Krooninen sairaus

tiivistelmä

14-3-3 proteiinit ekspressoituvat dimeerisiä adaptoriproteiineja ilmenneitä keskeisinä välittäjinä monien solun signalointireittien useita solutyyppejä. Sen vaikutukset ovat pääasiassa välittää sitoutuminen selektiivisen fosfoseriini /treoniini-proteiineja. Tärkeys 14-3-3 proteiinien syöpä on vasta alkanut tulla ilmi ja sen täsmällinen rooli syövän etenemiseen sekä mekanismeja, joilla 14-3-3 proteiinit välittävät syöpäsolun toiminto ei vielä tunneta. Vaikka proteiini 14-3-3σ on laajalti hyväksytty tuumorisuppressorina, 14-3-3ζ, β ja y-isoformien on osoitettu olevan kasvaimen edistävät vaikutukset. Tärkeydestä huolimatta 14-3-3 perheen välittämisessä eri solussa prosessien tarkkaa roolia ja mekanismi 14-3-3ζ pysyvät tutkimaton. Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme rooli proteiinin 14-3-3ζ eturauhassyövässä soluliikkuvuus ja migraatiota käyttämällä biokemiallisia, molekyylibiologian ja sähköinen cell-alustan impedanssin tunnistava lähestymistapoja sekä solu- pohjainen funktionaalisia määrityksiä. Tutkimuksemme osoitti, että ilmaisu villin tyypin proteiini 14-3-3ζ tehostaa merkittävästi Rac aktiivisuutta PC3-soluissa. Sitä vastoin ilmaus dimeerin kestävää mutanttia proteiinia 14-3-3ζ (DM-14-3-3) esti Ras ja siihen liittyviä fosforylaatio p21 aktivoitu kinaasi-1 ja 2. Expression villityypin 14-3-3ζ tai konstitutiivisesti aktiivinen Rac1 tehostettu soluväliaineen tunnustamista, lamellipodioihin muodostumista, solujen vaeltamiseen ja trans-endoteelisolujen migraatiota PC3-soluissa. Sitä vastoin ilmaus DM 14-3-3ζ tai DN-Rac1 PC3-soluissa merkittävästi esti näiden solujen toimintaan. Tuloksemme osoittavat ensimmäistä kertaa, että 14-3-3ζ lisää eturauhassyövän solu-matriisi vuorovaikutuksia, liikkuvuuteen ja migraatiota

in vitro

aktivoimalla Rac1-GTPaasina ja on tärkeä kohde hoitotoimenpiteiden eturauhassyöpään .

Citation: Goc A, Abdalla M, Al-Azayzih A, Somanath PR (2012) Rac1 aktivointi ajamana 14-3-3ζ Dimerisaatio Edistää Eturauhassyöpä Cell-Matrix Interactions, Liikkuvuus ja migraatiota. PLoS ONE 7 (7): e40594. doi: 10,1371 /journal.pone.0040594

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 14 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 13 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Goc ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahastot olivat antamat University of Georgia Research Foundation, Wilson apteekki Foundation ja UGA College of Pharmacy läpi sisäiset tuet PRS, ja osittain National Institutes of Health avustus (R01HL103952) ja American Heart Association Scientist Development Grant (0830326N) PRS. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

seitsemän jäsentä 14-3-3 perhe (tunnetaan myös YWHA proteiinit) tiedetään vaikuttavan yli 100 avain signalointi molekyylejä normaaleissa ja syöpäsolujen ja säädellä monipuoliset soluprosesseja [1] [2]. Yleisesti, 14-3-3-isomuodot sitoutuvat kahteen fosforylaatiosta riippuvainen korkean affiniteetin sitoutumisen motiiveja, kuten RSXpSXP ja RXXXpSXP [3], [4]. Koska proteiini vuorovaikutus tämän sovittimen proteiini ovat riippuvaisia ​​samassa paikassa proteiinin 14-3-3 [5], miksi 14-3-3 tarvitaan niin monia eri isoformit on pitkäaikainen kysymys. Kun taas kaikki 14-3-3 isomuodot muodostaa homodimeerejä

in vivo

, yksi selitys vaatimus eri 14-3-3 proteiinien on muodostaa erillinen heterodimeerejä ainutlaatuinen tunnustusta motiiveja tiettyjä ligandeja. Vaikka useita 14-3-3 isoformit voivat muodostaa heterodimeerejä

in vitro

, yhdistelmä 14-3-3 ε ja ζ on ainoa tunnettu heterodimeeri, joka muodostuu

in vivo

[ ,,,0],6].

Vaikka globaali alas-säätely 14-3-3 ilmaisun välittää tuumorisuppressiogeeneksi, ilmentyminen 14-3-3 proteiinien merkittävästi kohonnut useita syöpiä [7], [8], [9] , [10], [11], [12]. Vaikka yli-ilmentyminen 14-3-3 β ja γ NIH 3T3-soluja on osoitettu indusoivan onkogeenisen transformaation [10], [13] β, γ, ε, ζ ja θ 14-3-3 geeniekspressioiden on osoitettu kohota keuhkosyövän yksin [14]. Kuitenkin kaikista 14-3-3 geenit, 14-3-3 σ ja ζ ovat eniten suoraan yhdistetty syöpään. Proteiini 14-3-3 σ ja f saada päinvastainen vaikutuksia nisäepiteelisoluissa [15]. Proteiini 14-3-3σ on ajateltu toimimaan tuumorisuppressorina kautta indusoi G2-M-solukierron pysähtymisen useimmat syövät [16]. Sen ilmentyminen säätyy alas in invasiivisia urogenitaalinen syövissä, kuten virtsarakon [17], eturauhas- [18], ja munasarja [19]. Sitä vastoin lisääntynyt ilmentymä 14-3-3ζ, Drosophila homologi ”Leonardo”, on yhdistetty parannettu kasvaimien syntyyn ja sen ennustetaan ennustetyövälineenä merkki ja terapeuttinen kohde syövän [20].

korrelaatio välillä lisääntyneen ilmentymisen 14-3-3ζ ja parantaa solujen selviytymistä on raportoitu eturauhasen syöpäsolujen [21]. Kaksi itsenäistä tutkimukset ovat myös osoitti suhde kohonnut ilmentyminen 14-3-3ζ ja esiintyvyys eturauhasen syöpää [22], [23]. Kuitenkin tarkka rooli 14-3-3s eturauhasen syövän etenemisessä ei juuri tunneta. Vaikka vaikutukset 14-3-3s jakautumiseen, solusyklin ja selviytymisen syöpäsolut laajalti tutkittu, onko 14-3-3s ovat välttämättömiä muuttoa tahansa syöpäsolutyyppien ja johtavien mekanismien 14-3 -3-välitteisen suunnattuun vaellukseen syöpäsolujen on vielä määrittämättä. Meidän aikaisemmat tutkimukset NIH 3T3-soluissa ovat osoittaneet, että proteiini 14-3-3 yli-ilmentyminen johtaa aktivoinnin Rac1 ja p21 aktivoitu kinaasi (Pak) signalointireitin välittämisessä solujen vaeltamiseen [24]. Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme erityinen rooli 14-3-3ζ ja sen dimerisaatio säätelyssä eturauhassyövän (PC3) soluväliaineen vuorovaikutuksia, lamellipodioihin muodostumista, liikkuvuuteen eri soluväliaineen (ECM) proteiineja ja migraatiota aktivoimalla of Rac1. Tuloksemme osoittavat, että esto 14-3-3ζ voi olla potentiaalinen terapeuttinen strategia eturauhassyövän.

Tulokset

Protein 14-3-3ζ Expression Lisäykset onkogeenisella Transformation eturauhassyöpäsoluissa

Aikaisemmat tutkimukset ovat perustaneet suhde kohonnut ilmentyminen 14-3-3ζ ja lisääntyneestä eturauhassyövän ihmisellä [22], [23]. Siksi pyrimme verrata ekspressiotasoja 14-3-3ζ useissa eri hiiren (TRAMP) ja eturauhassyövän solulinjoissa. Tuloksemme osoittivat, että vaikka 14-3-3ζ ilmentyy ei-tuumorigeenisiä (TR-C2D) TRAMP (siirtogeenisiä Adenokarsinooma Mouse Prostate) solulinjaa, sen ilme on huomattavasti korkeampi tuumorigeenisia (TR-C2) ja metastaattinen (TR C2N) TRAMP solulinjoja (

p

0,05) (kuva 1A ja B). Kuitenkin merkittävä ero 14-3-3ζ ilmaisun välillä ei-metastasoituneen LNCaP ja metastasoituneen LNCaP C4-2 tai PC3-soluissa ei havaittu.

ζ ilmaisun kasvaa onkogeenisella transformaatio eturauhasen syöpäsoluja. (A) Hiiren TRAMP (TR-C2D, TR-C2 ja TR-C2N), ihmisen hormoni reagoiva LNCaP sekä hormoni tunteeton LNCaP C4-2 ja PC3 eturauhassyövän solulysaateista alistettiin western blot vertailevaa analyysia 14-3- 3ζ ilme. (B) kvantifiointi nämä tiedot yhtyeen densitometrian analyysi osoittaa lisääntyneen ilmentymisen 14-3-3ζ eturauhasen syöpäsolujen verrattuna ei-tuumorigeeniset hiiren TRC2D soluja. (C-E) PC3-solut transfektoitiin kontrollivektorilla, WT-14-3-3ζ ja DM-14-3-3ζ ja alistettiin elinkelpoisuuden (Trypan blue-määritys), proliferaatio (MTT-määritys) ja pesäkkeiden muodostuminen määrityksessä, vastaavasti. (*

p

0,001; Δ

p

0,01; #

p

0,05; n = 3).

aiemmin on osoitettu, että 14-3-3ζ dimerisaatio tarvitaan sen aktiivisuuden soluissa [26]. Siksi tutkimme seuraavaksi ilmentyminen ja /tai dimerointi proteiinin 14-3-3ζ voi välittää eturauhassyövän solun toimintoja, kuten proliferaatiota, elinkelpoisuuden ja pesäkkeiden muodostumista. Tutkimuksemme osoitti, että yli-ilmentyminen villin tyypin proteiini 14-3-3ζ (WT-14-3-3ζ) PC3-soluissa merkittävästi parannettu lisääntymistä (

p

0,001), elinkelpoisuus (

p

0,01) ja pesäkkeiden muodostuminen (

p

0,05), verrattuna ilmentävät kontrollivektorille vain (kuvio 1 C-E). Sitä vastoin solut, jotka ilmentävät dimeeri-resistentti mutantti 14-3-3ζ proteiinia (DM-14-3-3ζ), joka estää sen dimerisaation PC3 * soluissa johti merkittävään vähenemiseen proliferaation (

p

0,01 ), elinkelpoisuus (

p

0,01) ja pesäkkeiden muodostuminen (

p

0,01), verrattuna PC3-solut ilmentävät kontrollivektorille (kuvio 1 C-E). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen ja dimerointi 14-3-3ζ on tarpeen eturauhassyövän solujen toimintaa

in vitro

.

Protein 14-3-3ζ Dimerisaatio Drives Rac1 GTPaasi Aktiivisuus PC3 Solut

edellisen tutkimuksen NIH3T3-fibroblasteissa osoitti, että proteiini 14-3-3 on tarpeen aktivointi Rac1 ja p21 aktivoituu kinaasien 1 ja 2 (Pak 1/2) [24]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme määritetään, onko yli-ilmentyminen ja dimerointi proteiinin 14-3-3ζ johtaa Rac1 aktivaatio PAK1 /2 eturauhassyöpäsoluissa. Tutkimuksemme osoittivat, että yli-ilmentyminen PC3-solujen WT-14-3-3ζ merkittävästi parannettu Rac1 aktivointi osoituksena kohonneet GTP: hen sitoutuneen Rac1 verrattuna ohjaamaan vektoriin ilmentävien solujen (

p

0,01) (kuvio 2A ja B). Kuitenkin ilmaisu DM-14-3-3ζ PC3-soluissa esti merkittävästi GTP: hen sitoutuneen Rac1 tasolla kontrolliin verrattuna (

p

0,05) (kuvio 2A ja B). Sitten me selvitettävä, 14-3-3ζ ilme ja dimeroituminen on tarpeen sen vuorovaikutusta Rac1. Tuloksemme osoittivat, että vaikka immuunisaostuksessa 14-3-3ζ välillä PC3 soluista, jotka ilmentävät WT-14-3-3ζ kerasaostuvat Rac1 (

p

0,01), tämä vuorovaikutus oli poistetaan heti ilmaus PC3-solujen kanssa DM-14-3-3ζ (kuvio 2C ja D). Vuorovaikutus 14-3-3ζ ja Rac1 PC3-soluissa saavutettiin myös EGF (

p

0,05) (kuvio 2E ja F).

ζ ilmaisun ja dimeroituminen johtaa aktivoitumiseen Rac1 eturauhassyöpäsoluissa. (A) WT-14-3-3ζ ja DM-14-3-3ζ ekspressioplasmideja yhdessä kontrollivektorilla transfektoitiin PC3-solujen ja solujen lysaatit alistettiin Rac1 aktiivisuuden määritys käyttäen Pak-PBD-glutationi sepharose helmiä. (B) kvantifiointi nämä tiedot yhtyeen densitometrian analyysi osoittavat myönteistä suhdetta 14-3-3ζ ilmaisun, dimerointi ja Rac1 toimintaa. Bars kuvaavat Rac1 aktiivisuus mitattuna GTP sidottu Rac1 tasoilla. (C) WT-14-3-3ζ ja DM-14-3-3ζ ekspressioplasmideja sekä kontrollivektorilla transfektoitiin PC3-soluissa ja solu- lysaatit altistettiin immunosaostus 14-3-3ζ ja co-saostus Rac1 analysoitiin . (D) kvantifiointi nämä tiedot yhtyeen densitometria analyysi. Bars kuvaavat Rac1 aktiivisuus mitattuna GTP sidottu Rac1 tasoilla. (E) seerumia PC3-soluja käsiteltiin 50 uM EGF 12 h ja lysaatit altistettiin immunosaostus 14-3-3ζ ja co-saostus Rac1 analysoitiin. (F) kvantifiointi nämä tiedot yhtyeen densitometria analyysi. Bars kuvaavat Rac1 aktiivisuus mitattuna GTP sidottu Rac1 tasoilla. (*

p

0,001; Δ

p

0,01; #

p

0,05; n = 3).

Sen jälkeen, analysoitiin myös 14-3-3ζ-Rac1 vuorovaikutus voi johtaa siihen, että modulaatio Rac1-GTPaasi-aktiivisuus. Tutkimuksessamme yli-ilmentyminen konstitutiivisesti aktiivisen Rac1 aikaan voimakkaampaa migraatio PC3-solujen eri matrix proteiineja. Vastaavasti ilmaisu WT-14-3-3ζ myös lisännyt fosforylaatioon PAK1 /2 (

p

0,001) (kuvio 3A ja B). Koska pohjapinta tasot fosforyloitua PAK1 /2 kontrollivektorille transfektoiduissa PC3-solut olivat liian alhaisia, yli-ilmentyminen, joiden DN-Rac1 tai DM-14-3-3ζ eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia PAK1 /2 fosforylaation (kuvio 3A ja B ). Vaikka koekspressio DM-14-3-3ζ CA-Rac1 PC3-solut osoittivat merkittävää kasvua PAK1 /2-fosforylaation verrattuna kontrolliin vektori-ilmentäviä soluja (

p

0,001), koekspressio DN-Rac1 WT-14-3-3ζ merkittävästi heikentynyt PAK1 /2 fosforylaatiota (

p

0,001). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että aktivaatio Rac1 on alavirtaan 14-3-3ζ dimeroitumisen.

(A) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) ja DN-Rac1 (N

17) ekspressioplasmideilla ja vektori, yksinään tai yhdistelminä, transfektoitiin PC3-soluissa ja solu- lysaatit alistettiin Western-analyysi fosforyloidun PAK1. (B) kvantifiointi nämä tiedot yhtyeen densitometria analyysi. Bars kuvaavat PAK1 aktiivisuus mitattuna tasot fosforylaation. (*

p

0,001; Δ

p

0,01; #

p

0,05; n = 3).

vuorovaikutus proteiini 14-3-3ζ ja Rac1 Parantaa Matrix tunnustus PC3 Solut

Koska Ras-GTPaasit ovat master säätelijöitä solun tukirangan remodeling vastauksena vihjeitä solunulkoisesta microenvironment, tutkimme onko modulaatio proteiini 14-3-3ζ-Rac1 signalointi eturauhassyöpäsoluissa olisi mitään vaikutusta niiden kyky tunnistaa ja sitoutua ECM proteiineja, kuten fibronektiini (FN), vitronektiinissä (VN), kollageeni I (COLL-I) ja laminiini (LN ), joka ilmentyy runsaasti eri kudoksissa kätkeminen eturauhasen syöpäsoluja. Tutkimuksemme osoitti, että vaikka ilmaisu WT-14-3-3ζ ja CA-Rac1 parannettu PC3-solujen kiinnittyminen näiden ECM proteiinit, ilmaisutapoja DM-14-3-3ζ tai DN-Rac1 merkittävästi alentunut tätä prosessia (kuvio 4A-D) . Vaikka heikentynyt tarttuvuus DM-14-3-3ζ ilmentyminen pelastettiin koekspressoimalla kanssa CA-Rac1, koekspressoimalla WT-14-3-3ζ DN-Rac1 ilmentävien PC3-solut eivät pelastaa heikentynyt soluadheesiota (kuva 4A-D), mikä osoittaa, että 14-3-3ζ toimii ylävirtaan Rac1 aktivoinnin säätelyssä PC3 soluväliainekonstruktissa vuorovaikutuksia.

(AD) WT-14-3-3ζ, DM-14-3- 3ζ, CA-Rac1 (L

61) ja DN-Rac1 (N

17) ekspressioplasmideilla ja vektori, yksinään tai yhdistelminä, transfektoitiin PC3-soluissa ja seerumia solut altistettiin soluadheesioanalyysin solunulkoiseen matriisin proteiinit, kuten fibronektiini (FN), Kollageeni tyyppi I (COLLin-1), laminiini (LN) ja vitronektiini (VN), vastaavasti, ja solun tiheys 1 x 10

4 solua /kuoppa, kun läsnä oli 10 % FBS: ää. Bars kuvaavat useita PC3 solujen kiinni erityisiä ECM proteiineja. (*

p

0,001; Δ

p

0,01; #

p

0,05; n = 3 nelinkertaisesti).

proteiini 14-3-3ζ-Rac1 Signaling Säätelee lamellipodioihin Formation PC3 solut

tarkempaa analyysiä käyttäen phalloidin värjäystä PC3-soluja, jotka värjää spesifisesti vasta polymeroidut aktiinisytoskeletonille osoitti, että yli-ilmentyminen WT-14- 3-3ζ tai CA-Rac1 johti parantuneeseen lamellipodioihin muodostumista vasta leviää soluissa verrattuna kontrolliin ilmentävää käsittelemättömien PC3-soluja, kun läsnä oli 10% FBS: ää (kuvio 5A). Sitä vastoin ilmaisu DM-14-3-3ζ tai DN-Rac1 vähensivät lamellipodioihin muodostumista kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 5A). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin myös vaeltavien PC3-soluissa analysoitiin phalloidin värjäystä. PC3-solut ilmentävät WT-14-3-3 tai CA-Rac1exhibited parannettu lamellipodioihin muodostumista verrattuna vektori-ilmentäviä soluja (kuvio 5B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että 14-3-3ζ-Rac1 yhdistys on mukana lamellipodioihin muodostumista eturauhasen syöpäsoluja.

ζ-Rac1 yhteistyötä säätelee lamellipodioihin muodostumista PC3-soluissa. (AB) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) ja DN-Rac1 (N

17) ekspressioplasmideilla ja vektori, yksin tai yhdistelminä, transfektoitiin PC3-soluja, maljattiin soluviljelmässä kammiot läsnä oli 10% FBS: ää ja joka oli 40 minuuttia (A) tai 16 tuntia (B) sen jälkeen, kun pinnoitus. Paraformaldehydi kiinteät solut värjättiin Alexa Fluor (punainen) merkitty phalloidin detektoimiseksi vasta polymeroitavan aktiinisytoskeletonin ja lamellipodioihin.

yhteistyö Protein 14-3-3ζ ja Rac1 Parantaa EGF-stimuloidun PC3 Cell Suunnattu Migration ja migraatiota

Seuraavaksi tutkittiin, 14-3-3ζ on rooli eturauhassyövän solujen vaeltamiseen. Siksi meidän transfektoidut androgeeni-reagoiva LNCaP ja androgen-tunteeton PC3-solujen WT-14-3-3ζ ja DM-14-3-3ζ ja altistettiin ne migraatiokokeessa 24-kuoppalevyillä läsnä ja poissa ollessa EGF. Tuloksemme osoittivat, että vaikka ilmaisua sekä LNCaP ja PC3-solujen WT-14-3-3ζ merkittävästi parannettu solumigraation verrattuna vektorisäädön ilmentävien solujen (

p

0,05), kun läsnä on EGF, ilmaisutapoja DM-14-3-3ζ johti heikentyneeseen solujen vaeltamiseen kuluttua 24 h (

p

0,01 PC3-solujen ja

p

0,05 LNCaP) (kuvio 6A ja C) . Vaikka vastaava suuntaus havaittiin ilman EGR data ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 6B ja D).

LNCaP ja PC3 solujen vaeltamiseen. (A-D) WT-14-3-3ζ ja DM-14-3-3ζ ekspressioplasmidien tai kontrollivektori transfektoitiin LNCaP ja PC3-soluja. Sitten solut altistettiin solujen migraatiomääritys kautta tyhjästä tehty yksikerroksisiin soluja. Bars kuvaavat migraatio PC3-solujen mitattuna sen tyhjästä elpymistä. (*

p

0,001; Δ

p

0,01; #

p

0,05; n = 4 nelinkertaisesti).

Seuraavaksi määritetään, onko 14-3-3ζ-Rac1 yhteistyö on välttämätöntä migraatiota sekä vaeltamista samansuuntaisesti PC3-solujen vastauksena EGF eri ECM proteiineja, jotka ovat runsaasti kudoksissa kätkeminen syöpäsolujen eri vaiheissa kasvaimen kasvun, invaasio, migraatiota ja etäpesäkkeitä, kuten luussa. Meidän analyysi osoitti, että vaikka ilmaisu WT-14-3-3ζ ja CA-Rac1 merkittävästi parannettu PC3 solujen vaeltamiseen ECM proteiineja, kuten FN, VN, LN, Bone sialoproteiinia (BSP, Osteopontin) ja SPARC (osteonektiini), ilmaisutapoja DM-14-3-3ζ tai DN-Rac1 merkittävästi heikentynyt vaeltamista samansuuntaisesti PC3-solujen (kuvio 7A-F). Samoin vaikka ilmaisutapoja WT-14-3-3ζ tai CA-Rac1 merkittävästi parannettu migraatiota PC3-solujen, ilmaisutapoja DM-14-3-3ζ tai DN-Rac1 merkittävästi heikentynyt migraatiota mukaan PC3-solut (kuvio 8A-C) . Kun taas heikentynyt PC3 migraatiota DM-14-3-3ζ ilmentyminen pelastettiin koekspressoimalla kanssa CA-Rac1, heikentynyt liikkuvuus ja migraatiota DN-Rac1 ilmentävien PC3-soluissa ei pelastettiin koekspressoimalla WT-14-3 -3ζ (kuvio 8A-C). Yhdessä tuloksemme osoittavat roolin 14-3-3ζ välittämisessä Rac1 aktivointi tarpeen PC3 solujen vaeltamiseen ja migraatiota.

ζ välittämä PC3 solumigraation. (AF) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) ja DN-Rac1 (N

17) ekspressioplasmideilla ja vektori, yksin tai yhdistelminä, transfektoitiin PC3-soluja, ja solut altistettiin solujen migraatiomääritys muoviin tai soluväliaineen proteiinit, kuten fibronektiini (FN), laminiini (LN) ja vitronektiini (VN), osteonektiini (SPARC) ja Bone sialoproteiini (BSP, osteopontiini), vastaavasti . Bars kuvaavat migraatio PC3-solujen eri ECM proteiinit mitattuna sen tyhjästä elpymistä. (*

p

0,001; Δ

p

0,01; #

p

0,05; n = 4 nelinkertaisesti).

ζ välittämää Rac1 aktivointi säätelee PC3 solujen migraatiota. (AB) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) ja DN-Rac1 (N

17) ekspressioplasmidit, vektorisäätö sekä yhdistelmänä DN-Rac1 ja WT-14-3-3ζ, transfektoitiin PC3-soluja, ja solut altistettiin migraatiota määrityksessä

in vitro

käyttäen ECIS. (C) analyysi migraatiota PC3-solujen 1,5 tunnin kuluttua käyttöönoton solujen endoteelisolujen kerroksena ECIS array pelimerkkejä osoittavat roolin 14-3-3ζ dimerisoitumisen aktivointi Rac1 välittämisessä migraatiota PC3-soluja (Δ

p

0,01; #

p

0,05; n = 5).

keskustelu

ensisijainen havainto nykyisessä tutkimuksessa on, että ilmaisutapoja proteiini 14-3-3ζ PC3-soluissa johtaa parannettu solu-ECM vuorovaikutuksia, lamellipodioihin muodostumista, solujen vaeltamiseen ja migraatiota aktivoimalla Rac1-GTPaasi. Olemme aiemmin raportoitu, että yli-ilmentyminen proteiinin 14-3-3β tulokset tiiviimpään Rac1 ja Pak aktiivisuutta NIH 3T3-soluissa, mikä parantaa integriinin aktivaation, lamellipodioihin muodostumista, solujen vaeltamiseen ja soluväliaineen kokoonpano [24]. Olemme myös osoittaneet, että aktivaatio Rac1-PAK1 /2 reitin osallistuu onkogeenisen transformaation Rat-1 a-solujen [25], mikä tarkoittaa, että samanlainen mekanismi 14-3-3ζ syöpäsoluissa voi lisätä kasvaimen kasvua, migraatiota ja etäpesäkkeiden. Nykyisessä tutkimuksessa havaitsimme, että ilmaisu WT-14-3-3ζ PC3-soluissa johti parantuneen tarttuvuuden ja muuttoliike eri ECM proteiinit, jotka ovat runsaasti kudoksissa että satama syöpäsolujen aikana useita vaiheita tuumorisolujen invaasio, trans-verisuoni muuttoliike ja luun etäpesäke. Kuitenkin yli-ilmentymisen mutantin 14-3-3ζ (DM-14-3-3ζ), joka on aiemmin osoitettu estävän sen dimeroituminen [26], PC3-solut eivät osoittaneet näitä vaikutuksia, sen sijaan johti heikentyneeseen solun tarttuvuus ja siirtolaisuuden hallita PC3 soluihin. Vaikka WT-14-3-3ζ ilmentyminen johti tehostettua lamellipodioihin muodostumiseen ja lisääntynyt aktiivisuus Rac1-GTPaasina osoituksena parannetun fosforylaatio PAK1 /2, ilmaisutapoja DM-14-3-3ζ vastusti näitä vaikutuksia. Lisäksi meidän tiedot osoittivat, että dimerisaatio proteiinin 14-3-3ζ on tarpeen aktivointi Rac1, joka puolestaan ​​säätelee motiliteettia ja migraatiota eturauhasen syöpäsoluja. Kaikkiaan meidän tutkimus osoittaa välillä suoraa yhteyttä proteiinin 14-3-3ζ ja Rac1 säätelyssä ECM vuorovaikutusta PC3-solujen, niiden liikkuvuutta ja migraatiota, ja että estetään dimerointi 14-3-3ζ voi estää näitä vaikutuksia.

Vaikka rooli 14-3-3 proteiinien solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä on tutkittu laajalti, erityistä roolia 14-3-3s säätelyssä soluväliaineen vuorovaikutuksia, liikkuvuuteen ja transendoteelikulkeutumisessa hyökkäyksen ja molekyylitason mekanismit säännellään prosessi ei ole selvästi ymmärretty. Soluväliaineen vuorovaikutuksia ja muuttoliike ovat keskeisiä ominaisuuksia metastaattisen syöpäsolujen, ja ensimmäinen askel tähän prosessissa cytoskeletal remodeling, kontrolloivat pääasiassa pienten Rho GTPaasit [27] .Kaksi riippumattomissa tutkimuksissa tunnistettu proteiinikinaasi D (PKD) ehdokkaana proteiini liittyy F-aktiini muodostumisen ja vuorovaikutuksessa 14-3-3 säätelyssä sytoskeletaalisten kokoonpano [28], [29]. Kuitenkin PKD oli mukana negatiiviseen säätelyyn aktiivisen solun tukirangan remodeling in etureunan yli-ilmentyminen konstitutiivisesti aktiivisen PKD johtaen Solujen migraation aktivoimalla RhoA. Muita mekanismeja, jotka on liitetty 14-3-3-välitteisen solumigraation ovat sen osallistumista inaktivoitumisen cortactin, aktiinia sitovan proteiinin, välityksellä PKD-välitteisen fosforylaation Ser298, mikä inhibitio solumigraation [30].

tutkimuksen viimeisen kymmenen vuoden aikana on käynyt ilmi, miten tärkeää on 14-3-3 proteiinien positiivinen säätely solumigraation joihin Rac1-GTPaaseja. Alustavat todisteet 14-3-3 ja Rac1 yhdistys raportoitiin ensimmäisen kerran CHO-solussa malli [31]. Meidän lab on aiemmin osoittanut, että 14-3-3β aktivoi Rac1 ja PAK1 signalointi säätelyssä NIH 3T3 soluväliaineen vuorovaikutuksen, muuttoliike ja soluväliaineen kokoonpano kautta affiniteetti moduloiva integriinin α

5β

1 [24]. Osoitimme myös, että ilmaisun kanssa 14-3-3β tuloksia translokaatio Rac1 kalvoon röyhelöitä parantaa PAK1 aktiivisuutta ja lamellipodioihin muodostumista NIH3T3. Tämän jälkeen uudempi tutkimus osoittaa, että 14-3-3 ohjaa solua mekaniikka ja sytokineesiin in

Dictyostelium

kautta yhteensovittamista Rac1 aktiivisuuden, myosiinin II ja mikrotubuleihin [32]. Kuitenkin, ei ole muita raportteja assosiaatiosta 14-3-3 ja Rac1-GTPaasit säätelyssä solun migraation mitään syöpäsoluja. Esillä olevassa tutkimuksessa, tuloksemme osoittavat, että yli-ilmentyminen WT-14-3-3ζ johtaa lamellipodioihin muodostumista leviämisen ja vaeltavat PC3-solujen samanlainen konstitutiivisesti aktiivisen Rac1 ilmentäviä soluja. Sen sijaan, DM-14-3-3ζ inhiboi lamelipodia muodostumista. Tuloksemme Rac1 aktiivisuusanalyysiä ja fosforylaatiota PAK1 /2, alavirran substraatti Rac-GTPaasit, molemmat ilmaisivat 14-3-3ζ aktivoi Rac1. Lisäksi se, että ilmentäminen rinnakkain DM-14-3-3ζ ei estänyt fosforylaatiota PAK1 /2 välittämää ilmentymisen CA-Rac1 osoittavat, että 14-3-3ζ dimerisaatio on ylävirtaan Rac1 aktivoinnin. Vaikka tarkkaa mekanismia, jolla 14-3-3ζ säätelee Rac1 aktiivisuus eturauhasen syöpäsolujen ei käy ilmi myös tulokset, mahdollinen mekanismi olisi vuorovaikutusta 14-3-3ζ yksi sen guaniininukleotidiä vaihto tekijät (GEF) ja toimitettavaksi Rac1 jolloin sen aktivointi.

joukossa 14-3-3 isoformit, tehostettu ilmentyminen 14-3-3ζ on liitetty kehittää kasvain vastustuskykyä kemoterapiaa huumeiden, kuten eturauhassyöpä [21], [33]. Sen sijaan, alas-säätely 14-3-3 ilmentymisen herkistää syöpäsolut kemoterapeuttisten [2], [20], mukaan lukien eturauhassyöpä [21], syyllistämättä terapeuttista potentiaalia 14-3-3ζ syöpähoitoa varten. Viimeaikaiset edistysaskeleet siRNA perustuu knockdovvn 14-3-3 proteiineja sekä peptidi-inhibiittorien estää dimerointi 14-3-3, kuten R18 (difopein, dimeeri R18) [34], tai pieni molekyyli yhdisteiden, kuten FOBISIN 101 [35 ] osoittaa lupaus kehittää anti-14-3-3 hoitoa syöpään.

Yhteenvetona tunnistamme 14-3-3ζ ja Rac1 uusina kumppaneina koulutusjakson säätelevät eturauhassyövän solu-matriisi vuorovaikutuksia, liikkuvuuteen vastauksena invasiivinen ja metastaattinen ärsykkeiden sekä intravasation eturauhasen syöpäsoluja. Tuloksemme osoittavat, että 14-3-3 on potentiaalinen kohde hoitotoimenpiteiden eturauhassyövän.

Methods

Reagenssit, Cell Lines ja vasta-

Human PC3, LNCaP ja LNCaP C4-2-solut (ATCC, Manassas, VA) käytettiin ja ylläpidetään DMEM-korkean glukoosin (HyClone, Thermo Scientific, Logan, UT), jossa 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa. Hiiren TRAMP (TR-C2D, TR-C2 ja TR-C2N) solut lahjakas tohtori Barabara Foster, Baylor College of Medicine, TX. Ensisijainen vasta-aineita fosfo-PAK1 /2 Ser144 /142, 14-3-3ζ ja pan-proteiini-14-3-3 ostettiin Cell Signaling (Boston, MA). Anti-Rac1 vasta-aineita, fibronektiini ja laminiini saatiin BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Ensisijainen vasta-aineita β-aktiini hankittiin Sigma, St. Louis, MO. Kaikki sekundaariset vasta-aineet on saatu BioRad (Hercules, CA). Alexa Fluor555-leimattu phalloidin ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Osteopontiinin (Bone sialoproteiinia), osteonektiini (SPARC) ja vitronektiinissä ostettiin R 14-3-3 E5K, L12AE on Q12QR, Y82Q, K85N, ja E87Q), CA -Rac1 (Rac1-L

61), ja DN-Rac1 (Rac1-N

17) konstrukteja, vastaavasti, tai yhdistelmiä WT-14-3-3ζ DN-Rac1 (Rac1-N

17) rakentaa ja DM-14-3-3ζ CA-Rac1 (Rac1-L

61) käyttäen Lipofectamine 2000 Invitrogen (Carlsbad, CA) transfektioreagenssi mukaan valmistajan protokollaa. Proteiini 14-3-3 konstruktioita, alun perin tuotettu Joseph Avruch lab, Massachusetts General Hospital, Boston saatiin Addgene, Cambridge, MA. Ohjaus solut transfektoitiin väliaikaisesti tyhjällä vektorilla pBabe-puromysiini. Noin 70-80% transfektiotehokkuuden saatiin.

Rac1 aktivointi Pitoisuus

Rac1 aktiivisuus mitattiin käyttämällä Ras aktiivisuus määritys -kittiä Cytoskeleton (Denver, CO) valmistajan protokollan. Lyhyesti, PBD domeenin PAK fuusioitu glutationi

S

-transferase (GST) ja konjugoidut glutationi-Sepharose 4B sekoitettiin 1 mg: n koko proteiinia lysaatti PC3-soluja transfektoitiin väliaikaisesti WT-14- 3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 tai DN-Rac1 plasmideja tai yhdistelmiä CA-14-3-3ζ kanssa DN-Rac1 ja DM-14-3-3ζ CA-Rac1, jota seuraa inkubointi 4 ° C: ssa 1 h. Helmet otettiin talteen sentrifugoimalla ja pestiin kolme kertaa pesupuskurilla 1X Complete-proteaasi-inhibiittorit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) ja kaksi kertaa 1X PBS: llä. Proteiinit eluoitiin keittämällä helmiä 2X Laemmli-näytepuskurissa (BioRad, Hercules, CA) 5 minuutin ajan, erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja blotattiin Rac1 vasta-aineilla.

trypaanisineä elinkelpoisuusarviointi

Solut kasvatettiin konfluenssiin DMEM, jossa oli 10% FBS: ää. Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

3 solua /100 ui DMEM: ssä ja annettiin kiinnittyä yön yli. Tämän jälkeen solut transfektoitiin vastaavien plasmidit ja viljeltiin 48 tuntia. Soluja viljeltiin sitten vielä 24 h seerumittomassa olosuhteissa. Sitten solut otettiin talteen trypsinoimalla, värjättiin trypaanisinisellä liuos (0,04% w /v, Invitrogen, Carlsbad, CA), ja laskettiin käyttäen hemosytometria. Yhteensä solut ja trypaanisininen-värjätty (eli käyttökelvottomaksi) solut laskettiin, ja prosenttiosuus käyttökelvottomaksi solujen laskettiin.

proliferaatiomääritystä

leviämisen PC3 solulinjoissa määritettiin käyttäen ei-radioaktiivista BrdU-pohjainen soluproleferaatiomäärityksessä (Roche Applied Science), mukaisesti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, transfektoidut PC3-solut maljattiin 96-kuoppaisille tasapohjaisille levyille tiheydellä 5 x 10

3 solua 100 ui, ja annettiin kasvaa 48 tuntia. Soluja viljeltiin sitten vielä 24 h seerumittomassa olosuhteissa. PC3 Sitten solut altistettiin 5-bromi-2-deoksiuridiini määritys käyttämällä BrdU Labeling ja Detection Kit III (Roche Applied Science), mukaisesti valmistajan protokollaa. BrdU-DNA: han määritettiin mittaamalla absorbanssi sekä 450 ja 690 nm: ssä ELISA-levyn lukijalla. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D.

Colony muodostumisen määritys

Pesäkkeenmuodostusta määritys suoritettiin käyttäen protokollaa [36].