenispesifiseen qRT-PCR-analyysi, ensin osoittaa, että siRNA yksilölle Smad isoformit on erittäin spesifinen ja tehokas, merkittävästi hiljentää suunnattu isomuodon mukaan ≥90% kussakin tapauksessa, kun taas joilla ei ole merkittävää vaikutusta muihin kuin kohde-isoformit (kuva 3A). Seuraavaksi me pyrkineet mitkä Smad: ien aktivoitiin heti endogliini yli-ilmentymisen. Knockdovvn Smad1 johtaa lähes täydelliseen menettämiseen erityisen signaalin vasta-aine, joka tunnistaa fosfo-Smad1, 5, ja 8 (kuvio 3B). Olemme vahvistaneet, että Smad1 proteiinin ilmentyminen on ehkäistä tehokkaasti siRNA ja Smad1, mutta ei tukahdutti siRNA kohdentamalla Smad5 tai Smad8. Käyttämällä ainetta, joka tunnistaa sekä fosforyloitu Smad1 ja Smad5, me osoitamme, että Smad5 myös fosforyloituu läsnä endogliinin. Sitten jatkoi osoittamaan, että knockdovvn Smad1 aiheuttaa 90% alenema endogliini aiheuttama lisäys BRE

2-lusiferaasi (kuvio 3C). Sen sijaan, endogliini aiheuttama kasvu BRE

2-lusiferaasiaktiivisuus pieneni vain 30%, kun Smad5 pudotus, ja ei lainkaan Smad8 pudotus. Lopuksi, kun osoitamme kuvassa 2 että BMPRII Knockdown lisää Smad1 aktivointia, tutkimme vaikutus Smad isoformin tukahduttaminen edessä BMPRII Knockdown vuonna endogliiniksi täynnä soluissa (kuvio 3D). Samanlaisia ​​havaintoja kuvassa 3C, Smad1 Knockdown merkittävästi kumoaa lisääntynyt BRE

2-lusiferaasin aktiivisuus saavuttaa BMPRII Knockdown, kun Smad5 tai Smad8 Knockdown ei ole merkittävää vaikutusta. Kaikki yhdessä edellä havainnot osoittavat, että ActRIIA lisää Smad1 fosforylaation ja toiminta, vaikka BMPRII vähentää sitä.