Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoitteena nykyisen oli selvittää kliinistä merkitystä liitosadheesiomolekyyliin molekyylin A (JAM-A) potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja biologisen toiminnan JAM -A NSCLC solulinjoissa. Olemme osoittaneet, että JAM-A ekspressoituu pääasiassa solukalvojen ja korkea ekspressio JAM-A esiintyi 37%: keuhkojen kasvain yksilöitä verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Korkea ilmentyminen JAM-A korreloi merkitsevästi TNM (P = 0,021), imusolmuke etäpesäke (P = 0,007), ja pieneni eloonjäämisen (P = 0,02), Lisäksi havaitsimme, että hiljentäminen JAM-A pieniä häiritseviä RNA esti kasvainsoluproliferaation ja indusoi solusyklin pysähtymisen G1 /S rajan. Western blotting -analyysi osoitti, että pudotus JAM-A vähensi proteiinin tasot sykliini D1, CDK4: n, 6, ja P-Rb. Siten JAM-A: lla on tärkeä rooli NSCLC etenemiseen.

Citation: Zhang M, Luo W, Huang B, Liu Z, Sun L, Zhang Q, et al. (2013) yli-ilmentyminen JAM-A ei-pienisoluinen keuhkosyöpä korreloi syövän etenemiseen. PLoS ONE 8 (11): e79173. doi: 10,1371 /journal.pone.0079173

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 30, 2013; Hyväksytty 23 syyskuuta 2013 Julkaistu: 12 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 30972967) ja Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen of Higher Education of China (nro 20092104110018). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

liitosadheesiomolekyyliin molekyyli A (JAM-A) on tyypin I trans- glykoproteiini, joka kuuluu immunoglobuliinien superperheen. JAM-A on levitetty laajalti kudoksiin, mukaan lukien istukka, keuhkot, maksa, munuaiset, haima, sydän, aivot, suolet, ja imusolmukkeiden [1], [2], [3], [4]. JAM-A ilmentyy pääasiassa välisissä liitoksissa epiteeli- ja endoteelisolujen, JAM-A on myös todettu pinnalla leukosyyttien, lymfosyytit, verihiutaleet, ja punasolujen [5], [6], [7], [8]. JAM-A on osallisena erilaisissa solun prosesseissa, kuten solujen-soluadheesiota, leukosyyttimigraatio, verihiutaleiden aktivaatio, angiogeneesi, ja reovirus sitova [5], [9], [10], [11]. JAM-A-proteiini koostuu solunulkoisen domeenin, jossa on kaksi Ig-silmukkaa, yhden kalvon läpi ulottuvan alueen, ja lyhyt sytoplasminen häntä, joka päättyy PDZ sitova motiivi. JAM-A voivat muodostaa homodimeerejä kautta N-terminaalista Ig silmukka. Homofiilisiä vuorovaikutukset ovat tärkeitä edellä mainittujen JAM-A funktio soluissa [12]. C-terminaalinen PDZ sitova motiivi voi helpottaa vuorovaikutusta eri teline proteiinit, kuten ZO-1, AF-6, ja PAR-3 [13], [14], [15]. JAM-A dimerisaatio ja PDZ sitovat motiivit ovat kriittisiä signalointiryöpyn [16], [17]. Äskettäin JAM-A on liitetty syövän etenemiseen, mutta rooli JAM-A kasvaimen kasvua ja levittäminen on edelleen kiistanalainen kysymys. Naik, et ai. [18] ilmoitti aluksi, että JAM-A voi vähentää hyökkäyksen ja liikkuvuus rintasyövän solulinjoissa

in vitro

ja JAM-A ilmentyminen syöpäpotilaista oli negatiivisesti yhteydessä kasvaimen aggressiivisuus ja etäpesäkkeiden. Samanlaisia ​​clinical- tai

in vitro

-muodostunutta tiedot raportoitu muiden mukana kohtukarsinooma [19] ja haimasyövän [20]. Päinvastoin, Mc Sherry et ai. [21], käyttämällä suurempaa kliinistä datajoukon, ilmoitetaan positiivinen korrelaatio JAM-A ilmaisun ja invasiivisen rintasyövän ennustetta. Vastaavasti suurempia clinical-,

in vitro

– ja

in vivo

-muodostunutta aineistoja äskettäin raportoitu rintasyövän ja epidermoidikarsinooman [22], [23], [24], [25], [26]. Ilmaisu JAM-proteiini ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kudoksiin ja suhdetta eri ennusteeseen viittaavia tekijöitä ei ole täysin tutkittu. Lisäksi tarkka rooli JAM-A keuhkosyöpä etenemiseen on epäselvä. Niinpä määritettiin JAM-A ilmentymistä NSCLC kudoksissa immunohistokemiallisesti. Lisäksi päätimme yhdistyksen välillä JAM-A ilmaisun ja lisääntymistä useissa NSCLC solulinjoissa. Osoitimme, että JAM-A ilmentyy suhteellisen suuria määriä NSCLC kudoksissa ja joidenkin NSCLC solulinjojen, ja että solukalvon liittyvä JAM-A tasot korreloivat kasvaimen aggressiivisuus.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus suoritettiin hyväksyntää Institutional Review Board of China Medical University. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta pienisoluista keuhkosyöpää ja kaikki kliiniset tutkimukset tehtiin periaatteiden mukaisesti saatettiin voimaan Helsingin julistuksen.

Potilaat ja näytteet

Kahdeksankymmentäkaksi NSCLC näytettä saatiin ensimmäinen Affiliated sairaala China Medical University vuosien 2002 ja 2009; 42 näytettä tehtiin seurantatutkimusta. Kukaan potilaista ei saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen kirurgista resektiota. Histologinen diagnoosi ja arvosana erilaistumiseen kasvainten määriteltiin arviointi hematoksyliinillä ja eosiinilla värjättyjen kudosleikkeiden mukaan Maailman terveysjärjestön ohjeiden luokitusta. Kaikki 82 näytteet arvioitiin uudelleen suhteessa histologisia alatyyppi, erilaistumista tila, ja kasvain vaiheessa. Okasolusyöpä ja adenokarsinooma havaittiin 36 ja 46 82 tapauksissa vastaavasti. Imusolmukemetastaaseja havaittiin 31 potilaalla. Kasvaimet luokiteltiin vaiheisiin I (n = 45), II (n = 30), ja III (n = 17) mukainen p-TNM pysähdyspaikan järjestelmä International Union Against Cancer (7. painos). Kokonaiselossaoloaika määriteltiin ajaksi alustavan diagnoosin kuolemaan tai viimeisimmän seurannan.

Solulinjat ja Soluviljelyolosuhteiden

HBE, A549, H1299, H157, ja H460 solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SPC ja LK2 solulinjoja ostettiin Shanghai Cell Bank of Kiinan Academy of Science. Soluja viljeltiin RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen), 100 IU /ml penisilliiniä (Sigma, St. Louis, MO, USA), ja 100 mg /ml streptomysiiniä (Sigma). Soluja kasvatettiin steriili kudosviljelymaljoihin ja siirrostettiin välein 2 päivää käyttäen 0,25% trypsiiniä (Invitrogen).

immunohistokemia Analysis

Kirurgisesti-leikattu kasvain näytteet kiinnitettiin 10% neutraaliin formaliiniin, valettiin parafiini, ja 4-um: n paksuisia leikkeitä valmistettiin. Immunovärjäys suoritettiin käyttäen ElivisionTM plus polymeerilatekseja HRP (hiiri /kani) IHC Kit (Maixin, Fuzhou, Kiina). Osat poistettiin parafiini ksyleenillä, rehydratoitiin asteittai- sessa alkoholisarjassa, ja keitettiin 0,01 M EDTA-puskuriin (pH 9,0) 20 minuuttia kattilassa. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin käyttämällä vetyperoksidia (0,3%), jota seurasi inkubointi vuohen normaalia seerumia voidaan vähentää ei-spesifisen sitoutumisen. Kudosleikkeet inkuboitiin JAM-Kanin monoklonaalista vasta-ainetta (1:100 laimennus; Abcam, Cambridge, MA, USA). Kanin immunoglobuliini, samassa pitoisuudessa kuin antigeeni-spesifisen vasta-aineen (Maixin) käytettiin negatiivisena kontrollina. Värjäys kaikkien primaaristen vasta-aineiden suoritettiin 4 ° C: ssa yön yli. ElivisionTM plus polymeerilatekseja HRP käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin 3, 3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla kehittää Peroksidaasireaktio. Counterstaining jaksoissa tehtiin hematoksyliinillä, jotka sitten dehydratoidaan etanolin ennen asennusta. Kaksi itsenäistä tutkijat tutki kaikki kasvain dioja satunnaisesti. Viisi näkemyksiä tutkittiin kullekin levylle ja 100 soluja havaittiin kohti näkymä 400X suurennuksella. Immunovärjäystä JAM-A teki seuraavat puoliksi Paljousosuusmenetelmää arvioimalla edustaja kasvain alueilla; intensiteetti ja prosentuaalinen solukalvojen oli korkeampi immuunivärjäystä kuin kontrolli soluja. Kalvo värjäys kasvainsolujen katsottiin olevan positiivinen immunovärjäyksellä. Intensiteetti JAM-A kalvojen värjäys myös pisteytettiin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko), 2 (kohtalainen) ja 3 (korkea). Prosenttiosuus tulokset jaettiin seuraavasti: 1, 1% -10%; 2, 11% -50%; 3, 51% -80%; ja 4, 81% -100% [20]. Tulokset Kunkin kasvaimen näytteen kerrottiin antamaan lopullinen pistemäärä 0-12 ja koko ilmaus JAM-A määritettiin niin alhainen (≤4) tai korkea ilmentyminen ( 4).

Quantitative Real -Aika PCR (SYBR Green Method) B

Quantitative reaaliaikaisia ​​PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems, Foster City, USA) kokonaistilavuudessa 20 ui on 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) seuraavasti: 95 ° C 30 sekuntia; 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 sekunnin ajan; ja 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Dissosiaa- vaihe suoritettiin tuottaa sulamiskäyrään vahvistaa spesifisyyden vahvistusta. β-aktiini käytettiin viite-geeniä. Suhteellinen ilmentymiselle olivat edustettuina ACt = Ct geeni-Ct viite ja taitekohdan muutos geenien ilmentyminen laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmä, jossa ΔΔCt = (Ct

geeni-Ct

viite )

näytteenvastaanottopinnassa (Ct

geeni-Ct

viite)

kalibraattori. Primer sekvenssit JAM-A olivat 5′-GTG AAG TTG TCC TGT GCC TAC TC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-ACC AGT TGG CAA GAA GGT CAC C-3’ (reverse). Primer sekvenssit β-aktiini olivat 5’TGC CTA GAT CAA GAA GCA G -3 ’(eteenpäin) ja 5′- TGC CTA GAT CAA GAA GCA G -3’ (taaksepäin). Kolmen erillisen kokeen tehtiin kolminkertaisina samanlaisissa olosuhteissa.

Sirna Treatment

Sirna (siRNA) varten JAM-A syntetisoitiin Genepharma (Shanghai, Kiina). Sekvenssit siRNA olivat seuraavat: 5′-GAA GUG AAG GAG AAU UCA ATT-3 ’(sense); ja 5’-UUG AAU UCU CCU UCA CUU CTT-3 ’(antisense). Sekvenssit ei-kohdistuksen siRNA (negatiivinen kontrolli), käytettiin negatiivisena kontrolli olivat seuraavat: 5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ’(sense); ja 5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3 ’(antisense). Solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle 24 h ennen transfektiota kokeita. Solut transfektoitiin 100 pmol JAM-A siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA käyttäen Iipofectamine2000 (5 ul /kuoppa; Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, USA) valmistajan protokollan. Transfektion jälkeen, proteiini- ja mRNA-tasojen JAM-A arvioitiin 48 tuntia myöhemmin. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin identtisissä olosuhteissa.

Western blot -analyysi

Yhteensä proteiinin soluista uutettiin hajotuspuskuriin (50 mM Tris-HCI [pH 8,0], 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P40, 0,5% natriumdeoksikolaattia, ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridia [PMSF] Beyotime, Haimen, Kiina) ja mittaamaan bikinkoniini- happoa (BCA) menetelmä (Beyotime). Kuusikymmentä ug proteiinia erotettiin SDS-PAGE (10%) ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA), jälkeen estää 5% BSA: lla Tris-puskuroitu suolaliuos-Tween 20 (TBST; 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl ja 0,05% Tween-20), membraaneja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli seuraavien primaaristen vasta-aineiden: JAM-A (1:1000, Abcam); ja anti-P-Rb, anti-P27, anti-P21, anti-sykliini A, anti-sykliini B, anti-sykliini D1, anti-CDK4, anti-CDK6, anti-AKT1 /2, ja anti-P-AKT Thr 308 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Inkuboinnin jälkeen peroksidaasiin kytkettyä anti-hiiri tai kaniinin IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) 37 ° C: ssa 2 h, sitoutuneet proteiinit tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja todeta käyttäen Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). Suhteellinen proteiinin tasot laskettiin perustuen GAPDH kuin latauskontrollina. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin identtisissä olosuhteissa.

virtaussytometria Pitoisuus

Solut trypsinoitiin ja 1 x 10

6 solut pestiin kahdesti jäähdytetyllä inkubaatiopuskuria (2% BSA PBS: ssa) ja sentrifugoitiin, sitten solut suspendoitiin uudelleen 100 ui inkubaatiopuskuria ja inkuboitiin kanssa tai ilman FITC-konjugoitua hiiren anti-ihmis-JAM-A-vasta-aine (1:100; Biolegend, San Diego, CA, USA) tai FITC-konjugoitua hiiren IgG1 , κ isotyypin kontrollivasta-aine (1:100; Biolegend) jäillä 30 minuutin ajan pimeässä. Sitten solut pestiin kahdesti inkubaatiopuskurissa ja käsiteltiin virtaussytometria-analyysiä. Aineisto analysoitiin FlowJo 7.6.1 ohjelmistoa. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kolmena kappaleena samanlaisissa olosuhteissa.

Cell Proliferation Test

soluproliferaation määritys suoritettiin käyttäen MTT (Sigma) mukaisesti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, H1299 ja A549-soluja ohimenevästi transfektoitu JAM-A siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA. 24 tunnin kuluttua solut trypsinoitiin ja ympättiin pitoisuutena 3 x 10

3 solua /100 ul /kuoppa 96-kuoppaisille viljelylevyille yön yli. Kunkin seuraavan päivänä solut käsiteltiin 20 ul: (5 mg /ml) /kuoppa MTT-liuosta viime 4 h viljelmän. Elatusaineet korvattiin DMSO: n (150 ul /kuoppa). Optinen tiheys kuoppien mitattiin 490 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa. Kolmen erillisen kokeen 5 sisäinen rinnakkaista koetta kohti suoritettiin samanlaisissa olosuhteissa.

Colony muodostumisen määritys

pesäkemuodostusta määrityksiä, solut transfektoitiin JAM-A: n tai negatiivinen kontrolli siRNA: ssa 48 tuntia, sitten maljattiin 6-kuoppaisille viljelylevyille (1000 kuoppaa kohti) ja inkuboitiin 12 päivää. Levyt pestiin PBS: llä ja värjättiin Giemsa. Määrä pesäkkeiden 50 solua laskettiin. Pesäkkeet laskettiin manuaalisesti mikroskoopilla. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kolmena kappaleena samanlaisissa olosuhteissa.

Cell Cycle Analysis

Solut (100000) ympättiin 6-kuoppaisille viljelylevyille, synkronoidaan jälkeen seerumistarvaatio 24 tuntia, sitten transfektoidaan osoitettujen määrien siRNA. Solut kerättiin, kiinnitettiin 75% etanolilla 48 h transfektion jälkeen, pestiin PBS: llä ja värjättiin 5 mg /ml propidiumjodidia PBS: ssä, jota oli täydennetty RNaasi A: ta (Roche, Indianapolis, IN, USA) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tiedot kerättiin käyttämällä BD järjestelmiä. Kolmen erillisen kokeen tehtiin identtisissä oloissa.

Tilastollinen analyysi

SPSS (versio 16.0 for Windows, SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) käytettiin kaikissa analyyseissä. Chi-neliön testiä käytettiin määrittämään korrelaatiota JAM-A ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia. Kaplan-Meier -käyrät käytettiin selviytymisen analyysin ja log-rank määritettiin perustuen eroja. Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan muita tietoja. P-arvot perustuivat kaksipuolisen tilastollinen analyysi, ja p 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

Expression ja jakelu JAM-A NSCLC Kudokset

Analysoimme ilmaisun ja jakelu JAM-A 82 NSCLC yksilöiden ja vastaavat normaalit kudokset käyttävät immunohistokemiallisesti. JAM-A pääasiassa ilmaistu solukalvojen; korkea ilmentyminen JAM-A havaittiin 37% keuhkojen kasvain näytteet (taulukko 1), joka oli paljon korkeampi kuin keuhkoputken epiteelissä ja penumosyy- vastaaviin ei-tuumori- keuhkojen kudoksia (Fig. 1). Olemme tutkineet suhde ekspression kalvon JAM-A ja ennusteeseen viittaavia parametreja. Perustuen yhden muuttujan analyysin, korkea ilmentyminen kalvo JAM-A korreloi merkitsevästi TNM (P = 0,021) ja imusolmukemetastaaseja (P = 0,007), mutta ei iän (p = 0,818), sukupuoli (P = 0,96), erilaistumista (P = 0,174), kasvaimen tila (P = 0,105), ja kasvaimen histologia (P = 0,818; taulukko 1). Olemme arvioineet suhde ekspression kalvon JAM-A ja elinaika 49 pienisoluista keuhkosyöpää. Sen jälkeen Kaplan-Meier selviytymisen analyysissa havaittiin, että potilaat, joilla on korkea ilmentymisen kalvo JAM-A oli huomattavasti alhaisempi eloonjääminen (mediaanielinajassa = 50 ± 8,92 kuukautta; 95% luottamusväli [CI], +32,56-+67,48kuukausi) kuin potilailla, joilla on alhainen ilmentyminen kalvo JAM-A (mediaani selviytymisen = 61 ± 4,31 kuukautta; 95% CI, +52,56-69,45kuukausi, P = 0,02; Fig. 2).

(A) Vahva JAM-A ilmentyminen keuhkoadenokarsinooma (400X). (B) Heikko JAM-A ilmentymisen keuhkoadenokarsinooma (400X). (C) Vahva JAM-A ilmentyminen keuhkossa levyepiteelisyöpä (400X). (D) Heikko JAM-A ilmentyminen keuhkossa levyepiteelisyöpä (400X). (E) Heikko värjäytyminen normaalissa keuhkoputkien epiteelin syövätöntä keuhkokudoksessa (400X). (F) Negatiiviset kontrollit JAM-A värjäys ei-immuuni kanin IgG-vasta-(400X).

Potilaat, joilla on alhainen ilmentyminen JAM-A oli parempi eloonjäämisaste kuin potilaat, joilla on korkea ilmaus JAM -A, määrittelemän log-rank-testi (P ​​= 0,02).

JAM-A väheneminen Estää Keuhkosyöpä Cell Proliferation

Olemme havainneet JAM-A ilme normaaleissa keuhkoputken epiteelin (HBE) solut ja kuusi keuhkosyövän solulinjat Western blot ja reaaliaikaisen PCR-analyysillä. H1299 ja A549-solut osoittivat korkeita ilmentymisen JAM-A, HBE solut kohtalainen ekspressiotasot JAM-A, ja H157, H460, SPC, ja LK2 esillä alhainen ilmentyminen JAM-A (Fig. 3A, B ). Koska JAM-A on tyypin I transmembraaniglykoproteiini, me analysoitiin solu- kalvoon liittyvä JAM-A tasoja käyttäen virtaussytometria määritys suhteellisen korkea endogeeninen JAM-A solulinjoja (H1299 ja A549) ja suhteellisen alhaisen endogeenisen JAM-A solulinjat (H460 ja H157). Kuten on esitetty kuviossa. 3C, ilmentyminen pinta JAM-A H1299 ja A549-soluja oli paljon suurempi kuin H157 ja H460-soluissa. Siten käytimme H1299 ja A549-soluja in menettämisestä toiminnon tutkimuksia.

JAM-A ilmentymisen paneelin ihmisen hengitysteissä solulinjat arvioitiin Western blot, Data näytetään edustava Western blotit kokeiluja. Kokeet itsenäisesti toistettiin 3 kertaa samankaltaisilla tuloksilla. (B) Suhteellinen ilmentyminen JAM-A mRNA: n paneelia ihmisen hengitysteiden solulinjat arvioitiin real-time PCR. Suhteellinen määrä JAM-A mRNA normalisoituivat p-aktiini, verrattiin H157 soluihin perustuva yhtälö RQ = 2

-ΔΔCt. Pylväät, keskiarvo RQ kolminkertaisten arvojen edustavassa kokeessa; baareja, max /min RQ. Kokeet itsenäisesti toistettiin 3 kertaa ja suoritettiin kolmena kappaleena samanlaisin tuloksin. (C) pinta-ilmentymisen JAM-A paneelin ihmisen hengitysteissä solulinjat arvioitiin virtaussytometrian määrityksessä. Konfluentit solut trypsinoitiin ja virtaussytometria määritys analyysit tehtiin, kuten on kuvattu menetelmät-osassa. Data näytetään edustava histogrammit (yläpaneeli), fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo kolmena arvojen edustavassa kokeessa, kolumnit, tarkoittaa; baareja, SD. (Alapaneeli). Kokeet itsenäisesti toistettiin 3 kertaa kolmena kappaleena samanlaisia ​​tuloksia.

onko vai ei JAM-A osallistuu moduloinnissa keuhkosyövän solujen kasvua, käytimme siRNA että pudotus JAM-A ilmentymistä H1299 ja A549-solulinjoja. Verrattuna negatiivinen kontrolli siRNA-transfektoiduissa solulinjoissa, JAM-A-spesifinen siRNA ehkäistä tehokkaasti koko JAM-proteiini tasoilla (Fig. 4A), JAM-A mRNA (Fig. 4B), ja pinta ekspressiotasot (Fig. 4C) kahdessa testattu solulinjoissa. Solun kasvu määritettiin MTT: llä. H1299 ja A549-soluja oli transfektoitu JAM-A-spesifinen siRNA oli kasvunopeus laskee verrattuna negatiiviseen kontrolliin siRNA (Kuva. 5A). Sitten suoritti riippumaton menetelmä (pesäkemuodostusta) vahvistaa anti-proliferatiivista vaikutusta JAM-A inhibitio keuhkosyövän soluja. Kanssa MTT tuloksiin, JAM-A Knockdown vähentää tehokkaasti kapasiteettia pesäkkeen muodostumisen 2 testattujen keuhkosyövän solulinjoja (negatiivinen kontrolli vs. JAM-A siRNA, H1229:231 ± 19 vs. 55 ± 7, p 0,01 ; A549:420 ± 31 vs. 273 ± 21, p 0,01; Fig. 5B).

(A) Western blot analyysit JAM-A ehtyminen tehokkuutta syöpäsoluissa. Data näytetään edustava Western blotit (vasen paneeli). Densitometria arvo analyysi 3 itsenäistä Western blot kokeissa data normalisoitiin vastaan ​​GAPDH, kolumnit, keskiarvo; baareja, SD, ** p 0,01 (oikea paneeli). (B) Reaaliaikainen PCR analyysejä JAM-A ehtyminen tehokkuutta syöpäsoluissa, suhteellinen määrä JAM-A mRNA normalisoituivat p-aktiini, verrattiin negatiiviseen kontrolliin siRNA-transfektoiduissa ryhmä perustuu yhtälöön RQ = 2

-ΔΔCt. Pylväät, keskiarvo RQ edustavassa kokeessa; baareja, max /min RQ. Kokeet itsenäisesti toistettiin 3 kertaa kolmena kappaleena samanlaisia ​​tuloksia. (C) Virtaussytometria määritys analyysit JAM-A pinta ilme ehtyminen tehokkuutta. H1299 ja A549-soluja ohimenevästi transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA tai JAM-A siRNA; 48 tunnin kuluttua solut käsiteltiin trypsiinillä ja virtaussytometria määritys analyysit tehtiin, kuten on kuvattu menetelmät-osassa. Data näytetään edustava histogrammit (ylempi paneeli), fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo kolmena arvojen edustavassa kokeessa, kolumnit, tarkoittaa; baareja, SD. ** P 0,01 (alempi kuva). Kokeet itsenäisesti toistettiin 3 kertaa kolmena kappaleena samanlaisia ​​tuloksia.

(A) MTT-analyysi suoritettiin, kun JAM-A siRNA hoitoa. Absorbanssi 490 nm: ssä eri ajankohtina havaittiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD edustavia kokeita, * p 0,05; ** P 0,01. 3 itsenäistä koetta 5 sisäinen rinnakkaista koetta kohti suoritettiin samanlaisin tuloksin. (B) arviointi klonogeeniset potentiaalit JAM-A-köyhdytettyä syöpäsoluja. Täydellinen kentät per levy kuvattiin ja esitettiin. Data näytetään edustava pesäkemuodostusta (vasen paneeli), pesäkkeiden määrä kolminkertaisten arvojen edustavassa kokeessa laskettiin, kolumnit, keskiarvo; baareja, SD. ** P 0,01 (oikea paneeli). 3 itsenäistä koetta kolmena kappaleena tehtiin samoin tuloksin.

JAM-knockdown Tulokset G1 pidätys ja kasvunestomenetelmää keuhkosyöpään Cells

vieressä pyrittiin selvittämään mahdollisia mekanismeja, joilla JAM -A knockdown voivat vähentää solujen lisääntymistä. Analysoimme solusyklin fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS), ja osoitti, että solujen prosenttiosuus G1 faasi kasvoi (H1299, negatiivinen kontrolli vs. JAM-A siRNA, 57,8 ± 2,8 vs. 68,1 ± 2,5, p A549 negatiivinen kontrolli vs. JAM-A siRNA, 57,12 ± 2,77 vs. 65.96.1 ± 2,52, p 0,05; Fig. 6), kun taas solut S-vaiheeseen laskivat käsitellyissä soluissa JAM-A knockdown verrattuna ohjata soluja (H1299, negatiivinen kontrolli vs. JAM-A siRNA, 30,49 ± 2,8 vs. 24,1 ± 2,74, p 0,05; A549 negatiivinen kontrolli vs. JAM-A siRNA, 29.33 ± 2,61 vs. 23.49.1 ± 2,49, p 0,05; ** P 0,01 (oikea paneeli).

(A) Western blot -analyysi paneelin proteiinien tehtiin siNC- tai siJAM-A-transfektoidut H1299 solulinjoja (vasen paneeli) ja A549 solulinjoja (oikea paneeli). Data näytetään edustava Western blotit. Kolme riippumatonta koetta suoritettiin samanlaisin tuloksin. (B) Densitometria analyysi 3 itsenäistä Western blot kokeissa data normalisoitiin vastaan ​​GAPDH, kolumnit, keskiarvo; baareja, SD, * p 0,05; ** P 0,01.

PI3K-Akt-β-kateniinin Signaali Cascade ei ole estetty runsas Expression of Surface JAM-A Lung Cancer Cells

Julkaistut tutkimukset osoittavat että JAM-A rajoitetaan suolen epiteelisolujen (IEC) lisääntymistä estämällä PI3K-Akt-β-kateniinin signaali cascade aktivointi [27]. Tutkia, onko tämä signaali polku on myös tehokas keuhkosyövän solulinjoja, testasimme myös koko ja fosforyloidun tasot Akt in JAM-A menettämisestä toiminnon tutkimuksia. Western blot -analyysi paljasti, että pudotus JAM-A ei muuta aktiivista tasoa Akt, mikä viittaa siihen, että korkea JAM-A tasot H1299 ja A549-solut eivät vaikuta PI3K-Akt-β-kateniinin cascade aktivointi (Fig. 7).

keskustelu

JAM-A on ilmaistu monenlaisia ​​kasvaimia ja on sekaantunut syövän etenemiseen. Ilmaisu JAM-A-proteiinin NSCLC kudoksissa ja suhdetta eri ennusteeseen viittaavia tekijöitä ei ole täysin tutkittu. Lisäksi tarkka rooli JAM-A keuhkosyöpä etenemiseen on epäselvä. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin ekspressiokuvion ja biologisen toiminnan JAM-A NSCLC. Olemme osoittaneet, että JAM-A on pääasiassa lokalisoitu solukalvojen ja ilmentyminen JAM-A keuhkosyöpä kudoksiin on korkeampi kuin vastaavassa normaalissa keuhkojen kudoksiin. Korkea taso ilmentymisen kalvo JAM-A merkitsevästi yhteydessä kehittynyt pTNM vaiheessa imusolmukemetastaaseja, ja vähentää yleistä selviytymisen keuhkosyöpäpotilaita. Yhdessä tuloksemme paljasti, että JAM-A on potentiaalinen kasvaimia synnyttävän proteiinin NSCLC ja voisi toimia negatiivisena ennustaja selviytymisen pienisoluista keuhkosyöpää.

edelleen tutkia mahdollisuuksia funktio JAM-A keuhkosyöpäsoluissa käytimme siRNA että pudotus JAM-A ilmentymistä H1299 ja A549 solulinjat, jotka ilmentävät suhteellisen korkeita pinta JAM-A. Lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostuminen kahdessa solulinjassa oli merkittävästi tukahdutti jälkeen hiljentäminen JAM-A. Useimmat proliferatiivisen tekijät vaikuttavat solujen kasvuun vaikuttavat solusyklin etenemistä, joten olemme analysoineet solusyklin ja osoitti, että JAM-A pudotus soluilla oli korkeampi G1 vaiheen ja alempi S-vaiheessa kuin kontrollisolut. Siten JAM-A hiljentäminen esti G1-to-S siirtyminen solusyklin etenemisen, mikä saattaa valaista mekanismi JAM-A keuhkosyöpään solujen lisääntymisen. Voit selvittää mahdolliset mekanismi JAM-A solukierron säätelyssä, tutkimme vaikutus JAM-A Knockdown solujen syklin liittyviä molekyylejä. Analysoimme ilmentymisen sykliini A, sykliini B, sykliini D1, CDK4, CDK6, P21, P27, ja P-RB, ja totesi, että ekspressiotasot sykliini D1, CDK4, CDK6, ja P-RB laskivat sen jälkeen JAM -A knockdown. Aikaisemmin on osoitettu, että P-RB vastaa merkittävä G1 tarkastuspiste, estämällä S-vaiheen merkintä ja solujen kasvua fyysisesti liittämällä E2F tekijöitä ja estää geeniekspression aktivaation, joka koodaa tarvittavien tuotteiden S-vaiheen etenemisen. Proteiinikompleksi muodostuu sykliini D1, CDK4 ja CDK6 se fosfory- P-RB ja edistää P-RB inaktivaatiota. Edelleen fosforylaatio P-RB eri CDK johtaa vapautumisen E2F, mikä helpottaa geenien aktivaation kriittinen S-vaiheen etenemisen [28], [29], [30]. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että JAM-A positiivisesti ohjaa NSCLC solujen lisääntymistä säätelemällä ilmaus solusyklin liittyviä molekyylejä, kuten sykliini D1, CDK4, CDK6, ja P-RB.

Julkaistut tutkimukset osoittavat, että JAM-A rajoittaa IEC lisääntymistä estämällä PI3K-Akt-β-kateniinin aktivointi [27]. Tutkia, onko korkea pinta JAM-A kaksi testattujen solulinjojen vaikuttaa kielteisesti solujen lisääntymistä samalla tavalla kuin IEC, testasimme myös aktiivinen (fosforylaatio) tasot Akt in JAM-A menettämisestä toiminnon tutkimusten . Western blot-analyysi osoitti, että knockdovvn JAM-A H1299 ja A549-solut eivät muuta aktiivista tasoa Akt, joka osoittaa, että korkea JAM-A H1299 ja A549-solut eivät vaikuttaneet PI3K-Akt-β-kateniinin signaali cascade aktivointi.

rooli JAM-A kasvaimen kasvua ja levittäminen on edelleen kiistanalainen kysymys. Naik, et ai. [18] ilmoitti aluksi, että JAM-A ilmentyminen on negatiivisesti liittyy rintasyöpään aggressiivisuus ja etäpesäkkeiden 12 kasvaimia ja vastaavien muiden kuin kasvainkudoksessa, sekä 50 pahanlaatuisia ja vastaava metastasoituneen imusolmuke näytteitä. Kuitenkin, Mc Sherry et ai. [21], suurilla kliiniset tiedot sarjaa (270 potilasta invasiivisen rintasyövän kudos microarray [TMA] ja riippumaton tietojen joukko geenin ilmentymisen tietoja 295 primaarisessa rintasyöpä), osoitti positiivisen korrelaation JAM-A ilmaisun ja invasiivisia rintasyöpä ennuste, mikä vahvistettiin edelleen niiden toiseen julkistettuun raportti käyttämällä suurempaa datajoukon [24]. Äskettäin, Murakami et al. [22] käyttäen TMA 444 potilasta, joilla oli invasiivinen rintasyöpä, myös raportoitu samanlainen korrelaatio. Yhteydessä invasiivisen rintasyövän, ottaen huomioon suuremman datajoukon, yhdistyksen välillä ennusteeseen viittaavia tietoja ja Eloonjääntitulokset analysoitiin McSherry et al. [21], [24] ja Murakami et al. [22], korkea JAM-A ilmentymisen pitäisi olla negatiivinen ennustetekijä potilaan lopputulokseen. Mekanismi, jonka avulla kasvainsolujen säilyttää korkean JAM-A aikana kasvaimen etenemistä on määriteltävä. Gotte et ai. [25] osoitti, että miR-145, joka tavoitteet ja alas-säätelee JAM-A, on alassäädetty rintasyöpäsoluissa. Nämä tiedot saattavat selittää korkeita JAM-A tämäntyyppisen kasvaimen [22]. Kuitenkin, onko miR 145 samanlaiset tehtävät NSCLC rintasyövässä tarvitsevat lisätutkimuksia. On huomattava, että negatiivinen, mutta ei myönteisiä vaikutuksia JAM-A taudin etenemiseen raportoitiin myös kliinisten tietojen perusteella sarjaa liittyy kohtukarsinooma [19] ja haimasyövän [20], mikä viittaa siihen, että rooli JAM-A syövän etenemiseen voi olla riippuvaista solutyypistä. Julkaistut tiedot ovat keskittymällä mekanismeja JAM-A säätelevä syövän etenemiseen, vaikka kiistanalainen, olisi parempi selventää tätä asiaa. Positiivinen [21], [22], [23], [24], [25], [26] ja negatiivinen [18], [19] vaikutuksia JAM-A syövän etenemistä on raportoitu

in vivo <