Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kertyvät todisteet osoittavat, että epiteelisyöpäsolujen, kuten nenänielun karsinooma (NPC) solut, express immunoglobuliinit (Ig: t). Olemme aiemmin havainneet, että ilmaus kappa-kevytketjun proteiinin NPC-solut voidaan voimistuvan EBV-koodatun piilevä membraaniproteiini 1 (LMP1). Tässä tutkimuksessa käytimme NPC solulinjoja malleina ja totesi, että LMP1-täydennetty kappa tuotanto vastaa kohonneet ERK fosforylaatioon. PD98059 vaimentaa LMP1 aiheuttama ERK-fosforylaation mikä laski ilmentymisen kappa-kevytketjun. ERK-erityisiä Sirna pilaa LMP1 aiheuttama

kappakevytketjun

geeniekspressiota. Lusiferaasireporttiterilla määritykset osoittavat, että immunoglobuliini

κ

3 ’tehostajana (3’E

κ) on aktiivinen IgK ilmentäviä NPC solujen ja LMP1 ylössäätelee aktiivisuus 3’E

κ NPC soluissa. Lisäksi mutaatio analyysi PU sitova sivusto 3’E

κ ja estämällä MEK /ERK-reitin PD98059 osoittavat, että PU sivusto on toimiva ja LMP1-tehostetun 3’E

κ aktiivisuus on osittain säännelty Tämä sivu. PD98059 hoito johtaa myös pitoisuudesta riippuvaa inhibitiota LMP1 aiheuttaman Ets-1 ilmentymisen ja fosforylaatio, joka vastaa annosriippuvaisesti vaimennus LMP1 aiheuttaman ERK-fosforylaation ja kappa-kevytketjun ilme. Tukahduttaminen endogeenisen

Ets-1

by Sirna mukana on lasku Ig kappa-kevytketjun ilme. Gel shift joissa käytetään ydin- otteet NPC solujen osoittavat, että transkriptiotekijä Ets-1 värvää LMP1 PU motiivi kuluessa 3’E

κ

in vitro

. ChIP määritykset osoittavat edelleen Ets-1 sitoutumisesta PU motiivi 3’E

κ soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että LMP1 ylössäätelee 3’E

κ toimintaa ja

kappa

geeniekspressiota aktivoimalla Ets-1 transkriptiotekijän kautta ERK signalointireitin. Meidän tutkimukset antavat näyttöä uusi sääntelyn mekanismi kappa ilmaisun, jolla virus-koodatut proteiinit aktivoivat

kappa

3 ’tehostajana aktivoimalla transkriptiotekijöitä ei-B epiteelisyöpäsolujen.

Citation : Liu H, Duan Z, Zheng H, Hu D, Li M, Tao Y, et ai. (2012) EBV-Koodattu LMP1 ylössäätelee Ig

κ

3’Enhancer Toiminta ja Ig

κ

ilmentäminen Nenänielun Syöpäsolut aktivoimalla Ets-1 ERK Signaling. PLoS ONE 7 (3): e32624. doi: 10,1371 /journal.pone.0032624

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 01 helmikuu 2012; Julkaistu: 01 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat valtion Key Basic tutkimus- ja kehittämissuunnitelma (973), Ministry of Science and Technology of China (nro 2004CB518703), National High Technology Research ja kehittämisohjelma (863) Kiinan (nro 2006AA 02A 404) ja National Nature Science Foundation of China (nro 30471968, nro 30973399). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

rajoittaminen immunoglobuliinin (Ig) ekspression soluihin B-solulinjaa on vakiintunut. Kuitenkin olemme huomanneet, Ig kappa kevytketju ”yllättäen” ilmaistaan ​​epiteelin syöpäsolulinjoissa ja epiteelikudosten [1], [2], [3]. Ilmaisu Ig kappa-kevytketjun ei-hematopoieettista tuumorisolulinjat myös raportoinut muissa laboratorioissa [4], [5], [6], [7].

immunoglobuliini

kappakevytketjun

geenien ilmentyminen on valvonnassa erillisiä cis-säätelyelementtejä, kuten promoottorit ja tehostajat. Kaksi tärkeää

kappa

parantajia: introni tehostajana (iE

κ), joka sijoittuu J

κ-C

κ alueen ja 3’tehostajana (3’E

κ), joka sijaitsee alavirtaan C

κ alueella, on tunnistettu [8], [9], [10]. Molemmat parantajia ovat inaktiivisia pro-B ja esi-B-solujen vaiheet ja aktiivisia IgK ilmentävä kypsän B-solujen ja plasmasolujen vaiheissa [10], [11]. Aktiivisuus Näiden parantajia on yleensä transkriptionaalisesti hiljainen muissa soluissa, jotka eivät voi tuottaa kappaketjun, kuten T-lymfosyyttejä (Jurkat) [10], epiteelisolut (HeLa) [10], ja NIH3T3-fibroblasteissa [12]. Näiden havaintojen perusteella, aktivointi näiden säätelyelementtejä uskotaan yleisesti vaaditaan

immunoglobuliini kappa

geenien ilmentymistä ja on B solulinjaan vapaan tapahtuma [10]. Kiinnostavaa, olemme havainneet, että ihmisen iE

κ on aktiivinen IgK-ilmentävät nenänielun karsinooma (NPC) solulinjoissa, mikä on tärkeää kevyen kappa-ketjun ilmentymisen näissä soluissa [13]. Kuitenkin myös muut

kappa

tehostajana, 3’E

κ, on toiminnallinen IgK ilmentäviä epiteelisyöpäsolujen edelleen tuntematon.

toiminta edistävät välittävät DNA sitovia proteiineja jotka rekrytoidaan sääntelyn osia parantajia. Useita myönteisiä säätelyelementtejä on tunnistettu 3’E

κ, kuten konsensus PU motiivi (TTTGGGGAA) transkription tekijä Ets-sukuiset proteiinit [10]. ETS perhe käsittää useita subfamilies, kuten ETS (Ets-1, Ets-2), TCF (Elk-1, Sap-1, jne.), Ja SPI (PU.1, Spi-B, Spi-C jne.) . Perheenjäsenet tunnistetaan sen perusteella, niiden rakenteellinen koostumus ja niiden yhtäläisyyksiä evoluutiossa kunnostetussa Ets verkkotunnusten välittävät sitoutumista puriinirikkaan DNA-sekvenssit, joissa on keskeinen GGAA /T ydin konsensus [14], [15]. Ets perheen proteiinit ovat ydin- proteiineja ja fosforylaatio on tärkeä translaation jälkeistä muuttamista monet Ets perheenjäsenet, jotka voivat vaikuttaa niiden transkription toimintaa ja DNA-sitova toiminta [15]. B-soluissa, sitoutuminen PU.1 proteiinin kappa-3 ’tehostaja on tärkeä rooli 3’E

κ funktiona [16]. Fosforylaatio PU.1 at Ser148 tarvitaan vuorovaikutusta PU.1 kanssa Pip DNA ja tämä fosforylaatio voi säädellä transkriptionaalista aktiivisuutta PU.1 [17]. Kuitenkin PU.1 proteiini yksinomaan ilmaistaan ​​hematopoieettisten solujen [15], [18] eikä se todennäköisesti suorittaa sääntelytehtävää in IgK ilmentäviä epiteelisyöpäsolujen. Tuoreessa tutkimuksessa käyttämällä kromatiinin immunosaostuksella yhdistettynä genominlaajuisten promoottori mikrosirut kyselyn käyttöasteen kolme ETS proteiinien ihmisen T-solulinja, paljasti, että tarpeeton käyttöaste oli usein havaittu, kun taas erityisiä käyttöaste oli vähemmän todennäköistä [19]. Näin voimme spekuloida, että jos 3’E

κ on todellakin toimiva IgK ilmentäviä epiteelisyöpäsolujen, muut Ets proteiinit ovat todennäköisesti rooli 3’E

κ aktiivisuus kuin PU.1 . Siksi päätimme tutkia tarkemmin, mikä transkriptiotekijä (t) sitoutuneena PU sitoutumiskohta 3’E

κ ja onko sitoutuminen on tärkeää 3’E

κ toiminnallinen aktivaation Ig kappa ilmentävien epiteelisolujen syöpäsolut.

edellinen tutkimus osoitti, että

kappakevytketjun

geeni ilmennettiin NPC ja muiden epiteelikasvainsolut. Mitä mielenkiintoisinta, huomasimme, että tasot kevyen kappaketjun olivat huomattavasti korkeammat LMP1-positiivisten solujen verrattuna LMP1-negatiiviset solut [2]. Koska sen transformoivan ja tuumorigeenisiä toimintaa, LMP1 katsotaan olevan merkittävä kasvaimia synnyttävän koodaama proteiini EBV. LMP1 välittää erilaisia ​​solun signalointireittien kuten NF-KB, c-Jun-NH

2-terminaali kinaasien (JNK), p38 /MAPK, PI3K /Akt ja JAK /STAT ja aiheuttaa transkription säätelyä useiden solun geenejä, kuten kuten

il-6, IL-8, bCL-2, CD23, A20

ja

EGFR

[20], [21], [22]. LMP1 voi myös aktivoida Ras /ERK /MAPK signalointireitille [23], ja Ras /MAPK signalointikinaasit, Raf, MEK ja ERK: t, aktivoituvat LMP1 ilmentäviä nenänielun epiteelisolujen [24]. Lisäksi Kim [25] kertoi, että vakaa transfektoimalla

LMP1

geeni MDCK-soluissa indusoima Ets-1, mikä viittaa siihen, että

Ets

voisi olla tavoite geenin LMP1. Kuten edellä on mainittu, Ets-1 ja Ets-2 ovat alaperheen jäseniä Ets-related proteins. Molemmat ovat ydin- tavoitteita Ras-signalointireitin ja fosforylaation konservoituneita treoniinitähteitä, Thr38 ja Thr72, on tarpeen molekyylipainon tapahtuma Ras-aktivaatio näiden transkriptiotekijöiden [26]. Kumulatiivisesti, joka on LMP1 /ERK /Ets /kappa signalointiryöpyn olla olemassa, jolla LMP1 ylössäätelee kappakevytketjun ilmentymistä NPC soluissa.

Tässä tutkimuksessa, MEK estäjä, PD98059, käytettiin tutkittaessa roolia ERK väylän LMP1-parannettu kevyen kappaketjun tuotantoa NPC soluissa. Tässä esitetyt tulokset osoittavat, että LMP1-täydennetty kappa tuotanto vastaa kohonneet ERK fosforylaatioon. PD98059 estää LMP1 aiheuttaman ERK-fosforylaation mikä laski ilmentymisen kappa-kevytketjun. ERK-erityisiä Sirna pilaa LMP1 aiheuttama

kappakevytketjun

geeniekspressiota. Lusiferaasireporttiterilla määritykset osoittavat, että 3’E

κ on aktiivinen IgK ilmentäviä NPC solujen ja vakaa LMP1 ilmaisun ylössäätelee aktiivisuutta 3’E

κ NPC soluissa. Mutaatiot PU sitoutumis- 3’E

k- merkittävästi vähentää LMP1-parannettu 3’E

κ aktiivisuutta. LMP1 aiheuttama 3’E

κ toimintaa dramaattisesti inhiboivat ERK ylävirtaan estäjä, PD98059. Hoito PD98059 johtaa myös pitoisuudesta riippuvaa inhibitiota LMP1 aiheuttaman Ets-1 ilmentymisen ja fosforylaatio, joka vastaa annosriippuvaisesti vaimennus LMP1 aiheuttaman ERK-fosforylaation ja kappa-kevytketjun ilme. Knockdown Endogeenisen

Ets-1

by Sirna mukana on lasku Ig kappa-kevytketjun ilme. Gel shift joissa käytetään ydin- uutteita valmistetaan eri NPC solulinjoista vahvistaa, että transkriptiotekijä Ets-1 värvää LMP1 PU motiivi ihmisen

kappa-kevytketju

geeni. ChIP määritykset osoittavat lisäksi, että Ets-1 sitoutuu suoraan PU motiivi 3’E

κ soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että LMP1 ylössäätelee 3’E

κ toimintaa ja

kappakevytketjun

geenin ilmentymistä aktivoimalla Ets-1 transkriptiotekijän kautta ERK signalointireitin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja soluviljelmä

HNE2 on EBV-LMP1-negatiivinen ihmisen NPC solulinjassa. HNE2-LMP1 on solulinja, joka ekspressoi konstitutiivisesti LMP1 käyttöönoton jälkeen täyspitkän

LMP1

cDNA HNE2 soluihin [27]. Ihmisen myeloomasolulinjat, XG6, joka ilmaisee sytoplasminen λ kevyen ketjun, ja XG7, joka ilmaisee sytoplasmisen κ kevytketjun [28], käytettiin kappaketjun negatiivisia ja positiivisia kontrolleja, vastaavasti. Raji on ihmisen B-solujen Burkittin lymfooman solulinjassa. Kaikki solulinjat pidettiin RPMI1640 (GIBCO, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (GIBCO, USA), 1% glutamiinia ja 1% antibiootteja 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Sillä XG6 ja XG7 solut, 1 ng /ml rIL-6 (Sigma, St. Louis, MO) lisättiin RPMI1640-alustaa, johon kuten edellä on kuvattu [28]. Solut logaritmisessa kasvuvaiheessa käytettiin kaikissa kokeissa.

Kemikaalit ja solun hoitojen

ERK ylävirtaan kinaasi MEK estäjä, PD98059 (Cell Signaling, USA), valmistettiin kantaliuos 20 mM dimetyylisulfoksidissa (DMSO, Sigma). Subkonfluentit solut käsiteltiin yhdisteen eri pitoisuuksilla eri aikoina. Yksityiskohtaiset käsittelymenetelmät on kuvattu kuvassa Legends. Lopullinen DMSO-konsentraatio elatusaineessa pidettiin alle 0,1%, mikä ei ollut merkittävää vaikutusta solujen kasvuun. Vehikkelikontrollit valmisteltiin kaikkien hoitojen.

Plasmidit

Ihmisen

β-globiini

promoottori oli 128 emäsparin minimaalinen promoottori sama, jolla aiemmin [29]. Promoottori saatiin monistamalla ihmisen HNE2 solun genomisen DNA: n kanssa seuraavia alukkeita: sense, 5 ’-

gagctc

acggctgtcatcacttagacctcac-3′, joka sisältää

SacI

-kloonauskohta; antisense, 5 ’-

AAGCTT

taagcaatagatggctctgccctgac-3′, joka sisältää

Hind III

päällä. Fragmentti insertoitiin

Sac I /Hind III

kohtiin

pGL3-Basic

vektori (Promega, Madison, WI), ja plasmidi nimettiin

pGL3-β

.

313 emäsparin fragmentti, joka sisälsi ihmisen 3’E

κ tehostajana ydin ja 90 emäsparia ylävirtaan tehostajana ydinjaksoja [10], [30], [31] kloonattiin. 3’E

κ edistäjän fragmentti monistettiin HNE2 solun genomisesta DNA: sta PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita ihmisen

Ig kappa

geeni (GenBank tulonumero. NG_000834): sense, 5 ’-

GGATCC

cctcttggtaccccagcata-3 ’, joka sisältää keinotekoisen

BamHI sivuston; antisense, 5′-

gtcgac

ctgaaagggtgtggagtgct-3 ’, joka sisältää keinotekoisen

Sall Sivuston. PCR-monistetut fragmentit pilkottiin sitten

BamHI /Sall

ja insertoitiin vastaaviin restriktiokohtien

pGL3-β

edellä kuvatulla plasmidilla tuottaa

pβ-3 ’ E

κwt

. PCR-tuotteet vahvistettiin niiden koon, määritettynä elektroforeesilla ja DNA-sekvensoinnilla. PU motiivi mutantti (nimetty

pβ-3’E

κmt

) alkaen

pβ-3’E

κwt

muodostettiin PCR: perustuu päällekkäisyyttä laajennus tekniikka [ ,,,0],32]. Käytetyt alukkeet mutaatioiden olivat: eteenpäin, 5′-accctttgggcccctgaaaacagaacc-3 ’; käänteinen, 5’-ttttcaggggcccaaagggtcttctcc-3 ’. PCR-monistetut fragmentit halutut mutaatiot kloonattiin sitten

BamHI /Sall

kohtiin

pGL3-β

plasmidi. Odotettu mutaatiot ja eheyden tehostajana varmistettiin automaattisella sekvensoinnilla käyttäen Applied Biosystems sekvensseri ja ohjelmistot (Foster City, CA).

RNA-interferenssi

HNE2-LMP1 soluja kasvatettiin 6 kuoppaiset levyt ja transfektoidaan ERK-erityinen Sirna oligonukleotidi (si-ERK, Cat no: # 6560; 100 pmol, Cell Signaling) tai salattu oligonukleotidit (si-salattu, Cat no: # 6568; 100 pmol; Cell Signaling ); ETS-1-spesifisiä Sirna oligonukleotidi (si-Ets-1, Cat no: sc-29309, 150 pmol, Santa Cruz) tai salattu oligonukleotidit (si-salattu, Cat no: sc-37007, 150 pmol; Santa Cruz ) käyttäen Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA) 72 tuntia mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vahvista ERK tai Ets-1 knockdovvn, transfektoitujen solujen si-ERK, si-Ets-1, tai salattu oligonukleotidi kerättiin proteiiniuutto ja immunoblottaus.

lusiferaasireporttiterilla määrityksissä

pGL3-β, pβ-3’E

κwt

ja

pβ-3’E

κmt

tulikärpäsen lusiferaasireportterista edellä kuvatut plasmidit käytettiin yhdessä ohjaus

pGL3-Basic

vektorin (Promega) ja sisäisen valvonnan plasmidi

PRL-SV40

(Promega). Soluja viljeltiin 24-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

5 kuoppaa kohti yön yli ja sitten transfektoitiin ilmoitetuilla plasmidi käyttäen Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Kukin transfektio sisälsi 800 ng /kuoppa tulikärpäsen lusiferaasireportteriplasmidi ja 80 ng /kuoppa sisäisen valvonnan

PRL-SV40

plasmidiin. 24 h transfektion jälkeen solut joko jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin 50 uM PD98059 tai 0,1% DMSO: ssa 12 tunnin ajan. Solut kerättiin 36 tuntia transfektion jälkeen ja lysaatit analysoitiin tulikärpäsen ja

renilla

lusiferaasiaktiivisuuden mukaisesti valmistajan ohjeiden käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay Kit (Promega), jossa on GloMax 20/20 luminometrillä (Promega) . Lusiferaasireportteri plasmidit kotransfektoitiin

PRL-SV40

vektori korjaamiseksi vaihtelut transfektion tehokkuutta. Tiedot edustettuina taitteen induktio verrattuna

pGL3-Basic

vektori. Vähintään kolme riippumatonta transfektio kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin koe-konstruktia.

Käänteinen transkriptio ja polymeraasiketjureaktio

aliyhtyvät HNE2 ja HNE2-LMP1 solut käsiteltiin tai ei käsitelty 50 uM PD98059 varten 12 tunnin ajan. Kokonais-RNA eristettiin soluista, mukaan lukien XG6, XG7 tai Raji-solulinjoja valvontaa, käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen) ohjeiden mukaisesti valmistajan. RNA liuotettiin 20 ul: aan DEPC-käsiteltyä vettä ja kvantifioitiin 260 nm: ssä. Kokonais-RNA (2 ug) käänteistranskriptio SuperScript ™ IIRT (Invitrogen) 42 ° C: ssa 50 min, ja tuloksena cDNA altistettiin PCR. Sillä

kappa-kevytketjun

RT-PCR: llä, jotta voidaan määrittää optimaalinen PCR-sykliä numero, vakiomäärä tulon cDNA: ta käytettiin PCR-reaktioissa, sykli määrä vaihteli välillä 25 ja 40 (25, 28, 32, 36, 38, 40), ja PCR-tuote 36 sykliä oli hyvä havaittavan signaalin, ja oli lineaarisella alueella. Pyöräily edellytykset

ihmisen kappa-kevytketjun

(GenBank tulonumero. AJ010442) tai

aktiini

: 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 36 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 50 ° C: ssa 30 sekuntia, 72 ° C 30 sekuntia, ja laajennus 10 minuuttia 72 ° C: ssa. PCR-reaktio-olosuhteet Ets perheenjäsenten, LMP1 ja GAPDH ovat 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 32 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 40 sekunnin ajan, ja laajennus 10 min 72 ° C: ssa. Kvantitatiivista tosiaikaista RT-PCR: llä (qRT-PCR), iTaq SYBR Green Supermix kanssa Rox (Cat. No. 172-5850, Bio-Rad) käytettiin seuraavia sykliolosuhteita: 95 ° C: ssa 10 min, sitten 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja sen jälkeen 60 ° C: ssa 1 min ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Suhteellinen mRNA ekspressiotasoja laskettiin vertaileva CT (ΔΔCT) menetelmä normalisoinnin jälkeen GAPDH ilme. Alukesekvenssit monistamiseksi Ig kappa-kevytketjun, Ets perheenjäsenten [33], LMP1 [34], ja sisäiset kontrollit on lueteltu taulukossa S1. PCR-tuotteet erotettiin 1,5-2% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin etidiumbromidilla.

Proteiinin uutto

Koko-solu-lysaatit olennaisesti valmistettiin menetelmän mukaisesti, joka on aiemmin kuvattu [2]. Sillä elektroforeesi liikkuvuutta shift määritykset (EMSAs) tumauutteita valmistettiin käyttäen NE-PER Ydin- ja Sytoplasmiset Extraction Kit (Cat. No. 78833, Pierce, USA) seuraten valmistajan ohjeita. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-Assay Reagent (Cat. No. 23228, Pierce).

Western blot-analyysi

Proteiinit (50-100 ug) keitettiin SDS-näytepuskurissa 5 minuutin ajan , eroteltiin 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Millipore, USA). Epäspesifinen reaktiivisuus esti inkuboimalla kalvon 30 minuutin ajan Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween-20 ja 10% rasvatonta kuivamaitoa. Kaivoa inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa eri primaarisilla vasta-aineilla, jonka jälkeen inkuboitiin huoneenlämmössä 1 tunnin ajan piparjuuren peroksidaasiin konjugoitua hiiren tai kanin sekundaarinen vasta-aine (Santa Cruz, USA), ja pestiin sitten kolme kertaa 10 minuutin ajan kunkin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,1% Tween-20. Vasta-aine-sitoutuneet proteiinit havaittiin käyttäen vahvistettua kemiluminesenssidetektiolla kit (Cat. No. 34075, Pierce) ja sen jälkeen altistumisen autoradiografisten kalvon. Sen jälkeen, kun hyvää fosforyloidun ERK: t tai fosforyloitu Ets-1 tutkia ERK aktivoinnin tila tai Fosforyloidun Ets-1, kalvot stripataan inkuboimalla 50 ° C: ssa 30 min strippaus-puskuria (100 mM β-merkaptoetanolia, 2% (paino /tilavuus) natriumdodekyylisulfaatti ja 62,5 mM Tris-HCI, pH 6,8) ja uudelleenseulottiin anti-ERK tai anti-Ets-1. Seuraavia vasta-aineita käytettiin Western-blottauksella: hiiren anti-LMP1 monoklonaalinen vasta-aine (CS.1-4, DAKO, Tanska), kanin anti-ihmis-kappa-kevytketju-vasta-ainetta (A0191, DAKO), Ets-1 (sc-350), fosforyloitua treoniinien (sc-5267), ERK (sc-93), fosforyloitu ERK (sc-7383), ja α-tubuliinin (sc-5286) (kaikki Santa Cruz).

Immunopresipitointi

Koko-solulysaateista (200 ug) sekoitettiin proteiini A-Sepharose-helmiä (Sigma), inkuboitiin 4 ° C: ssa 2 tuntia, ja sentrifugoitiin 2 minuutin ajan 2000 rpm: llä preclearing. Sitten Supernatanttifraktio inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli 4 ug ETS-1-vasta-aineen ja proteiini A-Sepharose-helmiä, minkä jälkeen sentrifugoitiin 2 minuutin ajan nopeudella 12000 rpm. Immunopresipitaatit kerättiin ja pestiin viisi kertaa PAPI-puskurilla (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, joka sisälsi 1% NP-40, 0,05% SDS: ää, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl: a, ja proteaasi-inhibiittorit). Sakat eluoitiin proteiini-A-Sepharose helmiä keittämällä 5 min ja lopuksi suoritettiin Western blot-analyysi käyttäen vasta-ainetta havaitsemaan treoniinifosforylaatio.

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määritykset

elektroforeettisen liikkuvuuden muutos määritykset (EMSAs) suoritettiin käyttäen LightShift ™ Kemiluminesenssiin EMSA Kit (Cat. no. 20148, Pierce) noudattamalla valmistajan ohjeita. Proteiinikonsentraatio tumauutteiden määritettiin käyttäen BCA-proteiinimääritysreagenssilla (Cat. No. 23228, Pierce) ja EMSAs suoritettiin käyttäen eriä, jotka sisältävät yhtä suuret määrät proteiinia. Reaktioseokset (20 ui), joka sisälsi tumauutteita (8 ug) inkuboitiin biotiini-leimattua kaksijuosteista oligonukleotidikoettimia (2 nM) reaktiopuskurissa (Pierce) 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktiot suoritettiin elektroforeesi 5%: n polyakryyliamidigeeleillä 0,5 x Tris-boraatti-etyleenidiamiinitetraetikkahappo etikkahappoa (TBE) puskuri seurasi elektroblottaus päälle Biodyne ™ B nailonkalvoihin (Cat. No. 77016, Pierce) ja UV silloittumista . Biotinyloitua oligonukleotidia havaittiin sitten tutkimalla streptavidiinilla konjugoitu HRP ja visualisoitiin käyttäen ECL kit ja autoradiografialla. Kilpailun analyysit, 100-kertaisen ylimäärän vastaavaa leimaamatonta villityypin oligo tai mutantti-oligo on sisällytetty sitova reaktio. Vasta-aineen supermuutoksena kokeissa, reaktioseokset esi-inkuboitiin 2 ug: ETS-1 (sc-350X, Santa Cruz), vasta-ainetta huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Täydentävä oligonukleotideja käytettiin koettimina tai kilpailijoita ovat seuraavat: ihmisen villityypin κPU oligonukleotidit, 5′- gaagaccctttggggaactgaaaacaga-3 ’ja 5′-tctgttttcagttccccaaagggtcttc-3’, joka on johdettu sekvenssistä PU sivuston sisällä ihmisen 3’E

κ. Mutatoidun κPU oligonukleotidit (nimetty mutPU) käytettiin 5′-gaagaccctttgggcccctgaaaacaga-3 ’ja 5′-tctgttttcaggggcccaaagggtcttc-3’. Epäspesifinen kilpailevien koettimet olivat 5′-ccagagggggatttccaagaggcca-3 ’ja 5′-tggcctcttggaaatccccctctgg-3’, jotka olivat peräisin sekvenssistä NF-KB-sivustolle ihmisen iE

κ. Sitoutumiskohdat on alleviivattu ja mutaatioita lihavoitu. Mutatoitu oligo koettimet vastaan ​​κPU sidoskohdan EMSAs ovat samat kuin mutatoidun sekvenssien reportterigeenirakenteilla.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys

ChIP-analyysi suoritettiin käyttäen ChIP iinianalyysikitissä (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) mukaan valmistajan suositusten. Lyhyesti, formaldehydi lisättiin suoraan HNE2-LMP1 solujen lopulliseen konsentraatioon 1%, ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Sitten solut neutraloitiin 5 min glysiinillä huoneenlämpötilassa ja pestiin kahdesti jääkylmällä 1 x fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita. Solut hajotettiin käyttäen SDS-hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita. Chromatin lysaatissa (350 ui) leikattiin keskimäärin pituuden ~500 emäsparia sonikoimalla Branson Sonifier Cell Disruptor B15 (tehon säätö 4, käyttömäärä 40%), jossa 14 sykliä 20 sekunnin pulssia 20 sekunnin välein. Suspensio esipuhdistettiin on lohen sperman DNA /proteiini A /agaroosi-50% lietettä 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Kun chromatin oli ”esiselkeytettiin”, pieni näyte (10 ui) tallennettu ”input DNA” PCR-analyysi myöhemmin. Jäljellä olevat alikvootit (100 ui kutakin) leikataan silloitettua chromatin inkuboitiin yön yli 2 ug Ets-1 (sc-350X), kani-IgG (sc-2027) (Santa Cruz), tai ei-vasta-ainetta 4 ° C: ssa, joilla on lievä vapina. Immuunikompleksien inkuboitiin 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa lohen maidin DNA /proteiini A /agaroosi-50% liete, joilla on lievä ravistellen, pestiin ja eluoitiin. Ristisitova purettiin käyttämällä 5 M NaCl. Proteinaasi K -hajotuksen jälkeen, DNA: n näytteistä uutettiin fenolilla, saostettiin etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 50 ul: aan DDH

2O. DNA-liuos (2 pl) käytettiin 36 sykliä PCR-monistusta. PCR-tuotteet analysoitiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelissä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä. Seuraavia alukkeita käytettiin ChIP määrityksissä: ihmisen 3’E

κ edistäjän kuten PU-sitova alue, 5′-ccagggaccaagatagcaac -3 ’ja 5′-ctgaaagggtgtggagtgct -3’ (158 bp).

tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset laskelmat tehtiin käyttäen SPSS (v. 12,0) tilastollinen ohjelma. Erot eri ryhmien arvioitiin Studentin

t

testiä. Ero oli tilastollisesti merkitsevä, kun

p

0,05.

Tulokset

LMP1 parantaa kevyen kappa-ketjun ilmentymisen kautta ERK signalointireitin ihmisen NPC soluissa

LMP1 voi aktivoida Ras /ERK /MAPK signalointireitille [23] ja edellisessä tutkimuksessa todettiin, että LMP1 ylössäätelee kappakevytketjun ilmentymistä NPC solulinjoissa [2]. Vahvistaa, onko ERK koulutusjakso on osalliseksi LMP1-täydennetty kevyen kappaketjun ilmaisun PD98059 käytettiin manipuloimaan ERK aktivointia ja kappa-ketjun säätelyä aiheuttama LMP1. Taso ERK-fosforylaation oli suurempi HNE2-LMP1 soluissa kuin HNE2 soluja, jotka osoittivat, että LMP1 todellakin aktivoi ERK-reaktiotien NPC-soluissa (kuvio 1A). Hoito HNE2-LMP1 solujen PD98059 johti annoksesta riippuvalla tukahduttaminen LMP1 aiheuttaman kappa-kevytketjun (kuvio 1 B), joka vastasi annoksesta riippuvalla vaimennus ERK-fosforylaation indusoiman LMP1 (kuvio 1A). PD98059 (50 pM) osoitti selvästi estävä vaikutus HNE2-LMP1 soluissa, mutta ei ollut vaikutusta HNE2 soluihin (kuvio 1C). Sen määrittämiseksi, mikäli inhibitio Ig kappa ilmentymisen PD98059 käsittely tapahtuu transkription tasolla, HNE2 ja HNE2-LMP1 soluja pidettiin samoissa olosuhteissa ja tasot

kevyen kappa-ketjun

mRNA tutkittiin RT -PCR. Käsittely PD98059 (50 pM) aiheuttama vähentyneen merkittävästi LMP1 aiheuttama

kappa

mRNA ilmaisun, mutta

kappa

mRNA tasolla HNE2 pysyivät pääosin ennallaan (kuvio 1 D), joka yhtyy immunoblottaus tuloksia. Edelleen vahvistaa, että ERK koulutusjakso on rooli LMP1 aiheuttama

kappakevytketjun

geenien ilmentyminen, me pudotti

ERK

ilmentymisen RNA-interferenssi. Kun taas transfektio HNE2-LMP1 solut salattu oligonukleotidin ei vaikuttanut LMP1 aiheuttama

kappa

geenin ilmentymistä,

si-ERK

pyöristettyjä vaikutus LMP1 (kuvio 1 E), joka osoittaa, että ERK polku on mukana tämän tapahtuman. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset vahvistavat ajatusta siitä, että ylösajon kevyen kappa-ketjun LMP1 tapahtuu aktivoitumisen kautta ERK /MAPK-signalointi- reitin.

(A) HNE2-LMP1-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla PD98059 tai 0,1 % DMSO: ssa 2 tuntia. Kokosolulysaateille valmistettiin ja kokonais- ja fosforyloitu ERK-tasot määritettiin Western-blottauksella. (B) HNE2-LMP1-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla PD98059 tai 0,1% DMSO: ssa 12 tunnin ajan. Kappakevytketjun ilmentymistä NPC soluissa arvioitiin Western-blottauksella käyttämällä spesifistä vasta-ainetta. (C) HNE2 ja HNE2-LMP1-soluja käsiteltiin 50 uM PD98059 tai 0,1% DMSO: ssa 12 tunnin ajan, ja Western-blottaus suoritettiin havaita kappa-kevytketjun ilmaisua. (D) HNE2 ja HNE2-LMP1 soluja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi ilmoitetun pitoisuuden PD98059 tai 0,1% DMSO: ssa 12 tunnin ajan. Kokonais-RNA eristettiin soluista ja altistettiin RT-PCR: llä käyttämällä spesifisiä alukkeita suunniteltiin monistamaan

kevyen kappa-ketjun

ja

aktiini

mRNA: t. (E) HNE2-LMP1 solut transfektoitiin

si-ERK

tai salattu oligonukleotidi. ERK ja Ig kappa-proteiinia tasot havaittiin immunoblottauksella. Esitetyt tulokset edustavat kolmea riippumatonta koetta. Fosforylaatio tai kokonaan ilmaisun tasolla kunkin proteiinin sekä mRNA arvioitiin densitometrialla ja esitetään suhteessa vastaaviin latauskontrollina (oikea paneeli). XG7 ja XG6 solut näkyvät positiiviset ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti, kappa-kevytketju.

PU sitoutumiskohta on mukana LMP1-parannettu aktiivisuus 3’Eκ kautta ERK-reitin

aktivoituminen 3’E

κ vaaditaan

immunoglobuliini kappa

geeniekspressiota. Sen tutkimiseksi, onko 3’E

κ voitaisiin toiminnallisesti aktivoida NPC soluissa, me linkittänyt 313 emäsparin ihmisen 3’E

κ tehostajana fragmentti, joka sisältää tehostajan ydin ja 90 emäsparia ylävirtaan tehostajana ydinjaksoja tämä on tarpeen maksimaalinen edistäjän aktiivisuutta, kun tehostaja ydin ei ole suoraan promoottorin viereen [31], ihmisen

β-globiini

-promoottorin ilmentymisen tulikärpäsen lusiferaasi-geenin ja analysoitiin tämän reportteri-konstrukti ohimenevä transfektio NPC solulinjojen (kuvio 2A, B). Ihmisen

β-globiini

promoottori valittiin, koska se on aiemmin käytetty useissa tutkimuksissa immunoglobuliini parantajia [35], [36], [37], ja myös siksi, että löysimme sen olevan minimaalisesti vaikuttaa LMP1 meidän kokeissa (kuvio 2C ja kuvio 3). Konstruktit vietiin HNE2 ja HNE2-LMP1 solujen aktiivisuuden testaamiseksi 3’E

κ. Transfektio

pβ-3’E

κwt

syntyy suurempi lusiferaasiaktiivisuus kuin transfektio

pGL3-β

rakentaa (ei tehostajana), riippumatta siitä, onko LMP1-negatiivinen (

p

0,05) tai LMP1-positiivisia (

p

0,01) NPC soluja tutkittiin. Nämä tulokset osoittivat, että 3’E

κ on aktiivinen NPC soluissa, jotka ilmaisivat Ig kappa-kevytketjun. Lisäksi aktiivisuus 3’E

κ in HNE2-LMP1 soluissa oli noin 3-kertainen vuonna HNE2 soluissa (

p

0,05) (kuvio 2C), jonka kanssa sovittu kappa ketju ekspressiomalleja näiden kahden solulinjojen [2].