Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä on hallitseva tyyppi keuhkosyövän, jolloin korkea kuolleisuus maailmanlaajuinen. Digoksiini, sydämen glykosidi, on äskettäin esitetty olevan uusi kemoterapeuttinen aine. Src on onkogeeni, joka on tärkeä rooli syövän etenemiseen ja on näin ollen potentiaalinen kohde syövän hoidossa. Täällä me tutkimme, digoksiini hillitsevän keuhkosyöpä etenemisensä estämällä Src-vaikutuksen. Vaikutukset digoksiinin keuhkosyöpään solujen toimintaan tutkittiin käyttäen pesäkkeiden muodostumista, muuttoliikkeen ja invaasio määrityksissä. Western blotting ja qPCR määrityksiä käytettiin analysoimaan mRNA ja proteiini ekspressiotasot Src ja sen loppupään proteiineja, ja solujen elinkelpoisuuden määritystä käytettiin mittaamaan solun sytotoksisuuden vaikutuksia. Tulokset solujen toimintaa määritykset paljastivat, että digoksiini inhiboivat, invaasio, muuttoliike, ja pesäkkeiden muodostuminen A549 keuhkosyövän soluja. Samanlaisia ​​vaikutuksia digoksiinin havaittiin myös muissa keuhkosyövän solulinjat. Lisäksi olemme havainneet, että digoksiini merkittävästi tukahdutti Src-vaikutuksen ja sen proteiinin ilmentymistä ja ajasta riippuvaisella tavalla sekä pienentää EGFR ja STAT3 toimintaa. Tuloksemme viittaavat siihen, että digoksiinia on potentiaalinen syöpälääke, joka voi tukahduttaa keuhkosyöpä etenemistä estämällä Src ja aktiivisuutta liittyvien proteiinien.

Citation: Lin SY, Chang HH, Lai YH, Lin CH, Chen MH, Chang GC, et ai. (2015) Digoksiini esti syövän Maligniteetti estämällä Multiple Src-Related signaalireaktioteissä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 10 (5): e0123305. doi: 10,1371 /journal.pone.0123305

Academic Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 07 marraskuu 2014; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2015; Julkaistu: 08 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia tiede ja teknologia, Taiwan, ROC (NSC 101-2325-B-005-001, NSC 102-2325-B-005-001, ja useimmat 103-2314-B-005-001-MY3) ja Taichung Veterans General Hospital ja National Chung-Hsing University (TCVGH -NCHU-1037605), Taiwan. Ylimääräistä rahoitus tuli Opetusministeriön, Taiwan, R.O.C. alle ATU suunnitelma. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on vallitseva tyyppi keuhkosyövän ja johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1]. Alhainen eloonjäämisaste keuhkosyöpäpotilaiden johtuu kasvain vastustuskykyä adjuvanttihoitoa ja etäpesäkkeiden [2]. Etäpesäkkeiden syöpäsolujen primaarikasvaimista on monivaiheinen prosessi, joka tapahtuu verisuonia tai imusuonten. Tähän mennessä ei ole olemassa tehokasta hoitoa estämään tai ohjata näitä metastaattinen prosesseja.

Oncogene riippuvuus määrittää sopivan syöpien kohdennettua hoitomuotojen. NSCLCs on monia kuljettaja mutaatioita, mukaan lukien EGFR, HER2, KRAS, BRAF, PIK3CA, AKT1, MEK1, ROS1, ja ALK [3]. Nämä kuljettaja mutaatiot vaikuttavat kasvain herkkyyttä syöpähoitojen. EGFR mutaatioita havainnollistaa terapeuttista merkitystä molekyyliklusterit. Kliiniset ja biologiset tiedot laajalti osoittavat, että EGFR mutaatiot voivat ennustaa tehoa EGFR: n estäjien, kanssa hoitovaste yli 70% ja pitkäaikainen ilman taudin etenemistä havaittiin useita tutkimuksia [4,5]. Nämä inhibiittorit, esim Irresa ja Tarceva, lopulta rajoittaa ilmaantuvuudesta-mutaatioita ja muut otaksuttu molekyylitason mekanismeja [6,7]. Täten tunnistaa uusia yhdisteitä, jotka kohdistuvat syövän etenemiseen, kuten kasvua ja etäpesäkkeiden, on kiireesti syöpähoidossa tutkimukseen.

onkogeeni Src on tärkeä rooli syövän etenemiseen ja aiheuttaa huonon ennusteen potilaita, ihmisen erilaisten syöpien [8,9]. Src aktivointi, havaittiin lisääntyminen tyrosiinikinaasiaktiivisuuden, on tunnistettu eri syövissä, mukaan lukien NSCLC [10,11]. Src välittää lukuisia signaalinvälitysreittien elintärkeitä hallinnoinnin solutransformaatiota ja homeostaasin [12]. Kasvainsoluissa, yhdistys Src epänormaaliin reseptorityrosiinikinaaseilla lisää tyrosiinikinaasin Src, aktivoiden siten pro-eloonjäämisreittejä kautta PI3K /AKT, angiogeenisen reitin kautta signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STAT3), leviämisen polku kautta MEK /ERK, ja hyökkäyksen kautta FAK /paksilliini /p130CAS [13]. Lisäksi, Src on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa EGFR; Näiden proteiinien fosfory- toisiaan, ja solujen Src ja EGFR yhteistyötä syövän etenemiseen. Esimerkiksi Src välittää fosforylaatiota EGFR Tyr845 säännellä eloonjäämisreittejä [14,15]. Mutaatiot EGFR ja siihen liittyvät perheenjäsenten aiheuttaa toiminnallisia poikkeavuuksia, ja sen seurauksena, parannettu Src aktivointi [16]. Lisäksi, Src-kinaasi-inhibiittorit vaikuttavat myötävirtaan signalointikaskadissa Src ja EGFR toimintaa [17]. Prekliinisissä tutkimuksissa farmakologisia Src-inhibiittorit (dasatinibia saracatinib, ja bosutinib) ovat osoittaneet, että tukevat rooli Src terapeuttisena tavoite keuhkosyövän [18,19].

Sydänglykosidit suuri perhe kemiallisten yhdisteitä, joita löydetään sekundäärimetaboliitteja useissa laitoksissa ja joillakin eläimillä. Digoksiini, yksi tunnettu sydänglykosidit, ovat hyväksyneet sääntelyviranomaisten ja käytetään laajalti hoitoon sydämen vajaatoiminta. Sen sydämen vaikutukset välittyvät inhibition kautta Na + /K + ATP-aasi, joka johtaa lisääntyneeseen solunsisäisen kalsiumin pitoisuuksia ja lisätä sydämen supistuvuutta [20]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat raportoineet, että sydänglykosidit estävät selektiivisesti proliferaatiota ja indusoi apoptoosia sekä autophagy syöpäsoluissa mutta ei normaaleissa soluissa [21,22]. Nämä tulokset ehdotti myös, että sydänglykosidi lääkitys saattaa olla käyttöä syövän hoitoon. Kuitenkin syöpää ehkäisevistä vaikutuksista ja molekyylitason mekanismeja sydänglykosideja keuhkosyövän solut ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. Aikaisemmissa, julkaisematon tunnistimme digoksiinin peräisin pieni joukko luonnollisia yhdisteitä mahdollisena vähentää Src-vaikutuksen käyttäen ELISA lähestymistapaa. Tässä raportissa olemme edelleen paljastaa uuden mekanismin digoksiinin estämisessä NSCLC maligniteetti, joka voi olla läpi useita Src-pohjainen signalointireitteihin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lääkehoito

ihmisen keuhkoadenokarsinooma solulinjoissa, A549 (ATCC CCL-185), H3255 (ATCC CRL-2882), H1975 (ATCC CRL-5908), PC9 ja PC9 /gef [20] viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Soluja ylläpidettiin RPMI 1640 (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA), jossa oli 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (GIBCO BRL) ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä (GIBCO BRL). Digoksiinin ostettiin Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO, USA.), Ja valmistettiin pitoisuuteen 100 mM dimetyylisulfoksidissa (DMSO) kantaliuoksena. Työliuos valmistettiin tuoreena laimentamalla median haluttuna pitoisuutena. Vehikkelikontrolli oli 0,1% DMSO.

Transfektio

A549-soluja siirrostettiin 6 cm: n maljoihin 5 x 10

5 solua /malja tai 96 kuoppaan 5 x 10

3 solua /kuoppa ja transfektoitiin pEGFP-N3-Src Y527F tai pEGFP-N3 tyhjän vektorin (Clontech, Mountair View, CA, USA) käyttäen Lipofectamine-reagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan protokollan.

Western blot -analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [21]. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään Western blot-analyysit sisältyvät anti-fosfo-Src (Tyr418) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), anti-fosfo-FAK (Tyr576) (Invitrogen), anti-FAK (Invitrogen), anti-GAPDH ( Invitrogen), anti-fosfo-EGFR (Tyr1068) (Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-fosfo-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling), anti-fosfo-PI3K (Tyr458) (Cell Signaling), anti- AKT (Cell Signaling), anti-fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (Cell Signaling), anti-SAPK /JNK (Cell Signaling), anti-fosfo-paksilliini (Tyr118) (Cell Signaling), anti fosfori-p130Cas (Tyr410) (Cell Signaling), anti-EGFR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology), anti-PI3K (Santa Cruz Biotechnology), anti-fosfo-MEK1 /2 ( Ser 218 /Ser222) (Santa Cruz Biotechnology), anti-MEK (Santa Cruz Biotechnology), anti-fosfo-ERK (Tyr204) (Santa Cruz Biotechnology), anti-ERK2 (Santa Cruz Biotechnology), anti-paksilliini (Santa Cruz Biotechnology) , anti-P130 Cas (Santa Cruz Biotechnology), anti-fosfo-AKT (Ser473) (Millipore, Billerica, MA, USA) B

Reaaliaikainen käänteistranskriptio-PCR

Src, EGFR , STAT3 ja FAK-mRNA-tasot havaittiin SYBR Green reaaliaikainen RT-PCR: llä ABI Prism 7300 Sequence Detection järjestelmän (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). TATA-box-sitova proteiini (TBP) käytettiin sisäisenä kontrollina (GenBank X54993). Kaikki yksityiskohdat empiirisen menettelyjen ja laskelmat on kuvattu aiemmin [21]. Seuraavia alukkeita käytettiin: Src eteenpäin, 5′-GAGGCCCAGGTCATGAAGAA-3 ’; Src käänteinen, 5’-CCCTTGAGAAAGTCCAGCAAA-3 ’; EGFR eteenpäin, 5’-CTGGCAGCCAGGAACGTACT-3 ’; EGFR käänteinen, 5’-GCCATCCACTTGATAGGCACTT-3 ’; STAT3 eteenpäin, 5’-CCCTTTGGAACGAAGGGTACA-3 ’; STAT3 käänteinen, 5’-AAGTGACGCCTCCTTCTTTGC-3 ’; FAK eteenpäin, 5’GAGAGCTGAGGTCATTTTTGCA -3 ’; FAK käänteinen, 5’GCAGCAATGTCCCTGTGTACA -3 ’; TBP eteenpäin, 5’-CACGAACCACGGGACTGATT-3 ’; ja, TBP käänteinen, 5’-TTT TCTTGCTGCCAGTCTGGAC- 3 ’. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

solunelinkykyisyysmääritys

PrestoBlue elinkykyyn reagenssia (Invitrogen, USA) käytettiin arvioimaan solujen eloonjäämistä, kun digoksiinia hoidon mukaan valmistajan protokollaa. OD mittausta 570/600 nm: llä Victor

3 spektrofotometrillä (Perkin-Elmer, Boston, MA, USA) tallennettiin lisäämisen jälkeen reagenssi ja inkubointia. Kaikki näytteet testattiin kolmena kappaleena.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

yksityiskohtaiset menettelyt pesäkemuodostusta kuvattiin aiemmin [22]. Lyhyesti, että ankkurointi-riippuvaista kasvua määrityksessä, 500-solut suspendoitiin uudelleen RPMI ja ympättiin kuuden kuopan levyillä. 10 päivän jälkeen solut pestiin ja kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä. Seuraavaksi solut värjättiin 0,05% kristalliviolettia. Sen sijaan, että kiinnityspiste riippumattoman kasvun määrityksessä, kuuden kuoppalevyjä esipäällystetty 0,7% LMP-agaroosi on RPMI, jossa on 10% FBS: ää. 1000-solut ympättiin 0,35% LMP-agaroosi /RPMI, jossa on 10% FBS: ää. Kiinteytymisen jälkeen solut käsiteltiin digoksiinin 2 viikkoa. Levyt värjättiin 0,5 mg /ml p-iodonitrotetrazolium violetti. Pesäkkeet, joiden halkaisija on suurempi kuin 1 mm, laskettiin. Triplikaattinäytteet käytettiin kokeessa.

Invasion ja muuttoliike määritykset

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla digoksiinin 24 h ja siirrostettiin transwell kammioissa (8 um huokoskoko, 6,5 mm: n läpimitta; Corning Costar Corporation, MA, USA), jotka olivat tai ei päällystetty Matrigelillä (R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

edistäminen NSCLC solukuoleman digoksiinin

digoksiini, jota sydänglykosidi, on raportoitu on lukuisia syöpää ehkäisevistä vaikutuksista [24,25]. Sen määrittämiseksi, onko digoksiinin oli samanlaisia ​​sytotoksisia vaikutuksia eri keuhkosyövän solulinjat, viisi solulinjat, A549, H3255, H1975, PC9 ja PC9 /gef, käsiteltiin 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 ja 1 uM digoksiinin 24-96 h. PC9 jotka ilmentävät mutantti EGFR kanssa deleetion eksonissa 19 ovat gefitinibiä herkkä NSCLC solulinjassa. PC9 /gef solut valittiin vanhempien PC9 soluihin, joita oli altistettu jatkuvasti kasvavia pitoisuuksia gefitinibin [23]. Tulokset osoittivat, että solujen elinkelpoisuus vaikutti annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 1A-1E). Suurimmat vaikutukset havaittiin A549-soluja (IC

50 = 0,048, 0,036, 0,030 ja 0,029 uM 24, 48, 72 ja 96 h, vastaavasti), ja toinen suurimmat vaikutukset havaittiin H3255-soluissa (IC

50 = 0,104, 0,107, 0,070 ja 0,057 uM 24, 48, 72 ja 96 h, vastaavasti). 72 tunnin kuluttua altistumisen lääkkeen, IC

50-arvot digoksiinin PC-9 ja PC-9-IR solut 0,0917 ja 0,101 uM.

Viisi keuhkosyövän solulinjat, ( a) A549, (b) H3255, (c) H1975, (d) PC9 ja (e) PC9 /gef, käsiteltiin 6 eri annoksilla (0, 0,01, 0,05, 0,1, 1 ja 5 uM) digoksiinin eri ajankohtina (0, 24, 48, 72 ja 96 h), ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen PrestoBlue elinkykyyn reagenssin hoidon jälkeen. Määrälliset tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3); * P 0,05 verrattuna liuotinkontrolliviljelmissä (0,1% DMSO) vastaavana ajankohtana.

rooli digoksiinin on syöpää ehkäisevistä vaikutuksista

tutkimiseksi syöpää ehkäisevistä vaikutuksista digoksiinin, seuraavan kerran suoritetaan solun kiinnittymisestä riippuvuus ankkurista itsenäisyyttä, muuttoliike ja invaasio määrityksissä. Tuloksemme osoittivat, että digoksiini inhiboi A549-solujen pesäkkeiden annoksesta riippuvalla tavalla (10, 25, 50 ja 100 nM) muutaman viikon kuluessa, riippumatta kiinnittymisestä riippuvaisia ​​(kuvio 2A) tai ankkurista riippumattomaan kasvuun (kuvio 2B). Arvioitava edelleen antituumorivaikutukset digoksiinin muuttoliikettä ja invaasio, A549-soluja esikäsiteltiin vaihtelevilla digoksiinipitoisuuksiin 24 tuntia ja sen jälkeen niille invaasion ja muuttoliike määritykset 12 tuntia ja 16 h. Tuloksemme osoittivat, että digoksiini esti merkitsevästi solujen vaeltamiseen ja invaasiota 100 nM verrattuna liuotinkontrolliviljelmissä (0,1% DMSO, kuvio 2C ja 2D).

A549-soluja kasvatettiin kulttuuri malja (b) tai ilman (a ) pehmytagar käsiteltiin toivotun digoksiinipitoisuuksiin ja sen jälkeen niille pesäkemuodostusta analyysejä. (C) Digoksiini pienenee A549 solujen vaeltamiseen kyky, arvioituna Transvvell- migraatiokokeessa. (D) invasiivisuus A549-solujen digoksiinia arvioitiin käyttäen Matrigel-pohjainen transwell invaasiomääritys. * P 0,05 verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään (0,1% DMSO). Kukin käsittely itsenäisesti suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

digoksiini estää aktivointi Src ja siihen liittyvät proteiinit

Dasatinibia (BMS-354825), Src-inhibiittori (SKI), on tunnistettu tehokkaana tavoite terapian huumeiden in vitro ja in kliinisen tutkimuksen [26,27]. Tässä tutkimuksessa dasatinib käytettiin positiivisena kontrollina. Sytotoksisuuden määritys osoitti, että solujen elinkelpoisuus väheni merkittävästi digoksiinin, ja vaikutukset olivat voimakkaampia kuin Dasatinibihoidon samana pitoisuutena (100 nM) 24, 48, 72 ja 96 h (kuvio 3A). Sen määrittämiseksi, onko digoksiinin vaikuttaa fosforylaatiota Src ja niihin liittyvien proteiinien annoksesta riippuvaisella tavalla, Western blot-määritys suoritettiin. Tulokset osoittivat, että fosforylaatiota Src Y418, EGFR Y1068 ja STAT3 Y705 väheni annoksesta riippuvalla tavalla (50-500 nM), jonka digoksiinin A549 keuhkosyövän solulinjassa, joka on hallussaan villityypin EGFR (kuvio 3B). Olemme myös päättäneet, että digoksiini vähensi fosforylaatiota Src Y418, EGFR Y1068 ja STAT3 Y705 on ajasta riippuva tavalla 2-24 h A549-soluja (kuvio 3C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin muiden keuhkosyövän solulinjat, esim H3255 solulinja, joilla on Maailman L858R EGFR mutantin ja H1975-solulinja, joka sisältää L858R /T790M EGFR-mutantti (kuvio 3D ja 3E). Sen vahvistamiseksi, että vaikutus digoksiinin on säätelemällä Src-vaikutuksen, konstitutiivisesti aktivoitua Src mutantin konstruktio (Src Y527F) [28] käytettiin. Tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen Src Y527F parantaa fosforylaation STAT3 ja FAK. Kuitenkin fosforylaatiota Src Y418, STAT3 Y705 ja FAK Y576 oli vielä pienentää digoksiinin-käsitellyissä soluissa (kuvio 3F). Edelleen vaikutusten arvioimiseksi Src Y527F solujen elinkelpoisuuteen, A549-soluja transfektoitiin Src Y527F 18 tuntia ja sitten käsiteltiin 100 tai 250 nM digoksiinin 24 tuntia. Mutant Src Y527F-transfektoiduissa soluissa lisääntyi solujen elinkelpoisuuden, verrattuna mock transfektanttien (α = 0,05, p 0,05). Tiedot osoittivat myös, että 100 ja 250 nM digoksiinin esti merkitsevästi solujen elinkelpoisuutta Src Y527-transfektoiduissa soluissa verrattuna vehikkelikontrolliin (0,1% DMSO) Src Y527 transfektantin (α = 0,05, p 0,05) (kuvio 3G). Nämä tulokset osoittivat, että digoksiinia voi aiheuttaa sytotoksisen vaikutuksen ja vähentää fosforylaation Src, STAT3 ja FAK in solujen konstitutiivisen Src aktivointi.

(a) A549 solujen elinkykyisyys mitattiin käyttämällä Prestoblue elinkykyyn Reagent eri ajankohtina (0, 24, 48, 72 ja 96 h) tai ilman 100 nM digoksiinia tai dasatinibia. (B) analyysi fosforyloidun ja ei-fosforyloitu Src, EGFR ja STAT3 A549-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Syöpäsoluja käsitellään kanssa tai ilman eri pitoisuuksilla digoksiinin (50, 100, 250 ja 500 nM) tai 100 nM dasatinibia 24 tuntia analysoitiin Western blot. (C) analyysi fosforyloidun ja ei-fosforyloitu Src, EGFR ja STAT3 A549-soluissa on ajasta riippuva tavalla. Jälkeen digoksiini hoito (250 nM) ja 2, 4, 8, 12 tai 24 h, syövän solut kerättiin ja analysoitiin Western blot. Digoksiinin on Src, EGFR, ja STAT3 (d) H3255-solut ja (e) H1975-soluissa. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Kukin käsittely itsenäisesti suoritettiin kolmena kappaleena. (F) vaikutus Src Y527F on fosforylaatioon STAT3 ja FAK jälkeen digoksiinia hoidon A549-soluja. Mock ja EGFP-Src Y527F transfektantit hoidettiin 100 tai 250 nM digoksiinin 24 tuntia. Fosforylaation ja proteiinin kokonaismäärän tason Src, STAT3 ja FAK havaittiin Western-blottauksella. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Kukin käsittely itsenäisesti suoritettiin kolmena kappaleena. (G) digoksiini estää elinkelpoisuutta transfektoitujen solujen Src Y527F mutantti. Transfektion jälkeen Src Y527F ja käsittelemällä 100 tai 250 nM digoksiinin 24 tuntia, A549 solujen elinkelpoisuus määritettiin PrestoBlue elinkykyyn reagenssia. Määrälliset tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3); * P 0,05 verrattuna ajoneuvon ohjaus (0,1% DMSO) EGFP-Src Y527F transfektantti.

Digoxin estää Src-vaikutuksen ja alavirran signalointia

vaikutukset Digoksiini on Src loppupään tavoitteita havaittiin Western-blottauksella in digoksiinin saaneilla solulinjoissa (kuvio 4A-4C). Merkittävä esto PI3K, FAK, SAPK /JNK, paksilliini ja p130Cas toimintaa digoksiinin osoitettiin kolmessa solulinjoissa 250/500 nM ja alla. Erityisesti A549-soluja, herkin digoksiinin kasvun estäminen, osoitti edistäminen p-MEK1 /2 ja p-ERK by digoksiinin 100 nM (kuvio 4A). H3255-solut olivat toiseksi herkin digoksiinin koska p-Src estyi (kuvio 3D). Tässä solulinjassa, digoksiinin hieman vähennetty p-MEK1 /2 ja p-ERK 500 nM (kuvio 4B). Lisäksi, vaikka digoksiinin estivät merkittävästi ekspressiota p-Src 250 nM: H1975-soluissa (kuvio 3E), lisääntyminen p-AKT-vaikutusta oli konsertti inhibition kanssa p-MEK ja p-ERK (kuvio 4C) . Roolin tutkimiseksi ERK1 /2 vaikutus digoksiinin, A549-soluja käsiteltiin ERK-inhibiittoria U0126 ja 100 tai 250 nM digoksiinin 24 tuntia. Sitten solut altistettiin Western blotting (kuvio 4D) ja solujen elinkykyä (kuvio 4E) määrityksessä. Tulokset osoittivat, että esto ERK1 /2 fosforylaation ei ole voinut estää sytotoksisia vaikutuksia digoksiinin tai edistäminen p-ERK ja p-MEK1 /2 digoksiinin 100 nM. Tämä tulos viittasi siihen, että digoksiinia saattavat vaikuttaa muihin signaalinvälitysreittien ja estää muiden kasvutekijöiden tai proteiinikinaasien säädellä solujen kasvua näissä solulinjoissa.

Western blotting-analyysit fosforyloidun ja ei-fosforyloitu PI3K, AKT, MEK1 /2, ERK, FAK, SAPK /JNK, paksilliinin ja p130Cas (a) A549, (b) H3255, ja (c) H1975 solulinjat jälkeen 24 h hoito 100, 250 tai 500 nM digoksiinia. Liuotinkontrolliryhmän oli 0,1% DMSO; GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (D) Western blotting analyysit fosforyloidun ja koko ERK, MEK1 /2 ja AKT A549-soluissa, kun 24-tunnin hoidon 10 uM U0126 ja 100 tai 250 nM digoksiinin. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (E) ERK-inhibiittoria ei ole vaikutusta digoksiinin solukuolema. A549-soluja käsiteltiin nimetyn pitoisuudet U0126 ja digoksiinin. Solujen elinkelpoisuus mitattiin PrestoBlue elinkykyyn reagenssia. Data esitetään keskiarvoina ± S.D. (N = 3).

digoksiini vähentää mRNA: n ilmentymisen Src ja siihen liittyvät proteiinit

Kuviot 3 ja 4 osoittavat, että digoksiini ei ainoastaan ​​inhiboi Src ja niihin liittyvät proteiinikinaasi aktiivisuutta, mutta myös vähentää määrän Src ja liittyvien proteiinikinaasien. Olemme edelleen tarkasteltu, onko tämä vaikutus voi seurata proteiini epävakaus tai transkription säätely alaspäin. A549-soluja esikäsiteltiin proteasomin inhibiittoria MG-132 10 uM 2 tunnin ajan ennen altistusta 250 nM digoksiinin vielä 24 tuntia. Kuitenkin, kun läsnä on proteasomin inhibiittoria, ilmentymisen digoksiinin vähennetty Src, EGFR ja STAT3 ei muuttunut merkittävästi verrattuna, että solut digoksiinia yksinään (kuvio 5A). Olemme edelleen xamined onko digoksiinin vähentynyt ilmentyminen Src, EGFR, STAT3 ja FAK-mRNA A549-soluja käyttäen käänteistranskriptio kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR; kuvio 5B). Havaitsimme alas-säätely EGFR ja FAK mRNA ilmaisun 0.5- ja 0.6-kertaiseksi, 100 nM digoksiinia toisin Liuotinnesteyliherkkyys ohjaus (p 0,05) ja alas-säätely Src ja STAT3 mRNA ilmaisun 0.48- ja 0,67-kertaiseksi, 250 nM digoksiinia (p 0,05). Nämä tulokset osoittivat, että ilmentyminen Src ja niihin liittyvät proteiinit säätelevät digoksiinin, joka puolestaan ​​vaikuttaa transkription säätelyyn.

(a) A549-soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman MG132 (10 uM) 2 tunnin ajan, sitten käsiteltiin digoksiinin (250 nM) tai 0,1% DMSO: ta (liuotin kontrolli) ja kerätään 24 tuntia. Proteiinin ekspressio arvioitiin Western blot -analyysillä. GAPDH oli ohjaus Proteiinilisäyksen ja siirto. (B) Soluja käsiteltiin digoksiinin (100 ja 250 nM) 24 tuntia, ja havaitseminen Src, EGFR, STAT3 ja FAK-mRNA: n ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. * P 0,05, poikkeavat merkittävästi apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään (0,1% DMSO). Kukin koe suoritetaan itsenäisesti kolmena kappaleena.

Keskustelu

Keuhkosyöpä on korkea kuolleisuus ja se on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia. Viimeaikaiset onnistumiset täsmähoitoihin ovat parantaneet tuloksia syövän hoidossa. Kuuri EGFR TKI myös gefitinibi ja erlotinibi, on standardi ensilinjan hoitoon edenneisiin NSCLC potilaiden kätkeminen aktivoivia EGFR mutaatioita. [29]. Tämä lähestymistapa väistämättä edistää TKI vastus. Src, tunnettu onkogeenin, on tärkeä rooli monissa signalointireittejä ja ylläpitää aktivaatio erilaisissa syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä [30]. Tässä raportissa, huomasimme, että digoksiini estää merkittävästi Src fosforylaation NSCLC soluissa vaihtelevalla EGFR genotyyppejä, kuten villityypin, joka on L858R mutantti, ja L858R /T790M mutantti. Lisäksi olemme paljasti kyky digoksiinin estää keuhkosyöpä solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion in vitro. Lisäksi osoitamme monikäyttöinen rooli digoksiinin mahdollisesti liittyy signalointireittejä, joka tietojemme mukaan ei ole aiemmin raportoitu.

Digoksiinilla on luonnollinen yhdiste uutetaan foxglove (

rohtosormustinkukka

L.) [31], joka kuuluu ryhmään sydänglykosideja, jotka voivat sitoa ja inhiboida natrium- pumppuja. Sitä on käytetty kliinisesti sydämen vajaatoiminnan hoitoon ja eteisrytmihäiriö estämällä Na

+ /K

+ – ATPaasi monta vuotta [32], ja sitä merkittävästi estää niiden kasvun haimasyöpäsoluissa [33]. Kuten aikaisemmin on todettu, pieninä pitoisuuksina sydänglykosideja on osoitettu olevan alhainen sytotoksisuus normaaleissa soluissa [32]. Lisäksi, digoksiini on osoitettu estävän primaarisen kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen rinta- keuhko- käytettäessä ortotooppisten mallin, jossa ihmisen rintasyövän soluja istutettiin SCID-hiirissä [34]. Molekyylitasolla, digoksiinin down-regulation NDRG1 ja VEGF inhibition kautta HIF-1α hypoksisissa olosuhteissa A549-soluja [35] ja indusoi autophagy huomioimaan kasvua estäviä vaikutuksia in NSCLC soluissa säätelemällä mTOR ja ERK1 /2 signalointipolkujen [36]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että digoksiini vähensi fosforylaatiota Src annoksesta (50-500 nM) ja aika (2-24 h): sta riippuva tavalla. Tuloksemme paljasti myös, että digoksiini vähensi fosforylaatiota eksogeenisten, konstitutiivisesti aktiivinen Src transfektoiduissa soluissa. Kuitenkin aiemman raportin mukaan digoksiini hieman koholla fosforylaatiota sekä Src ja ERK NSCLC soluissa 10 minuutin ajan 100 nM ja lopulta johtivat väheneminen p53-proteiinin synteesi [37]. Me spekuloida, että ero saattaa johtua valotusaikaa digoksiinin. Kuitenkin tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa, että digoksiinia voi estää paitsi Src vaan myös fosforylaatiota ja ilmaus EGFR ja STAT3 hidastamiseksi syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota. Tuloksemme mahdollinen käyttö digoksiinin kuin monen tavoite aineena syövän hoitomuotoja.

TKI toimintaan vastaan ​​EGFR ovat tehokkaita keuhkosyöpäpotilaita EGFR mutaatioita; kuitenkin, vastus nousee ajan myötä. Siten löytää uusi aineena EGFR villityypin ja TKI kestävä keuhkosyövässä on välttämättömyys. Tutkimuksessamme EGFR villityypin keuhkosyövän solulinjassa A549, käytettiin seulomaan Src-inhibiittorit. NSCLC potilaille Arg substituutio Leu asemassa 858 tai deleetio eksonista 19 EGFR reagoivat EGFR TKI [38]. Useat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että monistamisen T790M mutaation EGFR edistää hankintaan EGFR-TKI vastus [39]. Siksi TKI-herkkä keuhkosyövän solulinjat (PC9, eksoni 19 poisto, H3255, L858R EGFR mutantti) [40] ja TKI-resistenttejä keuhkosyövän solulinjat (PC9 /gef, eksonin 19 poisto, hankitun vastustuskyvyn H1975, L858R /T790M EGFR-mutantti) [38], käytettiin arvioimaan syöpälääkkeiden tehokkuutta digoksiinin. Tuloksemme osoittivat, että A549-soluja oli herkin digoksiinin pieninä pitoisuuksina, kun taas muut keuhkosyöpään solut vastasivat digoksiinin pitoisuuksina 250-500 nM.

Tuore tutkimus osoitti, että Src aktivointi säätelee erilaisia polkuja, mukaan lukien selviytyminen, angiogeneesi, proliferaatiota, migraatiota, ja invaasio, läpi erilaisia ​​proteiineja, kuten PI3K /AKT, STAT3, MEK /ERK ja FAK /paksilliini /p130CAS [13]. Liu et ai. osoitti, että solujen lisääntymistä säädellään PI3K /AKT ja RAF /MEK /ERK signalointireitteihin [41]. Erillisessä tutkimuksessa, ERK1 /2 aktivaatio samanaikaisesti löydetty digoksiinin aiheuttaman autophagy [36]. Esillä olevassa tutkimuksessa, digoksiinin vähentää fosforylaation PI3K ja ERK erilaisten keuhkosyövässä 250 nM, mutta edistää fosforylaation MEK ja ERK matalina pitoisuuksina (100 nM) A549-soluja. Kuitenkin esto ERK-reitin ei muuttanut vaikutuksia digoksiinin, mikä osoittaa, että saattaa olla muita reittejä mukana vaikutuksia digoksiinin. Ehdotamme, että digoksiini voivat estää syöpäsolujen kasvua estämällä PI3K /AKT signalointireittejä, jotka johtavat autophagy eri pitoisuuksina. STAT3 aktivoituu EGFR villityypin NSCLC ja korreloi syövän etenemisessä, mukaan lukien solujen eloonjäänti, muuttoliike ja invaasio [42]. Sorafenibi ja yksi sen johdannaisista (SC-1) on raportoitu estävän EGFR villityypin NSCLC kasvua ja indusoivat apoptoosin kautta SHP-1 /STAT3-reitin [43]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että digoksiini paitsi lyhentää STST3 fosforylaatio EGFR villityypin NSCLC lisäksi myös EGFR mutantti-tyyppinen NSCLC. Lisäksi aktivointi FAK-Src molekyyli rakennustelineiden ja p130Cas-JNK signa- by α1-integriinien edistää hyökkäyksen koolonkarsinoomasoluissa [44]. Lisäksi paksilliini on poikkeuksellisesti säännellään oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia ja osallistuvat kasvaimen kasvua ja invaasiota. Kohdunulkoinen ilmentyminen paksilliini helpottaa solujen proliferaatio ja migraatio, kun taas paksilliini knockdown estää näitä tapahtumia mahalaukun soluissa [45]. Tuloksemme osoittivat, että digoksiini vaimentaa FAK-Src, paksilliini, PI3K /AKT, MEK /ERK, STAT3 ja p130Cas-JNK signaalireaktioteissä eri EGFR sisältävien keuhko- syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että digoksiini estää syöpäsolujen invaasiota vähentämällä Src aktivointi ja aktivoinnin liittyvien signalointireittien.

Yhteenvetona käyttäen in vitro lääkeaineen seulonta ja solujen toimintaa määritykset, huomasimme, että digoksiini voivat tukahduttaa keuhkosyöpä etenemistä estämällä Src aktivointi ja aktivoinnin siihen liittyviä reittejä, kuten solujen lisääntymisen, migraation, ja hyökkäys. Emme kuitenkaan vielä voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että muut signaalinvälitysreittien ja proteiinien pelata joitakin rooleja digoksiinin vaikutusten kumoamiseen (Kuva 6). Yhdessä ehdotamme, että digoksiinia on tärkeää syöpälääkkeen kehittäminen.

digoksiini-käsiteltyjä soluja, fosforylaatiota Src ja siihen liittyvien proteiinien estyi, mikä voi johtaa siihen, että inhibitio keuhkosyövän solujen lisääntymistä, muuttoliike, ja hyökkäystä.

Kiitokset

kirjoittajat kiittää professori Chih Xin Yang tarjota keuhkosyövän PC9 ja PC9 /gef solulinjoilla. Kiitämme myös Dr. Hong-Chen Chen tarjoamiseksi pEGFP-N3-Src-Y527F plasmidimutantti.