Krooninen sairaus

tiivistelmä

Integrative analyysit useiden genomista tietokokonaisuuksien valitut näytteet voivat tarjota paremman käsityksen yleistä tietoa ja voivat tehostaa tietoa syövän. Tavoitteena oli selvittää selvittämään yhdistyksen välillä kopioluvun vaihtelu (CNV) ja geenien ilmentyminen kolorektaalisyövässä (CRC) näytteet ja niitä vastaavat ei-syöpä kudoksiin. Kuusikymmentäneljä pariksi CRC näytteitä samoista potilaista tehtiin CNV profilointiin käyttäen Illumina HumanOmni1-Quad-kokeessa, ja validointi suoritettiin käyttäen multiplex ligaatio koetin monistamisen menetelmällä. Genominlaajuisten ilmentymisen profiloinnin suoritettiin 15 pariksi näytteitä samasta ryhmästä käyttävän potilaan Affymetrix Human Gene 1.0 ST array. Merkittävät geenejä saadaan molemmat array tulokset sitten päällekkäin. Tunnistaa molekyyli polkuja, tiedot on kartoitettu Kegg tietokantaan. Koko genomin CNV analyysi, jossa verrattiin primaarikasvaimen ja ei-syöpä epiteelin paljasti voittoja vuonna 1638 geenien ja tappioita 36 geenejä. Merkittäviä voittoja olivat löytyy useimmiten kromosomin 20 asemassa 20q12: n taajuudella 45.31% Tuumorinäytteissä. Esimerkkejä geenejä, jotka liittyivät tässä cytoband olivat

PTPRT

,

EMILIN3

ja

CHD6

. Eniten tappiot havaittiin kromosomissa 8, asema 8p23.2 kanssa 17.19% esiintyminen kaikissa kasvain näytteissä. Niistä geenit löytää tähän cytoband olivat

CSMD1

ja

DLC1

. Genominlaajuisten ilmentymisen profilointi osoitti 709 geenit on säädelty ja 699 geenien olevan säädellä vähentävästi CRC verrattuna ei-syöpä näytteitä. Integrointi näiden kahden aineistoja tunnistettu 56 päällekkäistä geenejä, jotka sijaitsivat kromosomeissa 8, 20 ja 22. MLPA vahvisti, että CRC näytteet oli korkein voitot kromosomissa 20 verrattuna vertailunäytteiden. Tulkinta CNV tietojen yhteydessä transcriptome kautta integroiva analyysit voivat tarjota tarkempaa tietoa perimän maiseman CRC.

Citation: Ali Hassan NZ, Mokhtar NM, Kok Sin T, Mohamed Rose I , Sagap I, Harun R, et ai. (2014) Integroitu analyysi Kopioi numero vaihtelu ja genominlaajuisten Expression profiloinnin peräsuolen syövän kudoksia. PLoS ONE 9 (4): e92553. doi: 10,1371 /journal.pone.0092553

Editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 24 helmikuu 2014; Julkaistu: 02 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Ali Hassan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Projekti rahoittivat tiede, teknologia Innovation (07-05-MGI-GMB016) ja Higher Instituutio Huippuyksikkö myöntää ministeriön korkeakoulu. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on merkittävä terveysongelma, jolla on yli miljoonaa ihmistä vuosittain diagnoosin maailmanlaajuisesti [1]. Tämä syöpä on kärkikolmikkoon kaikista syövistä, jotka johtavat kuolemaan maailmanlaajuisesti [2]. Malesiassa, se sijoittuu toiseksi yleisin syöpä molemmilla sukupuolilla [3].

Yksi muoto geneettinen epävakaus, joka havaitaan ainakin 85% satunnaisia ​​CRC tapauksissa on kromosomi epävakaus (CIN) [4] . Aneuploidy on seurausta CIN joka johtaa voitto tai tappio kokonaisuudessaan tai osaa kromosomialueita [5], ja se voi aiheuttaa rakenteellisia monimutkaisuus, joka johtaa perimän epävakaisuuden. Yksi yleinen muoto rakenteellisten varianttien johtuva CIN tunnetaan kopioluvun vaihtelut (CNVs), joka määritellään voitto tai tappio kopioita DNA-segmentit, jotka ovat suurempia kuin 1 kb pituudeltaan verrattuna viittaus genomiin [6]. CNVs voivat vaikuttaa geenin ilmentymisen ja on yhdistetty sairastuvuuteen. On ehdotettu, että transkription muutokset vastaavat CNVs ja muutokset geeni annostus voidaan korreloida muutoksia ilmaisun tasolla [7].

Tuhannet CNV sivustoja on dokumentoitu käyttäen sirutekniikkaa. Aiemmat tutkimukset kolorektaalisyövissä ovat paljastaneet voitot kromosomissa 8q, 13 ja 20q ja tappiot kromosomissa 8p, 17p ja 18q [8], [9], [10], [11], [12]. Nämä poikkeamia johtavat deleetio tai monistuminen tuumorisuppressorigeeneille, onkogeenien tai ei-koodaavat RNA: t, kuten miRNA, jotka johtavat poikkeava geenien ekspressiota, jotka vaikuttavat syöpään liittyvien biologisten prosessien [13], [14].

geenin, joka on yksi päällekkäisiä alleeli (a kopioluvun 3) on korkeampi ekspressiotaso kuin villityypin [15]. Toisaalta, geeni, joka on yksi alleeli poistetaan (a kopioluvun 1) on pienempi ilmentymisen taso [15]. Integrative analyysit CRC osoitti, että ekspressiotasot tiettyjen onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille liittyivät CNV [16]. Esimerkiksi vahvistus tai vahvistus

MYC

geenin asemassa 8q24 aiheuttaa yli-ilmentyminen tämän geenin CRC. Lisäksi poistetaan tai tappio

APC

geenin asemassa 5q21 johtaa sen vapautuneilla ilmaisun CRC [17]. Samanlaiset korrelaatio on havaittu myös rinta- ja keuhkosyöpää. Noin 12% muutoksia geenien ekspressiotasoja raportoitiin olevan yhdenmukaiset kopio numero rintasyövän [18], ja noin 78% geenit osoittivat positiivinen korrelaatio CNV ja geenin ilmentymisen taso on keuhkosyöpä tutkimuksen [19].

tämän tutkimuksen tavoitteena oli saada käsityksen molekyylimekanismeihin CRC kautta analyysit CNV ja genominlaajuisten ilmentymisen profilointi ensisijainen kasvain ja sen vastaava ei-syöpä paksusuolen epiteelin. Halusimme myös selvittää suhdetta CNV profiilin ja transcriptome CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Patient rekrytointi

Tutkimus suoritettiin hyväksyntää eettisen komitean ja Universiti Kebangsaan Malesia (UKM 1.5.3.5/244/UMBI-004-2012), ja kirjallinen tietoinen suostumus otettiin kukin 64 potilasta, joille tehtiin leikkaus. Yksikään potilaista ei ollut saanut kemoterapian tai sädehoidon ennen leikkausta. Primaarikasvaimen ja ei-syöpä kudoksiin (10 cm: n päässä kasvain) saatiin heti leikkauksen jälkeen ja pikajäädytettiin nestemäisessä typessä varastoinnin.

Genomisen DNA: n ja RNA: n eristys

Frozen leikkuu on suoritetaan kaikista näytteistä käyttäen leikkauspaksuuden 5-7 um. Leikkeet kiinnitettiin objektilaseille ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 80% syöpäsoluja) tai puuttuminen kasvainsolujen ja niiden vastaavat ei-syöpäsoluja. DNA eristettiin käyttäen Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit mukaan valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA uutettiin 15 pariksi näytteistä käyttäen Qiagen QIAmp Mini Plus Kit. Laatu eristetty DNA ja RNA kvantitoitiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), ja vain näytteet, jonka puhtaus on 1,8-2,1 (A260 /A280) valittiin. Eheys eristetty DNA-näytteet arvioitiin 1,0% agaroosigeeleillä, ja eheys eristetyn RNA määritettiin käyttäen Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, USA). Näytteet, joiden RNA Integrity Number (RIN) 6,0 ja edellä valittiin geeniekspressioprofilointi.

CNV ja geenien ilmentymisen profilointi

Kaikki 64 pariksi Näytteet analysoitiin käyttäen Illumina HumanOmni1-Quad Bead siru, joka sisältää 1140419 yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) loci, joka perustuu Illumina Infinium II määritys-protokolla (Illumina, San Diego, CA, USA). Geeniekspressioprofilointi suoritettiin 15 pariksi näytteitä käyttäen Affymetrix GeneChip- Human Gene 1.0 ST array, joka sisältää 36079 selostukset kanssa 28869 hyvin selityksin geenit (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA). RNA valmistettiin käyttäen Suosionosoituksia WT-Amp ST System protokollan ennen hybridisaatiota prosessin (NuGen Technologies Inc., San Carlos, CA, USA). Taulukot värjättiin skannattavaksi perustuu GeneChip- Whole Transcript (WT) Sense Tavoite Merkinnät Pitoisuus protokolla, joka oli kaavailema Affymetrix.

toimittaminen microarray tiedot ArrayExpress tietokantaan

Raaka ja normalisoitu microarray data ladattiin ArrayExpress tietokantaan: https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress. ArrayExpress liittyminen on E-MEXP-3980.

Tilastollinen analyysi CNV profilointi

binääritiedostoja (.

IDAT

), joka oli tuottanut Illumina skannausohjelmisto (Bead Scan Array Reader) analysoitiin käyttämällä Illumina Genome Studio genotyypin Module versio 2.3.33 (Illumina, San Diego, CA, USA), jolloin saatiin normalisoitu genotyypin tietoja. Genotyyppi verokanta oli vahvistettu ≥90%, ja loppuraportti normalisoitu genotyyppitietoja siirrettiin kolmannen osapuolen ohjelma, Partek Genomic Suite versio 6.6 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA), jotta määrittää CNV profiilit.

Parilliset CNV analyysi suoritettiin vertaamalla intensiteetti kunkin hybridisaatio signaalin kasvaimen näyte, kun se on sovitettu ei-syöpä epiteelin. Genominen segmentointialgoritmi havaitsemiseen käytettiin CNV voittoja ja tappioita. Seuraavat tiukat parametrit asetettiin vähentää vääriä positiivisia muutos: jokainen segmentti on oltava vähintään 10 peräkkäisen suodatettua koetin asetetaan, p-kynnysarvo 0,001 verrattuna naapurimaiden lähialueiden ja signaali-kohina kynnyksen 0.5. Cut-off-arvo voitto asetettiin edellä 2.3, kun taas tappio asetettiin alle 1,7. CNV vaadittiin voitot tai tappiot, joita esiintyi vähintään 10% (7 näytettä) näytteiden kokonaismäärästä. Täydellinen luettelo kaikista CNV voitot ja tappiot sisältyvät taulukkoon S1. Kromosomaalinen sijainnit kopioluvun voitot ja tappiot 22 autosomeiksi ovat osoittaneet karyograms (kuva 1).

Voitot näkyvät vihreinä ja tappiot näkyvät punaisina. Pituus vaakasuora palkki vastaa näytteiden lukumäärän mukana vastaavissa cytoband. Useimmat voitot löydettiin pitkän varren kromosomin 20 ja tappioita pääasiassa havaittiin lyhyen varren kromosomin 8.

Tilastollinen analyysi geeniekspressioprofilointi

Affymetrix CEL tiedostot tuotiin Partek Genomic Suite 6.6 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA) suorittaa geeniekspressioprofilointi analyysi. Raw CEL tiedostot käsitellä taustakorjausta ja quantile normalisointi (mediaani skaalaus) käyttäen vankka multi-array keskiarvon (RMA) menetelmällä. Pääkomponenttianalyysiin (PCA) käyrä muodostettiin laadun ohjauksen vaihe (kuvio 2A), ja erä vaikutus poistettiin lähteenä vaihtelua. Kolmen tavalla ANOVA suoritettiin kaikissa näytteissä. Tilastollisesti merkitsevästi ilmaistuna geenejä tunnistettiin käyttäen sekoitettua mallia varianssianalyysi on väärä löytö korko (Benjamini-Hochberg testi) säätää p-arvo ≤0.05 ja taita-muutos arvot -2 2. hierarkinen klusterointi syntyi visualisoida malleja ilmaisun datan (kuvio 2B). Gene ontologia rikastamiseen analyysi suoritettiin käyttäen DAVID (Tietokanta Annotation, visualisointi ja Integration Discovery) bioinformatiikan välineitä.

(A) PCA parvikuvio CRC tietoja. Jokainen piste edustaa näytettä. Pisteitä värittävät ryhmä tila sininen edustaa ei-syöpä epiteelin ja punainen edustaa kasvainkudoksen. (B) Hierarkkinen klusterointi mRNA profiileja. Näytteet on merkitty vaaka-akselilla ja ryhmitelty väripalkkia välillä dendogram ja lämmön kartan. Sininen edustaa ei-syöpä epiteelin ja punainen edustaa kasvainkudoksen. Kaiken kaikkiaan oli selkeä ero ei-syöpä epiteelin ja kasvainkudoksen ryhmä tutkittaessa molemmat PCA (kuvio 2A) ja hierarkkinen klusterointi (kuvio 2B).

integrointi kopioluvun vaihtelun ja genomi- laaja ilmaisu analysoi

tiedot CNV ja genominlaajuisten ilmentymisen analyysit analysoitiin erikseen. Tunnistaa merkittävät geenien näytteillä CNV ja geeniekspression muutoksia, meillä on päällekkäin kaksi aineistot kuten esitetty Venn-kaavio (kuvio 3A). Kromosomaalinen sijainnit päällekkäisten geenien välillä aineistot on esitetty pyöreä kartta (kuvio 3B).

(A) Venn-kaavio edustaa yhteistä geenien CNV ja geeniekspression aineistot paljasti 56 päällekkäin geenejä. (B) Pyöreä kartan yleiskatsaus CNVs ja geeniekspression data. Kromosomit näkyvät värikoodattu ulomman kaikkein rengas. Toinen rengas näyttää jakautuminen geeniekspressioprofiili. (Punainen osoittaa ylöspäin geenien ja vihreä tarkoittaa alas geenien). Sisempi rengas edustaa CN muutoksia (punainen merkitsee voitto CN ja vihreinä tappio CN). Sisin rengas näyttää jakautuminen kahdesta päällekkäisestä aineistoja.

Sub-analyysi tietojen kopiomäärä vaihtelua ja genominlaajuisten lauseke mikrosirun varten 15 pariksi tapauksissa

analysoi tiedot, jotka saatiin kopiomäärä ja genominlaajuisten ilmentymisen profilointi 15 pariksi näytteitä Partek Genomic Suite 6.6 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Genominen segmentointialgoritmi sovellettiin parametrit mainittiin kopioluku analyysi osiossa. Tuloksena taulukkolaskenta sisälsi yksittäisiä markkereita, jotka näkyvät poikkeavaan tasoja DNA kussakin kasvain suhteessa sen pariksi normaalia. Expression data normalisoitiin perustason ja suhteet olivat log2-muuttaneet ennen analyysiä. Molemmat aineistot korreloivat käyttämällä Pearsonin lineaarinen korrelaatio menetelmä ja muodostimme sirontakuvaajan katseluun tulokset (kuvio 4A ja 4B).

sirontakaavioissa geeniekspression (y-akseli), joka korreloi kopioida numeron (x-akseli ), jossa ero ilme CN muutos CRC

ARGLU1

(kuvio 4A) ja

UGGT2

(kuva 4B) geenejä. Jokainen piste edustaa yhtä näytettä.

Multiplex Ligaatioseoksista Probe Vahvistus (MLPA) B

validoimiseksi CNV profilointitulosten, valitsimme kromosomi 20 varten MLPA määritystä käyttäen SALSA MLPA P157 20q koetin sekoita mukaan valmistajan protokollan (MRC-Holland, Amsterdam, ja Alankomaat). Koetin sekoitus sisältää 34 koettimia 26 eri geeniä, jotka sijaitsevat 20q. Fragmentti analyysi PCR-tuotteiden suoritettiin käyttäen GeneScan-500 LIZ Size Standard Applied Biosystems 3130 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Fluoresenssin kerättiin aikana fragmentti erottaminen ja tuodaan Coffalyser.Net ohjelmisto (MRC-Holland, Amsterdam, ja Alankomaat) analysoitavaksi.

Tulokset

Väestörakenteen Data

64 potilasta, 39 (60,94%) olivat naaraita ja 25 (39,06%) oli miehiä (taulukko 1). Enemmistö oli Malays (48.44%), jonka jälkeen Kiina (46.88%) ja intialaiset (4,69%). Perustuu Dukes luokitus, 33 potilasta (51.56%) olivat Dukes B, 27 potilasta (42.19%) olivat Dukes C ja 4 potilasta (6,25%) olivat Dukes A. Keski-ikä oli 56 ± 13,35 vuotias.

Kopioi numero voitot todettiin usein, että q käsivarteen kromosomin 20

Niistä 8722 genomista segmenttiä kaikissa näytteissä, me supistuu analyysimme on 2212 CNV alueille, vastasi autosomeiksi jotka osoittivat monistuksissa (taulukko S1). CNVs olivat hajallaan kromosomissa 1-22 korkein vahvistus löytyy kromosomissa 20, mikä oli 388 segmenttiä, jotka edustivat 17,5% kaikista voitot. Toiseksi eniten voittoja dokumentoitiin kromosomissa 7, jossa 369 genomiset segmentit, jonka jälkeen kromosomi 8, jossa 338 genomista segmenttiä. Pisin pituus CNV vahvistuksen segmenteissä oli välillä 8q22.1 ja 8q22.2 vastaten 4.070.488 bp. Kaikkiaan 1638 geenejä monistettiin kaikissa näytteissä ja 765 näistä olivat ainutlaatuisia tai ei-tarpeeton geenejä. Cytoband 20q12 oli korkein taajuus voitot, joihin osallistuu vähintään 45,31%: n kasvain näytteitä. Kahdeksan geenit tunnistettiin tässä lokuksessa ja niistä kolme, nimittäin

PTPRT

,

CHD6

ja

EMILIN3

, on kuvattu aikaisemmin ja peräsuolen syövän. Kuvio 1 esittää jakautuminen näiden geenien kromosomissa 20, ja voitot näkyvät vihreinä. Tiedot päälle 10 merkittävää geenit mukaan RefSeq tietokantaan esitetään taulukossa 2.

Kopioi numero tappiot olivat pääasiassa löytyi p käsivarteen kromosomin 8

poisto tai tappio kopioluvun arvon alle 1,7 havaittiin koko kromosomin 1-22 autosomeiksi, jossa suurin havaittu kromosomissa 8, joka oli 225 CNV vaikuttaa segmentteihin. Erityinen alue tappioista havaittiin asemassa 8p23.3 17,9% esiintyminen kaikissa kasvain näytteissä. Toiseksi korkein taajuus tappiot havaittiin kromosomi 17, jossa on 213 genomiset segmentit, jonka jälkeen kromosomi 19, jossa on 184 genomista segmenttiä. Pisin menetys genominen oli 8p23.1 on 8p22, joka koostui 3093282 bp. Havaitsimme vain 14 ainutlaatuista tai ei-tarpeeton geenejä (taulukko 3). Analyysi yksittäisten geenien kromosomissa 8 osoitti, että vain 5 geenejä on aiemmin raportoitu liittyvän CRC; Näiden geenien olivat

CSMD1

,

DLC1

,

TUSC3

,

SGCZ

ja

LONRF1

. Jakauma tappioista, punaisella, voidaan havaita karyotyypin kaaviossa, kuten on esitetty kuviossa 1.

Analyysi geeniekspressioprofilointi

analyysi paljasti merkitseviä eroja geenien ilmentyminen välillä primaarikasvaimen ja ei-syöpä epiteelin näytteitä. Luokittelu PCA osoitti selvästi ero kahden erottuva ryhmiin kudoksen tyyppi (kuvio 2A). Kaikkiaan 1408 geenit ilmentyvät differentiaalisesti vähintään kaksinkertaiseksi kanssa tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05). Kuitenkin yksittäinen geeni edustaa useita koetinsarjojen kutsutaan sisarusten antureista ”in Affymetrix GeneChip-. Siksi kaikki tarpeettomia koetinsarjojen suodatettiin, joka jätti 1191 ainutlaatuisia geenejä tarkempaa analysointia varten. Näistä 584 geenit havaittiin olevan säädelty taas toinen 607 geenejä havaittiin olevan alassäädetty. Useimmat up-geenien havaittiin kromosomien 7 (n = 48, 8,22%), 2 (n = 44, 7,53%) ja 12 (n = 42, 7,19%). Down-geenien lähinnä sijaitsevat kromosomeissa 1 (n = 73, 12%), 2 (n = 44, 7,25%), 3 ja 4 (n = 43, 7,08%). Niistä up geenien olivat

MYC

,

CD44

,

ABC22

,

TIMP1

, ja

BIRC5

, kun taas alas geenien mukana

FAS

,

Klf4

,

UGTIA1

ja

CA2

. Täydellinen luettelo differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja niitä vastaavat taittuva muutoksia ilmaisun ja p-arvot on esitetty taulukossa S2. Hierarkkinen klusterointi syntyi ja näkyvään muotoon että karttaa, jossa kaksi erilaista ilmaisua kuvioita voidaan havaita (kuvio 2B). Toiminnallisen kuvauksen merkittävistä geenien suoritettiin käyttäen GO analyysiä, ja ne todettiin jaettava koko viisi luokkaa, johon kuului solusykliä, solunjakautumisen, kromosomi erottelu, nukleosidi- sitova ja ATP: n sitoutuminen (p 0,05).

vaikutus CNV ilmenemistä paksusuolen syöpään liittyvien geenien

integrointi kaksi profilointi aineistot osoittivat 56 päällekkäisten geenien (kuvio 3A ja 3B), ja täydellinen luettelo näistä päällekkäisten geenien esitetään Taulukko S3. Kaikkiaan 1135 geenien vain geenin ilmentymisen muutoksia ja 723 geenien CNV muutoksia, mutta ei muutoksia transkriptipitoisuuksissa havaittiin. Integrointi CNV ja geeniekspression analyysit osoittivat positiivista yhdistys 48 geenejä (85,7%) ja negatiivinen yhdistyksen loput 8 geenit (14,3%) (taulukko 4).

edelleen ymmärtää edelleen biologinen tehtävä näiden geenien 56 geenejä tehtiin toiminnallinen huomautusta ja luokittelu analyysin avulla DAVID v6.7. Olemme löytäneet geenit, jotka liittyvät biologisiin prosesseihin ja solukomponenttien.

Nämä geenit ovat edelleen kuvata Kegg reitin tietokannasta, vuorovaikutukset ehdokas onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille jotka tunnistettiin CNV ja ilmaisun array. Analyysi paljasti, että solusyklin oli kaikkein merkittävästi rikastettu polku ja

CDC25B

,

PCNA

ja

p107 /RBL1

olivat avain, mukana geenejä (kuvio 5).

Cell cycle havaittiin olevan merkittävin rikastettu reitti (p 0,05). Geenien (

CDC25B, PCNA ja p107 /RBL1

) näkyy punaisena Ruudussa geenit on voitto CN ja lisääntynyt ekspressiotaso.

korrelaatio CNV geeni ilmentymisen paksusuolen syöpään liittyvien geenien osajoukossa 15 pariksi näytteiden

määritellä suhde DNA: n kopioiden lukumäärä, ja geeni-ilmentymisen, olemme soveltaneet Pearsonin lineaarinen korrelaatio mallin (kuvio 4A 4B). Korrelaatioarvot välillä ei havaittu -0,85-0,89. Käyttämällä katkaisu p 0,05, 2159 geenit osoittivat merkittäviä korrelaatioita kopiomäärä ja geenien ilmentymisen. Kaikkiaan 914 transkriptien 616 geeneistä oli hyvä korrelaatio (r 0,6) välillä kopiomäärä ja geenien ilmentymisen. Viisi-korreloivat geenejä

ARGLU1

,

UGGT2

,

CES2

,

FUT10

ja

pAOX

. Täydellinen luettelo korreloi geenien kanssa Pearsonin korrelaatio ja p-arvot, voidaan tarkastella taulukossa S4.

validointi CNV profiloinnin avulla MLPA

Suoritimme MLPA määrityksen ja kohdennettuja 26 geenien 150 näytettä (50 normaaleista kudoksista ja 100 kasvaimet) vahvistaa CNV profilointitiedot. Valitsimme antureista, joka peitti q käsivarteen kromosomin 20 ja tulokset pidetään hyväksyttävänä, jos ohjaus huippu putosi alueella 0,8-1,2. Deleetio pisteytettiin jos keskiarvo annos testin sisäisen valvonnan huiput oli alle 0,7, ja päällekkäisyyksiä pisteytettiin jos keskiarvo annos oli 1,3 tai suurempi. Normaali vertailunäytteellä ei osoittanut kopioluvun muutoksia tahansa geenien ja MLPA analyysi osoitti, että kopioluvun voitto todettiin kaikissa kaksikymmentäkuusi testattu geenejä. Taulukossa 5 on yhteenveto MLPA analyysin keskiarvot kunkin geenin.

Keskustelu

Me tehdään integroidun analyysi käyttämällä useita aineistoja peräsuolen kudosten tunnistamiseksi differentiaalisesti ilmentyvien geenien kanssa muutos genomista segmenttiä. Analysoimme CNVs ja geenien ilmentymisen profilointi 64 pariksi ja 15 pariksi CRC kudoksiin vastaavasti. Käyttö viereisen ei-syöpä kudoksiin samasta yksilöstä vähensi muunnelmia johtuivat yksilöiden välistä heterogeenisyyttä.

Tässä tutkimuksessa havaittiin useita polttoväli genomista voitot ja tappiot CRC, joka osoitti jonkin verran yhteensopivuutta tulokset aikaisemmista tutkimuksista [20], [21], [22]. Yksittäiset analyysi CNV aineisto paljasti merkittäviä voittoja kromosomissa 20q, jotka olivat myös erittäin yhdenmukainen aiempien tutkimusten [23], [24]. Samanlaisia ​​voittoja oli havaittu myös rintasyövän ja ensisijainen mahasyövän [25]. Cytoband 20q12 osoitti korkein taajuus voitot joka kesti 39239931-41684451 emäsparin myötävaikutuksella kahdeksan geenien, kuten

PTPRT

,

CHD6

,

EMILIN3

,

LPIN3

,

PLCG1

,

TOP1

,

ZHX3

ja

MAFB

. Kahdeksasta geenit,

TOP1

,

PLCG1

ja

PTPRT

liittyivät CRC.

topoisomeraasi 1 (

TOP1

) on onkogeeni, joka katalysoi purkautuminen DNA ja luo yhden juosteen molekyylejä, joita tarvitaan lukuisissa biologisissa prosesseissa, kuten DNA: n replikaation, transkription ja DNA: n korjaukseen [26]. Tutkimus

TOP1

käyttäen array CGH löytyy voittoja sen kopioluku CRC näytteissä [9]. Lisääntynyt kopioluku

TOP1

havaittiin myös vaiheen III CRC potilaalla on keskimäärin neljä geenin kopioita jokaisen solun fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH) -menetelmällä [27], [28].

toinen geeni, joka liittyi CRC tunnistettu tässä tutkimuksessa oli fosfolipaasi C-gamma 1 (

PLCG1

), joka on signalointi molekyyli ja on viereisen geenin

TOP1

.

PLCG1

aktivoituu vasteena kasvutekijän stimulointi ja osallistuu säätelyyn erilaisten solun toimintoja, kuten solujen vaeltamiseen, invaasiota ja etäpesäkkeiden [29], [30], [31].

proteiinityrosiinifosfataasi-reseptoriin T (

PTPRT

) sijaitsee alueella monistettu alue 20q12 välillä 39344635-41684451 bp. Se on tuumorisuppressorigeenin ja on osoitettu olevan olennainen rooli soluadheesion ja solunsisäinen signalointi [32]. Gain kopioluvun joihin

PTPRT

geeni on tunnistettu aikaisemmassa tutkimuksessa munasarjojen selvä karsinooma käyttämällä array CGH [33]. Vahvistus kopiomäärä tämä geeni voi olla seurauksena, että ”matkustaja geeni” vaikutusta, koska emme voineet havaita mitään muutoksia sen geenien ilmentyminen.

Muut merkittävästi laajemmat cytobands Q käsivarteen kromosomin 20 koodatun vakiintunut onkogeenien jotka liittyivät CRC, ja nämä sisältyvät 20q11.21 (

BCL2L1

), 20q13.2-20q13.31 (

AURKA

), 20q11.23 (

SRC

CTNNBL1

), 20q11.21-20q11.22 (

DNMT3B

) ja 20q11.22 (

DYNLRB1

). Nämä havainnot viittaavat siihen tärkeän osallistuminen useiden kandidaattigeenejä sisällä pitkän varren kromosomin 20 syövän kehittymisen ja etenemisen. MLPA näyttää olevan luotettava ja tehokas tapa arvioida DNA kopioluvun muuttuu, koska suurin osa näistä testattiin geenien paljasti yhteensopivuutta mikromatriisi tuloksiin.

Kopioi numero tappiot pääosin osoitteessa p käsivarteen kromosomin 8 korkein tappio löydettiin cytoband 8p23.2 4008230-4027339 bp. Niistä geenit, jotka asuvat tällä alueella on CUB ja Sushi Useiden verkkotunnusten 1-geeni (

CSMD1

), joka on tuumorisuppressorigeeniä joka koodaa useita domain täydentää sääntely- ja Adhesion Protein. Polttoväli kopioluvun menetys

CSMD1

-geeni on havaittu CRC [34], rintasyöpä [35] ja mahasyövän [36], ja alentunut taso

CSMD1

ilmentyminen ilmoitettiin merkittävästi liittyy korkea-kasvaimen ja vähentää yleistä eloonjäämisen rintasyövän tutkimuksessa [37]. Toinen alue, joka todettiin omaavan kopioluvun menetyksen, joka havaittiin tässä tutkimuksessa cytoband 8p23.1-p22, joka sisälsi alueen, joka kattaa 12601480-15694761 bp. Geeni, joka sijaitsee tällä alueella on poistettu Liver Cancer 1 (

DLC1

), joka on raportoitu olevan tuumorisuppressorigeenin ja on osoitettu läpikäyvän kopioluvun menetys useita syöpiä, kuten hepatosellulaarinen syöpä ja rintasyöpä [38], [39].

Teimme sub-analyysi 15 pariksi näytteitä CRC arvioida suhdetta kopiomäärä muutoksia ja geenien ilmentymisen. Geenit mukana CRC, kuten

MYC

(v-myc linnun myelocytomatosis virus- onkogeenin homologi) [40]

CCNB1

(sykliini B1) [41] ja

PLK1

( polo-kaltainen kinaasi 1) [42], oli säädelty ja yhtäpitävästi monistettiin kopiomäärä tutkimuksessamme. Seitsemän geenejä havaittiin alassäädetty menetys kopioluvun mutta vain kaksi geeniä,

MUC17

(mukiinia 7) [43] ja

CES

(karboksyyliesteraasin 2) [44] ovat olleet osoitettu liittyvän CRC.

Integrated analyysi käyttäen Venn-kaavio osoitti, että 85,7% geenien oli positiivinen -alueella. Kun kartoitettu Kegg reitti, solusyklin todettiin eniten merkittävästi rikastettu reitti (p 0,05). Solusyklin on kriittinen säätelijä solujen lisääntymistä, ja kasvua ja solujen jakautumista sen jälkeen, kun DNA-vaurioita. Solusyklin koulutusjakson on pääasiassa sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) perhettä ja niiden säätelyalayksiköt, The sykliinit. Solusyklin on neljä vaihetta ja kaksi suurta tarkastuspisteiden on G1-S- ja G2-M siirtyy säilyttää oikea järjestys tapahtumat [45]. Menetys solusyklin Checkpoint ohjaus edistää geneettinen epävakaus, mikä johtaa hallitsemattomaan soluproliferaatioon ja voisi edistää syövän kehitystä [46].

Solunjakautumisen cycle 25B (

CDC25B

) on jäsenenä solunjakautumisen aikana (CDC) fosfataasi perhe, joka toimii aktivaattoreita CDK: iden ja sykliini-kompleksien säädellä etenemisen solusyklin [47].

CDC25B

vastaa alkuperäisen defosforyloinnilla ja aktivoinnin CDK, aloittaen täten tapahtumasarjaa, joka johtaa tuloa mitoosin [48], [49]. Yli-ilmentyminen

CDC25B

on havaittu 43% CRC potilaista ja korreloi huonoon ennusteeseen [50]. Lisääntynyt

CDC25B

taso riittää heikentämään DNA-vaurioita tarkistuspisteitä, mikä puolestaan ​​lisää spontaani mutageneesi ja häiritsee tullessa mitoosin [51], [52], [53].

Lisääntyvät solun tuma-antigeenin (

PCNA

) raportoitiin olevan välttämättömiä DNA: n replikaatio, DNA: n korjaukseen ja solusyklin säätelyssä [54]. Retinoblastooma kaltainen 1 (

p107 /RBL1

) kuuluu Retinoblastoomageenin perhe (RB), ja geenit tässä perheessä on todettu tuumorisuppressoreilla. RBL1 ja muiden RB-proteiinien yhteistyössä säädellä solusyklin etenemisen kautta G1 vaiheen solusyklin [55]. Kuitenkin mekanismi PCNA ja RBL1 osallistuminen solusyklin reitin CRC on edelleen epäselvä ja vaatii lisätutkimusta.

Havaitsimme myös geenejä negatiiviset assosiaatiot kopiomäärä ja geeniekspressiotasot. Geenit sisältävät

BCAS1

,

EDN3

,

FABP4

,

MATN2

,

SDCBP2

,

SPTLC3

TRPA1

ja

WFDC2

. Tämä paradoksi on negatiivinen suhde kopiomäärä aseman ja geenien ilmentyminen on havaittu aiemmassa tutkimuksessa CRC [56] ja saattaa johtua useita mekanismeja, jotka ovat vastuussa normaalin ja epänormaalin geenien toiminnan säätelystä, mukaan lukien ne, jotka liittyvät mutaatio, promoottori metylaatio ja miRNA ilmaisun [57]. Tämän ymmärtämiseksi ilmiötä, lähestymistapa käyttäen syvä sekvensointitekniikan todennäköisesti todennäköisesti antaa vastauksen näihin odottamattomia löydöksiä.

Yhteenvetona yhdistämällä aineistoja kahdesta eri profilointi tutkimuksissa onnistuneesti tunnistettu 56 päällekkäin geenien muutokset kopioluvun ja geenien ilmentymisen. Solusykli määritelty avaintekijäksi signalointireitille tästä integroitua analyysiä. Kuitenkin tulevaisuudessa tutkimukset ovat tarpeen, jotta niiden vaikutus näiden geenien tuloksista taudin.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Täydelliset tiedot kopioluvun vaihtelun profiilia 64 peräsuolen syöpäpotilailla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0092553.s001

(XLSX) B Taulukko S2.

Täydelliset tiedot geeniekspressioprofiili 15 peräsuolen syöpäpotilailla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0092553.s002

(XLSX) B Taulukko S3.