Krooninen sairaus

tiivistelmä

proteiinityrosiinifosfataasi lokalisoitu Mitochondrion 1 (PTPMT1) on kaksi spesifisyyttä fosfataasi yksinomaan paikallistettu mitokondrioita, ja on viime aikoina osoitettu olevan kriittinen komponentti kardiolipiini biosynteesireitissä. Vaimennussäätely PTPMT1 haiman beta-soluissa on osoitettu lisäävän solujen ATP-tasot ja insuliinin tuotantoa, kuitenkin yleinen rooli PTPMT1 syöpäsoluissa ei ole tunnettu. Me raportoimme tässä, että downregulation PTPMT1 aktiivisuus on riittävä indusoimaan apoptoosin syöpäsoluissa. Lisäksi vaiennettaisi PTPMT1 vähenee kardiolipiini tasoilla syöpäsoluissa, kun taas valikoivasti lisäämällä ATP-tasot glykolyyttisissä media. Lisäksi subletaali downregulation PTPMT1 synergoi alhainen paklitakseliannoksilla edistää syöpäsolun kuoleman. Tuloksemme viittaavat siihen, että inhibitio PTPMT1 aiheuttaa metabolisen kriisi syöpäsoluissa, joka indusoi solukuolemaa, ja se voi olla mekanismi, jonka avulla syöpäsolut voidaan herkistyneet tällä hetkellä käytettävissä olevat hoidot.

Citation: Niemi NM, Lanning NJ, Westrate LM, MacKeigan JP (2013) alassäätely on mitokondrio fosfataasilla PTPMT1 ne edistävät syöpäsolun kuoleman. PLoS ONE 8 (1): e53803. doi: 10,1371 /journal.pone.0053803

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 21, 2012; Hyväksytty: 05 joulukuu 2012; Julkaistu: 10 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Niemi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat palkinnon numero R01CA138651 National Cancer Institute JP MacKeigan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mitokondrioissa yleisimmin tunnetaan nimellä ”voimanpesä solun,” sisältää proteiinit, joilla on laaja translaation jälkeisiä modifikaatioita, kuten fosforylaation ja asetylointi. Nämä muutokset puolestaan ​​vaikuttavat metabolisen kapasiteetin, dynamiikka, ja yleinen homeostaasin organelle [1], [2], [3], [4]. Lokalisointi lukuisia kinaasien ja fosfataasien sisällä mitokondriot viittaa siihen, että fosforylaatio on aktiivisesti säännelty prosessi, joka on merkittävä rooli mitokondrion proteiinien toimintaa [5], [6]. Huolimatta laaja luettelo fosforylaatiotapahtumien sekä entsyymejä, jotka voivat katalysoida nämä tapahtumat, koko asetus mitokondrion prosesseja fosforylaation, ja miten nämä tapahtumat vaikuttavat solun kohtaloon epäselviä.

PTPMT1 on kahteen eri fosfataasi lokalisoitu erityisesti ja yksinomaan mitokondriot [7]. Se on ankkuroitu sisemmän mitokondriokalvon sen fosfataasin domain altistuvat matriisiin, sijoittamalla se proksimaaliseen lukuisia vastaavien entsyymien energian tuotantoon ja aineenvaihduntaa. Mielenkiintoista kyllä, alustava

in vitro

tutkimukset käyttäen yhdistelmä PTPMT1 osoitti, että tämä entsyymi on selvästi parempana lipidien alustoille yli proteiinisubstraatteja [8], mikä viittaa siihen, että PTPMT1 voi suoraan vaikuttaa lipidien osastoon mitokondrioissa. Tuore tutkimus vahvisti tämän, mikä osoittaa, että PTPMT1 toimii nisäkkään fosfatidyyliglyseroli fosfaatti (PGP) lipidi fosfataasi, joka katalysoi toiseksi viimeinen vaihe kardiolipiini biosynteesitien [9]. Tärkeää on, kardiolipiinin syntetisoidaan ja hyödynnetään yksinomaan mitokondrioissa, ja muut kriittiset synteettisiä entsyymejä tämän reitin tiedetään ankkuroitu sisempi mitokondrion kalvon [10]. Tämä asettaa PTPMT1 nimenomaan ja valikoivasti sijainti kardiolipiiniä biosynteesin, ja ehdottaa, että modulaatio tämän lipidi voi olla kriittinen tehtävä tämän fosfataasin.

häiriöiden kardiolipiini homeostaasin on aiemmin liitetty apoptoosin. Kardiolipiinin sisällä sisemmän mitokondriokalvon on osoitettu sitoutuvan sytokromi c, ja on ehdotettu, että hapetus tämän lipidin vaaditaan täyden sytokromi c: n vapautumisen ja sen jälkeen mitokondrio-riippuvaista apoptoosia [11]. Lisäksi kardiolipiinin on liitetty kohdentamisessa lukuisten proapoptoottisten proteiinien mitokondriot, kuten tBID, BH3-ainoastaan ​​proteiinin tiedetään aiheuttavan sytokromi c release edistämällä mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi [12]. Kuten lohko apoptoosin pidetään tuntomerkki syövän [13], dysregulaatio kardiolipiiniä voivat vaikuttaa Tuumorigeenisuustutkimuksissa solujen vaikuttamalla niiden kyky läpikäydä solukuolemaa. Lisäksi muutokset vuonna kardiolipiini biosynteesitiessä on myös yhdistetty apoptoosin. RNAi-välitteinen pudotus kardiolipiiniä syntaasin (CLS1; geenin nimi

CRLS1

) on riittävä vapauttamaan sytokromi c: sisemmästä mitokondrion kalvon, ja herkistää syöpäsolut apoptoottisiin ärsykkeisiin [14].

Huolimatta silmiinpistävää homologia PTPMT1 ja toisen veren rasva fosfataasi, PTEN, niiden katalyyttidomeeneissa [8], kemiallista seulontaan tunnistettu yhdiste, aleksidiini dihydrokloridi, joka on spesifinen PTPMT1

in vitro

[15]. Aleksidiini dihydrokloridi on bisbiguanide yhdiste tunnistettiin aluksi sen antibakteerisia ominaisuuksia, mutta kiinnostavaa on myös tunnistettu indusoi mitokondrioiden toimintahäiriöitä ja apoptoosin [16]. Kuten PTPMT1 on lokalisoitu erityisesti mitokondrioissa, aleksidiini dihydrokloridi voi olla moduloiva mitokondrioiden ja sen jälkeen pro-apoptoottisen vaikuttaa inhiboimalla PTPMT1 fosfataasin aktiivisuuden.

Ehdotettu rooli kardiolipiiniä normaalissa apoptoottisen prosessin, yhdessä vankka solukuolemaa indusoiva fenotyyppi aleksidiini dihydrokloridia, johti meidät oletuksen, että downregulation PTPMT1 geeniekspression aiheuttaisivat apoptoottinen solu kohtalo syöpäsoluissa. Tutustua hypoteesin, käytimme RNAi pudotus PTPMT1 ja määritetään solujen seurauksena menetyksen tämän erityisen geenituotteen. Lisäksi tutkimme, vaikutukset PTPMT1 kohdistaminen yhdiste, aleksidiini dihydrokloridi, sen kyky sekä indusoida solukuolemaa syöpäsoluissa sekä herkistää näiden solujen kemoterapeuttisia on sublethal annoksilla. Tässä osoitamme, että RNAi-välitteinen vaiennettu PTPMT1 riittää aiheuttaa syöpää solukuoleman. Tämä solukuolemaa fenotyyppi on kytketty silmiinpistävää metabolisia muutoksia, mukaan lukien merkittävä downregulation kardiolipiiniä hävitessä PTPMT1, sekä kasvua ATP-tasot selektiivisesti glukoosia sisältävässä väliaineessa. Nämä tiedot valaisevat rooli PTPMT1 kriittiseksi selviytymisen geeni syöpäsoluissa, ja viittaavat siihen, että kohteekseen fosfataasi voi olla tehokas keino herkistää syöpäsolut olevista kemoterapeuttisia.

Tulokset

RNAi -välitteisen knockdovvn PTPMT1 aiheuttaa solukuoleman

vaikutusten tutkimiseksi kaatamalla PTPMT1 solun kohtalon, käytimme kaksi ainutlaatuista siRNA sekvenssit kohdistaminen ei-päällekkäisiä alueita PTPMT1 avoimen lukukehyksen. Kukin näistä siRNA: iden tarjoaa vankan pudotus on PTPMT1 mRNA-transkriptin 30 tuntia transfektion jälkeen, sekä PTPMT1 siRNA: t annetaan yli 98% pudotus suhteessa GAPDH (kuvio 1A). Sen määrittämiseksi, nämä siRNA tehokkaasti häiritä PTPMT1 proteiinin ilmentymisen, määritimme kykyä kunkin siRNA kaataa ilmentynyt, FLAG-leimatun proteiinin (kuvio 1 B, yläpaneeli) sekä endogeeninen PTPMT1 (kuvio 1 B, keskimmäinen paneeli). Nämä kokeet osoittavat selvää hiljentäminen PTPMT1 proteiinin ilmentymisen 48 tuntia transfektion jälkeen kuhunkin siRNA.

(A) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi PTPMT1 mRNA-tasojen HeLa-soluissa sen jälkeen, kun pudotus, jossa on kaksi ei-päällekkäistä PTPMT1-pyrkien siRNA: illa tai ei-kohdistuksen ohjaus. (B) HeLa-solut transfektoitiin kaksi PTPMT1 siRNA: t tai ei-kohdistuksen ohjaus 48 tuntia. Eräässä kokeessa, PTPMT1 oli yli-ilmentynyt (FLAG-tag) 20 tuntia (yhteensä siRNA transfektion aikaan 48 tuntia), ja ilmentyminen tutkittiin FLAG-vasta-ainetta (yläpaneeli). siRNA kaataa myös määritettiin endogeenisen PTPMT1 (keskimmäinen paneeli). Tubuliinia (pohjapaneeli) osoittaa yhtä suuri lastaus proteiinilysaattien kaikissa kaistoilla. (C-E) HeLa-solut transfektoitiin valvontaa tai PTPMT1 siRNA: t ja kerättiin sen jälkeen kun ilmoitettu ajat, jolloin solukuolema määritettiin propidiumjodidilla syrjäytymistä. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan kolmen kokeen. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen opiskelijan t-testiä; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001. (F) HeLa solut transfektoitiin kontrolli tai PTPMT1 siRNA ja analysoitiin elinkelpoisuuden reaaliajassa ( 120 tuntia) käyttäen xCELLigence järjestelmää.

Mielenkiintoista, molemmat siRNA sekvenssit aiheuttaa solukuolemaa jälkeen 72 tuntia naistaintumisprosenttia, josta tuli näkyvämpi 96 ja 120 tunnin kuluttua taintumisen (kuviot 1C-E, F). Prosenttiosuuden määrittämiseksi solujen käynnissä solukuoleman, teimme FACS-analyysi propidiumjodidilla positiivisten solujen 72, 96 ja 120 tunnin kuluttua siRNA pudotus transfektoiduissa soluissa joko PTPMT1 siRNA tai ei-kohdistuksen ohjaus. Kuten odotettua, solut transfektoitu ei-kohdistuksen ohjaus siRNA ilmeni vähän solukuoleman yli 120 tunnin aikana seurataan, 10,8% maksimaalisesta solukuolema nähnyt tämän ajanjakson aikana (joka on vain hieman suurempi kuin basaalisesti käsiteltyjen HeLa-solujen (p = 0,2 -0,9, ns)). Päinvastoin, joko siRNA kohdistaminen PTPMT1 aiheutti vankka solukuolemaa, erityisen selvästi 96 tunnin kohdalla (PTPMT1 siRNA # 1 p 0,001; PTPMT1 siRNA # 2 p 0,05) ja 120 tunnin (PTPMT1 siRNA # 1 p 0,01; PTPMT1 siRNA # 2 p 0,001), jotka osoittautuivat merkittävä molemmille käsittelemättömien solujen (0 h ehto, kuviot 1C-E) ja aika-sovitetun ei kohdistamisessa.

Voit selvittää tarkempaa kinetiikka tämän solukuoleman, me seurataan reaaliaikainen solujen elinkyky transfektio HeLa-solujen kanssa joko ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (sininen), tai toinen ainutlaatuinen PTPMT1 siRNA-sekvenssejä (PTPMT1-1, vihreä, PTPMT1-2, oranssi) (kuvio 1 F). Pääpiirteittäin propidiumjodidin solukuoleman tiedot, molemmat siRNA sekvenssit alkoi hidastua soluproliferaatioon noin 72 tuntia transfektion ja edistänyt merkittävästi solujen irtoaminen (merkki solukuoleman) 96 ja 120 tuntia transfektion jälkeen. Nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen PTPMT1 tarvitaan solujen elinkelpoisuuden HeLa-soluissa, ja ehdottaa, että PTPMT1 voidaan tarvita elinkelpoisuuden syöpäsoluissa.

PTPMT1 Knockdown Syyt Bax /Bak riippuvaista apoptoosia

Edellinen raportit ovat liittäneet downregulation kardiolipiiniä tasoilla sytokromin c vapautumista ja herkistymiseen apoptoottista solukuolemaa syöpäsoluissa sekä sydänlihassolujen [14]; [17]. Niinpä arveltu, että solukuolemaa fenotyyppi nähty vastauksena PTPMT1 Knockdown oli luontainen tai mitokondrio-riippuvainen, apoptoottisen vasteen. Sen määrittämiseksi, onko PTPMT1 pudotus indusoi apoptoosia, me määritettiin kaspaasi-3-pilkkoutumisen, sekä pilkkominen sen hyvin tunnettu substraatti, PARP. Kuviot 2A ja B osoittavat, että 96 tuntia transfektion jälkeen transfektoidut solut ei-suunnattu siRNA eivät näytä rikastumisen joko kaspaasi-3 tai PARP pilkkominen. Kuitenkin transfektio joko PTPMT1 kohdistamisen siRNA aiheuttama vankka rikastumista sekä kaspaasi-3 (kuviot 2C ja D) ja PARP pilkkominen (kuviot 2E ja F). Tärkeää on, sekä kaspaasi-3 pilkkominen ja PARP pilkkominen rata tiiviisti yhdessä näissä kokeissa, joissa korostetaan apoptoottinen fenotyyppi jälkeen PTPMT1 knockdown.

(A-F) HeLa-solut transfektoitiin kontrolli ei-kohdistettu siRNA (A, D ), PTPMT1 siRNA # 1 (B, E), tai PTPMT1 siRNA # 2 (C, F) 96 tunnin ajan. Solut kerättiin ja värjättiin pilkotun kaspaasi-3 (top paneelit) tai lohkaistaan ​​PARP (alapaneeli) kunkin kunnossa, positiivisuus merkitty lisääntyminen fluoresenssin FACS histogrammin (oikeanpuoleiseen alanurkkaan). (G-I) HeLa-solut transfektoitiin kontrolli, PTPMT1, ja /tai BAX /BAK siRNA: t 96 tunnin ajan. Solut kerättiin ja värjättiin pilkottiin kaspaasi-3 (G, H) tai propidiumjodidilla positiivisuus (I). Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan kolmen kokeen. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen opiskelijan t-testiä; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001.

Vaikka kaspaasi-3 on markkeri apoptoottisen solukuoleman, se aktivoituu vasteena sekä sisäiseen ja ulkoiseen apoptoottisten vihjeitä. Sen määrittämiseksi, onko PTPMT1 pudotus indusoi mitokondrioiden-riippuvaista apoptoosia, käytimme siRNA: t kaksoiskäynnistys pudotus pro-apoptoottisten proteiinien BAX ja BAK, jonka ilmentymistä on tarpeen klassisen, mitokondrio-riippuvaista apoptoosia [18]. Kun läsnä on ei-kohdistuksen ohjaus normalisoidaan siRNA-pitoisuus, PTPMT1 indusoi kaspaasi-3: sta pilkkomalla samanlainen kinetiikka, kuten nähdään kuviosta 2C (kuvio 2G). Silmiinpistävän kuitenkin Bax /Bak dual Knockdown täysin eliminoitu PTPMT1 välittämää apoptoottiset induktio (kuvio 2 H). Sen varmistamiseksi, että PTPMT1 pudotus ei aiheuta ei-apoptoottista solukuolemaa, kun läsnä Bax /Bak pudotus, me toistettiin nämä kokeet ja analysoitiin solujen propidiumjodidilla positiivisuus. Yhdenmukainen aiempien tietojen PTPMT1 siRNA aiheuttaa kasvun propidiumjodidista positiivisuus yli ei-kohdistuksen ohjaus (kuvio 2 I, siniset palkit). Tämä lisäys solukuoleman on täysin tukossa Bax /Bak Knockdown, joka tarjoaa merkittäviä suojan propidiumjodidista otto nähty PTPMT1 pudotus soluja (kuvio 2 I, vihreät palkit; p 0,01 PTPMT1 siRNA # 1, p 0,001 PTPMT1 siRNA # 2). Nämä tiedot osoittavat, että Bax /Bak ilmaus tarvitaan PTPMT1 aiheuttama solukuolema, ja viittaavat siihen, että PTPMT1 Knockdown indusoi luontaisen, mitokondrio-riippuvaista apoptoottista solukuolemaa, joka on riippuvainen sytokromi c release.

PTPMT1 Knockdown Syyt Apoptotic solukuolemaa Useita syöpäsolulinjoissa

Vaikka meidän tiedot ovat osoittaneet, että kaksi itsenäistä, ei-päällekkäistä PTPMT1 kohdistettuja siRNA edistää apoptoottista solukuolemaa HeLa-soluissa, geeni inaktivaatio PTPMT1 hiiren alkion fibroblastien tai hematopoieettisten solujen on vain vähän vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen. Oletimme, että downregulation transformoiduissa soluissa voisi olla vaihtoehtoinen vaikutus solujen kohtalosta suhteessa näiden ei-transformoidut ensiöparit. Sen määrittämiseksi, menetys PTPMT1 indusoi solukuoleman vain osapaneelin solulinjoja (esim Helas), tai on samanlaisia ​​vaikutuksia muihin transformoiduissa soluissa, päätimme paneelia syöpäsolun linjat, jotka ovat erittäin vastaanottavaisia ​​siRNA transfektiota (kaikki kudosten alkuperän (luu, aivot, keuhko, ja munuainen); ja tuumorigeenisyystesti

in vivo

. Samanlainen kuin meidän Aikaisemmissa kokeissa, nämä solulinjat transfektoitiin ei-suunnattu siRNA tai PTPMT1 siRNA # 1 tai # 2. 120 tuntia transfektion jälkeen, solut kerättiin ja analysoitiin apoptoosin kautta anneksiini V positiivisuus (y-akseli Kuviot 3A-C) ja propidiumjodidilla positiivisuus (x-akseli, kuviot 3A-C). Kuten kuvioissa 3B ja C, transfektio sekä PTPMT1 siRNA: iden aiheuttama vankka kasvoi anneksiini V ja PI-värjäys, mikä osoittaa, että nämä siRNA: t aiheuttavat näitä solulinjojen apoptoosiin. Useimmissa testatuissa solulinjoissa, oli vahva vaste, joiden keskimääräinen 3.8- ja 3.9- kertainen nousu solukuoleman esiintyvät 6 8 solulinjat testattiin PTPMT1 siRNA # 1 tai siRNA # 2, tässä järjestyksessä (kuva 3D). Olemme havainneet, että 786-0 soluja, munuaissyöpä solulinjat, eivät merkittävästi vaikuta PTPMT1 pudotus joko siRNA (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot osoittavat, että PTPMT1 pudotus aiheuttaa solukuoleman alijoukon syöpäsolulinjoja, viittaa sen ilmentyminen on kriittinen selviytymisen näistä solulinjoista.

(A-c) keuhkokarsinoomasolulinja H1299 ja osteosarkooman solulinja HOS transfektoitiin ei-kohdistuksen (A), PTPMT1 siRNA # 1 (B) tai PTPMT1 siRNA # 2 (C). Transfektion jälkeen näistä siRNA: iden 120 tuntia, populaatio soluista meneillään solukuoleman ja apoptoosin mitattiin propidiumjodidista positiivisuus (y-akseli) ja anneksiini V positiivisuus (x-akseli). (D) paneeli erittäin transfektoitavissa johdetut solulinjat monista kudostyypeistä (ks värilliset merkinnät yllä heatmap) transfektoitiin ei-kohdistuksen tai PTPMT1 siRNA. Solukuoleman ja apoptoosin analysoitiin propidiumjodidilla ja anneksiini V positiivisuus kuin (A-C). Kertainen muutos apoptoosin määritettiin normalisoimalla prosenttia solukuolema nähty transfektoiduissa soluissa ei-kohdistaminen ohjaimen 1, jossa kertainen muutos kuvastaa määrää solukuoleman ylittää tämän kynnysarvon PTPMT1 knockdown soluissa. Heatmap näyttää erilaisia ​​kertainen muutos 1 (mustat neliöt) + 5+ (viisi tai enemmän kertainen, punainen neliö).

titraus PTPMT1 Knockdown Alters Vaikutukset Cellular Elinkelpoisuus

RNAi titraus on aiemmin käytetty määrittämään geenin ilmentymistä kynnys tarvitaan solujen elinkelpoisuuden [19]. Näissä kokeissa siRNA oligonukleotidit laimennettiin ja titrattiin alhaiselle nanomolaarisia tasolla ymmärtää suhteellisen ilmentymistason että geeni on ylläpidettävä aiheuttaa tai estää tietyn solun kohtalon, kuten solukuoleman. Täydemmin ymmärtää siRNA-solukuolema olimme nähneet PTPMT1 Knockdown soluissa, me titrattiin kukin PTPMT1 siRNA, sekä ei-suunnattu siRNA ohjaus, ja tutkinut, mitä vaikutuksia näiden ero knockdowns HeLa solujen elinkykyä ja lisääntymistä. Kuten odotettua, titraukseen ei-kohdistuksen ohjaus 50 nM alas 5 nM oli vain vähän vaikutusta elinkelpoisuutta ja jakaantumista kapasiteettia HeLa-solujen yli 120 tunnin kuluessa (kuvio 4A, B; tummansininen datapistettä). PTPMT1 ilmentyminen differentiaalisesti vaimentua titraamalla sekä ainutlaatuinen PTPMT1 siRNA: t, yhä pudotus tehokkuus kunkin siRNA pitoisuus nousi 5 nM 50 nM (dataa ei esitetty). Mielenkiintoista, titraus kunkin PTPMT1 siRNA muuttanut proliferatiivisia ja elinkelpoisuus profiilit PTPMT1 knockdown solujen kun taas 25-50 nM PTPMT1 siRNA # 1 tai # 2 on riittävä indusoimaan solujen irtoamisesta ohjeellinen solukuoleman, 5-10 nM tämän saman siRNA näyttää pysäyttää leviämisen aiheuttamatta solujen irtoamisesta, osoitettuna neutraali rinne reaaliaikainen kannattavuuden tonttien (kuvio 4A, B).

(A) HeLa-soluja transfektoitiin annoksena kuin kohdistaminen (sininen viiva), PTPMT1 # 1 (vihreä viiva) tai PTPMT1 # 2 (oranssi line) siRNA yli 120 tuntia. Solut transfektoitiin 0, 5, 10, 25, tai 50 nM kutakin siRNA ja reaaliaikainen elinkykyisyys seurataan käyttäen xCELLigence. (B) muutosnopeus solujen impedanssin, heijastavat muutoksia lisääntymistä (nouseva) ja /tai elinkelpoisuutta (negatiivinen kulmakerroin) transfektoiduissa soluissa valvontaa tai PTPMT1 siRNA. Alhaisempi muutosnopeus impedanssi liittyy pienentynyt solun kiinnitys, osoittaa solukuolemaa. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan kolmen kokeen. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen opiskelijan t-testiä; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001.

knockdovvn PTPMT1 herkistää Syöpäsolut lähes tappavaan paklitakseliannoksilla

Havainto, että tasauspyörästö knockdown tasot PTPMT1 muuttunut syöpäsolun kohtalo nosti esiin mahdollisuuden, että optimaalista knockdovvn PTPMT1 (tasolle ei riitä indusoimaan apoptoosin) voi herkistää syöpäsolut alhainen kemoterapeuttisten, jotka muutoin olisivat suhteellisen tehotonta. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme transfektoitu 5 nM ohjaus- tai PTPMT1-spesifisiä siRNA: HeLa-soluja 30 tunnin ajan, ennen kuin altistetaan näiden solujen pieninä pitoisuuksina (5 nM), kemoterapeuttisen paklitakselin vielä 24 tuntia. Kuvio 5 osoittaa, että transfektio HeLa-solujen heikosti kuin kohdistaminen siRNA ei edistä herkistyminen pieniä annoksia paklitakselia, 5 nM paklitakselia indusoi 21% pienempi solun elinkelpoisuutta kuin kohdistaminen siRNA (kuvio 5A). Transfektio 5 nM PTPMT1 oli riittävä herkistää soluja paklitakselihoidolla: kun taas 21% kontrollisolujen tehtiin solukuolemaa kun läsnä oli 5 nM paklitakselia, 38%: n tai 57% 5 nM PTPMT1 siRNA-käsitellyt solut tehtiin merkittävästi enemmän solukuoleman mukaisesti samoissa olosuhteissa (siRNA: t 1 ja 2, vastaavasti; p 0,01 PTPMT1 siRNA # 1, p 0,001 PTPMT1 siRNA # 2, kuviot 5B ja C). Tärkeää on, 5 nM kutakin siRNA kohdistaminen PTPMT1 ei aiheuta merkittävää solun myrkyllisyyttä 72 tuntia (kuvio 5D, E), jotka osoittavat, että kuoleman aiheuttama 5 nM PTPMT1 siRNA yhdessä 5 nM paklitakselihoidolla on todennäköistä, synergistinen vuorovaikutus. Vahvista Näiden havaintojen määritimme solujen populaatio, joille solukuoleman kun paklitakselin altistuksen inkubaation jälkeen 5 nM PTPMT1 siRNA. Vaikka ei ole 0,1 nM tai 1 nM paklitakseli indusoi propidiumjodidilla positiivisuus transfektoiduissa soluissa ei-suunnattu siRNA (kuvio 5F, mustat pylväät), molemmat paklitakseliannoksilla lisäävät merkittävästi solujen populaatio, joille solukuoleman transfektion jälkeen PTPMT1 siRNA: ita ( Kuva 5F, harmaat pylväät). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että subletaalisia RNAi-välitteinen knockdovvn PTPMT1 on riittävä herkistää HeLa-solujen osa-tappava annos kemoterapeuttista paklitakseli.

(A-C) HeLa-solut transfektoitiin 5 nM non -targeting siRNA (A), PTPMT1 siRNA # 1 (B), tai PTPMT1 siRNA # 2 (C) 30 tunnin ajan ennen käsittelyä annos-vaste-subletaaleille paklitakselin (enintään 5 nM) 24 tuntia. Elävyys mitattiin käyttäen Cell Titer Glo. (D) elinkelpoisuus käsittelemättömien transfektoiduissa HeLa-soluissa kunkin siRNA 54 tuntia. (E, F) kvantifiointi HeLa solujen elinkelpoisuuden (E) tai HeLa solukuoleman propidiumjodidilla syrjäytyminen (F) kanssa 5 nM ei-kohdistuksen tai PTPMT1 siRNA (54 h yhteensä kohtelu) ja 5 nM paklitakselihoidolla (24 h yhteensä hoito) . Kutakin koetta varten, virhepylväät osoittavat standardipoikkeaman kolmesta kokeesta. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen opiskelijan t-testiä; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001.

PTPMT1 Knockdown indusoi Merkittävät Metabolinen muutokset Syöpäsolut

Kun on tunnistettu mitokondrio fosfataasi, PTPMT1 toiminta oli yhdistetty mitokondriaalisen aineenvaihduntaa, kun se oli osoittaneet, että PTPMT1 knockdown aiheuttaa voimakkaaseen kasvuun solujen ATP-tasot haiman beta-soluissa [7]. Äskettäin PTPMT1 todettiin olevan keskeinen fosfataasi biosynteesissä kardiolipiini keskeinen mitokondrio lipidiin liittyvät sekä mitokondrioiden aineenvaihduntaa ja apoptoosin. Tärkeää on, puutteet solun kardiolipiini tasoilla on liitetty apoptoosin [14], [20], joka johtaa meidät tutkimaan, jos PTPMT1 Knockdown syöpäsoluissa muuttaa tämän mitokondrioiden lipidejä. HeLa-solut transfektoitiin ei-kohdistuksen tai allas PTPMT1 siRNA: iden (siRNA: t # 1 + # 2), 72 tunnin ajan, minkä jälkeen solujen lipidit olivat radioaktiivisesti, uutettiin, ja ratkaistaan ​​ohutkerroskromatografisesti. Joka on aiemmin julkaistut tulokset [9], ablaatio PTPMT1 ilmaisu aiheuttaa vahva lasku kardiolipiini tasoilla suhteessa soluihin, jotka ilmentävät ei-kohdistuksen ohjaus (77%: n lasku, p 0,001, kuviot 6A ja B). Nämä muutokset mitokondrion lipidikoostumukseen on osoitettu muuttavan metabolinen kapasiteetti solujen menetys PTPMT1 ilmaisun tuloksena kasvusta ATP tasojen johtuvat korvaava siirtyminen tehostetun Glykolyysivaiheen [9]. Sen määrittämiseksi, mitokondrion aineenvaihdunta on muuttunut PTPMT1 Knockdown soluissa, ATP-tasot mitattiin soluissa, jotka ilmentävät joko ei-kohdistuksen tai PTPMT1 siRNA-allas (siRNA: t # 1 + # 2). Kuten on esitetty kuviossa 6C, PTPMT1 pudotus soluilla on huomattavasti enemmän ATP solua kohden kuin transfektoitujen solujen ei-kohdistuksen ohjaus, kun kasvatetaan standardi väliaineessa, joka sisältää glukoosia (40,5% enemmän ATP /solu, p 0,001). Sen määrittämiseksi, jos tämä lisäys riippuu glukoosiaineenvaihdunnan, me myös suorittaa tätä kokeilua soluissa viljelty väliaineessa, joka sisälsi vain pyruvaattia hiilenlähteenä, hylännyt glycolyic ohjelman mukana. Näissä olosuhteissa ei ole merkittävää muutosta ATP-tasot in PTPMT1 pudotus soluissa verrattuna kontrollisoluihin (10% enemmän ATP /solu, kuviossa 6C, p = 0,178). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että PTPMT1 Knockdown vähenee kardiolipiini tasoa HeLa-soluissa, mikä johtaa ohimenevää ATP-tasot riippumaton mitokondrioiden aineenvaihduntaa, todennäköisesti johtuu tehostetun glykolyysin.

(A, B) HeLa-solut transfektoitiin ei-kohdistamista tai poolin PTPMT1 siRNA: iden (# 1 + # 2) 72 tuntia. Soluja inkuboitiin

32P-ortofosfaatti ja radioaktiivisella leimalla lipidit uuttaa ja ratkaistiin ohutkerroskromatografisesti. Kardiolipiinin on esitetty korkeimmalla kohdalla kuvattiin TLC-levyt (A), ja koko kardiolipiini kvantitoitiin (B). (C) kokonaismäärä ATP /solu tutkittiin transfektoiduissa soluissa ei-kohdistuksen tai PTPMT1 allas siRNA: iden 72 tuntia. ATP /kenno määritettiin soluissa kasvaa sekä korkean glukoosia sisältävässä väliaineessa tai väliaineessa, joka sisältää vain pyruvaattia. Virhepylväät osoittavat standardipoikkeaman vähintään kolmen kokeen. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen opiskelijan t-testiä; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001.

aleksidiini Dihydrochloride Estää PTPMT1

in vitro

ja indusoi apoptoosia syöpäsoluissa

Äskettäin julkaisu on tunnistettu yhdiste aleksidiini dihydrokloridi selektiivisenä estäjänä PTPMT1

in vitro

[15]. Olemme pyrkineet vahvistamaan näitä tietoja käyttäen yhdistelmä PTPMT1. Kontrollina, testasimme myös kykyä aleksidiini dihydrokloridia estää MKP-3, kaksi spesifisyys fosfataasi vähän homologiaa PTPMT1. Yhdenmukainen tuottamien tietojen Doughty-Shenton et al., Aleksidiini dihydrokloridi estää fosfataasiaktiivisuutta PTPMT1 on huomattavasti pienempi IC

50 kuin muut fosfataasit, kuten MKP-3 (2,5 pM PTPMT1 v. 265 uM MKP-3 kuvio 7A). Ennen toteamisesta erityinen estäjä PTPMT1 fosfataasiaktiivisuus, aleksidiini dihydrokloridi oli osoitettu aiheuttavan apoptoosin syöpäsoluissa [21]. Sen määrittämiseksi, onko aleksidiini dihydrokloridi solukuolema meidän koejärjestelmässä, teimme yksinkertainen annos-vaste-koe, jossa me alttiina HeLa-solujen kaksinkertaiseksi sarjalaimennoksia aleksidiini dihydrokloridin 24 tuntia. Yhdenmukainen aiempien raportin, aleksidiini dihydrokloridi edistänyt vankka solukuolemaa, jota EY

50 lähellä 2,8 uM (kuvio 6B). Tärkeää on, tämä pitoisuus on lähellä pitoisuus, joka nimenomaan estää rekombinanttia PTPMT1

in vitro

, mikä viittaa siihen, että kohdentaminen tämän fosfataasin voisi olla vastuussa tästä solukuoleman fenotyypin.

(A) Rekombinantti PTPMT1 ja MKP-3 käsiteltiin eri pitoisuuksilla aleksidiini dihydrokloridia,

in vitro

fosfataasin määritykset suoritettiin, ja tuloksena vaikutukset entsymaattinen aktiivisuus mitataan. IC

50 jokaista entsyymiä laskettiin ja näytetään SigmaPlot. (B) HeLa-soluja käsiteltiin annosvaste aleksidiini dihydrokloridin 24 tuntia ja johtuvat muutokset elinkelpoisuus mitattiin käyttäen Cell Titer Glo. (C, D) HeLa-soluja käsiteltiin aleksidiini dihydrokloridi 24 tuntia ennen mittausta solukuolemaa (C) propidiumjodidivärjäys (C) tai apoptoosin induktio anneksiini V-värjäyksellä (D). Kutakin koetta varten, virhepylväät osoittavat standardipoikkeaman kolmesta kokeesta. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen opiskelijan t-testiä; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001.

Varmista, että aleksidiini dihydrokloridi indusoi apoptoottista solukuolemaa samanlainen kuin mitä näimme PTPMT1 siRNA Knockdown, me alttiina HeLa solut annosvaste aleksidiini dihydrokloridia, mitkä pitoisuuksilla aiheuttaa solukuoleman (via propidiumjodidivärjäys) ja onko tämä solukuolema oli apoptoottinen (määrittämällä anneksiini V positiivisuus). Nämä tiedot osoittavat, että dramaattinen kasvu HeLa solukuoleman välillä 2,5 ja 5 uM aleksidiini dihydrokloridi käsittely (kuvio 7C), joka yhtyy alkuperäistä annosvastekäyränä. Tärkeää on, että tämä muutos solukuolema on apoptoottisia, koska vastaavaa lisäystä anneksiini V-positiivisten solujen nähdään samalla annosvaste (kuvio 7D), ja on pieni mikromolaarisella alueella, joka kohdennettuja PTPMT1 fosfataasiaktiivisuus

in vitro

. Nämä tiedot viittaavat siihen, että apoptoottinen fenotyyppi aiheuttama aleksidiini dihydrokloridi hoito voisi johtua esto PTPMT1 fosfataasin aktiivisuuden.

subletaalit annokset aleksidiini Dihydrochloride riittävät herkistää syöpäsolut alhainen paklitakselin mutta eivät ole täysin riippuvaisia PTPMT1 esto

data viittaa siihen, että subletaalisia knockdovvn PTPMT1 voi herkistää soluja subletaalisia annokset kemoterapeuttisen ehdotti, että subletaalisia annokset aleksidiini dihydrokloridin voisi myös resensitize solujen kemoterapeuttisten. Käyttäen annos-vaste-käyrät analysoitiin kuviossa 6, käsittelimme HeLa-solut, joilla on osa-tappavan annoksen joko 0,5 uM tai 1 uM aleksidiini dihydrokloridin 24 tuntia. Tärkeää on, että kumpikaan konsentraatio lääkkeen aiheuttama solukuolema tämän ajan kuluessa (kuvio 7B-D). Sitten altistuvat aleksidiini dihydrokloridi käsiteltyjä soluja tai soluja, jotka oli käsitelty vehikkelillä vain ohjaus, ja annos-vaste-paklitakselia vielä 24 tuntia, ennen kuin määrityksiin elinkelpoisuutta. Molemmat annokset aleksidiini dihydrokloridia riittivät herkistää soluja monenlaisia ​​paklitakselipitoisuudet. Mielenkiintoista, 0,5pM aleksidiini dihydrokloridi voinut merkittävästi herkistää soluja paklitakseliannoksilla alle EY

50 (annoksilla 0,01-7,8 nM, Kuvio 8A). Kuitenkin suuremmilla annoksilla, jotka kaikki ylittävät 15,6 nM paklitakselia, aleksidiini dihydrokloridi esikäsittely pystyy merkittävästi herkistää soluja paklitakselihoidolla (15,6 nM annoksen, p 0,05, sillä 31,25-250 nM paklitakselia, p 0,01, kuva 8A). Vertailun vuoksi 1 uM aleksidiini dihydrokloridi herkistää soluja paklitakselille lainkaan tutkituilla annoksilla (0,01 nM annoksen, p 0,05, kaikkien muiden annosten, p 0,001, kuvio 8B). Vahvista nämä tiedot, määritimme solujen prosenttiosuus alttiina subletaalit tasoille aleksidiini dihydrokloridin (0,5 uM tai 1 uM), joka tahra positiivisesti propidiumjodidista hoidon jälkeen 1 nM paklitakselia. Kun taas solujen käsittely ajoneuvon on vain vähäinen vaikutus kontrolloida altistettujen solujen paklitakseli (8,0% v. 8,6% solukuoleman, p = 0,24, ns, kuvio 8C), pre-solujen käsittely joko 0,5 uM tai 1 uM aleksidiini