Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tavoitteena tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida syövänvastainen aktiivisuus Noskapiini (nro) ja Gemsitabiini (Gem) yhdistelmä (NGC) vastaan ​​ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja valaista taustalla vaikutusmekanismi.

Methods

Isobolographic menetelmä käytettiin laskemiseen yhdistelmäindeksiä arvot sytotoksisuustiedot. In vitro antiangiogeenistä ja apoptoottista aktiivisuutta nro, Gem ja NGC arvioitiin. In vivo tutkimuksissa, naispuolinen kateenkorvattomien nu /nu hiirille ksenosiirrettyjä kanssa H460 kasvaimia ja tehoa nro, Gem tai NGC määritettiin. Proteiini ilmaisuja immunohistokemiallisella värjäyksellä arvioitiin korjattu tuumorikudoksissa.

Tulokset

CI-arvot ( 0,59) olivat viittaavia synergistisen käyttäytymisen välillä nro ja Gem. NGC hoito osoitti merkitsevästi esti putken muodostumiseen ja lisäsi prosenttiosuutta apoptoottisten solujen. NGC, Gem ja nro hoito vähensi kasvainten tilavuuden mukaan 82,9 ± 4,5 prosenttia, 39,4 ± 5,8 prosenttia ja 34,2 ± 5,7 prosenttia vastaavasti. Erityisesti NGC hoito vähentynyt ilmentyminen solujen selviytymistä proteiinit; VEGF, CD31 värjäys ja mikroverisuonitiheys ja tehostettu DNA: n fragmentoituminen ja halkaistut kaspaasi 3 tasoa verrattuna monoterapialla käsiteltyjen ja kontrolliryhmien.

Johtopäätös

Nos voimisti syövän vastaisen aktiivisuuden Gem lisäaineen synergistiseen tavalla vastaan ​​keuhkosyöpä kautta antiangiogeenistä ja apoptoottisia reittejä. Nämä havainnot viittaavat siihen mahdollinen hyöty käyttää NGC kemoterapiaa keuhkosyöpään.

Citation: Chougule MB, Patel A, Sachdeva P, Jackson T, Singh M (2011) Enhanced Syövän aktiivisuus Gemsitabiini yhdistelmähoidossa Noskapiini kautta antiangiogeenistä ja Apoptotic Pathway vastaan ​​ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 6 (11): e27394. doi: 10,1371 /journal.pone.0027394

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 elokuu 2011; Hyväksytty 16. lokakuuta 2011; Julkaistu: 15 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Chougule et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki on jonkin tutkimuskeskusten Minority toimielimissä (RCMI) palkinto (G12RR03020-11) ja National Institute of General Medical Sciences /Vähem- Biomedical Research Support (NIGMS /MBRs) palkinto (5S06GM008111-36) National Institutes of Health (NIH ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien. Suurin osa potilaista on diagnosoitu keuhkosyöpä läsnä paikallisesti edennyt tai etäpesäkkeitä [1], [2]. Yli 85 prosenttia potilaista keuhkosyöpä on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Suurin osa vasta diagnosoitu NSCLC potilailla esiintyy tauti kuulu kirurgisesti ovat huonot ja riippuu systeemistä kemoterapiaa parantamaan niiden tulokset [3], [4]. Platinum perustuu yhdistelmä hoito ovat ensilinjan hoitovaihtoehto hoidossa NSCLC mutta niiden kliininen hyödyllisyys on rajoitettu johtuen merkittäviä toksisuuksia [4], [5]. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet kemoterapian vasteet NSCLC pysyvät 50 prosenttia ja kolmannes potilaista vaiheen IV tauti on 2 vuoden pysyvyys 20 prosenttia [3]. Perustaminen optimaalinen hoito-yhdistelmähoidot nykyisin käytössä ja kehitettävä uusia lääkkeitä on tärkeä askel saavuttaa korkeampi vaste ja elinajan pitenemiseen [6]. Tämän ongelman, huomio on keskittynyt löytämään uusia syöpälääkkeiden, joka toimittaa vastaava tai parempi eloonjääminen saavutettua platinalla hoito, mutta vähemmän myrkyllisyyttä. Gemsitabiini (Gem) on pyrimidiininukleosidi antimetaboliittina aine, joka tehoaa ihmisen erilaisten maligniteettien, mukaan lukien NSCLC puoltavine toksisuusprofiili [6], [7]. Useat tutkijat ovat tutkineet yhdistelmä Gem ja sisplatiinin, topotekaani, proteaasinestäjät, ja ginsenoside Rg3 hoitoon keuhkosyövän [8], [9], [10], [11], [12] ja ilmoitti tehostetun syöpää ehkäisevistä vaikutuksista [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [12], [13].

syövän vastaista aktiivisuutta mikrotubulusten-häiritseviä aineita, taksaanit ja vinka-alkaloidit on hyvin tutkittu [14]. Kuitenkin kliininen hyöty taksaanien on rajoitettu, koska lääkeaineen vastustuskykyyn, tarve laskimoon (i.v.) infuusiona pitkän ajan kuluessa ja siihen liittyvien toksisuuksien [15], [16]. Tämä on saanut haun mikrotubulusten kohdistaminen aine, joka voidaan antaa suun kautta, näyttää suotuisan toksisuusprofiilit ja niillä on paremmat terapeuttiset indeksit. Nos vaimentaa mikrotubulusdynamiikan juuri tarpeeksi aktivoida mitoottisiin tarkastuspisteiden pysäyttää solusyklin [17], [18] ja osoittivat antiproliferatiivista aktiivisuutta erilaisia ​​syöpäsolujen kuten monet lääkeresistentti varianttien ajan välttäen normaaleihin soluihin [18], [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Lisäksi nro osoitti myös vähän tai ei lainkaan myrkyllisyyttä normaalille elinten ja ei inhiboinut ensisijainen humoraalisia immuunivasteita hiirissä [19], [20]. Meidän aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että suun kautta nro osoittivat merkittävää syövän vastaista aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla vastaan ​​H460 keuhkojen tuumoriksenografteja [24]. Landen et ai. osoittivat, että ei ollut merkittävää parannusta syövän vastaisen aktiivisuuden nro yhdistettynä paklitakseliin [19] mahdollisesti kilpailun vuoksi saman tavoitteen. Käyttö Nos yhdistelmänä vinkristiinin synergistinen antituumorivaikutukset leukemiasoluissa in vitro [27]. Kuitenkin syövän vastaisen potentiaalia Nos yhdessä erilaisten syöpälääkkeiden hoidossa keuhkosyövän ei ole systemaattisesti tutkittu. Sekä Nos ja Gem on eri toimintamekanismi ja nro ja Gem yhdistelmä (NGC) voi johtaa mahdolliset synergistiset antituumorivaikutuksia keuhkosyöpään.

Perustuen kunkin aktiivisuus näiden aineiden ja niiden erilliset toimintamekanismeja, me hypoteesi, että NGC saattaa lisätä synergistiseen sytotoksisia vaikutuksia ihmisen keuhkosyövän soluja

in vitro

ja

in vivo

mahdollisesti hajoaminen spesifisyys proteiineja, parantaa antiangiogeeninen ja apoptoottista aktiivisuutta. Nykyisessä tutkimuksessa arvioimme syövän vastaista aktiivisuutta NGC hoidon vastaan ​​NSCLC-solujen in vitro ja in vivo H460 hiiren ksenografti keuhkojen kasvain malli, jota ei ole aikaisemmin raportoitu. Tavoitteet tässä tutkimuksessa olivat (a) tutkia syövän vastaisen aktiivisuuden yhdistelmä välillä nro ja Gem vastaan ​​NSCLC soluja, ja (b) arvioida antituumorivaikutus NGC hiirissä, jotka kantoivat H460 ksenografti keuhkokasvaimia ja selventämään taustalla vaikutusmekanismi.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Noskapiini ja Gemsitabiini ostettiin Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA ja Spectrum Chemicals USA vastaavasti. Ihmisen H460 ja A549-NSCLC-solut saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Kaikki muut kemikaalit olivat joko reagenssin tai kudosviljelmän. H460 ja A549-soluja kasvatettiin RPMI 1640 väliaineessa ja F12K väliaineessa (Sigma, St. Louis, MO, USA), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumia vastaavasti. Kaikki soluviljelyelatusaineella sisälsi antibiootti antimykoottiliuoksella penisilliini (5000 U /ml), streptomysiiniä (0,1 mg /ml), neomysiiniä (0,2 mg /ml). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5 prosenttia CO

2 ilmassa.

Eläimet

nainen Nu /Nu-hiiriä (kuusi viikkoa vanha, Harlan, Indianapolis, IN ) ryhmiteltiin ja majoitettu (8 /häkki) steriiliin mikroisolaattorihäkkeihin altaaseenpanoilmoitukseen yksikkö toimitetaan HÖYRYKARKAISTUT Tek-Fresh vuodevaatteet. Eläimiä pidettiin Florida A ja M University mukaisesti standardien

oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals

ja Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care. Tämä tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt Florida A ja M University (FAMU) Animal Care ja Käytä komitea (AUCU) elokuussa 2009. (Protocol # 002-09).

In vitro

sytotoksisuuden tutkimuksissa

A549 tai H460-solut maljattiin 96-kuoppaisille mikro- tiitterilevyiltä, ​​tiheydellä 1 x 10

4 solua /kaivo, ja sen annettiin inkuboitua yön yli. Soluja käsiteltiin eri laimennosten kanssa Gem läsnä tai poissa nro 10-30 ja 30-50 uM vastaan ​​H460- ja A549-soluissa. Levyjä inkuboitiin 72 tunnin ajan 37 ± 0,2 ° C: ssa inkubaattorissa. Solujen elinkelpoisuus kummassakin hoitoryhmässä määritettiin kristalliviolettimäärityksellä väriaineen määrityksessä.

Apoptoosin H460 ja A549-soluja

H460 tai A549-solut maljattiin tiheyteen 1 x 10

6 solua /kuoppa 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin yön yli. H460-soluja käsiteltiin Gem (0,4 ug /ml), tai o (30 uM), tai NGC ja A549-soluja käsiteltiin Gem (0,3 ug /ml), tai o (50 uM), tai NGC. 72 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja kiinnitettiin dioja käyttäen Cytospin R (Shandon) ja käsitellään kohti ApoTag Red In situ Apoptosis havaitseminen pakki R (Chemicon R International, CA, USA) protokollan. Kuvat dioja visualisoitiin Olympus BX40 fluoresenssimikroskoopilla. Määrällisesti apoptoottisia soluja, 100 solua 6 random mikroskooppikentäs- laskettiin.

esto-putken muodostumiseen HUVEC-solujen

in vitro

antiangiogeenisesti vaikutukset nro ja Gem analysoitiin käyttämällä

In vitro

angiogeneesimääritys Kit (Millipore, Billerica, MA, USA). Lyhyesti, HUVEC-soluja viljeltiin, kun läsnä tai poissa ollessa 30 uM nro, 0,4 ug /ml Gem ja NGC on polymeroidun Matrigel 37 ° C: ssa. Standard Matrigel annettiin polymeroitua 96-kuoppalevylle ja HUVEC-solut ympättiin tiheydellä 3 x 10

4 kuoppaa kohti ECM väliaineessa. 6 tunnin kuluttua putken muodostumiseen endoteelisolujen arvioitiin ja valokuvattiin. Kvantifiointi etenemisen angiogeneesin toteutettiin laskemalla kapillaariputki haarapisteet muodostivat jälkeen tietyn ajan (päätepisteen määritys). Branch pistettä useissa random view-kentät (3-10) kuoppaa kohti tulisi laskea ja laskea tulosten keskiarvo.

In vivo

antituumorivaikutusta NOS vastaan ​​H460 keuhkokasvaimia

kiinnittyneet H460-solut otettiin talteen ja sentrifugoitiin 500 g: ssä 4 min 4 ° C: ssa, ja solupelletti suspendoitiin uudelleen. Solut laimennettiin 3 x 10

6 solua /100 ui käyttämällä kasvualustaa. 100 ui solususpensiota injektoitiin subkutaanisesti oikeaan kylkeen alueella kunkin hiiren. Protokolla

in vivo

kokeiluja nude-hiirissä hyväksyttiin eläinten hoidon ja käytön komitea, Florida A ja M University, Tallahassee, FL. Hiiret satunnaistettiin (n = 8), sen jälkeen, kun 50 mm

3 tuumoriksenograftien (7 päivää kasvaimen istutuksen) ja käsiteltiin i) 160 ui vehikkeliä (fosfaattipuskuri, pH 3,5); ii) Gem (30 mg /kg i.v. bolus, Q3D × 7 aikataulu); iii) o 300 mg /kg vuorokaudessa suun kautta letkuruokinnalla; ja iv) NGC terapiaa 38 päivän jälkeinen kasvaimen istutuksen

. Noskapiini liuotettiin fosfaattipuskuriin, pH 3,5 ja Gemsitabiini liuotettiin suolaliuokseen fosfaattipuskuriin ennen antoa hiirille. Voit tarkistaa myrkytysoireiden, eläimet punnittiin kahdesti viikossa. Kasvaimen mitat mitattiin käyttäen lineaarista paksuus ja kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa yhtälöä: (1), jossa,

v = kasvaimen tilavuus

a = suurin halkaisija kasvaimen

b = pienin halkaisija kasvaimen

päivänä 38 kaikki eläimet uhrattiin poistamisen jälkeen kasvaimen kudokset; jotkut kasvaimet kiinnitettiin formaliiniin, kun taas toiset jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja varastoidaan -80 ° C: ssa.

Western-blottaus kasvainkudosnäytteet

proteiinit uutettiin kasvainkudoksen käyttäen RIPA puskuri proteaasinestäjä inkuboitiin 30 minuuttia jäillä ja supernatantit säilytettiin -80 ° C: ssa sentrifugoinnin jälkeen. Länsi blotting (WB), aiemmin perustettu menettely laboratoriossa käytettiin. [24], [28] Kalvot testattiin primaarisilla vasta-aineilla (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) SP1 (1:750), SP3 (1:750), VEGF (1:500), Pakt (1:500) , sykliini D1 (1:500), p53 (1:500), p21 (1:500),), PARP (1:1000), lohkaistaan ​​PARP (1:1000), pilkottiin kaspaasi 3 (1:1000), kaspaasi 8 (1:1000) ja kaspaasi 9 (1:1000), Bax (1:1000), Bcl

2 (1:1000), BID (1:500) ja β-aktiini vasta-aineita (1:500). Sitoutuneet vasta-aineet paljastettiin HRP konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1:2000) käyttäen SuperSignal West Pico kemiluminesenssi-liuosta (Pierce, Rockford, IL). Beeta-aktiini-proteiinia käytettiin latauskontrollina. Densitometriset analyysi bändejä suoritettiin käyttäen ohjelmaa ImageJ v1.33u.

TUNEL Pitoisuus, halkaistut kaspaasi 3 ilmaisun ja VEGFexpression

TUNEL, halkaistut kaspaasi-3: n ja VEGF värjäytymistä parafiini- upotettu kasvainkudoksista osat arvioitiin käyttäen DeadEndTM Kolorimetrinen Apoptosis Detection System (Promega, Madison, WI), pilkottiin kaspaasi-3-värjäykseen tarkoitettua reagenssipakkausta (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ja ImmunoCruz ™ ABC värjäys System (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), vastaavasti, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Kasvainkudossektioista (4-5 pm paksu) asennettuna poly-L-lysiinillä päällystettyihin dia poistettiin parafiini, jonka ksyleeniin ja dehydratoitiin kautta arvostellaan pitoisuudet alkoholin, inkuboidaan sitten 3 prosenttia vetyperoksidaasin 20 min endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi toimintaa. Antigeenin haku värjäystä ja estäminen endogeenisen peroksidaasin suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Näytteitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa 1:50 laimennoksella primaarisen vasta-aineen inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen ja sen jälkeen streptavidiini. Väri kehitettiin saattamalla peroksidaasi alustaan-kromogeenina, joka muodostaa ruskea reaktiotuote. Sitten leikkeitä vastavärjättiin hematoksyliinillä. Kolme dioja ryhmää kohti värjättiin ja TUNLE, halkaistut kaspaasi 3 värjätyt solut tunnistettiin tummanruskea sytoplasman värjäytymistä. VEGF värjätyt solut tunnistettiin ruskea värjäystä. Kuvat dioja visualisoitiin Olympus BX40 valomikroskoopilla.

CD31 Expression ja arviointi mikroverisuonitiheys

CD31 ilmaisu pesun jälkeen PBS: llä, leikkeet esikäsitelty sitraattipuskurissa on mikroaaltouuni 20 minuuttia 92-98 ° C: ssa. Kahden pesun jälkeen PBS: llä, näytteet inkuboitiin 10 prosenttia normaalia vuohen seerumia (Atlanta Biologicals, GA, USA) 20 minuutin vähentää epäspesifistä vasta-aineen sitoutumisen. Tämän jälkeen leikkeitä inkuboidaan sitten 1:500 laimennettua hiiren CD31 monoklonaalinen vasta-aine (Cell Signaling Tech, MA), joka on tunnustettu endoteelisolujen solupinnan, huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, jota seurasi 30 min käsittely HRP kani /hiiri (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Jaosto kehitettiin diaminobenzidene-vetyperoksidaasin alustaan, ja kevyesti vastavärjättiin hematoksyliinillä. Laskea mikroverisuonitiheys (MVD), kolmen parhaiten verisuonia alueilla kasvain ( ”hot spots”) valittiin ja keskiarvot saadaan laskemalla alusten. Yksi pienten suonten määriteltiin diskreetti klusterin positiivisten solujen CD31-värjäys, jossa ei vaadita, kun läsnä on ontelon. Pienten suonten määrä suoritettiin X400 (X40 objektiivilinssin ja X10 silmän linssi; 0,74 mm

2 per kenttä).

Tilastot

Yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutesti suoritettiin määrittää merkityksen eroja ryhmien käyttäen GraphPad PRISM 3.0-ohjelmisto (sandiego, CA). Eroja pidettiin merkittävinä kaikissa kokeissa

P

0,01 (*, poikkeavat merkittävästi käsittelemättömiä kontrolleja;

**, poikkeavat merkittävästi nro ja Gem yhden hoitoja.

Tulokset

Tehostemateriaalit

in vitro

sytotoksisuus NGC hoidon

in vitro sytotoksisuus tutkimukset nro vastaan ​​H460- ja A549-solut osoittivat IC

50-arvot 34,7 ± 2,5 uM ja 61,25 ± 5.6 uM. Gem osoittivat IC

50 0,7 ± 0,1 mikrog /ml ja 0,6 ± 0,2 mikrog /ml vastaan ​​H460- ja A459 NSCLC soluja. Yhdistetyt vaikutukset Gem ja nro soluproliferaatioon arvioitiin isobolographic analyysi. CI arvot vaihtelivat 0,34 ± +0,02-,59 ± 0,04 50 prosenttia solun tappaa viittaa synergistiseen voimakkaan synergistisen käyttäytymisen välillä nro ja Gem vastaan ​​molemmat NSCLC solulinjoja (kuvio 1A). isobologrammit varten 50% vaikutus, osoitettava, että IC

50 -equivalent pitoisuudet eri nro /Gem yhdistelmien alapuolella linjan additiivisuuteen, mikä osoittaa synergistisen activityof nro ja Gem yhdistelmä (Fig. 1B). Erottaminen pistettä isobologram- oli yhteneväinen Cl-arvot.

Eri pitoisuuksia nro käytettiin tutkimaan vaikutusta IC50 Gem. Muuttuvat suhteet lääkeainepitoisuuksien ja keskenään ei-yksinomaisen yhtälöitä käytettiin määrittämään CI. Cl-arvot edustavat keskiarvoa neljästä kokeesta. CI 1,3: vihamielisyys; CI 1,1-1,3: kohtalainen vihamielisyys; CI 0,9-1,1: lisävaikutus; CI 0,8-0,9: lievää synergiaa; CI 0,6-0,8: kohtalainen synergiaa; CI 0,4-0,6: synergiaa; CI 0,2-0,4: epätehokkaalla.

antiangiogeeninen vaikutus-putken muodostumiseen määrityksessä

o (30 uM), Gem (0,3 ug /ml) ja 30 uM: o + 0,3 ug /ml Gem hoito 6 tuntia oli huono organizationof HUVEC putkimaisia ​​rakenteita ja lasku kapillaariputki haarapiste muodostelmia (Fig. 2A) verrattuna ohjata ryhmää, joka osoitti rikas meshwork haaroittumisaste anastomosing kapillaarimaisen tubulukset multisentrinen liittymissä (Fig. 2). NGC hoito laski muotoilussa keskimäärin haarautumisen pisteen 68 ± 5 prosenttia verrattuna 26 ± 3 prosenttia vuoteen nro yksin ja 29 ± 4 prosenttia Gem yksinään (Fig. 2B).

putken muodostumiseen määritystä, HUVEC-soluja inkuboitiin nro (30 uM), Gem (0,4 ug /ml) ja NGC on polymeroiduista Matrigelillä 37 ° C: ssa. 6 tunnin kuluttua putken muodostumiseen endoteelisolujen kuvattiin ja kapillaariputki haarautumiskohdan muodostuminen kvantitoitiin (n = 3). Tunel määritystä, H460-soluja käsiteltiin Gem 0,4 ug /ml, nro 30 uM, ja NGC ja A549-soluja käsiteltiin Gem 0,3 ug /ml, nro 50 uM, ja NGC. Kontrollisolut olivat käsittelemättömiä. Micron bar = 10 um. Solut kvantitoitiin laskemalla 100 solua 6 satunnainen mikroskooppikentäs-. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona + SD (n = 6).

Apoptoosin H460 ja A549-soluja

Kuva. 2C osoittaa apoptoosin indusoituu H460- ja A549-soluja käsittelyn jälkeen Gem tai nrot tai NGC. NGC hoito johti apoptoosin 59 ± 4 prosenttia käsiteltyjen H460 soluja verrattuna 27 ± 3 prosenttia ja 20 ± 2 prosenttia Gem ja nro vastaavasti jälkeen 72 tunnin (kuvio 2D ja 2E). Samoin NGC hoito A549-solut johti 67 ± 5,0 prosenttia apoptoottisia soluja verrattuna 32 ± 2,0 prosenttia ja 20 ± 3,0 prosenttia Gem ja nro vastaavasti (kuvio 2D ja 2E). Kaikki hoidot olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin kontrolli (* P 0,01). Gem tai Nos hoito oli merkittävästi erilainen kuin NGC kohtelu (**, P 0,001).

Anti-kasvain aktiivisuuden NGC H460 ksenografteissa

Tulokset (Fig. 3) osoittavat, että kasvain laski merkittävästi hoidon jälkeen Gem, nro tai NGC verrattuna kontrolliin. Kasvaimen tilavuus varten NGC hoitoon keskimäärin 418,74 ± 55,53 mm

3 verrattuna 1605,08 ± 253,29 mm

3 nro hoitoon tai 1498,33 ± 149,38 mm

3 Gem hoitoon (kasvaimen tilavuuden ± SE) päivänä 38 post kasvaimen istutuksen. Lisäksi emme noudata mitään laihtuminen tai muita merkkejä myrkyllisyydestä hiirillä käsitelty NGC tai nrot tai Gem.

Hiiriä hoidettiin Gem 30 mg /kg i.v. bolus, Q3D × 7 aikataulu, nro 300 mg /kg /vrk, ja NGC. Kontrolliryhmä sai ainoastaan ​​ajoneuvon. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ja SE (n = 8). Tämä koe toistettiin kahdesti.

Vaikutukset spesifisyys proteiineja, angiogeeninen ja apoptoottisten proteiinien H460 ksenografti- keuhkokasvaimia

NGC ja Gem vähentynyt ilmentyminen SP1 ja SP3 korjatun kasvaimissa verrattuna kontrollihiiret (kuvio 4). NGC hoito vähentynyttä ilmentymistä VEGF-proteiinin ilmentymisen 0,26-kertainen verrattuna 0,12-kertaisesti nro ja 0,13-kertaiseksi Gem hoitoon, vastaavasti valvonnan taantuneet kasvaimissa (kuvio 4). Surviviinin ilmentymiseen proteiinin väheni merkittävästi 0,67-kertaiseksi, 0,29-kertainen ja 0,37 kertaisesti NGC, Gem ja nro hoitoon verrattuna kontrolliin vastaavasti ryhmä (kuvio 4). NGC osoitti merkittävää vähenemistä ilmentymisessä Pakt verrattuna kontrolliryhmään. Vuonna taantunut kasvaimia, NGC ja Gem merkittävästi vähentynyt sykliini D1 lauseke 0,39, 0,20, ja 0,15-kertaiseksi hallintalaitteiden (kuva 4). Nos, Gem ja NGC hoito lisäsi merkittävästi p53 lauseke 1.2, 1.3 ja 1.6-kertaisesti taantuneet kasvain näytteissä verrattuna ohjata vastaavasti. (Kuvio 4) Expression of p21 kasvoi merkittävästi 1,31-kertaisesti NGC hoitoon verrattuna 1,15 ja 1,13-kertaisesti nro ja Gem hoito vastaavasti (kuvio 4). Tulokset on esitetty kuviossa 5 osoittavat, että numeroa, Gem ja NGC hoito osoitti merkittävää voimistunutta ilmentymistä pilkkoa PARP, Bax, BID, kaspaasi 3, pilkotaan kaspaasi 3, kaspaasi 8 ja kaspaasi 9, ja vähentynyt ilmentyminen PARP ja Bcl

2 verrattuna hallita ryhmään. Ilmentymisen apoptoottisten ja antiapoptoottisten proteiinien NGC hoito oli merkittävästi erilainen kuin yhden aineen ryhmissä.

Kaista 1, käsittelemätön kontrolli kasvaimet; kaista 2, suullinen nro 300 mg /kg; kaista 3, Gem 30 mg /kg i.v. bolus, Q3D × 7 aikataulu; kaista 4; NGC. p-aktiini proteiini toimii latauskontrollina. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin rinnakkaisessa kokeessa. Proteiinin ekspressiotasoja (suhteessa p-aktiini) määritettiin. Keskiarvo ± SE kolmelle jäljitellä määrityksen.

Kaista 1, käsittelemätön kontrolli kasvaimet; kaista 2, suullinen nro 300 mg /kg; kaista 3, Gem 30 mg /kg i.v. bolus, Q3D × 7 aikataulu; kaista 4; NGC. p-aktiini proteiini toimii latauskontrollina. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin jäljitellä kokeissa. Proteiinin ekspressiotasoja (suhteessa p-aktiini) määritettiin. Keskiarvo ± SE kolmelle jäljitellä määrityksen.

DNA: n fragmentoituminen ja pilkotaan kaspaasi-3 ilmentyminen kasvainkudoksessa

Single-aineella joko Nos tai Gem aiheuttama DNA: n fragmentoituminen, joka oli edelleen merkitsevästi (** P 0,001) kasvoi NGC hoitoa. NGC hoito johti apoptoosin 80 ± 5,0 (** P 0,01) prosenttia kasvaimen soluja, kun taas nro ja Gem indusoi apoptoosia 34 ± 3,0 prosenttia ja 42 ± 4,0 prosenttia kasvainsolujen vastaavasti (Fig. 6). Gem, nro, ja NGC aiheuttama pilkotun kaspaasi-3 ilmentyminen kasvaimissa joka oli merkittävästi erilainen verrattuna hallita kasvaimia. NGC, Gem ja nro käsittely osoitti 62 ± 4,0, 34 ± 2,0, ja 26 ± 2,0 prosenttia lisääntyneen ilmentymisen katkaistun kaspaasi 3 kasvainten kudokset vastaavasti verrattuna kontrolliin ryhmään (Fig. 6).

Tiedot ilmaistaan keskiarvo + SD (n = 6).

angiogeneesin esto ja MVD kasvainkudoksessa

korkein VEGF: n ilmentymistä havaittiin kasvaimen kudokset kerättiin käsittelemättömiin hiiriin (Fig. 6 ). Vähentynyt VEGF värjäytyminen havaittiin kasvaimia, käsiteltiin NGC (0,28-kertainen) verrattuna kasvaimia käsiteltiin Gem (0,15-kertainen) tai o (0,1-kertainen) yksinään. Tämä vaste oli hyvin korreloi down-regulation of VEGF-proteiinin havaittiin kasvaimen lysaateissa käsiteltyjen hiirien samoja yhdisteitä (Fig. 4). CD31 (+) endoteelisolujen tunnistettiin käyttäen IHC tekniikkaa korjattu kasvainkudoksissa, ja tulokset on esitetty kuviossa. 6. värjäytyminen pienten verisuonten NGC, Gem ja nro käsitelty ryhmät olivat merkitsevästi laskenut 0,21, 0,08, ja 0,06-kertainen verrattuna kontrolliryhmään. Keskimääräinen pienten suonten kohden kenttä ryhmissä hoidettu nro, Gem ja NGC todettiin olevan 148,7 ± 18,6, 135,3 ± 17,5 ja 91,8 6,1 vastaavasti verrattuna 197,7 ± 22,4 kontrolliryhmässä.

Keskustelu

Huono kliininen tulos nykyisen kemoterapiaa edellyttää uudempien terapeuttista hoitostratetioigksi NSCLC [1], [3], [4]. Kehittäminen voimakas nonplatinum perustuu yhdistelmä kemoterapiaa vähemmillä haitallisia sivuvaikutuksia auttavat parantamaan kliinisen tuloksen joukossa keuhkosyöpäpotilaita [3], [4], [5]. Käyttö lupaava anti-mikrotubulusverkoston aineita on rajoitettu johtuen lääkeresistenssideterminantit, pitkittynyt i.v. infuusio ja syntyviä haitallisia sivuvaikutuksia [15], [16]. Nos on turvallisempi oraalisesti aktiivinen mikrotubulusten agentti [19], [20], [23] ja on näytteillä in vitro ja in vivo antituumoriaktiivisuus erilaisia ​​syöpiä [19], [20], [21], [22] , [23]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että nro näytteillä syövän vastaista aktiivisuutta hiiren H460 ksenograftimallia ilman haitallisia sivuvaikutuksia [24]. Helmi on yksi tehokkaimmista aineina keuhkosyöpä, joka estää DNA-synteesiä ja ribonukleotidireduktaasin [6], [7]. Siten on odotettavissa, että NGC kemoterapia voi käyttää additiivinen tai synergistinen syövän vastaista aktiivisuutta ja on alhaisempi haitallisia sivuvaikutuksia johtuvat pienemmällä annoksella vaatimus Gem.

Voimakkaasti kasvava H460- ja hitaasti kasvavia A549-soluja [28] valittiin varmistua toiminnan nro ja Gem yhdistelmä alemmilla IC

50 pitoisuuksia käyttäen yleisesti käytetty isobolographic menetelmä [28], [29], [30]. Tässä tutkimuksessa, isobolographic analyysi osoittivat, että nro tehostettu sytotoksisuutta Gem (CI-arvot 0,59) A549 ja H460 ihmisen NSCLC-solujen synergistinen tavalla (kuvio 1A). Synergistinen aktiivisuus havaittiin myös siinä isobologram-, jossa IC

50 yhtä pitoisuudet eri NGC sijaitsivat alle linjan additiivisuuteen (kuvio 1 B). Olemme äskettäin raportoitu, että CI-arvot 1,0 on osoitus synergististä välillä DIM-C-pPhC

6 H

5and Dosetakselia NSCLC soluissa [28].

selvää mahdollisista mekanismi, joka osallistuu tehostettua sytotoksisuutta Gem NOS, arvioimme HUVEC-putken muodostumiseen ja kasvainsolujen apoptoosin [31]. Newcomb et ai. kertoi, että Nos (0-150 uM) esti

in vitro

putki muodostumista 2H11 endoteelisoluissa [32]. Vastaavasti, Laquente et al osoittivat myös proliferaation inhibitio HUVEC-solujen Gem [33], ja näin ollen, olemme arvioineet antiangiogeenisen potentiaalia NGC. Ei ole ollut tutkimuksen toistaiseksi arvioida vaikutuksia GNC HUVEC-putken muodostumiseen. NGC osoittivat lineaarista rakenteiden verkoston olivat merkittävästi häirinneet verrattuna kerta aineella tai valvontaa. NGC näytteillä on synergistinen anti-angiogeenisen aktiivisuuden inhibitio-putken muodostumiseen verrattuna nro tai Gem yksinään (kuvio 2).

Apoptoosin on keskeinen mekanismeja syöpälääkkeiden ja merkittävän apoptoosin induktion, joka oli ilmeistä positiivinen TUNEL värjäys ja kromatiinin tiivistyminen NGC hoitoon verrattuna monoterapiana. Samanlaisia ​​tuloksemme, yhdistelmä hoito nro (150 mg /kg /päivä letkulla) ja

60Co säteily (single osa – 25 Gy) osoitti merkittävää (

P

0,01) lisääntyi TUNEL positiivinen GL261 solut verrattuna monoterapiana käsittelyä [33].

Todettuaan tehokkuuden NGC hoito

in vitro

, me seuraavaksi arvioitiin

in vivo

antituumorivaikutuksen tehosta NGC vuonna H460 ksenografti keuhkotuumoreista Nu /nu hiirille. Valitsimme terapeuttista annosta nro (300 mg /kg /dayand Gem (30 mg /kg iv bolus, iv bolus, Q3D × 7 aikataulu), joka perustuu aiempiin tutkimuksiin, jotka ovat osoittaneet annoksesta riippuvaista syövän vastaista aktiivisuutta (300 450 550 mg /kg /vrk) nro vastaan ​​H460 ksenografti hiirimallissa [24]. Meidän

in vivo

tulokset osoittavat lisäaine käyttäytymistä NGC hiiren H460 ksenograftin kasvainmuoto (kuvio 3A). Aiemmat raportoitu tutkimukset osoittivat, että syövän vastaisen aktiivisuus nro vaihtelee tyypistä ja herkkyydestä syöpäsolujen [19], [20], [21]. on mielenkiintoista, NGC hoito osoitti ei-merkittävää muutosta laihtuminen viittaa suotuisa toksisuusprofiili nro ja Gem. NGC hoito on edullista tavanomaisiin Gem + taksaania keuhkosyövän hoidossa johtuen parantuneesta potilaan mukautuminen antamalla suun kautta nro mahdollisimman vähän haitallisia sivuvaikutuksia. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että tehostettu kasvaimen kasvun estäminen voidaan saavuttaa yhdistämällä Gem muiden aineiden, kuten bortetsomibi [34] , Telomelysin [35], dihydroartemisiniini [36], paklitakseli [37], ja topotekaani [38] verrattuna yhteen aineella.

in vivo

lisäaine aktiivisuus NGC hoito voi johtua huonosta hyötyosuus ( 30%), lyhyempi puoliintumisaika plasmassa ( 4,5 h) ja ensikierron metabolia nro saatavuus pieneni Nos osoitteessa tuumoripaikkaan [39], [40], [41]. Tulevaisuuden tutkimukset keskitytään parantamaan hyötyosuuteen nrot tutkia sen syövän vastaisia ​​potentiaali yhdessä Gem.

Perustuu

in vitro

antiangiogeenistä ja apoptoottista aktiivisuutta olemme arvioineet ilmaisua Sp proteiinien, solujen eloonjäämistä, VEGF ja apoptoottisten proteiinien. Sp proteiinit ovat transkriptiotekijöitä, jotka ovat yli-ilmennetään monissa ihmisen kasvaimissa [42], [43]. Lou, et al. osoittaneet, että muutos fibroblastien johti kasvuun SP1 ilmentymiseen 8-18-kertaiseksi ja osoittivat muodostuminen erittäin pahanlaatuisten kasvainten atyymisissä ksenograftimalleissa [44]. Tällä hetkellä aika, osoitimme, että NGC hoito osoitti merkittävää (p 0,01) lasku ilmaus SP1 ja SP3 proteiineja verrattuna yhden aineella ja kontrolliryhmään. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että VEGF ilme on osittain riippuvainen Sp proteiineihin [45], ja siellä on myös näyttöä siitä, että surviviinin ilme on Sp riippuvainen [46]. Gem, nro ja NGC käsittely laski surviviinin ilmentymiseen keuhkoissa kasvaimissa (kuvio 4A ja 4B). Surviviini on jäsen apoptoosi-inhibiittori perhe, joka estää kaspaasi aktivaation ja toimii negatiivisena säätelijänä [46]. Näin ollen, alas-säätely surviviinin ilmentymisen tuloksia kaspaasien aktivaatio ja siten indusoi apoptoosia kasvainsoluissa. Havaitsimme myös, että NGC hoito laski merkitsevästi VEGF: n ilmentymistä (kuvio 4D) in taantuneet kasvaimissa verrattuna monoterapiana hoitoon. Samoin Papineni ym osoittaneet Tolfenaamihappo estää ruokatorven syöpä tukahduttaminen Sp proteiinien ja useita Sp riippuvaisten geenien ja proteiinien kuten VEGF surviviiniperäiset, sykliini D1 ja Bcl-2 [47]. Nos yksin ja NGC käsittely laski, VEGF: n ilmentymistä ja surviviinin, joka voi korreloida hajoamista SP1 ja SP3. Lisäksi meidän IHC Tulokset osoittavat, että NGC hoito laski VEGF ja CD 31 värjäytymistä tuumorikudoksissa korjattu hiiristä verrattuna monoterapialla hoitoa ja valvontaa (kuvio 6A). [48].