Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Haimasyöpä on aggressiivinen pahanlaatuisen ominaisella metastaattisen taudin kulun ja kestävyys tavanomaisiin kemosädehoidon. RLIP76 on monikäyttöinen solukalvon proteiini, joka toimii suurena merkaptuurihapon reitti kuljettajan sekä keskeinen säätelijä reseptori-ligandi-komplekseja. Tässä suhteessa olemme tutkineet merkitystä kohdistaminen RLIP76 on PI3K /Akt-reitin ja sääntelymekanismeissa vastaus kemosädehoidon.

Tutkimus Suunnittelu ja menetelmät

Solujen eloonjäänti arvioitiin MTT ja pesäkkeitä muodostavien määrityksiä. Cellular proteiinien tasoja ja fosforylaatio määritettiin Western blot -analyysit. Vaikutus apoptoosin määritettiin TUNEL määrityksessä. Syövän vaikutukset RLIP76 kohdennettuja toimenpiteitä

in vivo

määritettiin hiirillä ksenograftimallissa on haimasyöpä. Asetus Doksorubisiinin liikenteen ja säteilyherkkyydestä määritettiin liikenteen tutkimuksia ja pesäkkeitä muodostavien määrityksissä, vastaavasti.

Tulokset

Nykyinen tutkimukset paljastavat kattaa malli roolin RLIP76 säätelyssä tasot perustavaa laatua proteiinit kuten PI3K, Akt, E-kadheriinin, CDK4, Bcl2 ja PCNA jotka ovat erityisen tärkeitä signaalinvälityksessä kriittinen ylävirran signalointikaskadien jotka määrittävät leviäminen, apoptoosin ja haiman syöpäsoluja. RLIP76 ehtyminen aiheuttivat myös merkittävä ja jatkuva regressio vakiintuneiden ihmisen BxPC-3 haimasyövän kasvaimia paljaan hiiren ksenograftimallissa. RLIP76 osoittautui tärkeä säätelijä huumeiden kuljetuksen ohella myötävaikuttaa säteilyn vastarinnan haimasyövän.

Johtopäätökset /merkitys

RLIP76 edustaa mekanistisesti merkittävä tavoite kehittää tehokkaita interventioiden aggressiivinen ja tulenkestävä haimasyöpä.

Citation: Leake K, Singhal J, Nagaprashantha LD, Awasthi S, Singhal SS (2012) RLIP76 Säätelee PI3K /Akt Merkinanto ja kemosädehoidon Resistance in haimasyöpä. PLoS ONE 7 (4): e34582. doi: 10,1371 /journal.pone.0034582

Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 tammikuu 2012; Hyväksytty: 07 maaliskuu 2012; Julkaistu: 03 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Leake et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain NIH Grant CA 77495 ja Cancer Research Foundation of North Texas. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten ja naisten [1]. Noin 95% pahanlaatuisten kasvainten sisällä haima syntyvät exocrine kudoksesta. Niistä haiman eksokriinisen maligniteettien, 80%: sta 90% on ductal adenokarsinoomat [2], [3]. Alle 20%: lla haimasyöpä on sairaus, joka on makroskooppisesti rajoittuu haima diagnoosin kanssa muun potilailla, joilla on paikallisesti edennyt ja etäinen sisäelinten etäpesäkkeitä, useimmiten mukana maksaan [4]. Haimasyöpä hallussaan useita poikkeamia solu signalointikaskadien ja ovat tyypillisesti tunnettuja invasiivisia fenotyyppi ja vastareaktioita tavanomaisten tilojen hoidon. Hoitoon haimasyövän usein kohdannut pettymys tuloksia, koska resistenssin kehittyminen hoito seurauksena aktivoitumista useiden selviytymisen edistämiseen proteiineja, jotka transdusoivat signaaleja solunulkoisten signalointimolekyylien, kuten epidermaalinen kasvutekijä (EGF), transformoiva kasvutekijä (TGF ), tai insuliinin kaltaiset kasvutekijät (IGF1) [5], [6]. Molecular tutkimukset ovat myös tunnettu mutaatiot K-ras-onkogeenin 80% tai enemmän tiehyen adenokarsinoomat [7]. PI3K /Akt-reitin merkittävä rooli signaalinsiirtomekanismeissa alkupäässä kasvutekijäreseptoreita sekä kasvaimia synnyttävän K-ras [8] – [12]. PI3K /Akt signaloinnin edustaa myös voimakas ja perustavaa laatua akselin signaalin releen, joka määrittää pohjapinta selviytymisen ja kestävyys apoptoottisen vaikutusten kemosädehoidon erilaisia ​​syöpiä, mikä tekee PI3K /Akt-reitillä on keskeinen painopiste mekanistinen tutkimusten haimasyövän [13], [14]. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokasta hoitoa haimasyövän ja perinteisen kemosädehoidon on osoittanut hyvin vähän menestystä parantaa potilaan selviytymistä. Yleinen eloonjäämisaste haiman syöpäpotilaiden on -5%. Siten tutkimus vaikutusmekanismeja uusien tavoitteita, joita voidaan säädellä molekyylitasolla muutokset ajaa haimasyövän selviytymisen ja vastareaktioita hoito helpottaa kehittää tehokkaita interventioiden haimasyövän [4], [15].

merkaptuurihapon polku on kriittinen rooli säätelyssä solujen hapettumisenestopotentiaali ja kestävyys kemosädehoidon [16]. Glutationi (GSH) on rikkiä sisältävän pienen molekyylin soluissa, joka on olennaista solujen suojelemiseksi useilta myrkyllisiä ärsykkeitä, jotka indusoivat solukuoleman [17]. Ensimmäisen vaiheen aikana on merkaptuurihapon reitin, solun glutationi-S-transferaasit (GST) katalysoivat konjugoinnin annetaan kemoterapiaa huumeiden ja tuotteet lipidiperoksidaation, indusoi seurauksena sädehoitoa, jossa GSH muodostaa glutationi-konjugaattien (GS-Es) [18 ]. GS-Es ovat edelleen myrkyllisiä soluille ja ne on effluksoidaan ulos soluista, jotta voidaan suojata soluja solukuolemaa. Toisen vaiheen aikana ja merkaptuurihapon reitin, GS-Es on effluksoidaan ulos soluista ja tämä prosessi on välittyy energiaa riippuvainen liikenteen pumput läsnä solukalvon [19]. Meidän laaja aiemmin julkaistu tutkimuksia, olemme osoittaneet, että RLIP76 on ensisijainen merkaptuurihapon polku kuljettaja, joka poistaa GS-Es johtuvat tuotteista lipidiperoksidaation ja kemoterapiaa huumeita soluista. Tämä toiminto on RLIP76 on tärkeää syöpäsolujen verrattuna normaaliin solujen vähenemistä RLIP76 ei tapa normaaleja soluja, mutta on erittäin tehokas syöpäsolujen tappamiseksi lähes kaikenlaisten [20] – [24].

hiljattain julkaistut tutkimukset osoittavat, että RLIP76 on jännitys-reagoiva GS-E kuljettaja tarvitaan clathrin riippuvainen endosytoosin (CDE), joka tarvitaan asetuksen reseptori-ligandi-signalointi on solukalvon reseptorit [25]. Yhteydessä silmiinpistävää kemosädehoidon vastus haimasyövistä ja keskeistä asemaa RLIP76 tärkeänä merkaptuurihapon polku kuljettaja, joka on välttämätöntä selviytymisen ja hoito vastarinnan syövät, tutkimme roolia RLIP76 säätelyssä kriittinen viestintäproteiinit osallisena uudelleensijoittamista tulot useista ylävirtaan eloonjäämisreittejä ja mekanismeja, jotka auttavat kemosädehoidon vastustusta haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Doksorubisiini (DOX, adriamysiini) saatiin Adria Laboratories (Columbus, OH).

3H-GSH (3000 Ci /mmol) hankittiin yhtiöstä Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).

14C-DOX (spesifinen aktiivisuus 44,8 Ci /mmol) ostettiin NEN Life Sciences (Boston, MA). Polyklonaalisia kaniinin anti-ihmisen rec-RLIP76 IgG sekä esi-immuuni-IgG valmistettiin ja puhdistettiin kuten aiemmin on kuvattu [26], [27]. MRP (N19; cat # sc7774), Pgp (C19; cat # sc1517), Akt (cat # Sc8312), GAPDH (cat # sc32233), Bcl2 (cat # sc509), Bim (cat # sc11425), ja sykliini B1 ( kissa # sc595) vasta saatiin Santa Cruz Biotechnology (Columbus, OH). Pakt (S

473; kissa # 05-736) vasta-aine hankittiin Upstate Cell Signaling (Lake Placid, NY). Vasta-aineet PI3K (cat # 4292S), pPI3K (Y

458; cat # 4228), ja PCNA (kissa # 2586S) olivat Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). E-kadheriinin (cat # C3621), β-aktiini (cat # A5441), ja cdk4 (cat # DCS-35) vasta-aineet olivat Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO.) Ja Neomarkers (Fremont, CA) vastaavasti. TUNEL fluoresenssidetektoinnilla kit hankittiin Promega (Madison, WI). DNP-SG syntetisoitiin CDNB ja GSH menetelmän mukaisesti on kuvattu meidän aiemmin [28]. Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) hyväksytyn tutkimussuunnitelman. RLIP76 antisense ostettiin Biosynthesis, Inc., (Lewisville, TX) [22], ja RLIP76 siRNA ostettiin Dharmacon Research (Lafayette, CO), kuten aiemmin on kuvattu [29].

Eläimet

Hsd: Kateenkorvattomia nude nu /nu-hiiret saatiin Harlan, Indianapolis, IN. Eläimet pidettiin Beckman Research Institute, City of Hope National Medical Center, Duarte, CA. Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti hyväksytyn protokollan (# 11016) Beckman Research Institute, City of Hope National Medical Center Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC).

Solulinjat ja Cultures

Ihmisen napanuoran verisuonten endoteelisolujen (HUVEC) saatiin ystävällisesti Dr. Fiemu Nwariaku, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, kuten aiemmin on kuvattu (22-24), ja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, 5% CO

2 EGM-2 luodin kit väliaineessa, jota oli täydennetty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua FBS: ää ja 1% (v /v) Pen-Strep (P /S) liuosta. Ihmisen haimasyövän (BxPC-3 ja Panc-1) solulinjat hankittiin American Type Culture Collection, Manassas, VA, ja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 MEBM ja RPMI-1640- väliaineessa, jota täydensi 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua FBS: ää, 1% (v /v), Pen-Strep (P /S) liuosta, 2 mM L-glutamiinia, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaattia, 4,5 g /l glukoosia ja 1,5 g /l natriumbikarbonaattia. Kaikki solut testattiin

Mycoplasma

3 kuukauden välein.

MTT solunelinkykyisyysmääritys

Solun numero /ml määräosassa kasvavien solujen log-vaiheessa määritettiin laskemalla trypaanisinistä ilman soluja hemosytometriin ja 20000 solut maljattiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisille, tasapohjaisille mikro- tiitterilevyiltä. 12 h inkubaation jälkeen 37 ° C: ssa, väliaine, joka sisältää joko ennen immuuni IgG tai anti-RLIP76 IgG: tä (40 ug /ml lopullinen konsentraatio) lisättiin soluihin. 24-48 tunnin inkuboinnin 20 ui 5 mg /ml MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 2 tunnin altistuksen. Levyt sentrifugoitiin ja väliaine dekantoitiin. Solut sen jälkeen liuotettiin 100 ui DMSO: ta varovasti ravistellen 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen mittaus OD

570 nm [30]. Kahdeksan rinnakkaista kaivoja käytettiin jokaisen pisteen kaikkiin kolmeen mittauksia. Mitatut absorbanssiarvot olivat suoraan yhteydessä taulukkolaskenta laskemiseksi IC

50, määritellään lääkkeen pitoisuutena, joka vähensi formatsaanipitoisuus muodostusta 50%. Ehtyminen RLIP76 ilmentymisen soluissa RLIP76 siRNA ja RLIP76 antisense mitattiin seuraavasti: soluja inkuboitiin 3 h 0-2 ug /kuoppa joko RLIP76 siRNA käyttäen Transmessenger Transfection Reagent (Qiagen) tai RLIP76 anti-sense käyttäen Maxfect transfektioreagenssia (moolimassan omaavista) valmistajan mukaan tarjotaan protokollia.

kloonaus, prokaryoottisissa ja puhdistus RLIP76

Puhdistettua RLIP76 proteiinia (1965 emäsparia; 655 aa) saatiin

E. coli

BL21 (DE3), joka ilmaisee pET30a (+) plasmidi, joka sisältää täyspitkän cDNA: n, joka vastaa sekvenssin RLIP76. Puhdistus suoritettiin käyttäen DNPSG-affiniteetti-hartsi kuten aiemmin on kuvattu, ja puhtaus vahvistettiin Western blot -analyysit [26], [31].

toiminnallinen käyttökuntoon puhdistettua rec-RLIP76 keinotekoisia liposomeihin ja liikenteen tutkimukset

Puhdistettu RLIP76 dialysoitiin saattamisen puskuria (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCI

2, 1 mM EGTA, 100 mM KCI, 40 mM sakkaroosi, 2,8 mM BME, 0,05 mM BHT, ja 0,025% polidokanoli). Vesiemulsiota soija asolectin (40 mg /ml) ja kolesterolia (10 mg /ml) valmistettiin käyttövalmiiksi puskuriin sonikoimalla ja 0,1 ml tätä seosta lisättiin 0,9 ml: n erä dialysoitua ja puhdistettua rec-RLIP76 proteiinia. Reaktioseos sonikoitiin 50 W: ssa 30 sekunnin ajan. Rakkuloita aloitettiin lisäämällä 200 mg SM-2 bio-helmiä ennalta tasapainotettu saattamisen puskurissa ilman polidokanoli. Rakkuloita suoritettiin 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa, SM-2 bio-helmet poistettiin sentrifugoimalla ja vesikkelit (RLIP76-liposomit) kerättiin. Kerätty fraktio tuottaa pääasiassa unilammelar rakkuloita, joiden mediaani halkaisija on 0,25 um ja intravesicular /extravesicular tilavuussuhde 18 ul /ml. Ohjaus rakkulat (control-liposomeja) valmistettiin käyttäen sama määrä albumiinia tai raakaa proteiinia

E. coli

eivät ilmennä RLIP76. ATP-riippuvainen kuljetuksesta

14C-DOX ja

3H-DNPSG rec-RLIP76 rekonstruoitu proteoliposomit suoritettiin nopealla suodatuksella tekniikalla käyttäen tarkkaa kuvanneet meille aikaisemmin, jos tehokkuus toimittamisen proteoliposomit on perustettu [ ,,,0],26].

valmisteet raa’an membraanifraktioiden Western blot-analyysit

raa’at kalvon fraktiot valmistettiin normaalin ja syöpäsolulinjoissa käyttämällä vakiintuneita menettelyjä, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, solut pelletoitiin ja pestiin tasapainotetulla suolaliuoksella (138 mM NaCl, 5 mM KCI, 0,3 mM KH

2PO

4, 0,3 mM Na

2HPO

4, 4 mM NaHCO

3, ja 5,6 mM glukoosi, pH 7,4) kolme kertaa. Pestyt solut lyysattiin 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, joka sisälsi 1,4 mM BME, 0,1 mM PMSF, 0,05 mM BHT, 0,1 mM EDTA: ta ja 0,5% (v /v) polidokanoli. Lysaatit sonikoitiin kolme kertaa 30 sekuntia 50 W ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa ravistellen ajoittain. Inkuboinnin jälkeen saatu valmiste sentrifugoitiin 100,000- x g 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin ja alistettiin SDS-PAGE: lla. Tasot RLIP76 proteiinin normaaleissa ja syöpäsolujen mitattiin Western blot ja ELISA: lla käyttäen anti-RLIP76 IgG kuten aiemmin on kuvattu [29], [31]. Puhdistettu rec-RLIP76 kanssa puhtaus arvioitiin aminohappokoostumusanalyysille tuotettiin kalibrointikäyrien.

Transport tutkimuksissa IOVS

Raakaöljy kalvovesikkeleiden (nurinpäin rakkulat, IOV) valmistettiin normaali (HUVEC) ja pahanlaatuinen (BxPC-3 ja Panc-1) solulinjat käyttäen vakiintuneita menettelyjä, kuten on kuvannut meitä K562-solujen [26]. Liikenne tutkimukset DOX ja DNP-SG IOVS suoritettiin menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [26]. IOVS oli erikseen päällystettiin 40 ug /ml lopullinen pitoisuus joko anti-RLIP76 IgG, anti-MRP1 IgG tai anti-Pgp IgG ja käytetään mittaamaan ATP-riippuvainen oton

14C-DOX. ATP-riippuva oton

14C-DOX määritettiin vähentämällä radioaktiivisuus (cpm) kontrolleihin ilman ATP, että koe-ryhmät, jotka sisältävät ATP: tä. Kuljettaminen DOX laskettiin suhteen pmol /min /mg IOV proteiinia. Kuljettaminen

3H-DNP-SG mitattiin samalla tavalla.

tuumoriksenografteja malli

Hsd: Kateenkorvattomia nude nu /nu hiiret saatiin Harlan, Indianapolis, IN. Kaikki eläinkokeet suoritettiin protokollan mukaan hyväksymän Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC). Kolmekymmentäkuusi 10 viikon ikäiset hiiret jaettiin kuuteen ryhmään 6 eläimen (käsitelty ennalta immuuni seerumi, salattu siRNA, salattu antisense, RLIP76 vasta-aineita, RLIP76 siRNA ja RLIP76 antisense-DNA). Kaikki 36 eläimiin injektoitiin 2 x 10

6 ihmisen haimasyövän soluja (BxPC-3) suspension 100 ul: aan PBS: ää, ihonalaisesti. Eläimet tutkittiin päivittäin merkkejä kasvaimen kasvua. Hoitoa annettiin kun kasvaimen pinta-ala ylitti ~42 mm

2 (päivät 47 kasvainsolujen injektion, eli päivänä 1 käsittely). Hoito koostui 200 ug joko RLIP76 vasta, RLIP76 siRNA tai RLIP76 antisense 100 ui PBS: ää. Ohjaus ryhmiä käsiteltiin 200 ug /100 ui esi-immuuni seerumi, salattu siRNA ja salattu antisense. Kasvaimet mitattiin kahdessa ulottuvuudessa harpilla.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut (0,1 x 10

6 solua /500 ui) inkuboitiin salattu antisense- ja RLIP76 antisense (10 ug /ml lopullinen konsentraatio) 24 tuntia. 24 tunnin kuluttua eriä 50 ja 100 ui inkuboitiin edelleen 60 mm: n koko petrimaljoille, erikseen, jonka kokonaistilavuus 4 ml: ssa alustaa ja kussakin petrimaljassa. Sillä säteilytys kokeita, ohjaus ja RLIP76-proteoliposomit (50 ug /ml lopullinen konsentraatio, 24 h) käsitellyt solut säteilytettiin 100, 200, 500 ja 1000 CGY käyttäen Varian Clinac 2100C Linear Accelerator 6 MeV fotonisäteellä. 7 päivän jälkeen, joka tarttuu pesäkkeet vahvistettu, värjättiin 0,5% metyleenisiniä 30 min., Ja pesäkkeet laskettiin käyttäen INNOTECH Alpha Imager HP [32].

vaikutus RLIP76 antisense apoptoosiin TUNEL määrityksen

Solut (~ 1 x 10

6) kasvatettiin kannessa luistaa ja käsitellään salattuja antisense- ja RLIP76 antisense (10 ug /ml lopullinen konsentraatio) in Maxfect transfektioreagenssi (moolimassan omaavista). Apoptoosi määritettiin merkintöjä DNA-fragmenttien, joilla on terminaalivaiheen deoksinukleotidyyli–transferaasin dUTP nick-end merkinnät (TUNEL) määritys käyttäen Promega apoptoosin tunnistusjärjestelmä protokollan mukaisesti Valmistaja toimittanut [33].

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot arvioitiin kaksisuuntaista paritonta Studentin t-testiä tai verrattiin yksisuuntaisella ANOVA ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Sillä

in vivo

tutkimuksissa huumehoitoaloitteilla verrattiin kontrolliin ajoneuvo-hoidon arvoja.

p

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentäminen RLIP76 haiman syöpäsoluissa

Western blot analyysit kalvon proteiinin uutteita ihmisen normaaleissa ja haimasyövän soluja osoitti, että läsnä on suhteellisen suuria määriä RLIP76 haiman syöpäsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin (Fig. 1A). Sen jälkeen luonnehdinta tehostetun ilmentymisen RLIP76, me tutki tarkemmin vaikutusta RLIP76 estoa tai ehtyminen haiman syöpäsoluja. Tulokset arvioidaan RLIP76 proteiinin tasot on esitetty taulukossa 1 osoittavat kokonais- määrää raakaa kalvon proteiinit on saatu 10

8-soluja log-kasvuvaiheessa. RLIP76 proteiini edusti 12 ± 2 g /10

8 normaalien solujen ja -40 ± 3 ng /10

8 haimasyövän soluja, vastaavasti (0,19% ja ~0.61% koko pesuaineen liukoisen proteiinin limakalvojen normaaliin ja haimasyövän soluja, vastaavasti). Ilmentyminen RLIP76 haiman syöpäsoluissa oli verrattavissa alueella suhteessa tuloksia useista muista solulinjoista meidän aiemmissa tutkimuksissa [22], [24], [29].

alikvootit raakaöljyn membraanifraktioiden haimasyöpä solut (BxPC-3 ja Panc-1) ja normaali kontrolli solut (HUVEC), joka sisälsi 100 ug proteiinia käytettiin SDS-PAGE ja Western-blottauksella. Intensiteetti täyspitkän RLIP76 proteiini (~95 kDa) bändi kvantitoitiin skannausdensitometrialla käyttämällä Innotech Alpha Imager HP. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina (paneeli A). Vaikutus anti-RLIP76 IgG, RLIP76 siRNA ja RLIP76 antisense normaaliin ja haimasyövän soluja: Effect of anti-RLIP76 IgG: tä (40 ug /ml lopullinen konsentraatio) solun eloonjääminen määritettiin MTT-määrityksellä [29], [30]. Ehtyminen RLIP76 ilmentymisen RLIP76 siRNA ja RLIP76 antisense (kukin 10 ug /ml lopullinen konsentraatio) tehtiin käyttäen Transmessenger transfektio-Reagent-(Qiagen), ja Maxfect transfektio-reagenssia (moolimassan omaavista, Inc.), vastaavasti, mukaan valmistajan ohjeita. Solujen eloonjääminen mitattiin MTT sytotoksisuusmääritys 48 tuntia käsittelyn jälkeen. Arvot esitetään keskiarvona ± SD kahdesta erillisestä määrityksestä kahdeksan replikoituu kunkin (n = 16), mustat palkit, normaali HUVEC-soluja; harmaat palkit, BxPC-3 haimasyöpäsoluissa (paneeli B) * p 0,05, ** p 0,01 verrattuna vastaaviin kontrolleihin. Vaikutus RLIP76 antisense on PI3K ja Akt signalointia haimasyöpäsoluissa: RLIP76 antisense aiheutti eston PI3K /Akt-reitin BxPC-3 ja Panc-1-soluissa. Soluja käsiteltiin 10 ug /ml RLIP76 antisense 24 tuntia ja immuuni-blotattiin varten pPI3K, PI3K, Pakt, Akt, Bim, Bcl2, sykliini B1 ja CDK4. Sama blot oli riisuttu ja uudelleenseulottiin GAPDH tasapuolisen Proteiinilisäyksen (paneeli C). Bar kaavio näyttää kvantitoimiseksi kunkin Länsi-blotit. Pisteviiva mitään merkittävää muutosta havaittu salattu antisense (paneeli D).

RLIP76 estoa tai ehtyminen aiheuttaa sytotoksisuuden haimasyöpäsoluissa

Ensimmäinen sytotoksisia vaikutuksia RLIP76 eston haimasyövän soluja arvioitiin RLIP76 inhibitio käyttäen anti-RLIP76 IgG ja RLIP76 ehtyminen käyttäen RLIP76 siRNA tai RLIP76 fosforotioaatti-antisense jota vakiintunut MTT solujen eloonjäämistä määritys [22], [30]. Proteiini-A affiniteettipuhdistettua immunoglobuliinifraktio saatu immuniteettia edeltävä seerumi käytettiin kontrollina. Anti-RLIP76 IgG Näissä kokeissa käytettiin aiemmin osoitettu Ouchterlony’n double immuno-diffuusio määritys olevan ei-ristiin reagoiva muiden proteiinien myös Pgp tai MRP [31]. Soluja käsiteltiin preimmuuni-lgG, salattu siRNA, salattu antisense, anti-RLIP76 IgG, RLIP76 siRNA tai RLIP76 antisense 24 tuntia. Sytotoksisuuden kaikkien kolmen RLIP76 kohdistaminen aineet, RLIP76 siRNA, vasta-aine ja antisense, on edullisesti suunnattu pahanlaatuisia soluja verrattuna ei-pahanlaatuisten HUVEC-solut, jotka oli samanlainen havaintojemme kanssa muut pahanlaatuiset (keuhko, melanooma, munuaiset, eturauhanen ) ja ei-pahanlaatuisten solulinjojen [22], [24], [29], [34]. Toisin kuin aiemmat tulokset nähdään keuhko- tai koolonsyövistä (jossa kaikki kolme yksityiskohtaiset tulokset ovat samanlaisia), RLIP76 antisense oli merkitsevästi tehokkaampi tappaminen haimasyövän soluja kuin RLIP76 vasta-aineella (Fig. 1 B). RLIP76 välittää selviytyminen ja syöpäsolujen lisääntymistä monin mekanismein, jotka sisältävät tehostetun vieroitus tuotteita lipidiperoksidaation sekä sääntelyn solunsisäisen signalointireittien [19], [25], [35]. Parannettu teho RLIP76 antisense oli silmiinpistävä havainto, joka stimuloi edelleen yksityiskohtaisen tutkimuksen RLIP76 ehtyminen säätelyssä tasojen kriittisten solunsisäisten proteiinien haiman syöpäsoluja.

RLIP76 antisense down-regulation PI3K /Akt-reitin haiman syöpäsoluissa

BxPC-3 ja Panc-1-soluja käsiteltiin RLIP76 antisense 24 h, mitä seurasi Western blot -analyysit tutkia vaikutusta kriittisen solunsisäisiä proteiineja (kuviot. 1C ja D). PI3K /Akt on konstitutiivisesti aktivoidaan useimmissa haimatuumorien [11]. RLIP76 antisense hoito suppressoi merkitsevästi fosforylaatiota PI3K, yhteisen ylävirran signaali signalointia solmu, joka tranduces mitogeenisestä signaaleja tämän perusteella solukalvoreseptorien kasvutekijät ja integriinit. RLIP76 antisense hoito vähensi merkitsevästi myös proteiinin tasot ja fosforylaatiota Akt sekä BxPC-3 ja Panc-1-soluissa. Mielenkiintoista on, että fosforylaatio Akt ja PI3K: ta ei havaittu normaalissa HUVEC-soluissa (tietoja ei ole esitetty), joka on sopusoinnussa yleinen käsitys, että PI3K tai Akt aktivoidaan transformoiduissa soluissa [36]. PI3K ja Akt edustavat merkittävää solmut Viestireleen joka puolestaan ​​säätelevät kriittinen loppupään tavoitteet, jotka ovat mukana apoptoosin, leviämisen ja ylläpitää fenotyyppi syöpiä. Aktivoinnin Akt johtaa tukahduttaminen ilmentymisen E-kadheriinin [37]. E-kadheriinin pidetään merkkinä normaalin epiteelin fenotyypin ja menetys E-kadheriinin liittyy ”epiteelikasvaimet mesenkymaalitransitioon (EMT) ’ja aggressiivinen fenotyypin syöpiä [38]. Aktivoituminen PI3K johtaa edelleen aktivoituminen mTOR: n ekspressiota vähentävän pro-apoptoottisten Bim ja suosii eloonjäämistä ja syöpäsolujen lisääntymistä [39]. Kohonneiden tasojen anti-apoptoottisten Bcl2 ja sykliiniriippuvainen kinaasi 4 (CDK4) on osoitettu välittävän vastustuskyky mTOR inhibition [40]. Ehtyminen RLIP76 antisense huomattavasti tasot pro-differentiaatiomarkkeri E-kadheriinin ja pro-apoptoottista proteiinia, Bim ja vähentää tasot anti-apoptoottisen proteiinin Bcl2, sykliini B1 ja CDK4 sekä BxPC3 ja Panc-1 haima- syöpäsoluja. Siten ehtyminen RLIP76 oli merkittävä vaikutus kriittiseen välittäjiä PI3K /Akt signalointi akselin haimasyövän (kuviot. 1C ja D).

vaikutus RLIP76 heikentymisen klonogeeniset selviytyminen ja apoptoosin

Olemme edelleen vahvistaneet vaikutusta RLIP76 ehtyminen on proliferaatiopotentiaali ja solujen eloonjäämistä arvioimalla klonogeeniset potentiaali ja apoptoosin BxPC3 haiman soluja. RLIP76 antisense hoito aiheutti RLIP76 ehtymisestä kuin havaittiin Western blot (kuvio. 2A) ja esti klonogeeniset potentiaali määritettynä pesäkkeitä muodostavat määrityksessä (Fig. 2B). Vaikutus RLIP76 apoptoosiin arvioitiin TUNEL määrityksessä. Tulokset TUNEL-määritys osoitti havaittavaa apoptoosia, jossa salattu antisense kun RLIP76 antisense aiheutti apoptoosin BxPC-3 haimasyövän soluja. Kvantifiointi punaisen ja vihreän fluoresenssin kuva -J analyysi vahvisti laadullista loisteputki havainnot että RLIP76 ehtyminen antisense oli tehokas apoptoosin (Fig. 2C).

ehtyminen RLIP76 mukaan RLIP76 antisense käyttäen Western blot-analyysit, kaista 1 sisälsi standardi, kaistat 2 ja 3, sisälsi raakaa kalvo osa haimasyöpä (BxPC-3-solut) 24 h käsittelyn jälkeen RLIP76 antisense- ja salattu antisense, vastaavasti. Tulokset määrällisesti skannausdensitometrialla käyttämällä Innotech Alpha Imager HP. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina (paneeli A). Pesäkkeitä muodostavien tehokkuutta BxPC-3-solujen käsittelyn jälkeen antisense, tehtiin värjäämällä solut metyleenisinistä ja pesäkkeet laskettiin käyttämällä Innotech Alpha Imager HP. Arvot ovat keskiarvoja ± S.D. Kolmen erillisen kokeen. *** P 0,005 verrattuna ilman tai salattu antisense hoitoon (paneeli B). Apoptoosin BxPC-3-soluista RLIP76 antisense TUNEL määrityksen, salattu antisense (yläpaneeli) ja RLIP76 antisense (alempi paneeli) käsiteltyjen solujen. Apoptoottisia soluja osoitti vihreän fluoresenssin ja ominaisuus solun kutistuminen. Viereinen baari kaaviossa Kuva J analyysit TUNEL määrityksen edustavat prosenttiosuutta TUNEL positiivisia apoptoottisten solujen (vihreä) ja normaalin elävät solut (punainen). * P 0,05 (paneeli C).

RLIP76 ehtyminen aiheuttaa regressio haimasyövän nude-hiirissä

Edellä

in vitro

havainnot heijastavat anti- neoplastisia vaikutuksia RLIP76 ehtyminen tutkittiin tarkemmin

in vivo

hiirillä ksenograftimallia haimasyövän. Kasvain eläimillä vakiintuneiden

s.c.

. istutetaan BxPC3 haiman kasvaimet (~42 mm

2) käsiteltiin 200 ug: lla joko RLIP76 vasta-aineen, RLIP76 siRNA tai RLIP76 antisense mukaan

vatsaontelon.

injektio. Painonnousu oli verrattavissa ei-kasvain valvontaa, eikä avointa myrkyllisyys oli ilmeinen. Käsittely RLIP76 vasta-, RLIP76 siRNA tai RLIP76 antisense johti nopeaan ja dramaattisia vähennyksiä kasvaimia (kuviot. 3A ja B). RLIP76 vasta-aine, RLIP76 siRNA tai RLIP76 antisense hoidetuista eläimistä, joissa oli muodostuneita s.c. kasvaimet olivat elossa ~298 vuorokautta ilman todisteita toistumisen. Oli hallitsematon kasvu kaikissa kontrolliryhmissä käsitelty esi-immuuni seerumi, salattu siRNA ja salattu antisense ja siten kontrolliryhmien sensuroitiin mukaan ~49 päivää (Fig. 4). Tehokkuus kasvaimen tilavuuden väheneminen ilmeni kasvaimen painot päivänä 47 sen jälkeen, kun hoidon alussa (Fig. 3B). Tehokkuus RLIP76 vastamerkitystä heikentävien kasvaimen RLIP76

in vivo

on osoitettu Western blot varten RLIP76 kasvaimen homogenaateista (Fig. 3B, upotus). Sen jälkeen RLIP76 ehtyminen ja esto, tuumorin implanttien havaittiin kaikissa eläimissä, ilman mitään ilmeisiä toksisia vaikutuksia tai vaikutuksia painonnousuun.

vierassiirrännäisille tutkimuksissa käytimme kolmekymmentäkuusi 11-viikkoa vanha Hsd: kateenkorvattomiin nude nu /nu-hiiriä (Harlan, Indianapolis, IN) satunnaistettiin kussakin oli 6 eläintä kuuteen ryhmään seuraavat: 1) esi-immuuni seerumi, 2) salattu siRNA, 3) salattu anti-sense DNA: ta, 4) RLIP76 vasta-aineita, 5) RLIP76 siRNA ja 6) RLIP76 antisense. Kaikki 36 eläimiin injektoitiin 2 x 10

6 ihmisen haimasyövän soluja (BxPC-3) suspension 100 ul: aan PBS: ää, ihon alle yksi kylki kunkin nu /nu nude mouse. Eläimet tutkittiin päivittäin merkkejä kasvaimen kasvun ja kehon painoja. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet poikkipinta-ala ~42 mm

2 (47 d myöhemmin), eläimet satunnaistettiin hoitoryhmiin kuten on osoitettu kuviossa 4. Hoito koostui 200 ug RLIP76 vasta-aineita, siRNA tai antisense 100 ul PBS: llä. Kontrolliryhmät käsiteltiin 200 ug /100 ui joko esi-immuuni seerumi, salattu siRNA tai salattu anti-sense DNA: ta. Kasvaimet mitattiin kahdessa ulottuvuudessa käyttäen jarrusatulat. Kasvaimen mittaukset esitetään kaikki kontrolliryhmiin (pre-immuuni-IgG, salattu siRNA tai antisense) verrattuna kaikkiin käsiteltyjen ryhmien (anti-RLIP76 IgG, RLIP76 siRNA, tai anti-sense) (paneeli A). Kasvain-paino vähenee päivänä 47 sen jälkeen, kun hoidon aloituksesta (paneeli B) ja kasvaimen RLIP76 on tyhjentynyt antisense (paneeli B, upotus). Kasvaimet leikattiin 48 h jälkeen antisense-hoidon, punnittiin ja homogenisoitiin, ja alikvootit, jotka sisälsivät 100 ug proteiinia kustakin, ladattiin SDS-PAGE Western-blottauksella vastaan ​​anti-RLIP76 IgG: tä (n = 3, kaistat 1-3, salattu antisense käsitelty, ja kaistat 4-6, RLIP76-antisense käsitelty). Tulokset kvantitoitiin skannausdensitometrialla. Kalvo oli riisuttu ja uudelleen koetettiin β-aktiini-vasta tarkistaa yhtä suuri Proteiinilisäyksen, * p 0,05 verrattuna vastaaviin kontrolleihin. Western blot-analyysi kasvainkudoksen lysaatit: Mekanistiset perusteella kasvaimen kasvun inhibitio RLIP76-antisense määritettiin kasvaimen lysaateissa ohjaus ja RLIP76-antisense-käsitellyissä hiirissä. Kasvaimen kudokset homogenisoitiin, ja -70 ug proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla ja koestettiin pPI3K, PI3K, Pakt, Akt, PCNA, Bim, E-kadheriinin, sykliini B1 ja CDK4. Blotit riisuttu ja uudelleenseulottiin GAPDH tasapuolisen Proteiinilisäyksen (paneeli C). Bar kaavio edustaa densitometrian analyysejä. Pisteviiva mitään merkittävää muutosta havaittu salattu antisense (paneeli D).

Hsd: Kateenkorvattomia nude nu /nu hiiret saatiin Harlan, Indianapolis, IN. Kaikki eläinkokeet suoritettiin protokollan mukaan hyväksymän Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC).