Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Epigenetiikka määritellään periytyviä muutoksia geenien ilmentyminen, jotka eivät perustu muutoksiin DNA-sekvenssi. Posttranslational muuttaminen histoniproteiineista on merkittävä mekanismi epigeneettiset sääntelyn. Kinaasi PRK1 (proteiinikinaasi C liittyvät kinaasi 1, joka tunnetaan myös PKN1) fosforyloi histoni H3 treoniini 11 ja osallistuu säätelyyn androgeenireseptorin signalointi. Näin ollen on tunnistettu uusi lääke kohde, mutta ei tiedetä paljoakaan PRK1 estäjiä ja seuraukset sen eston.

Menetelmät /Principal löytäminen

Käyttämällä kohdennettua kirjasto seulontaan, tunnistimme kliinisissä ehdokas lestaurtinib (tunnetaan myös nimellä CEP-701) uudeksi estäjä PRK1. Joka perustuu syntyvän 3D-mallin PRK1 kinaasi käyttäen homologin PKC-theta (proteiinikinaasi c-theta) proteiinia templaattina, avain vuorovaikutus lestaurtinib kanssa PRK1 analysoitiin käyttämällä molekyyli- telakka tutkimuksissa. Lisäksi vaikutukset histoni H3 treoniinifosforylaatio ja androgeeniriippuvaisissa geenin ilmentyminen arvioitiin eturauhassyöpäsoluissa.

Johtopäätökset /merkitys

Lestaurtinib estää PRK1 erittäin voimakkaasti in vitro ja in vivo. Sovellettu soluviljelmässä se estää histoni H3 treoniinifosforylaatio ja androgeeniriippuvaisissa geenin ilmentymistä, joka on ominaisuus, joka ei ole vielä tiedossa. Niinpä meidän havainnot ovat vaikutuksia sekä ymmärrystä kliinisen aktiivisuuden lestaurtinib sekä tulevia PRK1 estäjiä.

Citation: Köhler J, Erlenkamp G, Eberlin A, Rumpf T, Slynko I Metzger E, et ai . (2012) Lestaurtinib Estää Histone fosforylaatio ja androgeeniriippuvaisissa Gene Expression eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (4): e34973. doi: 10,1371 /journal.pone.0034973

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 helmikuu 2012; Hyväksytty: 10 maaliskuu 2012; Julkaistu: 20 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Köhler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole rahoitusta tai tukea raportti.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigenetiikka määritellään perinnöllisiä muutoksia geenien asetusta, eivät määräydy muutokset genomissa [1]. Epigeneettiset prosessit ovat selkeät vaikutuksia patologia ihmisen sairauden [2], ja siten uusia estäjiä nämä ovat erittäin mielenkiintoisia lääkekehityksen [3]. Moninaisista histonimodifikaation [4], fosforylaatiota histonien ei niin hyvin tutkittu, etenkin lääkekehityksen. Useimmat raportit ovat Aurora-kinaasien, jotka ovat pikemminkin valvontaan osallistuvien mitoosin [5]. Toinen kinaasi mukana mitoosia että toimivansa histones on haspin [6], [7]. Kinaasien PKC-betaI [8] ja PRK1

a kappale (myös kutsutaan PKN1) [9] tärkeitä rooleja aktivoimaan geenitranskription [10] aikana androgeenireseptorin signalointi ja PRK1 pidetään lupaavana tavoite eturauhassyövän hoitoon. Etsittäessä uusia PRK1 estäjiä teimme kohdennetun kirjaston seulonta tunnistaa uusia osumia ja arvioida viite estäjien verrattuna. Olemme tunnistaneet kliininen ehdokas lestaurtinib (tunnetaan myös CEP-701) uudeksi voimakas estäjä epigeneettiset kinaasin PRK1.

Tulokset

Kohdennettu Library Screening

Koska lähtö- pisteen etsimään uusia PRK1 estäjiä, käytimme Biomol Kinase ja fosfataasinestäjällä kirjasto (n = 84, katso kuva S4, S5 ja S6) alustavaksi seulontaan 100 nM kynnyspitoisuutta. Tämä seulonta tunnistaa vain bisindolyl-maleimidi (BIM) Ro318220 ja rakenteellisesti samankaltaisista staurosporiinille osumia (yli 40% sitovia suhteessa staurosporiinille 100 nM) (katso kuva 1 ja taulukko 1). Ro318220 jo tiedetään estävän PRK1 [9]. Olemme edelleen seulotaan 200 yhdiste talon kirjaston kaupallisesti saatavilla ja geneerinen estäjät, vast. estäjä ehdokkaita. Ne sisältyvät vakio estäjät kuten erlotinibi, lapatinibi vatalanib, SB203580 ja SB216763 (katso kuva 1), jota on käytetty profiloitua erilaisten kinaasien ennen. Inhibiittorit K252a ja lestaurtinib ja lisäksi SB216763 (vuorovaikutus tietoja ei esitetty) valittiin telakka-tutkimus perustuu niiden rakenteellista samankaltaisuutta staurosporiinille ja Ro318220. Staurosporiini analogit osoittavat kaikki samanlainen sitova malli. K252a estää trkA, VEGFR2 ja MLK1 in kaksinumeroinen nanometrin alueella ja sen tiedetään olevan selektiivisyys yli PKC noin 10-20fold [11]. Lestaurtinib on raportoitu estävän trkA, B ja C [12], JAK [13] ja FLT3. Koska inhibitio FLT3, on tutkittu kliinisesti myelofibroosi ja AML [14], [15]. Lestaurtinib ja K252a molemmat sitovat PRK1 korkealla affiniteetilla (katso taulukko 1). Lestaurtinib valittiin edelleen biologista arviointia tutkimuksessamme koska sen kehittyneen kehityksen tilaa ja estivät androgeenireseptorin geenin reagoiva geenin transkription.

Molecular Modelling

malli Ihmisen proteiini C liittyvä kinaasi 1 (PRK1) muodostettiin homologiamallinnusta järkeistää havainnoista optimoimaan tutkimuksia. Malli perustui samankaltaisuuden PRK1 ja proteiinikinaasi C theta (PKC-theta) ja käytettiin telakointi tutkimuksiin. Koska käytettävissä kiderakenteet PKC alatyyppien monimutkainen estäjien näyttää kaikki aktiivisen kinaasin konformaation, PRK1 malli edustaa myös aktiivisen konformaation kanssa klassisen DFG-in motiivi (kuvio 2) [16]. 84 yhdisteet Biomol estäjä kirjasto, joka testattiin in vitro määrityksessä, oli typistetty osaksi ATP: n sitoutuminen taskuun PRK1. Käytimme kolmea eri telakointi menetelmiä (GOLD [17], LUISTOVOITELU [18] ja ParaDockS [19]) ja viisi erilaista pisteytysfunktioita (ChemScore, GoldScore, GlideScore, ParaDockS p-Score ja AMBER GBSA pisteet [20], [21]) . Kaikkiaan 63 yhdisteitä voidaan onnistuneesti telakoituna osaksi ATP: n sitoutuminen taskussa. Yleensä eri telakka menetelmillä tulokset olivat samanlaiset, vaikka sijoitusta yhdisteiden havaittiin olevan erilaisia ​​(taulukko S1). Kaksi aktiivista inhibiittorit päässä Biomol yhdisteestä keräämistä, staurosporiini ja Ro318220, olivat kärkipään joidenkin pisteytysfunktioita. Yleensä telakointi ja virtuaaliseulonnan tutkimuksia paremman syrjiä aktiiveja ja houkuttimina havaitaan käyttämällä pisteytyksestä perustuu useisiin eri pisteytysmenetelmiä [22], [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme myös laskea yksimielisyyteen pisteet käyttämällä viittä normalisoitua pisteytysfunktioita Chemscore, Goldscore, Glidescore, ParaDockS p-pisteet ja GBSA pisteet. Käyttämällä konsensus pisteytys selkeä syrjintään erittäin aktiivinen inhibiittorit staurosporiinille (Score 9.23) ja Ro318220 (Pisteet 9.51) ja inaktiivisen yhdisteet (mukaan lukien aktiivinen estäjät kuviossa 1) voitiin saada. Ainoa molekyyli, joka antoi samanlaisen korkeat pisteet oli liittyvän Bisindolylmaleimide johdannainen 31 (Pisteet 8,84, taulukko S1, kuva S5) joissa ei ole ilmennyt mitään in vitro aktiivisuus alle 100 nM (dataa ei esitetty).

molekulaarinen pinta sitova tasku näytetään. Lisäksi vetysidoksia sarana-alueen, protonoitu aminoryhmä staurosporiinin luovuttaa vetysidoksia (esitetty oranssi katkoviivoilla) ja Asp744 ja säilytetty veden molekyyli (esitetty punaisella).

telakointi järjestely ja staurosporiini aktiiviseen kohtaan PRK1 osoittaa, että ligandi on täysin haudattu ATP: n sitoutuminen tasku (kuvio 2). Tärkein, lactame ja maleimidiryhmiä staurosporii- ja Ro318220, vastaavasti, muodostavat kaksi vetysidoksia Glu696 ja Ser698, jotka ovat osa sarana-alueen PRK1 (kuvio 3A ja 3D). Van-der-Waalsin vuorovaikutuksia havaittu portinvartija jäännös Met695, sekä Val629, Phe626, Leu747, ja Phe904, vastaavasti. Lisäksi välisten vetysidosten protonoidut aminoryhmä staurosporiinin sekä tiourean ryhmä Ro318220 ja Asp744 voidaan havaita. Aminoryhmän staurosporiinilla on myös mukana vetysidoksen konservoituneen veden molekyylin ja selkäranka CO Asp744.

yhteinen vuorovaikutusten estäjien ovat vetysidoksia, joihin Glu696 ja Ser698 sarana-aluetta, ja Van- der-Waalsin vuorovaikutukset portinvartija tähteeseen Met695, sekä Val629, Phe626, Leu747, ja Phe904. Lisäksi, jotkut estäjien vuorovaikutuksessa Asp744, Asn745 ja konservoituneen vesimolekyyli (punainen pallo) lähellä Mg

2+ sitoutumiskohta kinaasin. Selkäranka on esitetty violetti nauha. Vain asiaan aminohappoja näytetään. Vetysidoksia näkyvät dashed oranssinvärinen linjat.

analyysi telakointi asentoja K252a ja lestaurtinib osoittivat, että molemmat yhdisteet ovat vuorovaikutuksessa samalla tavalla kanssa ATP: n sitoutuminen taskuihin kuin staurosporiinille (kuvio 3B ja 3C ). Lisäksi vuorovaikutus sarana-alueen polaarinen substituentit tetrahydrofuraanirenkaassa järjestelmän vuorovaikutuksessa konservoituneen vesimolekyyli sidottu Asp744 ja Asn745.

Cellular Testing

analysoidaan vaikutus lestaurtinib on androgeeniresponsiivinen LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa (katso kuvio 4) [24]. Vaikutusta androgeenireseptorin välittämän signaloinnin mitattiin käyttäen kvantitoimiseksi mRNA: n ekspression useista tunnetuista androgeenireseptorin kohdegeenien. Lestaurtinib estää ilmentymisen Transmembraaniaktivaattori proteaasin, seriini 2 (

TMPRSS2) B [25], insuliinin kaltainen kasvutekijä-1 (

IGF1-R27) B [25], CXC-kemokiinireseptori 4 (

CXCR429)

[26], Homeobox proteiini Nkx-3.1 (

NKX3.1) B [27], miespuolinen sukusolujen liittyvän kinaasin

(MAK30) B [28] , musculoaponeurotic fibrosarkooma onkogeenin homologi (

MMM)

[

29

], tumareseptori alaheimoon 4, ryhmä A, jäsen 1 (

N4A1) B [29], Gene säännelty rintasyöpä I

(GREB1) B [30] ja FK506 sitovan proteiinin 5 (

FKBP5) B [31] 5 uM, mutta ei vähennä ekspressiota androgeenistä riippumaton glyseraldehydi-3-fosfaatti dehydrogenaasi (

GAPDH) B-geeniä [31]. Samassa pitoisuusalueella, lestaurtinib aiheutti hypophosphorylation at histoni H3 treoniini 11 (kuvio S7).

Expression of androgeenireseptorin kohdegeenien

TMPRSS2

,

IGF1-R

NKX3.1

,

CXCR4

,

MAK

,

MAF

,

N4A1

,

GREB1

ja

FKBP5

mitattuna qRT-PCR androgeenien (R1881) stimuloi LNCaP eturauhassyövän solut alennetaan käsittelemällä lestaurtinib (lopullinen konsentraatio 5 uM). MRNA: n ilmentyminen

GAPDH

geeniä käytettiin kontrollina. Pylväät edustavat keskiarvoa + SD (n = 5). P-arvo: ns = ei merkitsevä; * = 0,05; ** 0,01; *** 0,001.

Keskustelu

histonimodifikaation on tullut painopiste lääkekehityksen ponnisteluja. Inhibiittorit entsyymien vahvistaa nämä muutokset ovat myös arvokkaita välineitä koetin signalointireittejä. Olemme tunnistaneet kliinisen ehdokas lestaurtinib estäjänä kinaasin PRK1 joka vaikuttaa epigeneettisiä sääntely ja androgeenireseptorin signalointia. Tämä uusi toimintatapa lestaurtinib ei tiedetä tähän mennessä ja se voisi olla tärkeää ymmärtää toimintansa hoitopaikassa. Rakenteellinen samankaltaisuus lestaurtinib verrattuna staurosporiinille mahdollistaa että muut kinaasit kuin PRK1 voivat myötävaikuttaa havaitut geeni säätelyvaikutukset LNCaP-soluissa. On kuitenkin erittäin tärkeää, että lestaurtinib on vaikutusta epigenetic histonimodifikaation ja vähentää androgeeniriippuvaisessa geeniekspression merkittävästi eturauhasen syöpäsoluja. Tämä seikka olisi otettava huomioon tulevissa arvioinneissa kliinisissä puitteissa.

Lisäksi in vivo vaikutuksia lestaurtinib, tunnistaminen lestaurtinib ja K252a uusina PRK1 estäjiä ja puute eston perustettu estäjät kanssa tukirunkoja kuten anilinokinatsoliineja, anilinophthalazines tai diarylimidazoles antaa arvokasta tietoa suunnitteluun edelleen ja valikoivampia PRK1 estäjiä mahdollisina terapeuttisina androgeeniriippuvaisissa syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

-kinaasimääritys

kinaasi-inhibiittorit ostettiin Sigma-Aldrich (Lestaurtinib) ja Biomol (Ro318220) ja käytetään saatu. Puhtaus oli 93% (paino /paino) kaikissa tapauksissa kuten toimittaja. Estäjä seulonta suoritetaan LanthaScreen ™ Eu-kinaasin Binding Assay Kit (Invitrogen), jossa lopullinen määritys pitoisuuksilla 5 nM PRK1 (Proqinase, Freiburg), 2 nM LanthaScreen Eu-anti-GST-vasta-aine (Invitrogen) ja 10 nM Kinase Tracer 236 (Invitrogen). Määritys suoritettiin 384-kuoppaisille mikrotiitterilevyille (Perkin Elmer, Rodgau). Lopullinen määritys tilavuus oli 15 ui. Detection suoritettiin EnVision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer, Rodgau, eksitaatio: 340 nm, 1

st Emission: 665 nm, 2

nd Emission: 615 nm, viive 100 us, Integration Time 200 us). Kinaasi estäjä kirjasto hankittiin Biomol (akateemisen koko, n = 84 – entinen CAT # 2831A, kuva S4, S5, S6). IC

50 määritykset tehtiin kolme riippumatonta kertaa, kukin kolmena rinnakkaisena.

Computational Methods

Al0l laskelmat tehtiin Pentium IV 2,2 GHz perustuu Linux-klusteri. Koska kiderakenne ihmisen PRK1 kinaasin (UniProt merkintä Q16512) ei tunneta, homologiamalli syntyi. BLASTP hakuun [32] suoritettiin ihmisen PRK1 aminohapposekvenssin. Korkeimmat samankaltaisuus oli löytynyt liittyvän kinaasin PKCtheta. Yleinen sekvenssin identiteetti ihmisen PRK1-sekvenssin ja joka on peräisin PKC-theta on 49%, jossa on vain pieniä aukkoja tai insertioita kohdakkain alueella. Sekvenssikohdistukseen tehtiin ClustalW [33] (kuva S1). Mallia tuotettiin ohjelman Modeller käyttäen koordinaatit PKC-theeta X-ray rakenne 2jed (Resolution 2,32 Å) aktiivisessa konformaatiossa. Päällekkäin PRK1 mallin ja PKC-theeta X-ray rakenne tuotti RMSD arvo 0,73 Å runkoatomeista havainnollistaa korkean rakenteellisen samankaltaisuuden molempien kinaasien. Stereokemiallinen laatu tuloksena PRK1 mallin analysoitiin käyttäen ohjelmaa PROCHECK [34]. Vetyatomit ja AMBER osittaisia ​​maksuja määrättiin. Malli oli energiaa minimoida käyttämällä AMBER voimakenttä [35]. Hienosäätö johti malliin erinomainen stereokemiallinen laatu 90,1%: n phi ja psi kulma-arvot kaikkein asemassa olevilla alueilla, ja 8,5% lisäksi sallia alueilla (kuva S2). Ei jäämiä mallissa sijaitsee kieltänyt alueella.

Ligandi Docking

kolmella eri telakointi ohjelmia (GOLD 4.1 [17], LUISTOVOITELU [18] ja ParaDockS [19]) ja telakka kaikki molekyylit osaksi PRK1 ATP-sitoutumiskohta. Kaikkien telakointi kulkee oletusasetukset ohjelmaa käytettiin. Sitoutumiskohta PRK1 määriteltiin Glu696, jonka säde on 15 Å kattaa ATP: n sitoutuminen taskussa. Konservoitunut vesimolekyylin havaittiin X-ray rakenteiden PKCbeta ja PKCtheta pidettiin osa proteiinia. Goldscore, Chemscore, Glidescore, ParaDockS p-Score ja AMBER GBSA [20], [35] pisteet valittiin kunto toimintoja. Kunkin molekyylin, 30 telakointi ajoja tehtiin. Saatu liuokset ryhmittyneet perusteella raskaan atomin RMSD arvot (1 A). Ensiksi testasimme ovatko telakointi ohjelmat pystyvät toistamaan sitoutumispaikan sitoutuneiden ligandien NVP-XAA228, Biomol 33 (Ro318220), ja staurosporiini kuten havaitaan röntgen rakenteita PKC-theta ja PKC-beeta, vastaavasti ( ATE koodit 2jed.pdb, 1xjd.pdb [36] ja 1i0e.pdb [37]). Korkein tarkkuus saatiin käyttämällä GOLD ohjelmaa ja Goldscore kuin sopivuuskertoimina. RMSD arvojen kärkipään Goldscore telakointi ratkaisu ja kiderakenne inhibiittorit ovat 0,78 Å, 0,71 Å ja 0,49 Å (raskaat atomit) vastaavasti, mikä osoittaa käytettävyyttä sovellettu telakka ohjelmien toistamiseksi kokeellisesti määrätyt rakenteet kinaasin inhibiittorikomplekseja.

Molecular Dynamics Simulations

vakaus johdettujen PRK1-inhibiittorikomplekseja tutkittiin avulla molekyylidynamiikan (MD) simulaatioita. Aktiivisimmat estäjää staurosporiinille käytettiin simulaatio. MD simulaatiot suoritettiin käyttämällä AMBER 10 ja AMBER 1999 voimakenttä [38], [39]. Ligandi voimakentät parametrit otettiin yleisestä Amber voimakenttä (GAFF), kun taas AM1 ESP atomi osittaisia ​​maksuja oli osoitettu estäjä. Kompleksit liotettiin laatikko TIP3P vesimolekyylien ja liikevoittomarginaali 10 Å. Ennen vapaata MD simulaatiot, kahdessa vaiheessa rentoutumisen tehtiin; Ensimmäisessä vaiheessa, pidimme proteiini kiinnitetty rajoite 500 kcal mol

-1 a

-1. Toisessa vaiheessa estäjä rakenteet lievennetty 0,5 ps, jolloin proteiini atomit lakkasi X-ray koordinaatit voimavakio on 500 kcal mol

-1 a

-1. Viimeisessä vaiheessa, kaikki rajoitukset poistettiin ja kompleksit lievennetty 1 ps. Lämpötila rento järjestelmän tasapainotettiin sitten 300 K kautta 20 ps MD käyttäen 2 fs aika askelta. Jatkuva tilavuus ajoittain rajan asetettiin tasapainottua lämpötila-järjestelmän Langevin dynamiikan [40] käyttäen törmäyksen taajuudella 10 ps

-1 ja nopeuden raja 5 yksikön. Aikana lämpötila tasapainotus rutiini, kompleksin liuotin laatikko oli hillitty alkuperäiseen koordinaatit heikolla voimavakio on 10 kcal mol

-1 a

-1. Lopullinen koordinaatit lämpötilan tasapainottumisen rutiinia (sen jälkeen, kun 20 ps), käytettiin sitten suorittaa 1 ns molekyylidynamiikan rutiininomaisesti käyttäen 2 fs aikaan vaihetta, jonka aikana lämpötila pidettiin 300 K: n Langevin dynamiikkaa käyttäen törmäyksen taajuus 1 ps

-1 ja nopeus enintään 20 yksikön. Paine solvatoidun järjestelmän tasapainotettiin 1 bar tietyllä tiheys vakiopaine määräajoin rajan, jonka isotrooppinen paineen skaalaus menetelmä, jossa käytetään paine-relaksaatioaika 2 ps. Aika vaihe vapaan MD simulaatioiden oli 2 fs kanssa sulku 9 Å ei-liimattu vuorovaikutus, ja ravista [41] käytettiin pitämään kaikki joukkovelkakirjat, joihin vetyatomit jäykkä. Sähköstaattisia vuorovaikutuksia laskettiin käyttäen Particle Mesh Ewald menetelmä [42]. MD simulaatio PRK1-staurosporiini kompleksi suoritettiin yhteensä 10 ns. RMSD juoni näkyy kuvassa S3.

Tietokanta

3D rakenteet Biomol yhdisteiden (kuva S4, S5, S6) luotiin käyttäen Omega-ohjelman (OpenEye Software). Kaikki mahdolliset isomeerit ja tautomeerit syntyi, mikä johti 265 3D rakenteita. Kaikki syntyy isomeerejä käytettiin telakointi tutkimuksen.

AMBER GBSA Pisteytys

typistetty asentoja olivat energiaa minimoidaan käyttämällä AMBER voimakentän ja GBSA jatkumo malli [21]. Kunkin molekyylin paras pisteytys aiheuttaa valittiin verrattuna biologiset tiedot. Minimointi toteutettiin yhdistämällä jyrkimmän laskeutumisen ja konjugaattigradienttimenetelmä algoritmi, jossa on neliöllinen keskiarvo kaltevuus 0,001 kcal /mol. AM1-BCC maksuja määrättiin varten estäjiä, ja Amber99 voimakentän haettiin proteiinia. Ei-sidottu sulku asetettiin 16 Å. Kaikki raskas atomien proteiinia kytkettyinä voimalla vakio 100 kcal /mol, kun taas estäjä atomien helpotettiin aikana energia minimointiprosessi. Sitova vapaa energia Δ

G

lasketaan seuraavasti: missä Δ

E

MM on ero energian välillä monimutkaisia ​​ja energioiden summa vapaan ligandin ja vapaa proteiini , Δ

G

solv on ero GBSA solvaatioenergia monimutkaisia ​​ja summa solvaatioenergia energioita vapaan ligandin ja vapaa proteiini, ja Δ

G

SA on ero pinta energia monimutkainen ja summa pinta energiat ilmaiseksi ligandin ja vapaa proteiini.

RT-qPCR Analysis

Vaikutus androgeenireseptorin kohdegeenien olivat määritetään reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR. LNCaP-solut pestiin kerran PBS: llä ja sitten nälässä 24 tuntia fenolipunattomassa-free RPMI1640 täydennettynä 0,5%: double-stripped vasikan sikiön seerumia (dsFCS). Sitten soluja käsiteltiin tai ei ole lestaurtinib (lopullinen konsentraatio 5 uM) kuten on osoitettu. Jos soluja ei käsitelty lestaurtinib, DMSO lisättiin ajoneuvon. 10 minuuttia lisäyksen jälkeen lestaurtinib tai ajoneuvon, soluja käsiteltiin yli yön kanssa tai ilman R1881 (10

-9 M), kuten on ilmoitettu. DNaseI käsitellyn RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen), käytettiin käänteistranskriptioon. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin LightCycler 480 (Roche). Tuote muodostuminen havaittiin sisällyttämällä SYBR vihreä I käyttäen ROX passiivinen viite (ABgene). Sillä qRT-PCR: Seuraavia alukkeita käytettiin:

TMPRSS2

[25] 5′-TCACACCAGCCATGATCTGT-3 ’ja 5′-CTGTCACCCTGGCAAGAATC-3’;

IGF1-R

[25] 5′-CTGTATGCCTCTGTGAACC-3 ’ja 5′-TAGACCATCCCAAACGAC-3’;

NKX3.1

[27] 5′-AGAACGACCAGCTGAGCAC-3 ’ja 5′-AAGACCCCAAGTGCCTTTCT-3’;

CXCR4

[26] 5′-CTGTGAGCAGAGGGTCCAG-3 ’ja 5′-ATGAATGTCCACCTCGCTTT-3’;

MAK

[28] 5′-TGGACTTGCAAGAGAATTAAGGT-3 ’ja 5′-CTTCAGGGGCACGATACC-3’;

MAF

[29] 5′-AGCGGCTTCCGAGAAAAC-3 ’ja 5′-GCGAGTGGGCTCAGTTATG-3’;

N4A1

[29] 5′-ACAGCTTGCTTGTCGATGTC-3 ’ja 5′-GGTTCTGCAGCTCCTCCAC-3’;

GREB1

[30] 5′-AAGCTGAGCAGCACAGACAA-3 ’ja 5′-GGCTTCTCTTCTCCGAGGTAG-3’;

FKBP5

[31] 5′-TTTTTGAGATTGAGCTCCTTGA-3 ’ja 5′-TTGTGTTCACCTTTGCCAAC-3’;

GAPDH

[31] 5′-GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3 ’ja 5′-GTTCACACCCATGACGAACA-3’. Pylväät edustavat keskiarvoa + SD (n = 5). P-arvo: ns = ei merkitsevä; * = 0,05; ** 0,01; *** 0,001.

Western blot -analyysi

LNCaP ihmisen eturauhasen adenokarsinooma-soluja kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (PAA), joka sisälsi naudan sikiön seerumia (PAA) 10% (v /v), penisilliini (PAA) 1% (v /v), streptomysiiniä (PAA) 1% (v /v), L-glutamiinia (PAA) 1% (v /v) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. 2,5 * 10

6-soluja ympättiin kudosviljelymaljoilla (10 cm) ja inkuboitiin RPMI1640-alustassa (PAA), joka sisälsi puuhiilellä puhdistettua naudan sikiön seerumia (PAA) 10% (v /v), penisilliiniä (PAA) 1% ( v /v), streptomysiiniä (PAA) 1% (v /v), L-glutamiinia (PAA) 1% (v /v). 24 h ymppäyksen jälkeen lestaurtinib tai Ro318220 (lopullinen konsentraatio kussakin tapauksessa 4,5 uM) liuotetaan kasvualustaan ​​(puuhiilellä puhdistettua naudan seerumin 10% (v /v), penisilliiniä 1% (v /v), streptomysiiniä 1% (v /v) , L-glutamiinia 1% (v /v), DMSO 1% (v /v), dihydrotestesterone 0,1 nM) ja inkuboitiin 18 tuntia. LNCaP-soluja inkuboitiin DMSO: ssa (1% (v /v)) käytettiin kontrollina. Seuraavat estäjää, solut pestiin kerran jääkylmällä PBS: llä, lyysattiin ytimet eristyspuskurilla (sakkaroosi 250 mM, Tris-HCI 20 mM, NaCl 150 mM, IGEPAL-CA 630 0,1% (v /v), CaCl

2 0,2 mM, MgCI

2 1,5 mM, DTT 1 mM, pepstatiini 1 pM, Protease Inhibitor Cocktail Mix (Sigma), PhosStop® (Roche), pH 8,0). Histonit olivat happouutettu (H

2SO

4 0,4 ​​N, DTT 1 mM, pepstatiini 1 uM, proteaasiestäjäseostabletit Mix (Sigma), PhosStop® (Roche)) yön yli.

Protein pitoisuuksia histoni uutteet määritettiin käyttäen BCA Protein Assay (Pierce). 5 ug proteiinit erotettiin SDS-geelielektroforeesilla (15% polyakryyliamidigeelillä) ja siirrettiin Roti®-PVDF-kalvolle (Roth). Membraani blokattiin sitten rasvatonta maitoa (Roth, 5% (w /v), TBS, Tween 20 0,1% (v /v)), ja tutkittiin anti-H3T11ph (Active motiivi) 1:1000 ja anti- H3 (Upstate) 1:5000 latauskontrollina. Canon CanoScan LiDE 50 käytettiin hankkimaan kuvan blot ja Adobe Photoshop 5.0 käytettiin kuvan käsittelyyn.

tukeminen Information

Kuva S1.

Sekvenssiryhmittely välillä PKC-theeta (Sbjct) ja PRK1 (Query).

doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s001

(TIFF) B Kuva S2.

PROCHECK-analyysi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s002

(TIFF) B Kuva S3.

RMSD juoni MD simuloinnin PRK1-staurosporiini kompleksin avulla AMBER10. Harmaa viiva kuvaa RMSD tontin PRK1 proteiini Ca-atomeja, kun taas musta viiva osoittaa vaihtelun inhibiittorin rakenteen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s003

(TIFF) B Kuva S4.

Yhdisteet päässä Biomol kirjastosta, yhdisteet 1-30.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s004

(TIFF) B Kuva S5.

Yhdisteet päässä Biomol kirjastosta, yhdisteet 31-60.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s005

(TIFF) B Kuva S6.

Yhdisteet päässä Biomol kirjastosta, yhdisteet 61-84.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s006

(TIFF) B Kuva S7.

Vaikutukset lestaurtinib ja Ro318220 on fosforylaatiota H3T11 LNCaP-soluissa 18 tunnin kuluttua.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s007

(TIFF) B Taulukko S1.

Scoring saadut arvot 63 telakoituna Biomol yhdisteitä ja seitsemän testatuista estäjä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034973.s008

(DOC) B