Krooninen sairaus

tiivistelmä

ADAM15 kuuluu perheen katalyyttisesti aktiivisen disintegriini- kalvo metalloproteinaasien, jotka toimivat molekyylitasolla signalointi kytkimet, irtoa kalvoon sitoutunut kasvutekijöitä ja /tai hajota ja inaktivoivat soluadheesiomolekyylien. Poikkeava metalloproteinaasi toiminta ADAM15 voi myötävaikuttaa taudin etenemiseen kautta vapauttamaan kasvutekijöiden tai häiriöitä soluadheesion. Tässä tutkimuksessa käytimme ihmisen virtsarakon syövän kudoksissa ja solulinjoissa arvioida ilmentymistä ja toimintaa ADAM15 etenemisessä ihmisen virtsarakon syöpä. Tutkiminen genomin ja transcriptome tietokantoja paljasti, että ADAM15 sijoittuu alkuun 5% of monistettujen geenien ja sen mRNA yliekspressoituvat merkittävästi invasiivisen ja metastaattisen virtsarakon syöpä verrattuna invasiivisen sairauden. Immunovärjäystä virtsarakon kasvainkudoksen array suunniteltu arvioimaan taudin etenemiseen paljasti lisääntynyt ADAM15 immunoreaktiivisuus lisääntymiseen liittyvien syöpään vaiheessa ja eläintutkimuksissa merkitsevästi voimakkaampaa värjäytymistä metastaattisen näytteissä. Noin puolet invasiivisia kasvaimia ja suurin osa metastaattisen tapauksista esiintyi voimakasta ADAM15 värjäystä indeksi, vaikka kaikki huono laatu ja noninvasive tapaukset osoittivat negatiivinen tai heikko värjäystä. Knockdovvn ADAM15 mRNA ilmaisun estivät merkittävästi virtsarakon kasvain solujen vaeltamiseen ja vähensi invasiivisen kapasiteettia virtsarakon kasvainsolujen kautta matrigeelin

TM ja yksikerroksiset verisuonten endoteelin. Knockdovvn ADAM15 ihmisellä ksenograftimallia virtsarakon syövän esti kasvaimen kasvua 45% verrattuna kontrolleihin. Rakenteelliset mallintaminen katalyyttisen domeenin johti suunnittelun uusi ADAM15 erityisiä sulfonamidi estäjä, joka osoitti bioaktiivisuuden ja vähensi elinkelpoisuutta virtsarakon syövän solujen

in vitro

ja ihmisen virtsarakon syövän ksenograftien. Yhdessä tulokset paljasti undescribed roolia ADAM15 vuonna hyökkäystä ihmisen virtsarakon syövän ja ehdotti, että ADAM15 katalyyttinen domeeni voi elinkelpoisen terapeuttinen kohde potilailla, joilla on pitkälle edennyt tauti.

Citation: Lorenzatti Hiles G, Bucheit A, Rubin JR, Hayward A, Cates aL, Day KC, et al. (2016) ADAM15 liittyy toiminnallisesti metastaattista Progression of Human virtsarakon syövän. PLoS ONE 11 (3): e0150138. doi: 10,1371 /journal.pone.0150138

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 09 helmikuu 2016; Julkaistu: 01 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Lorenzatti Hiles et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee osittain R01CA154252 (MLD), University of Michigan Cancer Centerin Support Grant (P30 CA46592) ja virtsarakon tutkimukseen varoja antelias avunantajien yliopiston Michigan urologian osasto. Tätä työtä myös tukee osittain Euroopan egyptiläinen Pharmaceutical Industries. GLH tukee UL1TR000433 (Postdoctoral Translational Scholars Program, Michigan Institute for Clinical and Health Research) ja University of Michigan. Rahoittajan EEPI antoi tukea muodossa konsulttipalkkiot tekijöille [MLD ja LE], mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja laatijat käsikirjoituksen ovat seuraavat kilpailevia intressejä: MLD on maksettu konsultti Euroopan Egyptian Pharmaceuticals, Alexandria, Egypti. Kirjoittajat myös ilmoittavat, että tämä tuki EEPI ei muuta niiden noudattamista PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Lyhenteet: ADAM A disintegriini- ja Metalloproteinase; DMEM Dulbeccon Modified Eagle Medium; EGF, epidermaalinen kasvutekijä; EGFR, epidermaalisen kasvutekijän reseptori; FBS, naudan sikiön seerumia; FRET, fluoresenssiresonanssienergiansiirto siirto; GAPDH, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi; GPCR, G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori; HB-EGF, Heparin sitova epidermaalisen kasvutekijän; HUV-EC-C, ihmisen napalaskimon endoteelisoluja; MTS, 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsoliumin; OD, optinen tiheys; PBS, fosfaattipuskuroitu suolaliuos; PMS, fenatsiinimetosulfaattia; RFLP, fragmentti pituus polymorfismi; SCID, Severe Combined Immunodeficiency; SD, keskihajonta; sE-cad, liukoisen E-kadheriinin; SEM, Standard keskivirhe; shRNA, lyhyt hiusneula-RNA; TBST, Tris-puskuroitua suolaliuosta plus Tween; TEM, Trans-Endoteliumin Migration; TGFa, Transforming Growth Factor Alpha; TGFli, transformoivan kasvutekijän beta

Johdanto

Virtsarakon syöpä on neljänneksi yleisin syy syövän, ja kahdeksas yleisin syy syövän kuoleman miehillä. Arviolta 74000 miehiä ja naisia ​​on diagnosoitu ja 16000 ihmistä kuolee virtsarakon syövän vuoden 2015 loppuun mennessä [1]. Vaikka suurin osa virtsarakon syöpien läsnä noninvasive alkuvaiheen kasvaimet, jopa kolmasosa ei-lihas- invasiivisen sairauden etenee lihasten invasiivista sairautta ja etäispesäkkeitä ajan [2]. Huolimatta tehokkuutta sisplatiini-pohjainen kemoterapiaa paikallisesti levinneen ja metastaattinen virtsarakon syöpä, puute kestävyyttä vastauksista ja puuttuminen toisen linjan hoito pisteestä tarvitaan tehokkaampia hoitoja [3, 4]. Kriittinen uusia terapeuttisia kehitys on kartoittaa erityisiä onkogeenisten reittejä lupaavia hoitotoimenpiteiden ja asianmukaisen tunnistamisen potilaiden todennäköisesti hyötyä tietystä hoito (yksilöllisesti syöpähoidon).

Useimmat virtsarakon syövät ilmaista kohonneet epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) [5,6,7]. EGFR moduloi solujen kasvua ja lisääntymistä sekä geenin ilmentymisen säätelemiseksi, angiogeneesi, liikkuvuuteen ja apoptoosin mikä lisää pahanlaatuinen potentiaalia [8,9,10]. Kohonnut EGFR on yleinen ensisijainen virtsarakon syövät noin 50% tapauksista, joilla yli-ilmentymisen [8]. Lisäksi suurin osa metastaattinen virtsarakon kasvaimia on osoitettu ilmentävän EGFR [11]. Edelleen, EGFR yli-ilmentyminen näyttää olevan merkittävää negatiivista ennustaja selviytymisen [5]. Niinpä biologinen polkuja, jotka parantavat kasvutekijä signalointi kautta EGFR todennäköisesti auttavat virtsarakon syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Soluun sitoutuneen EGFR: n ligandien, kuten hepariinia sitovat epidermaalinen kasvutekijä (HB-EGF), amfireguliini, transformoiva kasvutekijä alfa (TGFa) ja beetaselluliini tiedetään vapautetaan toiminnan kautta membraaniin sitoutuneiden proteaasit jäsenet mukaan lukien ADAM (A disintegriini- And Metalloproteinase) perhe [12-14].

ADAM perhe koostuu noin 40 proteiineja, mutta vain harvat osoittavat proteolyyttistä aktiivisuutta [15-17]. Proteolyyttisesti aktiivista Adams, tai sheddaasit, liikenteen kalvon piilevä muodossa, joka voidaan aktivoida proteolyyttistä vuodattamalla N-terminaalista estävä prodomeenille [12,13]. Entsymaattisesti aktiivinen proteiini lohkaisee ja vapauttaa useita fysiologisia solunpintaproteiinit lukien kalvoon ankkuroitua kasvutekijät ja niiden reseptorien, ecto-entsyymejä, ja soluadheesiomolekyylit kuten E-kadheriinin ja N-kadheriinin. Nämä toiminnot sijoittaa erityisiä ADAM perustutkimuksessa roolit solusignalointi ja säätelyyn soluadheesion ja solun liikkuvuudessa [12,15]. Useat ADAM on myös liitetty ihmisen kasvaimien syntyyn [13,14,16,18,19] ja lisääntynyt ilmentyminen ja toiminta näistä ADAM usein korreloivat kasvaimen etenemiseen ja aggressiivisuus taudin [18,20].

One katalyyttisesti aktiivisen ADAM, ADAM15, on raportoitu olevan yli-ilmentynyt useissa maligniteetteja, mukaan lukien melanooma, eturauhassyöpä ja rintasyöpä [20,21]. Luettelo substraattien ADAM15 on useita keskeisiä solujen säätelymolekyyleja kuten E-kadheriinin ja N-kadheriinin, desmogleiini ja EGFR: n ligandien, transformoivan kasvutekijän beta (TGF), amfireguliini, epiregulin ja HB-EGF [16,21,22]. Taso yli-ilmentymisen ADAM15 rinta- ja eturauhassyöpää on korreloinut kasvaimen aggressiivisuus ja metastasointiin [20]. Olemme osoittaneet, että inhibitio ADAM15 ilmentymisen PC-3 eturauhasen syöpäsolujen pienentää kasvaimen kasvua ja estää etäpesäkkeiden [23]. Välinen yhteys ADAM15 ja angiogeneesin on myös todettu [24,25].

biologiset ja molekyyliprofiilien virtsarakon syöpien ehdotti, että yli-ilmentyminen ja aktivaatio ADAM15 voi olla merkitystä etenemistä tämän taudin. Ensinnäkin, virtsarakon syöpien ilmentävät korkeita EGFR, jossa paikallinen vapautuminen EGFR ligandien edistäisi virtsarakon syövän kasvua [5-7,11]. Toiseksi E-kadheriinin, toinen substraatti ADAM15, on löydetty entsymaattisesti käsitellyssä muodossa sekä seerumin ja virtsanäytteiden virtsarakon syöpäpotilaiden joka korreloi myös huono kliiniseen tulokseen [26,27]. Kolmanneksi, virtsarakon syövän etenemisessä on läheisessä yhteydessä angiogeneesiin [9,28-30], joka voi vaikuttaa myös biologisen aktiivisuuden ADAM15 [24,25].

ADAM15 on nousemassa mahdollisena säätelijänä kasvain microenvironment ja lupauksensa terapeuttista kohdentaminen on kasvussa. Alustava tutkiminen ADAM15 ilmentymistä kudoksessa, solulinjoissa ja ksenograftimalleja ihmisen syövän (histologisesti samanlaisia ​​primaarikasvaimen) ehdotti sen toiminnallista roolia etenemisessä ihmisen virtsarakon syöpä. Kuitenkin vähän tiedettiin ilmentymistasojen ADAM15 ihmisen virtsarakon syövän tai miten ADAM15 voi toiminnallisesti välittää ja metastaasit virtsarakon syövän soluissa. Nykyisessä tutkimuksessa, ryhdyimme vahvistaa yhdistys ADAM15 ilmaisun kehittyneitä ihmisen virtsarakon syöpä ja määriteltävä toiminnalliset osallistumista ADAM15 etenemisen tätä tautia.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen virtsarakon syövän solulinjat UM-UC-6 [31,32] ja UM-UC-9 [32] saatiin alulle (HB Grossman, The University of Texas-MD Anderson Cancer Center, Houston TX). SV-40 ikuisti ihmisen Uroepithelial Cells (SV-HUC-1) [33] olivat ystävällinen lahja C. A. Reznikoft (University of Wisconsin, Madison, WI). Perustettu Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUV-EY-C) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Soluja käytettiin lyhyen aikavälin passage ja testattu restriktiofragmenttipituuspolymorfismin (RFLP) autentikointiin (Research Animal Diagnostic Laboratory, Columbia, MO). Soluja ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY), jossa on runsaasti glukoosia, johon on lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Life Technologies). HUV-EC-C-soluja ylläpidettiin Endoteelisolukasvun Medium EBM-2

TM (Lonza Inc., Allendale, NJ) täydennettynä EGM ™ -2 BulletKit ™ (Lonza Inc.) ja 10% FBS.

Generation of ADAM15 knockdown solulinjojen

UM-UC-6 ja UM-UC-9 ADAM15-knockdown virtsarakon syövän solut tuotetaan käyttäen lentivirus kuljettaa ADAM15 erityisiä knockdown lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) ( shA15), tai tyhjä vektori säätelysekvenssi ja /tai salattu shRNA järjestyksessä suunniteltu ohjaus off-tavoite vaikutuksia (ctlA15) kuten olemme aiemmin raportoitu [22,23]. Eteenpäin ja täydentävä kohdesekvenssejä ADAM15 olivat 5′-AACCCAGCTGTCACCCTCGAA-3 ’ja 5′-TTCGAGGGTGACAGCTGGGTT-3’.

Potilasnäytteet

kasvainnäytteestä tähän työhön saatiin säilyttäen potilaan luottamuksellisuus alle kirjallinen lupa on Michiganin yliopiston Virtsarakon syövän Tissue Bank. Jokainen lähde noudattaa Medical School Institutional Review Board hyväksyi protokollan (IRBMED HUM00042401). Kudos microarray koostui 110 ytimien 37 virtsarakon syöpäpotilailla, ja mukana näytteitä normaalissa virtsarakossa sekä pinnallinen invasiivisia ja metastaattinen virtsarakon syöpien.

Protein eristäminen ja Immunoblottausmääritys

Solut kerättiin kaavinta ja tuloksena solupelletti pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja jäädytettiin -80 ° C: ssa ennen uuttamista. Solupelletit hajotettiin hajotuspuskuriin (50 mM Tris [pH 7,6], 120 mM NaCl, 0,5% NP40, 1 mM EGTA: ta, 100 ug /ml phenylmethysulfonyl fluoria, 50 ug /ml aprotiniinia). Uutteet kirkastettiin sentrifugoimalla 10000 rpm 10 minuutin ajan, ja supernatantit kerättiin ja proteiinin määrä määritettiin käyttäen Bradford-proteiinimäärityksellä (Bio-Rad, Hercules, CA). Solu-uutteet (20 ug /kaista) erotettiin sitten ennalta valettuja gradientilla 4-20% Tris-glysiini-SDS-polyakryyliamidigeeleillä (Novex, Life Technologies, Carlsbad, CA) ja siirrettiin vahvistettu 0,2 um nitroselluloosamembraanille (EMD Millipore, Billerica, MA). Sitten kalvot estettiin, probed, ja kehitetään. Estopuskuria koostui 10% rasvatonta kuivamaitoa TBST (Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa oli 0,1% Tween 20, Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO). Ensisijainen ja toissijainen vasta-aineen inkuboinnit suoritettiin 2,5% rasvatonta kuivamaitoa TBST. Ensisijainen vasta-aineita GAPDH (hiiren monoklonaalinen MAB374 vasta-aine, paljon 2322571, EMD Millipore, Billerica, MA) ja ADAM15 (kanin polyklonaalinen AB19036 vasta-aine, Lot 2316790, EMD Millipore) on hyödynnetty loppulaimennos 1: 10,000 ja 1: 2000, vastaavasti. Toissijainen vasta-aineet vuohen anti-hiiri IRDye

TM 680RD 1: 5000 (926-68070, erä C30502-01, Li-Cor, Lincoln, NE) ja vuohen anti-kani IRDye

TM 800CW 1: 10,000 ( C30521-01, paljon C30521-01, Li-Cor). Kalvot oli kuvattu kanssa Li-Cor Odyssey CLX

TM (Li-Cor, Lincoln, NE) seuraten valmistajan ohjeita.

immunohistokemia

Parafiini kudosleikkeet poistettiin parafiini ja käsiteltiin peroksidi metanolissa endogeenisen peroksi- din blokkaamiseksi toimintaa. Antigeeni haku suoritettiin käyttäen sitraattipuskuria antigeenin haku valmistajan ohjeiden mukaisesti (Citra, Biogenex, San Ramon, CA). Immunovärjäys suoritettiin käyttämällä avidiini-biotiini-kompleksin värjäytymistä (ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Ensisijainen kanin polyklonaalinen vasta-aine ADAM15 (AB19035, erä 0603024760, EMD Millipore) laimennettiin 1:50 5% FBS PBS: ssä. Ennalta laimennetun kanin isotyyppiä liuos (Life Technologies, Carlsbad, CA) käytettiin negatiivisena kontrollina. Reaktio päätökseen kehitys 5 minuuttia substraatilla (3,3′-diaminobentsidiini plus peroksidi). Sitten lasit vastavärjättiin hematoksyliinillä. Objektilasit arvioitiin patologi (LPK) ja lajiteltava värjäys voimakkuus (on 1-4 mittakaavassa 1 = negatiivinen, 2 = heikko, 3 = väli, 4 = voimakas) ja prosenttiosuus kasvainsolujen värjäystä. ”Intensiteetti pisteet” (värjäytymisen intensiteetti kerrottuna prosenttiosuutena solujen värjäystä) käytettiin vertaamaan tuloksia.

haavan paraneminen Pitoisuus

UM-UC-9 ja UM-UC-6-solut ympätään 6-kuoppaisiin kudosviljelymaljoihin ja annettiin konfluentteja. Yksikerroksista solujen oli naarmuuntunut uusi 5 ml pipetin kärjen poikki keskellä kaivoja muodostavat ristin. Jälkeen raapiminen, kuopat pestään varovasti kahdesti väliaineen poistamiseksi irrotettuja soluja, ja sitten täydennetään tuoreella DMEM 10% FBS: ää. Kuvat on otettu ja digitalisoitu dokumentoida alkuperäisen halkeama. UM-UC-9 ja UM-UC-6-soluja inkuboitiin 18-20 ja 12 tuntia, vastaavasti. Kuvat on otettu ja digitalisoitu dokumentoida muuttoliikettä. Parantava kuilu mitattiin Image Analysis Software

TM Olympus (Olympus, Center Valley, PA).

matrigeelin

TM Invasion jaosto Pitoisuus

BD BioCoat

TM Matrigel

TM Invasion Chambers (BD Biosciences, Bedford, MA) käytettiin. 24-kuoppaiset kammiot rehydratoitiin PBS: llä ja ctlA15 ja SH15 UM-UC-9 tai UM-UC-6-solut ympättiin kammioihin, mukaan valmistajan menettelyä (BD Biosciences). Tilavuus 0,2 ml solususpensiota, joka sisälsi 1×10

5 solua /ml seerumivapaassa väliaineessa lisättiin kuhunkin insertin. Tilavuus 0,5 ml DMEM + 10% FBS: ää lisättiin huonompi hyvin. Chambers inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä ja UM-UC-9 ja UM-UC-6 Solujen annettiin kulkeutua vastaan ​​seerumi kaltevuus ajaksi 24 tai 12 tuntia. Inkuboinnin jälkeen, ei-tunkeutuvat solut poistettiin ylemmältä pinnalta insertin kalvon pumpulipäinen applikaattorit. Solut alemmalla pinnalla kalvon kiinnitettiin 10% formaliinilla ja värjättiin kristallivioletilla (BD Bioscience). Solujen laskenta suoritettiin alkaen fotomikrograafeja 3-5 kenttää per insertti. Kukin solulinjoista määritettiin vähintään kolme kertaa.

migraatiota Pitoisuus

BD BioCoat

TM insertit ja 24-kuoppaisille levyille (BD Biosciences) käytettiin ja migraatiota määrityksessä. Fibronektiini lisättiin takki kukin välike (Sigma-Aldrich Co.) pitoisuutena 50 ug /ml. HUV-EC-C endoteeli- solut ympättiin insertin pitoisuudessa 1×10

5 solua /250 ui EBM-2 alusta plus täydentää. HUV-EC-C-soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan, jolloin muodostuu yksikerroksinen. UM-UC-9 ja UM-UC-6, ctlA15 ja shA15, soluja ylläpidettiin 24 tuntia ja ympättiin hyökkäys lisää tiheydellä 1×10

5 solua /250 ui seerumivapaassa väliaineessa. Ohjaus insertit kuormitettiin väliaineen arvioida muuttavien taustalla endoteelisolujen. Alempi kammio täytettiin 300 ui EBM-2 + 10% FBS. Kammiot inkuboitiin sitten, jotta kasvainsolujen kautta muuttaa endoteelisolujen kerroksen kohti seerumin kaltevuus. UM-UC-9-soluja inkuboitiin 24 ja UM-UC-6 ajaksi 12 tuntia. Non-transmigratory solut poistettiin pumpulipuikolla. Seuraavaksi muuttavien kasvaimen solut kiinnitettiin 10% formaliinilla ja värjättiin kristallivioletilla ja valokuvattiin määrällisesti kasvain solujen vaeltamiseen. Kolme kenttää per insertin valokuvattiin ja solut laskettiin avustuksella ImageJ [34]. Kukin ehto ajettiin kolmena kappaleena.

rakenne-pohjainen suunnittelu Novel Chemical Inhibitor kohdistaminen Catalytic Domain ADAM15

katalyyttiseen keskukseen ADAM15 on ainutlaatuinen ja ehdottaa mahdollisuuden suunnitella uusia kemiallisia koettimia jotka ovat selektiivisiä ADAM15 metalloproteinaasiaktiivisuus. Tämä lähestymistapa johti ensitunnistamiseen ja validointi epäspesifinen estäjä, marimastaatti, rakenteellisena koetin erinomaiset ennustettu sidonta ja estäjä vastaan ​​aktiivista kohtaa ADAM15. Edelleen rakennemallinnus johti tunnistamiseen bifenyylin sulfonamidi-inhibiittori, PD166793 [35], joka on jolla on useita ominaisuuksia, jotka tekevät siitä houkuttelevan lähtökohta analogista synteesiä ADAM15 antureista. Ennakkojärjestäminen-pohjainen suunnittelu, ottaen huomioon ainutlaatuiset amfipaattista ominaisuudet ADAM15 S1 ”tasku, pystyimme suunnittelemaan ja syntetisoitua uusi lyijyn yhdiste, adamastat, joka on suunniteltu selektiivinen koetin ADAM15. Optimaalinen sidontavaihtoehdoista ja suhteellinen sidosenergioiden meidän ADAM15-inhibiittori laskettiin laajalti hyväksytty AUTODOCK Vina ohjelma Molekyylien telakointi ja virtuaaliseulonnan [36] jotka ovat edustettuina S1 taulukossa. Nämä laskelmat, ennustavat, että adamastat pitäisi sitoutua selektiivisesti ja suurella affiniteetilla katalyyttiseen keskukseen ADAM15.

fluoresenssiresonanssienergiansiirto (FRET) Pitoisuus

Rekombinanttisen ADAM15 katalyyttinen domeeni (A15cat) määritettiin käyttämällä FRET perustuvia määrityksiä, jotka mittaavat pilkkominen fluorogeenisen ADAM15 substraattipeptidi. Esto katalyyttistä aktiivisuutta A15cat mukaan marimastaatti, PD166793 ja adamastat määritettiin käyttäen fluorogeenisen peptidi (DABCYL-HGDQMAQKSK (5FAM-NH2), jotka on saatu ADAM15 pilkkomis- alhaisen affiniteetin IgE-reseptorin (CD23) [37]. Näissä kokeissa substraatin konsentraatiossa 1 uM inkuboitiin rekombinantti A15cat (0,5 ug /ml) 24 tunnin ajan 24 ° C: ssa 384-kuoppalevyillä (Corning, Corning, NY), jossa inhibiittorin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa ratkaisuja. Fluoresenssi mitattiin käyttämällä PHERAstar (BMG LABTECH Inc., Cary, NC) fluoresenssilevylukijaa (eksitaatio 485 nm ja emissio 530 nm: ssä).

Cell Proliferation Analysis

vaikutuksen tutkimiseksi meidän ADAM15 knockdowns päälle soluproliferaatiota, ctlA15 ja shA15 UM-UC-9 ja UM-UC-6, solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 1000 ja 500 solua /kuoppa vastaavasti 200 ui väliainetta. päätepisteitä arvioitiin sen jälkeen, kun 12, 24, 48 ja 72 tunnin inkubaation jälkeen.

Samalla tavalla anti-proliferatiivista vaikutusta adamastat analysoitiin maljaamalla SV-HUC-1, UM-UC-9 ja UM-UC-6-solujen pitoisuutena 2000, 1000 ja 500 solua /kuoppa vastaavasti 100 ui väliainetta. Solujen annettiin kiinnittyä yön yli ja käsiteltiin 100 ul: lla /kuoppa 2X adamastat liuosta (5 uM lopullinen pitoisuus) tai vastaava konsentraatio DMSO: a vehikkelikontrollina. Näin ollen, solut laitettiin inkubaattoriin 12, 24, 48, 72, 96 ja 120 tuntia.

Soluproliferaatio arvioitiin kunakin ajankohtana kautta biopelkistys vesiliukoista MTS tetratsolium (3- (4,5 -dimethylthiazol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium) suola sen formatsaani, jonka metabolisesti aktiiviset solut [38]. Kun oli lisätty 40 ui MTS /fenatsiinimetosulfaatti (PMS) (20: 1) liuosta (Promega, Madison, WI), soluja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa ja absorbanssi formatsaanituotteen mitattiin 490 nm: ssä .

elinkykyyn Analyysi

SV-HUC-1, UM-UC-9 ja UM-UC-6-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille pitoisuutena 2000, 1000 tai 500 solua /kuoppa vastaavasti 100 ui DMEM: ä + 10% FBS: ää (ei fenolipunaista). Inkuboinnin jälkeen 24 tuntia, soluja käsiteltiin lopulliseen pitoisuuteen 0,1% DMSO: ta (ajoneuvon ohjaus), 0,1, 1, 10 tai 100 uM adamastat 100 ui elatusainetta ja inkuboitiin 96 tuntia. Tämän jälkeen 40 ui MTS /PMS-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin 2 tunnin inkubaation 37 ° C: ssa [38]. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Nollakoekuoppien, keskipitkän vain ja 2,5 uM staurosporiinia (Sigma-Aldrich) sisällytettiin kontrolleiksi. Solujen elävyys (%) oli arvioida seuraavasti: (OD näyte-OD staurosporiinille) /(OD keskipitkän OD staurosporiinille) x 100.

tuumorikasvun Severe Combined Immunodeficiency (SCID) Hiiret

vaikutuksen tutkimiseksi hiljentäminen ADAM15 virtsarakon syövän kasvua, ctlA15 ja shA15 UM-UC-6-soluja inokuloitiin subkutaanisesti pitoisuudessa 1×10

6-soluja C57BL /6-SCID-hiiriin, kaksi 10 hiiren ryhmiin. Määrittämään Näytteen koon adamastat

in vivo

kokeissa käytettiin kaavaa: (n = log 0,10 todennäköisyys tyypin II virhe jaettuna 95% mahdollisuus havaitsemiseksi painoero on 40% tai enemmän. Log 0,10 jaettu log 0,6 = 4,5 hiirtä ryhmää kohti), joten 5 hiirtä per ryhmä käytettiin kokeessa. 3 viikon kuluttua, hiiret lopetettiin ja kasvaimet punnitaan.

In vivo

tehoa adamastat määritettiin myös UM-UC-6-ksenografteja, jossa 1×10

6 UM-UC-6 virtsarakkokasvain solua injektoitiin ihon alle kylkeen SCID hiirillä. Kun otetaan huomioon ennustetun adamastat suun kautta saatavuutta, eläimiä käsiteltiin letkuruokinnalla adamastat jälkeen kasvaimen aloittamisesta (10 päivää injektion jälkeen). Hiiret erotettiin kahdeksi ryhmäksi 5 eläintä ja käsiteltiin päivittäin adamastat (100 mg /kg /annos) tai ajoneuvon hallinnan (PBS) 3 viikkoa ennen ruumiinavaus. Jokainen kasvain resektoitiin ja punnittiin samalla kuoleman jälkeen. Kokeellinen yksikkö oli yksi kasvain hiirtä kohti ja kaikki kasvaimet (100%) otettiin mukaan analyysiin.

Eläinten lukumäärä sisältyvät aiemmin saatu havainnoimalla vähimmäismäärä, joka voi aiheuttaa tilastollista merkittävyyttä alla kokeellinen olosuhteissa. Kaikki ryhmät olivat satunnaisesti jaoteltuna häkissä. Syöpäsolun inokulaation tai adamastat käsittely aloitettiin samaan aikaan. Hiiret eivät osoittaneet painon ja ei ole haitallisia vaikutuksia, jotka johtuvat adamastast tai letkulla tekniikka ei havaittu.

SCID-hiirissä, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat miehillä ja naisilla, 8-10 viikkoa vanhoja, kasvatetaan jonka Ulamin Breeding Ydin. Eläimiä pidettiin taudinaiheuttaja vapaa laitos ilmanvaihto häkeissä. Hyvinvoinnin arvioitiin päivittäin kirjoittajien ja eläinlääkintähenkilöstön Michiganin yliopistossa.

Etiikka ja ohjausjärjestelmästä.

hoitoa hiirten tarkasteli yliopiston komitea käytön ja hoidon of Animals (UCUCA) ja sen havaittiin olevan yhtä mieltä Michiganin yliopiston institutionaalisten ohjeiden. University of Michigan UCUCA hyväksynyt tämän eläinkokeissa protokollan PRO00004867. Siirrostus kasvainsolujen suoritettiin isofluoraanilla anestesian minimoimiseksi kärsimystä. Kaikki menettelyt kiinni ARRIVE suuntaviivat raportointiin eläinten tutkimuksen kuvatulla S1 ARRIVE muistilista.

Tilastollinen analyysi

kudoksessa mikrosiruanalyysi, värjäys indeksi (voimakkuuspisteet kerrottuna prosenttiosuus kasvainsolujen värjäys) laskettiin kullekin ydin. Useita ytimiä saman kliinisessä vaiheessa samasta potilaasta yhdistettiin yhteenveto pisteet edustavat keskiarvoa sydämiä. Tämä yhteenveto johti 48 datapisteet (vastaten ainutlaatuinen potilaan diagnoosin yhdistelmät) ja ADAM15 värjäystä arviointia. Yksisuuntainen ANOVA käytettiin vertaamaan värjäytyminen indeksin yhteenveto pisteet vaiheessa. Kaikki pareittain vertailut tehtiin ryhmien välillä käyttäen Tukey-Kramer menetelmä korjaamaan monivertailuja. Heikkous ANOVA malli on, että voi olla korrelaatio sisällä potilaalle, että ei oteta huomioon tällä menetelmällä. Toistuva toimenpiteiden mallia käyttäen värjäystä indeksiä kunkin ytimen yksilöllisesti korrelaatio rakenteita selittää toistuvaa sydämiä sisällä potilaan ja diagnoosi käytettiin tarkistaa tulokset ANOVA tiivistelmän pisteytysmalli. Tämä malli hajosi normaaliuden oletukset mutta oli samanlaisia ​​tuloksia ja samat johtopäätökset. Yksinkertaisuuden vuoksi ANOVA tulokset näytetään. Parittomia, 2-tailed t-testiä käytettiin sen määrittämiseksi, mikäli tilastollisesti merkitseviä eroja havaittiin haavan paranemista, invaasio, muuttoliike, ja

in vivo

hiiren vierassiirrekokeissa. Lisääntymistä ja solujen elävyyden tulokset arvioitiin 2-tie ANOVA ja Turkin useita vertailutestejä. Analyysi suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 6 Ohjelmisto (La Jolla, CA). Tiedot katsottiin tilastollisesti merkitsevä

p

0,05.

Tulokset

ADAM15 ilmentyminen liittyy paikallinen invaasio ja metastasointiin Ihmisen virtsarakon syövän

olimme aiemmin raportoitu, että ilmentymistä ADAM15 liittyi metastaattista etenemistä rinta- ja eturauhasen syöpiä [20]. Kuitenkin rooli ADAM15 etenemisen virtsarakon syöpä ei ollut tutkittu. Aloitimme tämän tutkimuksen kartoittamalla Oncomine

TM (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI) geenien ilmentyminen tietokanta arvioida DNA kopioluvun ja mRNA tasot ADAM15 ihmisen virtsarakon syöpä taulukot. Analyysi 191 näytteiden osoitti, että ADAM15 kopiomäärä on merkittävästi kohonnut pitkälle N vaiheessa (N1 +) invasiivisia virtsarakon syöpä verrattuna invasiivisen (N0) tauti. Niistä 18823 analysoidaan geenejä, ADAM15 sijoittui 45

th korkein kopioluku tai top 5% (kuvio 1A). Analysoimalla lisäksi 3 riippumatonta transcriptome tutkimukset Oncomine

TM (Sanchez, Lee ja Blaveri), löydettiin merkittäviä yliekspressio ADAM15 mRNA tunkeutumisen virtsarakon syöpä verrattuna normaaleissa kudoksissa (kuvio 1 B).

analyysi käyttäen Oncomine

TM (Compendia Bioscience) geenin selain.

A)

Boxplots yhteenveto keskimääräinen kopioluku ja keskihajonta (SD) virtsarakon syövän geenien ilmentyminen tietokokonaisuutta. ADAM15 kopioluku oli koholla invasiivisia virtsarakon syövän (N1 +) verrattuna invasiivisen sairauden (N0).

B) B ADAM15 mRNA yli-ilmentyy invasiivisia virtsarakon syöpä verrattuna invasiivisen virtsarakon syöpään. Pylväät edustavat ADAM15 mRNA-tasot kolmessa eri julkaistu mRNA ilmaisun tutkimukset.

C) B-Mikrovalokuvat ja ADAM15 immunovärjäyksessä virtsarakon syövän etenemisen kudosmatriisien. Kolme patologinen vaihetta edustaa (normaali kudos, noninvasive, ja invasiivisia virtsarakon syöpä).

D) B Boxplots edustavat ADAM15 värjäytyminen indeksin tässä TMA keskiarvona ± SD. Invasiivinen ja metastaattinen virtsarakkosyöpänäytteiden osoittivat merkittävästi lisätä värjäystä indeksi verrattuna invasiivisen sairauden.

Näiden löydösten merkitystä virtsarakon syövän etenemiseen oli validoitu arviointi ADAM15 proteiinin ilmentymistä kliinisistä näytteistä. Immunovärjäys virtsarakon syövän kudos microarray suoritettiin, osoittaa tietyn polttovälin yliekspressio ADAM15 useimmissa kehittyneen (invasiivinen ja metastaattinen) virtsarakkosyöpänäytteiden. Vertailun kaikki huono laatu ja noninvasive virtsarakon syöpä näytteistä (27/27), oli lieviä ADAM15 värjäytymistä indeksi (0-2), kun taas 48% (27/56) ja invasiivisia ja 72% (13/18) ja metastaattista tapaukset osoittivat kohtalaisesta suureen värjäystä indeksi (2-4) (taulukko 1). Lähempi histologinen arviointi osoitti, että ADAM15 paikantuu normaalin uroteelin kanssa hyvin järjestäytynyttä värjäytymisen soluliitos, ja lisäsi positiivisuus sateenvarjosolu luminaalipintaan (kuvio 1 C). Sen sijaan, kohdunkaulan syöpä yksilöitä näytteillä enemmän sekavaa ja sytoplasmista värjäytymistä ADAM15. ADAM15 immuno-positiivisuus kasvoi pitkälle (kuvio 1 D) ja oli merkittävästi suurempi kuin kasvaimia eteni noninvasive invasiivisia ja etäpesäkkeitä. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että ADAM15 yliekspressio liittyy tiiviisti paikallisen invaasion ja metastasointiin ihmisen virtsarakon syöpään.

knockdovvn ADAM15 Vähennykset muutto Virtsarakon syövän solut

Cellular motiliteettia vaaditaan kasvaimen invaasion ja metastaasin. Olemme tutkineet endogeeninen ilmentyminen ADAM15 kahdessa virtsarakon syövän solumalleja ja analysoinut, vähennys ADAM15 ilmentyminen estää virtsarakkokasvain solun liikkuvuus. Hyödyntämällä siirtymäkauden cell carcinoma linjat UM-UC-9 ja UM-UC-6 [31,32], arvioimme ADAM15 proteiinin taso immunoblottausanalyysillä käyttäen sytoplasminen-spesifistä vasta-ainetta vastaan ​​ADAM15. UM-UC-9 ja UM-UC-6 virtsarakon syövän solut ilmensivät kohtuullisesti ADAM15 proteiinin kun normalisoitu GAPDH lastaus valvonta (kuvio 2A, S1 Kuva ja S2 Kuva).