Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia nanobubbles kuljettaa androgeenireseptorin (AR) siRNA ja niiden

in vitro

ja

in vivo

antituumorivaikutuksia yhdistettynä ultraääni- säteilytys, androgeenista riippumaton eturauhassyöpä (AIPC).

Materiaalit ja menetelmät

Nanobubbles kuljettaa AR siRNA valmistettiin käyttäen poly-L-lysiiniä ja sähköstaattinen adsorptio menetelmiä. Käyttäen C4-2 solujen aktiivisuuden testaus indeksi, optimaalinen säteilytys parametrit (mukaan lukien nanobubble numero /solujen määrän suhde, mekaaninen indeksi [MI], ja säteilytys aika) määritettiin ja käytettiin transfektoimaan ihmisen kolmesta eturauhassyövän solulinjoissa (C4 -2, LNCaP ja PC-3-solut). AR ekspressiotasoja tutkittiin RT-PCR ja Western blot-analyysi. Lisäksi vaikutukset nanobubbles ja ohjaus mikrokuplat nimetty SonoVuen arvioitiin kautta kuvantaminen on C4-2 ksenograftimallissa. Lopuksi, kasvua ja AR ilmentyminen seitsemän ryhmää kasvaimen kudokset arvioitiin käyttäen C4-2-ksenografti-hiirimallissa.

Tulokset

nanobubbles oli keskimääräinen halkaisija on 609,5 ± 15,6 nm, ja se voisi sitoutuvat tehokkaasti AR siRNA. Alle optimoitu oloihin nanobubble numero /solujen määrä suhde 100:1, MI 1,2, ja säteilytys aika 2 min, korkein transfektion hinnat C4-2, LNCaP ja PC-3-solut olivat 67,4%, 74,0%, ja 63,96% vastaavasti. Vuonna C4-2 ja LNCaP-solut, käsittelemällä näitä sitovia nanobubbles plus ultraäänisäteilytyksen inhiboi merkittävästi solujen kasvua ja johti tukahduttaminen AR-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen. Lisäksi varjoainetehosteisiin ultraääni osoitti, että nanobubbles saavuttaa vahvempi signaaleja kuin SonoVue ohjaus Keski hypovascular alueen kasvaimia. Lopuksi, kasvaimen vastainen vaikutus näiden nanobubbles plus ultraäänisäteilytyksen oli merkittävintä ksenograftin kasvaimen malliin verrattuna muiden ryhmien kanssa.

Johtopäätös

Nanobubbles kuljettaa AR siRNA voitaisiin mahdollisesti käyttää geenin vektorit yhdistettynä ultraäänisäteilytyksen hoitoon AIPC.

Citation: Wang L, Zhang M, Tan K, Guo Y, Tong H, Fan X, et al. (2014) valmistaminen Nanobubbles Kirjanpitoarvo androgeenireseptorin siRNA ja niiden estovaikutusta androgeenin Independent Eturauhassyöpä kun Yhdistettynä ultraäänisäteilytyksen. PLoS ONE 9 (5): e96586. doi: 10,1371 /journal.pone.0096586

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 23 helmikuu 2014; Hyväksytty: 09 huhtikuu 2014; Julkaistu: 05 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30970830) ja Key projekti Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2012jjB0072). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on hyvin tunnettua, että eturauhasen syöpä on riippuvainen androgeenit [1]. Siksi androgeenideprivaatio on ollut tärkein hoito edenneen eturauhassyövän. Tähän hoitoon, mutta tauti nopeasti etenee androgeenista riippumaton eturauhassyöpä (AIPC) useimmilla potilailla [2], [3]. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokkaita pitkäaikaisia ​​hoitoja AIPC. Uusien hoitostrategioiden AIPC edelleen houkutteleva, mutta on haastava ongelma kliinisen onkologian. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvun AIPC riippuu androgeenireseptorin (AR). Siten estämällä AR ilme on runsaasti potentiaalia hoidettaessa AIPC [4].

Tutkimukset ovat osoittaneet, että tukahduttamalla AR ilmaisutapoja RNA-interferenssi (RNAi) tekniikka on tehokas tapa estää kasvun eturauhassyövän solut, osoittaa, että tämä menetelmä voi olla mahdollista voittaa esteet liittyvät AIPC hoitoon [5]. Meidän aikaisemmat tutkimukset, AR kaksijuosteinen RNA (dsRNA), jossa on suuri spesifisyys AR geenien tarkoituksena oli estää ilmentymisen AR AIPC soluissa ja estää solujen kasvua [6]. Kuitenkin tämän tyyppisen geeniterapian lähestymistapa on vaikea soveltaa kliinisessä ympäristössä alhaisen geenin transfektion tehokkuus. Yksi tärkeimmistä syistä alhainen transfektion tehokkuus on puute tehokkaan, noninvasive

in vivo

kohdegeenin jakelujärjestelmä. Viime vuosina, ultraääni-tuhottavissa mikrokuplien on osoitettu olevan lupaava menetelmä geeniterapiaa varten. Todellakin, ultraääni-välitteisen mikrokuplien tuhoutumisen ei voi vain parantaa geenin transfektion tehokkuutta, mutta voidaan myös käyttää kudosspesifistä toimitus terapeuttisten aineiden [7], [8].

kehittämiseen ultraääni molekyylikuvantaminen ja nanoteknologia, koko mikrokuplien pienenee edelleen, ja mikro- ja nanomittakaavan koot ovat nyt saavutettavissa. Nanobubbles tarjoavat useita etuja kohdegeenin transfektio [9]. Esimerkiksi nanobubbles on ominaista voimakas levinneisyys ja vakaana, joiden avulla he voivat päästä tuumorikudoksista läpi kasvaimen verisuoniston [10]. Siksi tässä tutkimuksessa, yhdistimme RNAi teknologia nanoteknologian valmistamalla nanobubbles kuljettaa AR Sirna (siRNA). Fysikaaliset ominaisuudet näiden kuplien analysoitiin sitten. Lisäksi valmis nanobubbles käytettiin siRNA transfektioon AIPC solujen kanssa ultraäänisäteilytyksen hoitoa indusoimaan vapautumisen siRNA transkriptien.

in vitro

transfektion tehokkuus oli systemaattisesti. Lisäksi, anti-kasvain tehoa nanobubbles arvioitiin käyttämällä kuvantamismenetelmin ja kasvaimen kasvun inhibition määritys hiiren ksenografti eturauhassyövän malli. Tässä esitetyt tulokset tarjoavat kokeellinen tuki käyttöön nanobubbles kuljettaa AR siRNA yhdistettynä ultraäänisäteilytyksen mahdollisena tehokas hoito AIPC.

Materiaalit ja menetelmät

synteesi AR siRNA

Perustuen aiemmin määritetty 19-emäsparin kohdesekvenssin AR cDNA, AR siRNA syntetisoitiin kanssa Äänenvaimennin siRNA Construction Kit (Ambion, Austen City, USA) [6]. Cy3-leimattu AR siRNA syntetisoitiin sitten käyttämällä Äänenvaimennin siRNA Cy3 Labeling Kit (Ambion) fluoresenssin jäljittämistä tutkimuksiin. Pitoisuus syntetisoitu siRNA määritettiin käyttämällä spektrofotometriä, ja siRNA: t laimennettiin 50 uM käytettäviksi tässä tutkimuksessa.

valmistaminen nanobubbles kuljettaa AR siRNA ja karakterisointi niiden fyysisten ominaisuuksien

suspensiota, jossa oli lipidiä täyteaineita, mukaan lukien dipalmitoyylifosfatidyylikoliini (DPPC), dipalmitoyylifosfatidyylietanoliamiini (DPPE), dipalmitoylphosphatidic happoa (DPPA), ja dipalmitoyylifosfatidyyliglyseroli (DPPG) (in moolisuhteessa 90:2:5:3), valmistettiin polyetyleeniglykolin (in moolisuhde 94:6). Suspensio jaettiin 1 ml: n pulloihin ja lyofilisoidaan. Lyofilisoitu suspensiot rehydratoitiin 1 ml nesteytys liuosta ja 50% glukoosia, propyleeniglykolia ja glyseriiniä tilavuudesta 08:01:01. Perfluoripropaania (C

3F

8) lisättiin sitten ampullit korvata ilmaan, ja ST-B-sarjan amalgamator (AT M Biomaterials Co Ltd, Peking, Kiina) käytettiin valmistettaessa aihio nanobubbles joiden toimintataajuus on yli 4500 kierrosta minuutissa ja värähtelyn aika 90 s. [11]

poly-L-lysiiniä (PLL) (1 mg /ml) valmistettiin steriiliin kahdesti tislattua vettä . PLL liuos sekoitetaan sitten tyhjä nanobubbles klo 01:01 (v /v) suhteen ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten seos pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) poistamaan kaikki sitoutumattomat PLL. Cy3-leimattu AR siRNA lisättiin tähän nanobubble liuokseen 01:01 (v /v) suhteen, ja seosta inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten 200 ui PBS: ää lisättiin nanobubble seokseen, ja suspensio pestiin sentrifugoimalla kahdesti nopeudella 600 rpm 3 minuutin ajan poistamaan kaikki sitoutumattomat AR siRNA, jonka jälkeen nanobubbles leimattu sekä AR siRNA ja PLL saatiin. Nanobubble liuos ja vesiliuos, joka sisältää sitoutumatonta siRNA sitten keitettiin 5 minuutin ajan, minkä jälkeen optinen tiheys mitattiin 260 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä. Määrä nanobubbles mitattiin käyttämällä hemosytometriä [10]. Seuraavaa kaavaa käytettiin laskemiseen siRNA lastaus valmiudet:

koko, jakautuminen ja zeta-potentiaali sekä tyhjä ja valmis nanobubbles AR siRNA mitattiin Zetasizer Nano ZS90 partikkelikokoanalysaattorilla (Malvern Instruments Ltd , Worcestershire, UK). Muoto ja hajontaa nanobubbles Lisäksi tutkittiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa (OLYMPUS LX71, Olympus, Tokio, Japani).

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

kolme ihmisen eturauhassyövän solulinjaa käytettiin transfektiossa tutkimuksissa: LNCaP (androgeenistä riippuva solujen AR ilmaisua, ATCC, Manassas, VA, USA), C4-2 (AIPC solujen AR ilme, ViroMed Laboratories Inc., Minnetonka, MN, USA), ja PC-3 (ilman AR lauseke, ATCC, Manassas, VA, USA). Kaikki solulinjat viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Rutiini kohtia suoritettiin trypsiinihajotuksen. Yksi päivä ennen käsittelyä ultraäänisäteilytyksen, kaikki solut ympättiin viljelmässä levyille konfluenssiin 50%.

optimointi säteilytyksen olosuhteet transfektion nanobubbles kuljettaa AR siRNA

Jotta epäspesifinen negatiivinen vaikutukset solujen aktiivisuuden, sopiva pitoisuusalue nollanäytteen nanobubbles ja tuhoavasti säteilytysolosuhteita määritettiin ennen

in vitro

Solukokeita.

ultraääni säteilytys suoritettiin PHILIPS iU22 ultraäänijärjestelmän ( Royal Dutch Philips Electronics Ltd, Alankomaat). Ultraääni koetin kiinnitettiin kiinnike; Säteilevän pinnan kohtasi pystysuoraan ylöspäin ja peitettiin tasaisesti ultraääni kytkentä geeli; 24-kuoppalevylle, jossa 1,5 x 10

5 C4-2-soluja viljeltiin kussakin kuopassa oli sijoitettu vaakasuoraan säteilevän pinnan pinta koettimen sen varmistamiseksi, että kukin kuoppa oli täysin alttiina säteilevään lähteeseen; nanobubble suspensio lisättiin kuhunkin kuoppaan ja riittävästi sekoitettu; ja ultraääni säteilytys suoritettiin vaihteluita useita parametreja, kuten keskittyminen tyhjä nanobubbles (arvioitiin sen nanobubble numero /solujen määrä suhde), mekaanisen indeksin (MI, heijastus ultraääni energia lasketaan jakamalla huippu negatiivisen äänenpaineen mukaan neliöjuuren taajuus), ja säteilytys aika. Yksityiskohtaisesti vaikutusten arvioimiseksi aihion nanobubble pitoisuus, kuusi ryhmää perustettiin perustuu niiden nanobubble numero /solujen määrä suhde, joka on 0, 45:1, 90:1, 135:1, 180:1, tai ohjaus ryhmä (normaalit solut ilman hoitoa kontrollina); anturin taajuus oli 1,0-5,0 MHz, kesto oli 30 s, ja MI oli 1,0. Lisäksi viisi ryhmää perustettiin vaihtelevalla sydäninfarktien, nimittäin 0,1, 0,6, 1, 1,4, tai verrokkiryhmässä (normaalit solut ilman hoitoa kontrollina); anturin taajuus oli 1,0-5,0 MHz, kesto oli 30 s, ja nanobubble numero /solujen määrä suhde oli 100:1. Viisi työryhmää, joiden vaikutusten arvioimiseksi kesto, joka oli 10 s, 30 s, 1 min, 2 min, tai verrokkiryhmässä (normaalit solut ilman hoitoa kontrollina); anturin taajuus oli 1,0-5,0 MHz, MI oli 1,0, ja nanobubble numero /solujen määrä suhde oli 100:1. Jälkeen ultraäänisäteilytyksen, soluja viljeltiin 24 tuntia, ja solujen kasvu määritettiin käyttäen veren laskenta väline; solu lasketaan käytettiin testaukseen indeksi vaikutusten arvioimiseksi näiden parametrien solujen toimintaa. Kaikki määritykset toistettiin ainakin kolme kertaa, ja erilaisia ​​tuhoavia edellytyksistä

in vitro

ultraäänisäteilytyksen määritettiin.

Transfektio tehokkuuden määritys eturauhassyöpäsoluissa

LNCaP , C4-2, ja PC-3-solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

4 solua per kuoppa ja viljeltiin yön yli. Nanobubbles kuljettaa Cy3-leimattua AR siRNA lisättiin sitten kuoppiin kunkin soluviljelylevy ja transfektoitiin nämä kolme solulinjojen ennalta määrätyn valikoiman tuhoavia olosuhteissa. Transfektiotehokkuus arvioitiin sitten käyttäen fluoresenssimikroskopiaa. Prosenttiosuus fluoresoivien solujen (transfektio rate) määritettiin virtaussytometrialla. Lyhyesti, solut suspendoitiin uudelleen sen jälkeen, kun trypsiinihajotuksen tuottaa yhden solususpensiota. Virtaussytometria (FACSCalibur, Becton Dickinson, NJ, USA) käytettiin mittaamaan fluoresenssin intensiteetti 10000 soluja, ja tulokset analysoitiin käyttäen FlowJo 7,65 ohjelmistoa. Solut porteilla prosenttiosuuden laskemiseksi transfektoitujen solujen sisällä koko solupopulaation, minkä ansiosta määritys optimoitu parametrit saavuttaa korkeimman transfektion tehokkuutta. Kaikki analyysit toistettiin vähintään kolme kertaa.

Solun kasvun estäminen määrityksessä

Kukin kolmesta eturauhassyövän solulinjoissa oli jaettu kuuteen solun hoitoryhmissä mukaan reagensseja ja olosuhteita (taulukko 1). Kaikki ryhmät transfektoitiin käyttämällä edellä mainittua ultraäänisäteilytyksen menetelmän mukaisesti asianmukaiset parametrit: tiheys 1,0-5,0 MHz, mekaaninen indeksi (MI) on 1,2, ja altistumisen kestoa B-mode ultraääni 2 min. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) käytettiin päivittäin ensimmäisestä kuudes päivä transfektion jälkeen arvioida solujen kasvua. Kukin ryhmä oli 10 vastaava testaus kaivoja ja 2 Negatiivisena kontrollina kuoppia. Absorbanssiarvot 450 nm: ssä [D (450 nm)] analysoitiin mikrolevylukijalla (Model 550, Bio-Rad, USA). Solu kasvukäyrä saatiin kuvaajien aika (X-akseli) verrattuna vastaavan absorbanssin arvo (Y-akseli), ja solun kasvun esto (IR) laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa:

lisäksi, solun morfologia 48 h transfektion jälkeen havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia.

Detection of AR-mRNA: n ekspression taso RT-PCR

LNCaP ja C4-2-solut transfektoitiin käyttäen edellä mainittuja ultraääni säteilytys menetelmä edellä parametrit. Kokonais-RNA uutettiin kustakin ryhmästä 48 h kuluttua ultraäänisäteilytyksen. RT-PCR-analyysi suoritettiin käyttäen RNA PCR Kit (AMV Ver. 3.0, Kioto, Japani), ja glyseraldehydi-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin kontrollina. Alukesekvenssejä (5 ’→ 3’) varten AR olivat AAG CCA TTG AGC CAG GTG TAG TG (ylävirtaan) ja AAC CAG ATG AGG GGC GAA GTA GA (myötävirtaan) ja alukesekvenssit GAPDH olivat ACC CAT CAC CAT CTT CCA GGA G (ylävirtaan) ja GAA GGG GCG GAG ATG ATG AC (alavirtaan). Nämä alukkeet monistettiin 275 emäsparin AR fragmentti ja 159 emäsparin GAPDH fragmentti, tässä järjestyksessä. Käänteinen transkriptio-olosuhteet olivat 50 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 99 ° C: ssa 5 min, ja 5 ° C: ssa 5 min. PCR-olosuhteet olivat 94 ° C 2 min; 32 sykliä, joissa 94 ° C 30 s, 57 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C 1 min; ja 72 ° C: ssa 10 min. RT-PCR-tuotteet ladattiin 2% agaroosigeelillä. Elektroforeesin jälkeen vyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä Bio-Rad GelDoc 2000 geeliä kuvantamisjärjestelmä (Bio-Rad, CA, USA) ja ne densitometrisesti analysoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (NIH, https://rsb.info.nih.gov/ij/). Kaikki analyysit toistettiin viisi kertaa.

Detection of AR-proteiinin ekspressiotaso Western blot -analyysillä

LNCaP ja C4-2-solut transfektoitiin käyttämällä edellä mainittua ultraäänisäteilytyksen menetelmää optimoidun parametrit. Solun kokonaisproteiinia uutettiin kaikissa ryhmissä käyttäen soluhajotuspuskurin 48 h kuluttua ultraäänisäteilytyksen. Proteiinikonsentraatio määritettiin käyttämällä Bradfordin menetelmällä. 50-ug: n erä kutakin solulysaattia erotettiin 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) geelillä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) membraanille. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa 4 tuntia huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin primäärisen vasta-aineen (hiiren monoklonaalinen vasta-aine ihmisen AR; Santa Cruz Biotechnology, Kalifornia, USA), jonka 1:400 laimennus 37 ° C: ssa 4 h. Membraanit pestiin sitten Tris-puskuroidulla suolaliuoksella /Tween (TBST) puskurilla ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (vuohen anti-hiiri-IgG, Zsjqbio, Peking, Kiina) (1:1200 laimennus) 37 ° C: ssa 2 tuntia. Tehostetun kemiluminesenssin (ECL) reagenssia käytettiin sitten havaitsemaan proteiinivyöhykkeet altistamalla blotteja autoradiografinen kalvon. Kvantitatiivinen kuva-analyysi suoritettiin käyttäen Määrä Yksi 4,52 ohjelmisto (Bio-Rad). GAPDH käytettiin normalisoimaan näytteitä. Kaikki analyysit toistettiin viisi kertaa.

kuvantaminen nanobubbles kuljettaa AR siRNA hiiren ksenograftimallia

Tämä eläin Tutkimuksen hyväksyi Laboratory Animal Welfare ja eettisen komitean kolmannen Military Medical University , Kiina. Viisi miestä SCID-hiiriin, joiden paino 22-25 g (5-7 viikkoa vanhoja) olivat ksenosiirrettyjä 3 x 10

6 C4-2 syöpäsolujen 100 ul: ssa Matrigel (BD Biosciences, Basel, Sveitsi). Kasvainten annettiin vakiintua ja kasvaa halkaisijaltaan 10-15 mm. Sitten eläimet nukutetaan injektoimalla vatsaonteloon 100 ui 1%: pentobarbitaalinatriumia liuosta ja sitten kiinnitetään vatsalleen. Kaksiulotteinen ultraääni kuvia ksenosiirrettyjä kasvainten hankittiin käyttäen PHILIPS iU22 ultraääni järjestelmä. Nanobubbles kuljettaa AR siRNA sitten annettiin hiirille häntälaskimon kautta injektiona annoksena 5 ml /kg kehon painoa. Käytetyt muuttujat saamiseksi ultraääni kuvat olivat seuraavat: koetin taajuus = 5-12 MHz; MI = 0,4; ja voitto = 70%. Koetin on vahvistettu, ja varjoainetehosteisiin dynaamisia kuvia otettiin kiinni ultraäänellä työasemaohjelmisto-. Mikronikokoluokan mircrobubbles nimetty SonoVuen varjoainetta (Bracco, Milano, Italia) käytettiin verrokkina samoissa olosuhteissa. Kvantitatiivinen analyysi tehtiin käyttämällä Philips QLAB 8.1 ohjelmisto (Royal Dutch Philips Electronics Ltd, Alankomaat).

In vivo

kasvaimen kasvun estäminen määrityksessä

Tämä eläin hyväksyi tutkimuksen jonka Laboratory Animal Welfare ja eettisen komitean kolmannen Military Medical University, Kiina. Viisikymmentäkuusi uros SCID-hiirelle painoltaan 22-25 g (5-7 viikkoa vanhoja) olivat ksenosiirrettyjä 3 x 10

6 C4-2 solua 100 ul: ssa Matrigel. Eläin Tutkimuksen hyväksyi eläinten eettisen komitean Kiinan Pharmaceutical yliopistosta. Kasvainten annettiin vakiintua ja kasvaa halkaisijaltaan 7-10 mm. Eläimiä laakeri tuumoriksenografteja sitten satunnaisesti jaettu seitsemään ryhmään (kahdeksan eläintä ryhmää kohti). Hoitoja käytetään ryhmät 1-6 on lueteltu taulukossa 1. Ryhmä 7 annettiin nanobubbles kuljettaa roskaa siRNA + ultraääni säteilytys. Yksityiskohtaisesti, annokset nanobubbles kuljettaa AR siRNA (noin 1,6 x 10

6 /ul), tyhjä nanobubbles ja suolaliuoksella olivat 5 ml /kg kehon painoa. Paljas AR siRNA annos oli 100 ug hiirtä kohti. Kaikki nanobubbles, paljas AR siRNA, ja suolaliuos annettiin laskimoboluksena häntälaskimon kautta. Hiiret ryhmissä 3-7 sitten nukutettiin isofluraanilla ja kiinnitetty vatsalleen. Välittömästi injektion jälkeen tuumoriksenografteja käsiteltiin käyttäen Philips iU22 ultraääni-järjestelmä. Perfuusio nanobubbles kasvaimeen visualisoitiin reaaliajassa ultraäänellä (5-12 MHz), on pieni akustinen teho (MI 0,4) minimoimiseksi nanobubble tuhoa. Kun visualisointi nanobubbles sisällä Kasvaimen nanobubbles murtuivat lisäämällä MI 1,2: n taajuudella 1-5 MHz. Ultraääni altistuksen kesto 30 min käytettiin varmistamaan, että kaikki nanobubbles tuhoutuivat. Hoidon aikana, muuntimen sovellettiin liikkein, jotta koko -tuumoriksenografti sai ultraääni altistumista. Kaikki eläimet, hoito on suoritettava kolme kertaa, kerran 3 d (päivänä 0, päivänä 3, ja päivä 6). Suurin halkaisija (a, mm) ja lyhin halkaisija (b, mm) mitattiin kunkin tuumorin joka 3. d alkavat ensimmäisenä hoitopäivänä (päivä 0) ja päättyy 21 päivän kuluttua ensimmäisestä käsittelystä (päivä 21). Kasvaimen tilavuus (TV) laskettiin seuraavan kaavan mukaan: TV = 1/2 x a × b

2. Suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV) laskettiin sitten seuraavalla kaavalla: RTV = TV

n /TV

0 x 100%, jossa TV

n on tuumorin tilavuus mitattiin vuorokautena n ja TV

0 on tuumorin tilavuus päivänä 0. kasvaimen kasvukäyrä merkittiin perustuen RTV. Päivänä 21, kaikki eläimet tapettiin, ja kasvaimet käytetty ja punnittiin. Tuumorin kasvun esto (TGIR) laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: TGIR = (1-TWT /TWC) x 100%, jossa TWT ja TWC ovat keskiarvo kasvain painot käsitellyissä ja kontrolliryhmissä, vastaavasti.

havaitseminen AR mRNA ilmaisun eturauhastuumoreissa by qRT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin kasvainkudoksista ohjeiden mukana SuperScript Vilo RT-PCR Synthesis Kit (Invitrogen). Pitoisuus ja eheyden RNA määritettiin spektrofotometrinen klo A260 ja A280. Noin 500 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin Superscript III (Invitrogen) käyttäen N6 satunnaisia ​​alukkeita. Noin 2 ui cDNA monistettiin käyttäen yksivaiheista reaaliaikainen PCR Applied Biosystems 7500 FAST koneen kanssa vakio-ohjelma. Suhteellinen ekspressiotasot AR-mRNA laskettiin käyttäen kaavaa, jossa.

Detection of AR-proteiinin ekspressiotaso eturauhastuumoreissa Western blot -analyysillä

Vieraslajisiirteen kasvainkudoksessa homogenisoitiin 1 ml radioimmuunisaostuksella määritys (RIPA), joka sisälsi proteaasi-inhibiittori ja sentrifugoitiin 12000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti säilytettiin -80 ° C: ssa. Kokonaisproteiinia erotettiin 10% SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin PVDF-kalvolle 100 V: ssa 50 min. Western blot vaiheet olivat samat kuin kuvattiin

in vitro

kokeessa.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 13.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Quantitative data esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (± SD). Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin vertaamaan avulla useita ryhmiä (n 2). Independent-näytteiden t-testejä käytettiin verrattaessa avulla kummassakin hoitoryhmässä ja sen suhteellinen kontrolliryhmään. P-arvo (P) 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

fysikaaliset ominaisuudet nanobubbles kuljettaa AR siRNA

Kuvat, jotka on saatu kirkkaan kentän mikroskopia osoitti, että nanobubbles olivat homogeenisia kooltaan ja jakautuneet tasaisesti ilman merkittävää aggregoitumista (Fig. 1A). Säännöllinen nanobubbles havaittiin optisella mikroskoopilla (1000 x) (Fig. 1 C). Fluoresenssimikroskopia vahvisti, että meidän siRNA merkinnät lähestymistapa oli tehokas; vain nanobubbles konjugoitu Cy3-leimatun AR siRNA näytteillä punaisen fluoresenssin (Fig. 1 B), ja fluoresenssia havaittiin säännöllisesti nanobubbles (Fig. 1 D). Saadut tulokset, jonka hiukkaskoko analysaattori osoitti, että nanobubbles oli keskimääräinen halkaisija on 609,5 ± 15,6 nm (vaihteluväli, 269-1030 nm), ja niiden zeta-potentiaali oli -29,9 ± 6,6 mV. Tyhjä nanobubbles oli keskimääräinen halkaisija on 509,3 ± 45,19 nm (vaihteluväli 324-930 nm), ja zeta-potentiaali näiden kuplien oli -27,3 ± 6,4 mV. Kuten on esitetty kuviossa. 2, määrä siRNA ladattu kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla. Keskimääräinen AR siRNA lastaus valmiudet nanobubbles oli (18,94 ± 0,35) x 10

-9 nmol /nanobubble.

(A) PLL nanobubbles kirkkaassa-kentän mikroskopia. (B) Ilmeinen fluoresenssia havaittiin PLL nanobubbles. (C) Tyhjä nanobubbles kirkkaassa-kentän mikroskopia. (D) Ei fluoresenssi havaittu tyhjä nanobubbles. Punaiset nuolet kuvat osoittavat nanobubbles (1000 x).

Optimal säteilytysolosuhteita transfektioon

Kuva. 3 esittää vaikutuksista eri parametrien ultraääni Säteilytyksen C4-2 solujen kasvuun. Tilavuus on nanobubbles yli 6 ui (jäljempänä nanobubble numero /solujen määrä suhde oli 135:1) johti merkittävään vähentää solujen kasvua (P 0,05 kontrolliin verrattuna) (Fig. 3A). MI on suurempi kuin 1,4 aiheutti myös merkittävän solujen kasvun esto (P 0,05 kontrolliin verrattuna) (Fig. 3B). Kuitenkin vaikutus säteilytyksen aikaa solujen kasvua havaittiin olevan melko alhainen; ei ollut käytännöllisesti katsoen mitään merkittäviä eroja solujen kasvua ryhmien välillä käsiteltiin erilaisilla säteilytysaikoja (Fig. 3C). Siten tuhoavia säteilytys olosuhteet lopulta haluaa olla nanobubble numero /solujen määrä suhde 135:1 ( 6 ui nanobubbles), MI 1,4, ja säteilytys aika ≤2 min.

(a) vaikutus nanobubble pitoisuus (jossa MI on 1,0 ja säteilytys aika 30 s), U: alttiina ultraääni; (B) vaikutus MI, joiden nanobubble numero /solujen määrä suhde 100:1 ja säteilytys aika 30 s; ja (C) vaikutus säteilytys aikaa, jossa on nanobubble numero /solujen määrä suhde 100:1 ja MI 1,0. Solut laskettiin 24 tunnin kuluttua ultraäänisäteilytyksen. Kaikki määritykset toistettiin kolme kertaa. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD (n = 3). Tähdellä (*) edustaa merkitsevyystaso verrattuna kontrolliin (P 0,05).

Transfektio tehokkuuden määritys eturauhassyöpäsoluissa

Red fluoresenssi (merkki Cy3-leimattua AR siRNA) havaittiin suurimmassa osassa sytoplasmassa kaikissa kolmessa eturauhassyövän solulinjoissa, mutta sitä ei ole havaittu tumassa (kuvio. 4). Nämä tulokset osoittavat, että Cy3-leimattu AR siRNA onnistuneesti transfek-. Prosenttiosuudet transfektoitujen solujen näissä solulinjoissa eri ultraäänisäteilytyksen olosuhteet on esitetty taulukossa 2.

punainen fluoresenssi sytoplasmassa osoittaa, että Cy3-leimattu AR siRNA onnistui transfektoitiin (400-kertainen suurennus).

Kuten on esitetty taulukossa 2, kun nanobubbles kuljettaa AR siRNA annettiin klo nanobubble numero /solujen lukumäärän suhde 100:1 (5 ui nanobubbles), prosenttiosuus transfektoiduista soluista lisääntyi sekä lisäykset MI ja säteilytys aika. Korkeimmat transfektiotehokkuutta saavutettiin MI 1,2 ja säteilytys aika 2 min. Näin ollen optimoitu parametrit saavuttaa mahdollisimman transfektion tehokkuus olivat seuraavat: 5 ui nanobubbles, MI 1,2, ja säteilytys aika 2 min; seuraavat

in vitro

analyysit suoritettiin käyttäen näitä parametreja.

Solun kasvun estäminen

CCK-8 analyysi ensimmäisestä kuudenteen päivä transfektion jälkeen osoitti, että solujen kasvua estyi ryhmien 3, 5 ja 6 C4-2 ja LNCaP-soluissa (kuvio. 5A ja 5B). Kuudentena päivänä transfektion C4-2 solut Ryhmä 6 osoittanut nopeinta kasvun estäminen nopeudella 64,7%. Ei kuitenkaan ole merkittäviä solujen kasvun inhibitio havaittiin PC-3-soluja, ja kasvun esto ryhmässä 6 oli vain 0,9% (taulukko 3).

merkittävä solujen kasvun esto havaittiin ryhmien 3, 5, ja 6 molemmissa solulinjoissa. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD (n = 10). Ryhmät 1-6 edustavat paljas AR siRNA + tyhjä nanobubbles, nanobubbles kuljettaa AR siRNA, paljas AR siRNA + ultraäänisäteilytyksen, tyhjä nanobubbles + ultraäänisäteilytyksen, paljas AR siRNA + tyhjä nanobubbles + ultraääni säteilytys, ja nanobubbles kuljettaa AR siRNA + ultraäänisäteilytyksen, vastaavasti .

AR-mRNA: n ilmentymisen tasot määritettiin RT-PCR: llä

agaroosigeelielektroforeesilla tuloksia seuraavista RT-PCR: llä, on esitetty kuviossa. 6A. Bändit 275 emäsparin (AR) ja 159 emäsparin (GAPDH) havaittiin kaikissa ryhmissä sekä C4-2 ja LNCaP. AR bändit ei havaittu missään PC-3 ryhmiin, koska PC-3-solut eivät ilmennä AR. Tulokset kvantitatiivisen analyysin (Fig. 6B), osoitti, että molemmissa solulinjoissa, AR-mRNA: n ekspressio oli merkittävästi vaimentaa Ryhmät 3, 5, ja 6 kontrolliin verrattuna (ryhmä 1). Korkeimmat tukahduttaminen saavutettiin ryhmässä 6.

Kaistat 1-6 edustavat ryhmät 1-6, vastaavasti (konsernista1: siRNA + NB, Group2: siRNA-NB, Group3: siRNA + USA, Group4: NB + USA , RYHMÄ5: siRNA + NB + USA, RYHMÄ6: siRNA-NB + USA). Koot markkereita (M kaista, alhaalta ylös) ovat 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ja 450 emäsparin. GAPDH toimi sisäisenä viitteenä. Korkeimmat tukahduttaminen AR mRNA: n ilmentymisen havaittiin Group 6. (A) ja (B): Bändit RT-PCR-tuotteiden ja tulosten kuvan määrällisesti; tiedot histogrammit edustavat keskiarvoja ± SD viidestä riippumattomasta kokeesta. (* P 0,05 ** P 0,01 vs. ryhmä 1 C4-2 solujen # P 0,05 ja ## P 0,01 vs. ryhmä 1 LNCaP).

transfektion AR-proteiinin ekspressiotasot määritettiin Western blot -analyysillä

Western blot tulokset on esitetty kuviossa. 7. AR -proteiiniekspressio tukahdutettiin ryhmien 3, 5 ja 6 C4-2 ja LNCaP. Korkeimmat tukahduttaminen havaittiin Ryhmä 6, joka oli yhdenmukainen RT-PCR-tuloksiin.

Kaistat 1-6 edustavat ryhmät 1-6, vastaavasti (konsernista1: siRNA + NB, Group2: siRNA-NB, Group3 : siRNA + USA, Group4: NB + USA, RYHMÄ5: siRNA + NB + USA, RYHMÄ6: siRNA-NB + USA). GAPDH-proteiini toimi sisäisenä viitteenä. Korkeimmat tukahduttaminen havaittiin Group 6. (A) ja (B): Immuno-bändejä ja tulokset kuvan määrällisesti; tiedot histogrammit edustavat keskiarvoja ± SD viidestä riippumattomasta kokeesta. (* P 0,05 ** P 0,01 vs. ryhmä 1 C4-2 solujen # P 0,05 ja ## P 0,01 vs. ryhmä 1 LNCaP).

kuvantaminen nanobubbles kuljettaa AR siRNA on C4-2 eturauhassyöpäksenograftista malli

Varjoainetehostettu dynaaminen kuvia nanobubbles kuljettavat AR siRNA on esitetty kuvassa. 8. Tulokset osoittivat, että nanobubbles saavuttaa vahvempi signaaleja kuin SonoVue Keski hypovascular alueen kasvaimia. Kuvantamisen data-analyysi (taulukko 4) osoittivat, että nämä nanobubbles oli merkittävä nousu piikin intensiteetin ja kuvantamisen kestoa verrattuna SonoVuen ohjaus (P 0,05). Ympäröivän kasvaimen alueella, nanobubbles näytetään myös huomattavasti pidempi kuvantamisen kestoa kuin SonoVueta (P 0,05).

(A) -ksenografti tuumorinäytesylinterin;