Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, microRNA profilointia virtsan ja plasman klo eturauhasen voi erottaa hengenvaarallisia alkaen indolent eturauhassyöpään.

materiaalit ja menetelmät

paneeli MikroRNA profiloitiin plasmassa 70 potilasta ja virtsassa 33 potilasta kerätty ennen eturauhasen. Expression of MikroRNA oli korreloi kliinisen loppuarvoissa seurannan ajan 3,9 vuoden tunnistamaan MikroRNA jotka voivat ennustaa kliinisen vasteen jälkeen eturauhasen. Kone oppimisen lähestymistapaa sovellettiin testata ennustava kyky kaikkien MikroRNA profiloituja virtsassa, plasmassa, ja molempia, ja maailmanlaajuinen suorituskykyä arvioidaan käyttämällä ala saa operaattori ominaiskäyrä (AUC). Validointi virtsan ilmentymisen miRNA suoritettiin edelleen itsenäinen kohortin 36 potilasta.

Tulokset

paras ennustaja Plasman kahdeksasta MIRS tuotti vain kohtalainen ennustava suorituskyky (AUC = 0,62). Paras ennustaja korkean riskin tauti saatiin aikaan käyttämällä miR-16, miR-21 ja miR-222 mitattuna virtsaan (AUC = 0,75). Tämä yhdistelmä kolmesta MikroRNA virtsaan oli tarkemman ennusteen korkean riskin sairaus kuin yksittäiset microRNA. Käyttäen eri menetelmää huomasimme, että tämä joukko miRNA kyennyt ennustamaan suurvolyymista korkealaatuisesta tauti.

Johtopäätökset

Alustavien havaintojen ehdotti, että plasman ja virtsan profilointia MikroRNA at radikaalin prostatektomia voi sallia ennustus eturauhassyövän käyttäytymistä. Kuitenkin olemme huomanneet, että microRNA ilmaus allekirjoitus ei validoida riippumattomasti kohortin potilaista käyttää eri alustan PCR. Tämä korostaa tarvetta itsenäiseen validointi potilasaineistoihin ja ehdottaa, että virtsan microRNA allekirjoituksia eturauhasen ei voi olla vankka tapa ennustaa kurssin kliinisen sairauden jälkeen lopullinen hoito eturauhasen syöpä.

Citation: Sapre N, Hong MKH, Macintyre G, Lewis H, Kowalczyk A, Costello AJ, et al. (2014) kokoama MikroRNA virtsaan ja veren Fail toteuttamaan vahvistus Ennakoiva biomarkkereita riskialttiista Eturauhassyöpä. PLoS ONE 9 (4): e91729. doi: 10,1371 /journal.pone.0091729

Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugali

vastaanotettu: 24 syyskuu 2013; Hyväksytty: 14 helmikuu 2014; Julkaistu: 04 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Sapre et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: NS on tukee jatko apurahoja Cancer neuvoston Victoria, Cybec Foundation ja Royal Australasian College of Surgeons. Tutkimus tukivat rahoitusta Australian hallitus Australian Eturauhassyöpä Research Epworth. AK ja GM tukee NICTA. NICTA rahoittaa Australian hallituksen edustama Department of Broadband, viestintä- ja Digital Economy ja Australian Research Council kautta ICT huippuyksikkö ohjelman. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on ominaista sen selvästi vaihteleva ja arvaamaton tuloksia. Käyttöönotto prostataspesifisen antigeenin (PSA) testaus on johtanut dramaattinen kasvu varhainen havaitseminen eturauhassyövän (CAP) ja vaihe muuttoliikkeen siten, että enemmän miehiä varhaisvaihetta CaP ovat nyt diagnosoitu sairaus, [1], [2 ]. Kuitenkin testi ei ole erityistä Cap [3] eikä se salli tarkkaa riskien kerrostuminen ja valinta näiden potilaiden todennäköisesti periksi heidän sairautensa jälkeen varhain radikaali hoidon [4], [5]. Sairastavuus liittyvä tyypillinen hoitoja on synnyttänyt lukuisia biomarkkereiden kehitys tutkimuksia yrityksessä tunnistaa potilaat todennäköisimmin hyötyvät ajoissa puuttumaan vähentää riskiä toistumisen ja etäpesäke [6].

Vaikka paljon tutkimusta tavoitteena on löytää biomarkkerit, jotka voivat parantaa eturauhassyövän havaitseminen hinnat yli PSA, avainkysymys kliinisesti, on havaitseminen korkean riskin hintakatto varhaisessa, parannettavissa vaiheessa. Vaikka suurin osa tapauksista seurata veltto tietenkään eivätkä vaadi parantavaa hoitoa, joidenkin syöpien on potentiaalia metastasize ja vaatia aggressiivinen, varhainen, kliininen interventio. Kuitenkin nykyinen kliinis mallit eivät salli lääkäreille tarkasti erottaa aikaisessa vaiheessa välillä korkean riskin ja veltto CaP [7]. On kiireellisesti kliininen tarve uusille markkereita, jotka syrjivät veltto aggressiivisia eturauhasen syöpiä varhaisessa vaiheessa.

MikroRNA (miRNA) ovat noin 22 nukleotidin pituinen, yksijuosteisia, ei-koodaavat RNA: t, jotka sitoutuvat täydentävä ”siemen” alueita löytyy 3’alue (UTR) erityisen lähetti-RNA (mRNA) lajit. MiRNA moduloida mielipiteenilmaisun mRNA tavoitteina joko merkitsemällä ne hävitettäväksi tai estämään niiden sitoutumista translaatiokoneistolla [8]. MiRNA on osoitettu olevan mukana monenlaisia ​​tärkeitä fysiologisia ja patologisia prosesseja kuten solukierron prosesseja, kehittäminen, selviytyminen, erilaistumisen, kasvun, apoptoosin ja immuunivastetta [8].

Useat tutkimukset ovat osoittaneet vapauttamisen miRNA on tärkeä mekanismi eturauhasen syövän synnyn [9] ja että tällaiset muutokset voidaan havaita seerumista CaP potilaista [10], [11], [12], [13]. On useita etuja miRNA biomarkkereina in Biofluids. Biofluids kuten plasmasta ja virtsasta ovat vähemmän invasiivisia saada verrattuna kudokseen ja miRNA usein vapautettu syövän ja näyttelytila ​​kudosspesifisiä ilme. Lisäksi niiden ilmentyminen veressä ja virtsassa on vakaa ja voidaan mitata herkästi kvantitatiivisella reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) [14]. Siellä on siis ollut paljon jännitystä noin potentiaalia miRNA biomarkkereina of korkki. Kuitenkin muutamat näistä tutkimuksista ovat suorittaneet järjestelmällisiä validoinnissa biomarkkereiden, joka on estänyt niiden kliinisen käännös hallinnan korkki. Lisäksi suurin osa näistä tutkimuksista, jotka ovat verrattuna varhain korkki kehittynyt /metastaattinen CaP käyttänyt kerätyistä näytteistä, kun potilaille on kehittynyt etäpesäkkeitä. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia, jos profilointi paneelin miRNA plasmassa ja virtsassa ensisijainen eturauhassyöpäpotilaalla ennen eturauhasen voi erottaa veltto korkki korkean riskin fenotyyppi ja vahvistaa kaikkia havaintoja itsenäinen kohortin potilaita.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä hanke oli täysi eettisen hyväksynnän institutionaalisilta tarkastuslautakunta. Eettisen hyväksynnät liittyvät tähän käsikirjoitus ovat Royal Melbourne Hospital Human Research Ethics Committee (HREC) N: o 2006,073 ja Epworth Healthcare HREC nro 34506. Kaikki potilaat antoivat täyden kirjallisen suostumuksensa näytteitä voidaan varastoida ja käyttää tutkimukseen käytetään potilastietojen ja suostumuslomakkeet että oli hyväksynyt eettiset toimikunnat.

MicroRNA paneelin valinta

systemaattinen kirjallisuuskatsaus tehtiin PubMed löytää MikroRNA osallisena eturauhas- ja epiteelin syöpä aloittamista, etenemistä ja etäpesäkkeitä käyttämällä termejä ”eturauhasen syöpä ”ja” microRNA ”heinäkuussa 2011. viitteiden tutkimuksia tarkastettiin edelleen artikkeleita kohteisiin. Kaikki artikkelit myös artikkelia, arvostelua ja abstraktit pidettiin. Yleisluonteisen tarkastuksen perusteella päätimme paneeli 12 Mirs profilointiin plasman ja 13 MIRS profiloinnin virtsassa, jotka kaikki oli vähintään 2 riippumatonta julkaistut tutkimukset osoittavat osallistuminen eturauhassyöpään Karsinogeneesin kanssa etusija annetaan niille, joilla on samanaikaisia ​​tukevat mekanistisen data . Lisäksi olemme mukana RNU48 meidän paneelissa otaksutuksi endogeeninen kontrolli [15].

Potilasvalinta

Kaikki potilaat, joilla on diagnosoitu CaP joille tehtiin eturauhasen klo Epworth sairaalan 2003-2010 yksityiskohtaiset PSA seurannan ja täydellinen kliinisten ja patologisten tietojen tunnistettiin prospektiivisesti kirjataan ja säilytetään omistettu eturauhassyövän tietokantaan. Ensimmäinen kohortti koostui potilaista, joilla on suuri riski fenotyypin eturauhassyöpä (n = 33 plasmanäytteet, 16 virtsanäytteet) ja potilailla, joilla on alhaisen riskin tai veltto fenotyyppiä syöpä (n = 37 plasmanäytteet, 17 virtsanäytteet). Toinen (validointi) kohortti koostui potilaista, joilla on suuri riski fenotyypin eturauhassyöpä (n = 22 virtsanäytteet) ja potilailla, joilla on veltto fenotyypin eturauhassyöpä (n = 14 virtsanäytteet). Korkean riskin syöpä määriteltiin Gleason luokan suurempi tai yhtä suuri kuin 7 ja kasvaimen tilavuuden 1cc tai kehittäminen etäpesäkkeitä tai aikaisin biokemiallisten uusiutuminen viittaavia systeemisiä mikro etäpesäkkeitä (lyhyt PSA kaksinkertaistui aika, epäonnistunut taltiointi sädehoito, PSA pysyvyys). Laiska syöpä määriteltiin Gleason 6, T2a, PSA 10 ja PSA-elinaika vähintään 3 vuotta (Epstein kriteerit) [16]. Plasman ja virtsan kerättiin potilailta ennen eturauhasen välittömästi sen jälkeen eturauhasen, snap-jäädytetään ja säilytetään nestemäisessä typessä.

Kliiniset tiedonkeruun

kliiniset ja patologiset tietoja on tallennettu etu- analysoitu jälkikäteen. Tiedot PSA seurannan kirjattiin prospektiivisesti ja päivitetään vuosittain. Kasvainten tilavuudet mitattiin tarkasti lasketun planimetry aikaan histologista arviointia, kuten aikaisemmin on kuvattu [17]. TNM (2002) luokittelujärjestelmän käytettiin vaiheessa yksilöt. Gleason summa pisteet, ja patologinen kasvaimen vaiheessa olivat kaikki arvioidaan erikseen. Potilaille, jotka eivät ole kokeneet biokemiallinen toistuminen tutkimuksen aikana, seuranta sensuroitiin aikaan niiden viimeisin PSA-testi. Potilaille, joilla on enemmän kuin yksi leikkauksen jälkeen PSA tallennettu, PSA kaksinkertaistumisaika (PSAdt) laskettiin käyttäen log kaltevuus menetelmällä [18]. Tätä tutkimusta varten biokemiallinen toistuminen määriteltiin leikkauksen jälkeisen PSA-arvo on suurempi tai yhtä suuri kuin 0,2 ng /ml ja nousee tai nouseva PSA taso tämän rajan alapuolella, joka tuntui hoitava lääkäri edustamaan toistuminen ja johti laitokselle pelastaa hoito. Merkittävä biokemiallinen toistumisen määriteltiin PSA toistumisen kaksinkertaistui ajan 6 kuukautta, kuten tämä on osoitettu olevan tarkempi ennustaja kehittämisestä metastaasien ja syövän aiheuttamaa kuolleisuutta kuin PSA toistumisen yksinään [19], [20]. Potilailla, joiden ensisijainen PSA pysyvyys, jotka olivat välittömästi hoidettiin salvage terapiaa PSAdt mielivaltaisesti oletetaan olevan 6 kuukautta. Kerääminen ja käyttää tätä tietoa oli Melbourne Health eettisen komitean hyväksyntä.

RNA

500 ui plasmaa tai virtsaa sulatettiin jäillä kokonais-RNA uuttamalla käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, TX, USA) valmistajan protokollan seuraavin muutoksin /ehdot: 1,5 tilavuutta lysis /Binding Buffer käytettiin solujen hajoamisen, ennen kuin lisättiin homogenaattia, ja RNA eluoitiin 40 ul: aan vettä. RNA eluoinnit jäädytettiin kuivajäässä ja varastoidaan -80 ° C.

RT-PCR

RNA keskittyi 40 ui 15 ul: Savant SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, NC, USA) 45 ° C /korkea paine. Käänteistranskriptio suoritettiin lämpösyklilaitetta (Applied Biosystems, CA, USA) käyttäen Taqman microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CA, USA) valmistajan ohjeiden pieniä RNA-määritys-protokolla seuraavin muutoksin: 7 ui RNA: ta käytettiin templaattina ja yhdistetyt alukkeita käytettiin ennalta valitun 14 miRNA lajeja.

Original Kohortin.

Quantitative real-time PCR suoritettiin tuloksena cDNA mukautetun Taqman Low Density Array kortit (Applied Biosystems , CA, USA), joka sisälsi alukkeita meidän miRNA mukainen paneeli valmistajan protokollaa. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja mediaani sisällytetään lopulliseen analyysiin. TLDA kortit ajettiin 7900HT Fast Real-Time PCR System.

Validation Kohortin.

Esivahvistus syntetisoitu cDNA suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 2,5 ui cDNA lisättiin 12,5 ul esivahvistus Mastermix, 3,75 ul alukepooli ja 6,25 ui nukleaasitonta vettä. Tämä reaktio kuumennettiin 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 55 ° C 2 min, 72 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 12 sykliä monistusta ennen kuumennusta 99 ° C: ssa 10 min. Monistetut reaktiotuotteet laimennettiin 200 ui käyttäen 0,1 x Tris-EDTA-puskuriin (pH = 8). RT-PCR, suorittavat sen VIIA 7 (Applied Biosystems, CA, USA) käyttäen 0,5 ul 20 x miRNA määrityksessä, 0,1 ui esivahvistimen tuote, 5,0 ui TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2⊥), 4,4 ui nukleaasitonta vettä oli yhdistää 10 ul PCR-reaktion. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja mediaani mukana kädessä.

Tietojen analysointi

Pre-processing.

kynnysarvot PCR ajojen asetettiin käyttäen RQ Manager ( Applied Biosystems) ja käsin tarkistaa sen varmistamiseksi, CT vastasi keskipisteen logaritminen vahvistus. Kaikki havaitut Ct-arvot ovat yli 34 katsottiin ole ilmaisseet ja asetettu 34. Jokainen määrittelemättömiä Ct-arvot asetetaan myös 34. Koska jokainen miR profiloitiin kolmena kappaleena, tahansa rinnakkaista arvo yli 20% eroaa loput kaksi arvoa pidettiin harha ja poistettiin analyysiä. Keskimääräinen Ct-arvo määritettiin sitten kullekin näytteelle ja miR poikki rinnakkaista.

Normalisation.

RNU48 profiloitiin kussakin näytteissä sisäsyntyinen valvontaa mutta katsottiin sopimatonta plasmassa useimmissa näytteiden se ei havaittu (kuvio 1a), katsotaan sopimatonta virtsaan se oli miR kanssa kolmanneksi suurin keskihajonta (kuva 1b), ja osoitti muuttujalauseke välillä korkean riskin ja alhaisen riskin ryhmiin. Näin ollen geometrinen keskiarvo normalisointi on käytetty, normalisointi osoitettu olevan tehokas miR PCR profilointi [21]

a) Ct-arvot endogeenisen valvontaa kaikissa näytteissä plasmassa kohortissa. CT 34 pidetään huomaamatta. b) keskihajonta Ct-arvojen poikki näytettä kutakin miR alkuperäisessä virtsassa kohortti.

Differential ilmentymisanalyysiä.

keskimääräinen Ct Näytteiden kuuluvat korkean riskin ja alhaisen -risk ryhmien avulla laskettiin ΔΔCt. Fold-muutos laskettiin 2

-ΔΔCt. Opiskelija t-testiä käytettiin laskettaessa merkitystä ero korkean ja matalan riskin ryhmissä ja p-arvo säädettiin useita testaus korjauksen käyttäen Benjamini-Hochberg menetelmä [22]

Feature valinta ja luokka on .

oletetaan data annetaan matriisi, N ominaisuudet (MIRS) varten

M

näytteitä eli sekä etiketti vektori järjestetty siten, että sekä jäljellä näytteitä. Olemme käyttäneet kahta eri menetelmää valinta /tilaus ominaisuuksia /Mirs useimmista vähiten ”erotteleva”. Ensimmäinen menetelmä oli klassisen Studentin t-testi, joka kohdennetaan

i

nnen ominaisuutena scorewheredenote keinot anddenote varianssit

i

nnen muuttujan näytteitä molempien ryhmiä kiinnostavat, tässä järjestyksessä. Sitten ominaisuudet ryhmitellään alenevassa järjestyksessä itseisarvojen tilastotieto, varten. Toinen tekniikka, nimeltään

painopisteen ominaisuuksien hallintaan

, riveissä ominaisuus alenevassa suuruuden välisen eron avulla

i

nnen muuttujan näytteitä molempien ryhmien kiinnostusta.

eriosa

t

huippuominaisuudet, me syntyy lineaarinen classifiersfor näytteen käyttäen tukivektoriluokitin algoritmi, joka valitaan painot

w

k

ja siepata

b

minimoimalla seuraavat toiminnalliset: Tässä

C

on säädettävissä laillistaminen vakio, jolla on suhteellisen heikko vaikutus lopputulokseen meidän tapauksessamme. Tulokset ilmoitetaan ovat käyttäneet

C

= 1.

Tulokset

Väestörakenne ja kliinis ominaisuuksia matalan riskin ja korkean riskin potilailla kohortin 1 (löytö kohortti) plasmassa ja virtsassa profilointi aseiden esitetään taulukossa 1.

microRNA profilointi plasma

suurin osa miRNA olivat sen pitoisuus plasmassa potilailla, joilla on suuri riski eturauhasen syöpä ja matalan riskin eturauhassyövän (kuva 2). Kolme näytettä osoitti kaiken kaikkiaan alhainen havaitseminen hinnat ja poistettiin myöhempää analysointia. Valvomatta klustereiden levitettiin näytteet poikki 12 Mirs profiloitu plasmassa onko siellä oli erotettu toisistaan ​​korkean riskin ja alhaisen riskin ryhmiin. Ei näyttänyt olevan mitään ilmeistä erottaminen korkean ja matalan riskin ryhmiin. Käytimme ominaisuus valintamenettelyä ja testattu suorituskykyä 12 Mirs niiden kyky rajata korkean riskin eturauhassyövän vähäriskisestä eturauhassyöpään. Taulukossa 2 esitetään tulokset meidän ominaisuus valintamenettelyn. Käyttäen sekä t-testiä ja painopisteen ominaisuus valintamenettely, miR16 valittiin kaikkein ennakoivaa ominaisuus kuitenkin ranking osoitti epävakaa tuloksia kaikissa Mirs. Kuvio 3, esittää ROC käyrä miR16, jotka osoittavat, että miR yleinen on melko huono suorituskyky, jossa ala käyrän alla 0,62. Vaikka ennakoiva, päätimme tämä esitys ei riittänyt perusteeksi lisävalidointia.

Näytteet ovat joutuneet ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi ja tulokset kuvata dendro- yläosassa kuvan.

miR-16 ei ennustaa todennäköisyys kehittää korkean riskin taudin eturauhasen (AUC = 0,62).

microRNA profilointi virtsan

Discovery kohortissa.

seulonnassa virtsassa, kaikki näytteet osoittivat havaittavissa ekspressiotaso valitun MIRS (kuvio 4). Valvomaton ryhmittely näytteistä kaikissa MIRS oli maltillinen ja erottaminen matalan riskin ja korkean riskin näytteissä (kuvio 4). Mirs 16, 20a, 21, 34a, 145, 106b, 182, 205, 221, 222, 331 ja 375 havaittiin korkeammilla tasoilla riskiryhmään, kun taas miR 218 havaittiin alemmilla virtsassa korkean riskin eturauhassyöpäpotilaalla. Näistä Mirs kaikki vaan miR 218 olivat merkittävästi erilaiset eri korkean ja matalan riskin ryhmissä (q-arvo 0,1), kuten on esitetty taulukossa 3. kertainen muutos miRNA, jotka merkittävästi voimistunut vaihtelivat 2,17 (miR 145) ja 8,09 (miR 222), kuten on esitetty taulukossa 3. määrittämiseksi minimaalinen joukko Mirs joka osoitti paras erottaminen korkean ja matalan riskin ryhmiin, käytimme piirre valintamenettelyä, joiden tulokset näkyvät taulukossa 4. sekä t- testaustoiminto valintamenettelyä ja painopisteen menettely valitun miR16 ja miR222 kaikkein ennakoivaa ominaisuuksia. Tämän lisäksi sijoitusta miR suorituskyky oli epävakaa. Siksi valitsimme miR222 ja miR16 vahvistettavaksi. Lisäksi olemme myös valitsi miR21. Vaikka se ei ole sijoitus erittäin ominaisuus valintamenettelyä, valitsimme sen ominaisuus, joka oli todennäköisesti riippumattomia miR222 ja miR16, vähiten korreloivat miR klusterissa sisältävä miR222 ja miR16 (kuva 4). Testasimme kaikkien suoritusta yhdistelmät 3 Mirs ja kaikki kolme yhdistetään osoitti parhaan suorituskyvyn AUC = 0,75 (kuva 5). Me katsotaan tämä esitys riittää edelleen seurannassa ja pyrki validointi kohortti.

Näytteet ovat joutuneet ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi ja tulokset kuvata dendro- yläosassa kuvan.

miR 16, miR 222 ja miR 21 ennustavan suurta riskiä eturauhassyövän AUC 0,75.

Validation kohortti.

Väestörakenne ja kliinis ominaisuudet matalan riskin ja korkean riskin potilailla kohortissa 2 (validointi kohortti) esitetään taulukossa 5. validointi vain toteutettu virtsasta lauseketta luokittelija plasman ilmentymisen miRNA tuotti vain kohtalainen suorituskyky.

Valitsimme miR 16, 21 ja 222 varten validointi itsenäisesti kohortin matalan riskin ja korkean riskin eturauhasen syöpiä. Valitsimme eri metodilla profiloinnin miRNA validoinnissa kohortti testata kestävyys, kuten on kuvattu menetelmissä. Testaamiseksi yhdenmukaisuuden havaitsemiseksi poikki kahden alustan, me profiloitu näytteet alkuperäisestä kohortin uuteen alustaan ​​ja havaittu korrelaatiota Ct-arvojen välillä alustojen kolmen Mirs. Kaikki kolme Mirs osoittivat korkeaa korrelaatiota alustoilla (kuvio 6) viittaa siihen, että havaitseminen nämä Mirs oli vahvaa. Niiden suorituskyky ennustajina korkean riskin tauti oli myös verrata eri alustoilla (kuva 7, AUC = 0,72). Kuitenkin kuten on esitetty taulukossa 6, validointi kohortissa, huomasimme, että kolme miRNA oli yllättäen havaittu alemmilla tasoilla riskiryhmään, verrattuna matalan riskin ryhmään: miR 16 (FC = 0,07, q = 0,08 ), miR 21 (FC = 0,14, q = 0,10) ja miR 222 (FC = 0,14, p = 0,10). Kun luokittelija rakennettu alkuperäisen kohortin käyttäen kolmea Mirs käytettiin validoinneista kohortin saavutimme suorituskyky AUC = 0,35 (kuva 7).

R

2 arvot edustavat Pearsonin korrelaatiota.

Eturauhassyöpä potilailla alkuperäisestä kohortin (sininen). Eturauhassyöpä potilaita validointi kohortin (punainen).

arviointi metodologian miRNA profilointiin.

arvioimiseksi, jos tämä muutos ekspressiokuviota miRNA johtui metodologinen ero, me profiloitu kolmen miRNA käyttäen sekä menetelmiä alkuperäisen löytö kohortissa. Olemme havainneet, että käyttämällä molempia menetelmiä, kaikki kolme miRNA havaittiin korkeammilla tasoilla riskiryhmään alkuperäisessä löytö kohortissa. Vertailu ilmentymistä näiden kolmen miRNA käyttäen sekä menetelmiä alkuperäisen kohortin osoitti hyvää korrelaatiota (Korrelaatiokerroin R

2 = 0,96 (miR 16), R

2 = 0,91 (miR 222) ja R

2 = 0,86 (miR 21)) vahvistetaan, että ero havaittu johtui biologinen vaihtelu sijaan menetelmien vaihtelu.

keskustelu

Hoitojen suuren riskin CaP edelleen haaste ja tämä tukee nykyistä ylihoito of biologisesti merkityksettömiä syöpiä. Mistään biomarkkereiden voidaan onnistuneesti kääntää kliinisen areenalle, se on kestettävä riittävästi validointi riippumattomissa kohortteja potilaiden ja osoittaa menetelmien luotettavuutta. Tässä tutkimuksessa olemme korosti validointi tulosten itsenäisessä kohortin käyttää vaihtoehtoista menetelmiin alustoilla. Alkuperäisessä kohortti, huomasimme, että miR 16, 222 ja 21 yläreguloituja korkean riskin eturauhassyövässä verrattuna matalan riskin syöpä ja virtsan profilointia miR 16, miR 222 ja miR 21, pystyi erottamaan ne syövät todennäköisesti veltto kurssilta biologisesti merkittävä syöpien jälkeen eturauhasen. Kuitenkin nämä samat miRNA havaittiin havaita alemmilla tasoilla riippumattomalla kohortin korkean riskin eturauhasen syöpiä verrattuna matalan riskin syöpiä. Tämä on toisin kuin tulokset alkuperäisestä kohortissa. Niinpä profilointi näille miRNA plasmassa tai virtsassa, tutkimuksessamme, ei voimakkaasti eroa matalan riskin ja korkean riskin korkki.

Koska miRNA profilointi käyttäen sekä näitä erillisiä menetelmiä alkuperäisen löytö kohortti tuotti samanlaiset tulokset, tämä on todennäköisesti se edusta biologinen vaihtelu sijaan ero johtuu menetelmiin vaihtelua. TLDA kortit ovat suhteellisen uusi alusta PCR: n suorittamista, joita ei ole tehty intensiivistä validointi, mutta on käytetty monien ryhmien aikaisemmin kvantifioivien geeniekspression [23], [24], [25]. Profilointi miR 16, 21 ja 222 näytteiden alkuperäisen kohortin käyttämällä kahta menetelmää osoitti, että tulokset korreloivat hyvin. Tämä vahvisti, että kokeelliset menetelmät oli vahvaa ja tulokset ovat osoitus tosi biologinen vaihtelu ilmentymistä näiden miRNA että kahdesta riippumattomasta.

analyysi virtsan diagnostisena tai ennustetyövälineenä on aiemminkin. Tasot proteiinin, mRNA miRNA ja jopa geenin metylaatio virtsassa ovat korreloineet syövän läsnäolon ja aggressiota aikaisempien tutkimusten [26], [27], [28], [29], [30]. Lisäksi toiset ovat löytäneet virtsa olevan parempi lähde eturauhasen materiaalista kuin plasma [28]. Menetelmä Näiden solujen aineiden pääsemästä virtsa on todennäköisesti kautta kuljetus syöpäsolujen kautta eturauhasen duktaaliseen järjestelmä [30] tai exosomal polku [27].

Useat aiemmat tutkimukset ovat tutkineet sääntelyn miRNA lajien eturauhasen syöpä kudoksiin nähden hyvänlaatuinen eturauhasen, laadukkaat ensisijainen suhteessa matala-asteista tai metastaattisen suhteessa ensisijainen syöpään [31], [32], [33]. Lisäksi monet miRNA osallistuvien eturauhassyövän aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden on toiminnallisesti tunnusomaista [34], [35]. Viimeaikaiset toimet myös profiloitu miRNA lajeja voimistuvan tai vaimentua plasmassa tai seerumissa eturauhassyövän potilaista [10], [11], [12], [13], [36], [37]. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että tiettyjä miRNA voivat olla käyttökelpoisia ei-invasiivisia ennustetekijöiden testi, mutta vain plasmasta tai seerumista. Harvat tutkimukset ovat profiloitu miRNA virtsassa potilaiden eturauhassyövän. He ovat havainneet, että useita verenkierrossa miRNA ilmentyvät differentiaalisesti eturauhassyövän [10], [11], [12], [13], [36], [37], [38]. Jotkut ovat havainneet, että miR 26a, 30c ja anna 7 ilmentyvät differentiaalisesti plasmassa tai seerumissa potilailla, joilla on eturauhasen syöpä verrattuna niihin, joilla eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) [12], [36]. Toiset ovat verrattuna potilailla, joilla on alhainen riski korkean riskin eturauhassyövän ja politiikan eri tutkimuksissa miR-141, miR-375, miR-221, miR-21 ja miR-145 ovat osoittaneet olevan koholla potilailla, joilla on korkean riskin tai metastaattinen eturauhassyöpä [10], [11], [37], [38]. Vaikka miR 222 ei ole osoitettu olevan merkitsevästi ennustavia korkean riskin taudin aiemmissa tutkimuksissa [39], miR 21 on osoitettu olevan koholla aggressiivisempia eturauhassyöpä joissakin tutkimuksissa [11], [37]. Shen, et al havaitsivat, että miR 21 tasoa korreloi Syöpä Eturauhasen Risk Assessment (CAPRA) tulokset [11] ja Agaoglu ja työtovereiden totesi, että miR 21 tasot olivat koholla potilailla, joilla oli etäpesäkkeitä verrattuna niihin, joilla oli paikallinen sairaus [37]. Vastaavasti miR 221 on osoitettu olevan koholla molemmissa näissä tutkimuksissa, mutta miR 221 ei johdonmukaisesti koholla korkean riskin kasvainten meidän kohortissa.

Kuitenkin nämä tutkimukset ovat toistuvasti tuottaneet eri miRNA allekirjoitukset riski kerrostuvat eturauhassyövän takia vaihtelevassa kokeellisia menetelmiä, puute kestävyys tilastollisen analyysin ja ei-standardoituja määritelmiä korkean riskin tai alhaisen riskin eturauhassyövän. Olemme yrittäneet ratkaista joitakin näistä ongelmista käyttämällä vankka tilastollinen lähestymistapoja tulosten analysointi sekä käyttämällä standardoituja määritelmiä veltto (Epstein kriteerit) ja suuren riskin tauti. Suurin osa aiemmista tutkimuksista ei sisälly validointi merkittäviä miRNA ja siten niiltä puuttuu kyky osoittaa toistettavuuden tietojen [11], [12], [13], [36], [37].

toinen kohta on korostettu, että näytteet muissa tutkimuksissa tähän mennessä otettu potilailta, kun he olivat kehittäneet etäpesäkkeitä. Vaikka tämä tarjoaa tietoa biologia syövän etenemisen, se ei salli riskin kerrostuminen potilaista, kun ne vielä ovat paikallisia sairaus, eikä se siten ole välitöntä kliinistä vaikutusta. Tutkimuksemme on uutta, että plasma- ja virtsanäytteitä kerättiin ennen eturauhasen ja siten ajankohtana, jolloin riski kerrostuminen, valinta hoitoon ja ennustettavuutta potilaiden on ensiarvoisen tärkeää.

Muita testejä kaupallisesti saatavilla riski kerrostuminen eturauhassyöpä ovat pCA3 ja PHI testi. PCA3 testi, joka on virtsa-pohjainen mRNA testi, on tarkempi eturauhassyövän kuin PSA-testi [30], [40]. Sen on osoitettu olevan käyttökelpoinen ohjata päätöksiä eturauhasen biopsia perustuu kumulatiivinen pistemäärä lasketaan mittaamalla ilmentyminen eturauhassyövän geenin mRNA: ta. Viime aikoina on osoitettu olevan ennustava ”merkittävä” eturauhassyövän oli merkittävä ero pCA3 tulokset potilaista, jotka täyttivät Epstein kriteerit indolent syöpiä [41] ja ”huomattava” syöpiä, jotka katsottiin sopiva eturauhasen. PHI testi, joka mittaa eri isoformin PSA ja [2] pro-PSA, on havaittu olevan hyödyllistä ennustettaessa eturauhassyövän Gleason score≥7 potilailla, joilla PSA 2-10 ng /ml, mutta ei liity eturauhasen tilavuus [42]. Kuitenkaan kumpikaan näistä Testien avulla niitä ihmisiä todennäköisesti kehittää etäpesäkkeitä jälkeen eturauhasen.

On joitakin rajoituksia tämän tutkimuksen, jotka on lueteltu. Joilla ei ole hyväksytty biologista ohjaus miRNA vuonna Biofluids, emme ole normalisoitu tuloksemme on ’house-keeping ”geeni. Useat endogeenisen valvontaa käytetään kudosten profilointiin tutkimuksissa. Kuitenkin kun käytimme RNU48 kuin endogeeninen kontrolli, huomasimme, että sen ilmaisua ei vastannut matalan riskin ja korkean riskin ryhmiin. Tällaisen järjestelmällisen häiriön sen ilme, se oli sopimaton endogeeninen kontrolli. Ajan, kun miRNA tutkitaan edelleen Biofluids, tietyt biologiset valvonta voisi syntyä. Toiseksi virtsa on dynaaminen kehon nesteen ja pitoisuudet voivat muuttua hydraatiotila ja munuaisten patologian. Tutkimuksessamme kaikki virtsanäytteet otettiin välittömästi ennen eturauhasen joten on todennäköisesti riittävän yhtenäisyyden sisällä virtsan koostumuksissa. Mittaus 24 tunnin virtsatilavuuksien olisi kultakanta arvioimiseksi hydraatiotila mutta tämä on työlästä, kallista ja vaivalloista alhainen täyttämisasteiden kliinisessä ympäristössä. Mittaus kreatiniini suhdeluvut ja ominaispaino ovat edelleen muita mahdollisuuksia ja mahdollisesti enemmän toteuttamiskelpoisia vaihtoehtoja. Lopuksi meidän otoskoko on pieni.

Lopuksi tässä olemme osoittaneet plasman ja virtsan profilointi miRNA ei voi olla vankka merkkiaine ennustus eturauhassyövän aggression ja korkean riskin sairaus. Tämä tutkimus korostaa sisällyttää validointi kohortteja ja menetelmiin kestävyyttä varmistaa toistettavuuden tiedot kaikissa tulevissa biomarkkereiden tutkimuksissa.