Krooninen sairaus

tiivistelmä

Thymosin β

10 (Tβ

10) säätelee aktiini dynamiikkaa kuin sytoplasmassa G-aktiini pidättävää proteiinia. Aikaisemmin olemme osoittaneet, että Tβ

10 alenee kasvaimen kasvua, angiogeneesin, ja leviämisen hajottamalla aktiini ja estämällä Ras. Kuitenkin vähän tiedetään sen toimintamekanismia ja biologinen funktio. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme perustaa uusi geeniterapian mallia käyttäen muuntogeenisten adenovirus, jota kutsutaan Ad.TERT.Tβ

10, joka voi yli-ilmentävät Tβ

10 geeni syöpäsoluissa. Tämä saatiin aikaan korvaamalla natiivi Tβ

10-geenin promoottori ihmisen TERT promoottori Ad.TERT.Tβ

10. Olemme tutkineet syövän tukahduttaminen aktiivisuutta Tβ

10 ja totesi, että Ad.TERT.Tβ

10 silmiinpistävän aiheuttama syöpä-erityinen ilmaisu Tβ

10 sekä apoptoosin rinnakkaisviljelmätilanteessa malli ihmisen primääri munasarjojen syöpäsolujen ja normaalien fibroblastien. Lisäksi Ad.TERT.Tβ

10 vähentynyt mitokondrion kalvon potentiaalia ja lisäsi reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto. Nämä vaikutukset monistettiin yhtäaikainen käsittely syöpälääkkeiden, kuten paklitakselin ja sisplatiinin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että nousu ROS tuotanto johtuu aktiini häiritsemiseen Tβ

10 yliekspressio lisää apoptoosin ihmisen munasarjasyövän soluja. Itse asiassa, syöpä-spesifinen yliekspressio Tβ

10 Ad.TERT.Tβ

10 voi olla arvokas syövän terapeuttista hoitoa varten munasarjasyöpä ilman toksisuutta normaaleille soluille.

Johdanto-osan : Kim YC, Kim BG, Lee JH (2012) Thymosin β

10 Expression ajamana Human TERT promoottori indusoi munasarjasyöpä-Specific Apoptosis kautta ROS tuotanto. PLoS ONE 7 (5): e35399. doi: 10,1371 /journal.pone.0035399

Editor: Yoshiaki Tsuji, North Carolina State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 joulukuu 2011; Hyväksytty: 16 maaliskuu 2012; Julkaistu: toukokuu 18, 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus lähde on Korean hallituksen. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tymosiineilla ovat perheen pieniä proteiineja, jotka on alun perin eristettiin vasikan kateenkorvan, ja ne jaetaan kolmeen luokkaan (α, β ja γ), joka perustuu niiden isoelektrisen pisteen [1]. Β-tymosiinit, joiden keskimääräinen molekyylipaino on noin 5 kDa, ovat erittäin konservoituneita happamia proteiineja, jotka ovat lähes kaikki eukaryoottisolussa. Β-tymosiinit estävät piikkilanka loppua aktiini polymerointi sitomalla aktiini monomeereja [2], [3]. Yhtenä runsaimmin β-tymosiinit imettäväisil-, tymosiiniaktiivisuutta β

10 (Tβ

10) vaikuttaa etäpesäke ja lisääntymistä monissa syöpäsolut [4] – [6]. Anti-syöpä vaikutuksia Tβ

10 näyttävät liittyvän läheisesti sen tehtävään säätelijänä aktiinin dynamiikan kasvainsoluissa [7], [8]. Actin dynamiikka voi levoton lisäämällä aktiini-vakauttaa lääkkeitä tai mutaatioiden aiheuttaen muutoksia solujen arkkitehtuurin ja sisäisen solujen liikkumista. Lisäksi viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että muutokset aktiini dynamiikka voi johtaa vapauttaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) peräisin mitokondrioita ja johtaa solukuolemaan, korostetaan säilyttää dynaaminen sääntely aktiinisytoskeletonin [9] – [14].

Äskettäin telomeraasi on tunnustettu laaja-tuumorimarkkeri ja nyt pidetään yhtenä tärkeimmistä terapeuttisina kohteina syövän hoitoon. Ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT), katalyyttinen alayksikkö telomeraasin, havaitaan noin 90% syöpäsolujen tuumorikudoksessa, mutta ei ole havaittavissa normaaleissa kudoksissa [15] – [17]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että hTERT-promootterin voi säädellä ektooppinen geenien ilmentymistä mielenkiinnon kohteena telomeraasia-positiivisten syöpäsolujen, mikä osoittaa, että hTERT-promootterin on lupaava ehdokas tuottaa syövän erityisiä adenovirusten [18] – [22].

Tässä kuvaamme rekombinantti-adenoviruksen, Ad.TERT.Tβ

10, joka on rakennettu insertoimalla Tβ

10 säätelyn alaisuudessa hTERT-geenin promoottori osaksi adenoviruksen p-shuttle-plasmidi indusoimaan kasvainspesifisen Tβ

10-geenin ilmentymistä. Olemme myös perustaneet yhdessä viljelemisen malli ensisijainen ihmisen munasarjan syöpäsolujen ja normaalien fibroblastien sekä jatkokäsitellään tämä rinnakkaisviljelemällä Ad.TERT.Tβ

10 valottaa syöpää konkreettisia vaikutuksia Ad.TERT.Tβ

10. Lisäksi olemme tutkineet mekanismi Tβ

10-indusoitua apoptoosia in 2774 ihmisen munasarjasyövän soluja, joita oli käsitelty Ad.TERT.Tβ

10. Nämä kokeet paljastivat todisteita siitä, että Ad.TERT.Tβ

10 indusoi syöpää erityinen ilmaisu Tβ

10, mikä johtaa syövän erityisiä apoptoosia ROS. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että syöpä-spesifinen yliekspressio Tβ

10 Ad.TERT.Tβ

10 voisi itse asiassa olla arvokas syövän terapeuttista hoitoa varten munasarjasyöpä ilman toksisuutta normaaleille soluille ja mahdollisesti muiden maligniteettien .

tulokset

Thymosin β

10 ilmoitettuna vähäisinä määrinä Munasarjasyöpä

meidän edellisessä tutkimuksessa raportoimme että Tβ

10 mRNA-tasot olivat koholla normaaliin munasarjat, verrattuna muihin kudoksiin, kuten perna, kateenkorva, eturauhanen, kives, ohutsuoli, paksusuoli ja perifeerisen veren leukosyytit, mutta mRNA-tasot Tβ

10 pieneni munasarjojen syöpien [23]. Olemme näin ollen vahvisti mRNA ja proteiini ekspressiotasot Tymosiinin β

10 (Tβ

10) vakavien tyypin munasarjasyövän ja mucinous tyyppi munasarjasyövän, sekä kohdunkaulan syövän ja kuolemattomaksi munasarjasyövän solulinjoissa, kuten kuten 2774, OVCAR3, ja SKOV3. Havaintomme että mRNA (kuvio 1A) ja proteiini (kuvio 1 B) tasojen Tβ

10 oli korkea normaalissa munasarjakudoksen, mutta laski kaikissa Seroosi syöpä, mucinous syöpä, ja kuolemattomaksi munasarjasyövän solulinjoissa, olivat yhdenmukaisia edellisessä tutkimuksessa. Emme kuitenkaan pystyneet havaitsemaan muutoksia normaalissa kohdunkaulan kudokseen, adenokarsinoomat, ja okasolusyöpää. Erityisesti, suuri ekspressiotasot Tβ

10 ovat ominaisia ​​normaalin munasarjat, mutta nämä tasot laskevat munasarjasyövän, viittaa siihen, että Tβ

10 on rooli munasarjan syövän kehittymisessä.

(A) mRNA ekspressiotasot Tβ

10 määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen kokonais-RNA: ta eristettiin ihmisen normaaleissa ja syöpäkudoksissa, kuten munasarjasyövän solulinjoissa, kuten vakavien karsinooma (seroosit. C) ja mucinous karsinooma (mucinous. C), kuolemattomiksi ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa (2774, OVCAR3, ja SKOV3) ja adenokarsinooman (Adeno. C) ja okasolusyöpää (okasolusyöpä. C) kohdunkaula. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE n = 3 erillistä näytettä kohden solutyyppi ryhmittely ja ilmaistaan ​​prosentteina normaalista munasarjasta. Merkittäviä eroja ryhmien välillä on merkitty tähdellä (*), P 0,05; Kahdella asteriskilla (**), P 0,01 (B) proteiini ilmentymisen taso Tβ

10 määritettiin immunohistokemiallisesti normaalissa munasarjassa kudosten ja verrataan että vakavien ja mucinous tyyppisiä munasarjasyöpä, vastaavasti.

syöpä-erityinen ilmaisu Thymosin β

10 Ad.TERT.Tβ

10

Valaistaan ​​roolin Tβ

10 ihmisen munasarjasyöpä, loimme uusi fysiologinen mallin viljellään yhdessä ensisijaisen munasarjasyöpä solujen normaalien fibroblastien ja käyttäen syöpää geenistä jakelujärjestelmästä, joka käsittää geneettisesti muunnettuja adenovirus. Rakensimme rekombinantti adenovirus, Ad.TERT.Tβ

10, korvaamalla Tβ

10-geenin promoottorin kanssa hTERT-promootterin, ja olemme vahvistaneet eheyden Ad.TERT.Tβ

10 polymeraasiketjureaktiolla ( PCR) käyttäen Ad-tERT, Tβ

10, ja E1a alukkeita (kuvio 2A). Vahvista taso Tβ

10 geenin ilmentymistä, käsittelimme 2774 solut Ad.TERT.Tβ

10 at infektiokertoimella (MOI) 10 ja sitten seurataan muutoksia Tβ

10 ilme käyttämällä immunosolukemiallinen (ICC) ja RT-PCR. Tuloksemme osoittivat, että Ad.TERT.Tβ

10 koholla Tβ

10 ilmentymistä sytosoliin (kuvio 2B).

(A) Kaavamainen esitys yhdistelmä-DNA-adenovirus, Ad.TERT.Tβ

10, syntyy rekombinaatio pSuttle.TERT.Tβ

10 ja selkäranka plasmidi pAdEasy-1 in BJ5183. Modifioidun pShuttle plasmidi, jota kutsutaan pSuttle.TERT.Tβ

10, kloonattiin hallittu insertoimalla ihmisen TERT- promoottorin ja Tβ

10-geeni tuottaa rekombinantti-adenoviruksen. Eheyden Ad.TERT.Tβ

10 määritettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen alukkeita Ad-TERT, Tβ

10, ja E1a. (B) aliyhtyvät 2774 munasarjasyöpä solut infektoitiin 10 MOI Ad.TERT.LacZ tai Ad.TERT.Tβ

10. 24 tunnin kuluttua Tβ

10-proteiinin ja mRNA-tasot määritettiin immunosytokemialla ja RT-PCR: llä, vastaavasti. (C) aliyhtyvät primäärisistä ihmisen munasarjasyöpä soluja viljeltiin yhdessä fibroblastien solut altistettiin 10 MOI Ad.TERT.LacZ varten 7 päivää. β-galaktosidaasi-ilmentymisen määrä määritettiin β-gal värjäyksellä (sininen väri). Arrow ytimessä luku osoittaa ensisijaisen munasarjasyöpäsolu massa. (D) aliyhtyvät primäärisistä ihmisen munasarjasyöpä soluja viljeltiin yhdessä fibroblastisoluja altistettiin myös 10 MOI Ad.TERT.Tβ

10 24 tunnin ajan. Tβ

10 ekspressiotaso määritettiin immunosolukemiallisella (vihreä väri). Alapuolella kuvion osoittavat ensisijaisen munasarjasyöpäsoluja.

arvioitiin myös syöpää selektiivisiä geeniekspression induktioon, yhdistelmä-DNA-adenoviruksia, Ad.TERT.Tβ

10 ja Ad.TERT.LacZ , meidän yhdessä viljelemisen malli ensisijainen munasarjasyöpäsoluja ja normaalien fibroblastien. Päivänä 7 käsittelyn jälkeen 10 MOI Ad.TERT.LacZ, havaitsimme, että munasarjasyövän solut olivat kasvaneet hyvin muodostaman kerroksen normaalin fibroblastisoluja, kuten on havaittu käsittelemättömässä ryhmässä. Lisäksi X-gal-positiivisten solujen, mikä osoittaa β-galaktosidaasi-ilmentymisen Ad.TERT.LacZ, havaittiin ainoastaan ​​ensisijainen munasarjasyöpäsoluja (kuvio 2C). 1. päivänä hoidon jälkeen Ad.TERT.Tβ

10, vihreä fluoresenssi, osoittaa Tβ

10 ekspressiota, havaittiin ensisijainen munasarjasyövän soluissa, mutta ei normaaleissa fibroblastisoluja (kuvio 2D), mikä viittaa siihen, että TERT-promoottori annetaan munasarjasyöpä erityisiä geeniekspressiota.

Effects of Thymosin β

10 munasarjasyöpäsolu Migration

Aiemmat raportit osoittivat, että syöpälääkkeen vaikutuksia Tβ

10 läheisesti jotka liittyvät sen säätelijänä aktiinin dynamiikan kasvainsoluissa [7], [8]. Me siis tutkittu roolia Tβ

10 syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Huomasimme, että molemmat syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota merkittävästi vähentynyt 2774 soluissa tartunnan Ad.TERT.Tβ

10, verrattuna 2774-solujen tartunnan Ad.TERT.LacZ ja infektoimattomia 2774 soluja (kuvio 3A). Suhteessa solujen vaeltamiseen, solu liike oli myös arvioitiin haavan paranemista määrityksessä. 2774 soluliikkuvuus muovisen pinnan heikkeni huomattavasti Ad.TERT.Tβ

10 hoitoa (kuvio 3B).

(A) aliyhtyvät 2774 ihmisen munasarjasyövän solut infektoitiin 10 MOI Ad.TERT .LacZ tai Ad.TERT.Tβ

10 12 tunnin ajan. Sen jälkeen uudelleen jousitus, soluja inkuboitiin edelleen 12 tunnin ajan ylemmässä kammiossa TRANSWELL® levy päällystetty kollageenia yksikerroksista migraatiokokeessa tai kaksinkertaisella kerroksella kollageenia ja matrigeelin varten invaasiomääritys. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina ajoneuvon valvonnan ja ovat keskiarvo ± SE (pylväät) kolmesta kokeesta. Merkittäviä eroja hikkelikontrolliryhmään merkitään tähdellä (*), P 0,05; Kahdella asteriskilla (**), P 0,01 (B) virus-tartunnan soluja myös edelleen inkuboitiin 35 mm: μ-lautasen, matala, joiden kulttuuri-Insert (Ibidi) 12 tunnin ajan, ja sen jälkeen havainto suunnan ja nopeuden solumigraation aikana haavan paranemista. Arpeutumisprosessit Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina ajoneuvon hallinnan ja ovat keskiarvo ± SE (pylväät) kolmesta kokeesta. Merkittäviä eroja hikkelikontrolliryhmään merkitään Kahdella asteriskilla (**), P 0,01.

induktio Cancer erityisiä Apoptoosi Ad.TERT.Thymosin β

10

vaikutusten tutkimiseksi yli-ilmentyminen Tβ

10 syövän solujen elinkykyä, subkonfluenteista 2774 munasarjasyövän solut infektoitiin Ad.TERT.LacZ tai Ad.TERT.Tβ

10 MOI 10, ja MTT-biomääritys suoritettiin päivittäin 6 päivää. Huomasimme, että Tβ

10 väheni merkittävästi munasarjasyövän solujen elinkykyä, verrattuna median valvontaa tai ilman Ad.TERT.LacZ (kuvio 4A). Seuraavaksi tutkia, onko lasku solujen elinkelpoisuuden johtui apoptoosin, suoritimme FACS-analyysi anneksiini V-FITC ja totesi, että yli-ilmentyminen Tβ

10 aiheuttaman apoptoosin, mutta ei kuolion, että 2774 munasarjasyövän solulinja (kuvio 4B). Lisäksi 1. päivänä käsittelyn jälkeen Ad.TERT.Tβ

10 yhteistyössä kulttuuri malli ensisijainen ihmisen munasarjasyöpä normaali fibroblastien Huomasimme selvästi ydin- pirstoutuminen (sininen fluoresenssi) vain munasarjasyöpäsoluja että yli-ilmentynyt Tβ

10 (vihreä fluoresenssi). Lisäksi emme voineet havaita ydin- pirstoutumista tai Tβ

10 Edellä mainitulla yhtälöllä taustatasoja normaalin fibroblasti. Nämä tulokset osoittavat, että syöpä-specific yliekspressio Tβ

10, joka helpottaa tert-promoottori, stimuloi syöpää erityisiä ydinvoiman pirstoutuminen yhtenä morfologiset apoptoosin tuntomerkkejä (kuvio 5A). Lisäksi havaitsimme silmiinpistävää morfologiset muutokset munasarjasyöpäsoluja käsiteltiin Ad.TERT.Tβ

10 yli 90 tunnin ajan käyttäen reaaliaikaisen kuvantamisen mikroskoopilla. Kun 10 tuntia hoidon Ad.TERT.Tβ

10, havaitsimme tyypillisen apoptoottisen morfologisia muutoksia munasarjasyöpäsoluja kuten solukalvon kupliminen, menetys solu-vuorovaikutuksiin, soluliman vakuolisaatiota, ja solun kutistuminen johtuu nopeasti nestehukka. Apoptoottisia soluja hävisivät vähitellen solukuolema, kun taas normaalit fibroblastisoluja näytti olevan vaikuta Ad.TERT.Tβ

10 yli 90 tunnin ajan (kuvio 5B; Elokuva S1).

(A) aliyhtyvät 2774 munasarjojen syöpäsolut säilytettiin 5 päivää täydellisessä elatusaineessa, joka sisälsi Ad.TERT.LacZ tai Ad.TERT.Tβ

10 MOI 10 tai 100, ja MTT-biomääritys suoritettiin päivittäin. (B) toisen päivän jälkeen virusinfektio, FACS-anneksiini V /propidiumjodidi (PI) määritys suoritettiin valmistajan (Clontech) protokollaa. Edustavia Sirontakuvaajien osoittavat jakautumista anneksiini V- ja PI-värjäytyneiden solujen. Ylälevyissä, X-akselin (FL1-H) osoittaa anneksiini V-FITC fluoresenssin havaitaan 518 nm: ssä, ja Y-akseli (FL2-H) osoittaa, PI fluoresenssi havaittiin 620 nm: ssä. Koska alempi vasen (LL) neljänneksessä osoittaa eläviä soluja, vasemmassa yläkulmassa (UL) neljännesten osoittavat nekroottinen soluja, ylhäällä oikealla (UR) quadrats osoittavat myöhään apoptoottisia soluja, ja oikeassa alakulmassa (LR) neljänneksessä osoittaa varhaisen apoptoottisia soluja (top paneelit) tulokset ilmaistaan ​​prosentteina koko solujen lukumäärän ja ovat keskiarvo ± SE (pylväät) kolmesta erillisestä kokeesta. Merkittävät erot vehikkeliryhmässä merkitään tähdellä (*), P 0,05; Kahdella asteriskilla (**), P 0,01.

(A) Co-viljelmiä subkonfluenteista ensisijainen ihmisen munasarjasyöpä soluja ja fibroblasteja altistettiin 10 MOI Ad.TERT.Tβ

10 24 tuntia, ja sitten immunosytokemia suoritettiin tarkkailemaan ydinaseiden morfologiset muutokset aiheuttamien Tβ

10 ilme. Differential häiriöitä kontrasti (DIC) kuva sulautettiin 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI) värjäys (sininen) ja Alexa 488 värjäys (vihreä) arvioida ydinaseiden pirstoutumista Tβ

10 ilme. Nuolet osoittavat ydinvoiman sirpaloitumista. (B) Co-viljeltiin subkonfluenteista primäärisistä ihmisen munasarjasyöpä ja fibroblastien altistettiin 10 MOI Ad.TERT.Tβ

10 yli 90 tunnin ajan, ja morfologiset muutokset sitten havaittiin käyttäen reaaliaikaista kuvantamisjärjestelmä. Valkoiset nuolet osoittavat valikoivaa morfologisia ominaisuuksia apoptoosin, kuten solujen solukalvon kupliminen, sytoplasmisen vakuolisaatiota, ja solujen kutistuminen jälkeen (10 h), jonka jälkeen menetys solu-solu-vuorovaikutuksia (sen jälkeen, kun 15 tuntia). Ja mustat nuolet seuranta yksi fibroblasteista osoittaa, että fibroblastit ovat aktiivisesti liikkuvat noin jopa ennen 90 h.

Suhde Thymosin β

10 ja Fas Expression

tutkia munasarjojen syöpä-spesifinen apoptoosin johtuu apoptoosin edistävien geenien ilmentyminen ja myöhemmin signaalitransduktion, arvioimme Fas ilmentyminen ja kaspaasi 3 aktivointi käyttämällä ensisijaista munasarjasyöpäsoluja viljeltiin yhdessä normaalien fibroblastien sekä 2774 munasarjasyövän solulinja. Olemme havainneet, että Ad.TERT.Tβ

10 indusoi Fas-mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä 2774 munasarjasyöpäsoluja (kuvio 6A). Ensisijaisen yhteisviljelmässä malli, Fas ekspressiota havaittiin ensisijainen munasarjasyövän soluissa, mutta ei normaaleissa fibroblasteissa. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​syöpää erityinen ilmaisu Tβ

10 infektion jälkeen Ad.TERT.Tβ

10 (kuvio 6B). Tärkeää on, Tβ

10 lisääntynyt kaspaasi 3 aktiivisuus kuten teki Sytokalasiini D (Cyt D) estäjä aktiini polymerointi. Lisääntynyt kaspaasi 3: n aktiivisuuden myös inhiboi lisäämällä kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK. Lisäksi nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​solujen elävyys saadut tulokset alarmar Blue määrityksessä (kuvio 6C).

(A) aliyhtyvät 2774 ihmisen munasarjasyövän solut altistettiin Ad.TERT.LacZ tai Ad.TERT. Tβ

10 MOI 10 48 tunnin ajan ja sen jälkeen seuraava kokeiluja, kuten RT-PCR ja Western blotting havaita FAS (CD95) mRNA ja proteiini ilmentymisessä. (B) aliyhtyvät primäärisistä ihmisen munasarjasyöpä soluja viljeltiin yhdessä fibroblasteja altistettiin myös 10 MOI Ad.TERT.Tβ

10 24 tunnin ajan ja sen jälkeen immunosytokemialla. Erityiset FAS /CD95-vasta-värjäyksen (Alexa 488, vihreä) sulautettiin ero häiriöitä kontrasti (DIC) kuvat ja tumavärjäystä kuvia (DAPI, sininen) käyttäen kuvantamisen ohjelmistoja. Valkoinen ja oranssi nuolet osoittavat fibroblasteja ja munasarjasyöpäsoluja, vastaavasti. (C) Soluja altistettiin Ad.TERT.LacZ tai Ad.TERT.Tβ

10 MOI 10 kanssa tai ilman kaspaasiestäjä (zVAD, 40 uM), ja aktiinin polymeroitumisen inhibiittoria (sytokalasiini D, 1 ug /ml) 48 tunnin ajan. 2774 munasarjasyöpäsoluja värjättiin sitten mukaan kaupallinen kaspaasi 3 iinianalyysikitissä protokolla (Thermo) ja kuvattiin käyttäen Thermo Scientific Cellomics ArrayScan korkea-pitoisuus seulonta (HCS) lukija. Pylväsdiagrammissa, arvot, jotka edustavat prosentteina ajoneuvon ohjaus seuraa suhde alueen kaspaasi 3 aktivointi ja alueen ytimen. Ja tulokset ovat keskiarvo ± SE (pylväät) kolmesta eri kokeesta. Merkittävät erot vehikkeliryhmässä merkitään Kahdella asteriskilla (**), P 0,01 (vasen pylväskaavio). Sytotoksisuus samoissa olosuhteissa määritettiin viljellyissä munasarjasyöpäsoluja käyttäen alamarBlue (AB) määritys kuin

in vitro

vaihtoehtoisen mallin. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina ajoneuvon valvonnan ja ovat keskiarvo ± SE (pylväät) kolmesta kokeesta. Merkittäviä eroja hikkelikontrolliryhmään merkitään tähdellä (*), P 0,05; Kahdella asteriskilla (**), P 0,01 (oikealla pylväsdiagrammi)

vaikutukset Thymosin β

10 Mitokondriovauriot ja ROS Production

Aiemmat raportit ovat osoittaneet että häiriöt aktiinisytoskeletonin indusoi solunulkoista sukupolven ROS, erityisesti O

2

-, joka vahvistaa Fas-riippuvaisen apoptoosin [13], [24]. Lisäksi, vähentynyt aktiini dynamiikka aiheuttaa depolarisaation mitokondrion kalvon ja lisätä ROS tuotannon, mikä johtaa solun kuolemaan [14]. Yhdessä me arveltu, että inhibitio aktiini polymeroinnin Tβ

10 avautuu mitokondrion kalvon huokosia tai kanavia pidemmän aikaa, mikä johtaa mitokondrion kalvon potentiaali (MMP), ja kasvu vapauttaa ROS sytoplasmaan. Siksi mittasimme Tβ

10 aiheuttamat muutokset MMP ROS tasoilla ja havaitsi, että aluksi korkeita MMP oli merkittävästi vähentynyt Tβ

10 yli-ilmentyminen (kuvio 7A). Lisäksi ROS tuotanto kasvoi Tβ

10 yliekspressio, joka on yhdenmukainen tulosten kanssa MTT biologista määritystä.

(A) Soluja altistettiin Ad.TERT.LacZ (10 MOI), Ad. TERT.Tβ

10 (10 MOI), ja aktiinin polymeroitumisen inhibiittoria (sytokalasiini D, 1 ug /ml) 48 tunnin ajan, ja sitten mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) määritys suoritettiin. MMP Testi suoritettiin käyttäen MMP iinianalyysikitissä protokolla (Thermo), ja tulokset kuvattiin käyttäen Thermo Scientific Cellomics ArrayScan korkea-pitoisuus seulonta (HCS) lukija. (B) Soluja altistettiin Ad.TERT.LacZ (10 MOI), Ad.TERT.Tβ

10 (10 MOI) kanssa tai ilman syöpälääkkeet, kuten paklitakseli (taksoli, 5 ug /ml), ja sisplatiini (platina, 10 ug /ml), 48 tunnin ajan. Tuloksia verrattiin muiden hoitojen, esimerkiksi kunkin syöpälääkkeen tai aktiinin polymeroitumisen inhibiittoria (sytokalasiini D, 1 ug /ml). Solunsisäiset reaktiivisen hapen (ROS) havaittiin fluoresenssi-ELISA-järjestelmän kanssa, hapetus-herkkiä fluoresoiva koetin 2, 7-dikloori-diasetaatti (DCF-DA). Sen lisäksi, että ROS-määritys, MTT-bio-määritys suoritettiin myös samoissa olosuhteissa. Kaikki Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina ajoneuvon hallinnan ja ovat keskiarvo ± SE (pylväät) kolmesta kokeesta. Merkittäviä eroja hikkelikontrolliryhmään merkitään tähdellä (*), P 0,05; Kahdella asteriskilla (**), P 0,01.

On raportoitu, että solun ROS nousevat olosuhteissa stressiä käsittelemällä syöpälääkkeiden kuten taksolin (paklitakseli) ja platina (sisplatiini) . Tämä ROS kasvu johtaa induktion proapoptoottiset molekyylejä, kuten p53 ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK: t), mikä johtaa solujen apoptoosiin [25] – [30]. Käytimme Ad.TERT.Tβ

10 toisena hoidon kaksi luokkaa ja syöpälääkkeiden, ja totesi, että co-hoito johti synergiavaikutukset, lisäämällä ROS sukupolvi ja vähentää solujen elinkelpoisuuden (kuvio 7B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että munasarjasyövän indusoiman apoptoosin Tβ

10 yliekspressio johtuu ROS tuotanto vastauksena laski MMP.

Keskustelu

SS-tymosiini perheenjäseniä, tymosiiniaktiivisuutta SS

4 (Tβ

4), tymosiiniaktiivisuutta SS

10 (Tβ

10), ja tymosiinia SS

15 (Tβ

15) on tutkittu syövän synnyn. He ovat sekaantuneet aktiini sitomiseen. Kuitenkin toiminta β-tymosiinit ei juurikaan tunneta, ja niiden rooli neoplastisen taudin etenemistä on edelleen kiistanalainen.

Kohonnut ilmentyminen Tβ

4 ja Tβ

10 on pidetty ominaispiirteenä ihmisen syövän synnyn. Yliekspressio Tβ

4 esiintyy monenlaisia ​​ihmisen karsinoomien. Tβ

4 vaikuttaa angiogeneesiin ja syövän soluvaelluksen monissa syöpäsolutyyppien [31] – [34]. Samoin, yliekspressio Tβ

10, on raportoitu lukuisia ihmisen karsinoomissa, mukaan lukien melanoomat [1], karsinoomat munuaisen, haiman [35], ja vatsa [36], samoin kuin medullary kilpirauhasen karsinoomat [37].

Paradoksaalisesti Tβ

4 ja Tβ

10 voi olla mukana syövän rappeuma, kuten raportit ovat osoittaneet, että Tβ

4 on kasvain tukahduttava vaikutus myeloomassa [38], ja Tβ

10 vapautetaan säännöstelystä munuaissolusyövässä [39] ja munasarjasyöpä [40]. Lisäksi Tβ

10 esti solujen vaeltamiseen ja kapillaarimaisen putken muodostumiseen ihmisen sepelvaltimon endoteelisolujen [6]. Tuloksista käy sotkea Tβ

10 syövän rappeuma, koska korkea Tβ

10 selostukset normaalissa munasarjassa oli huomattavasti vähennetty munasarjakarsinoomissa. Lisäksi ektooppinen ilmentyminen Tβ

10 munasarjasyöpäsolulinjoihin, vähentää solujen lisääntymistä ja liikkumista, ja apoptoosi kiihtyi. Näin ollen, Tβ

10 yli-ilmentyminen normaaleissa munasarjan soluissa näyttää toimivan negatiivisena säätelijänä syövän, vaikka täsmällinen mekanismi on epäselvä. Koska Tβ

4 indusoituu munasarjasyöpä [34] ja on rooli aktiinin sitomista kuten Tβ

10, ektooppinen ilmentyminen Tβ

10 meidän koejärjestelmässä voi johtaa lisääntyneeseen aktiivisuuteen p- tymosiinit ja myöhemmin häiriön aktiini dynamiikkaa. Tämä käsite tukee raportteja, Tβ

4 ja Tβ

10 teko aluksen kehitystä täydentävällä tavalla in vivo [6] ja että epätasapaino G-aktiini ja F-aktiini aiheuttaa solujen pyöristäminen ja kuoleman [41 ]. Niinpä katsotaan mahdollinen strategia syövän tutkimukseen ja geeniterapian kanssa Tβ

10. Me siis valmistettu rekombinantti adenovirus, Ad.TERT.Tβ

10, käyttää ihmisen geeniterapiassa ja selvittämiseksi mekanismi Tβ

10 munasarjasyövän ehkäisyä.

Rekombinantti adenovirus järjestelmät ovat monipuolinen geeniekspressiotutkimuksissa ja terapeuttisissa sovelluksissa, ja monet tutkijat ovat käyttäneet rekombinanttiadenovirusten menestyksellisesti viime vuosina. Kuitenkin niiden alhainen spesifisyys on haitta rajoittava hyödyllisyyttä näiden vektorien kuten

in vivo

terapeuttisia aineita. Vektorit yhdistävät korkean tarttuvuuden kanssa syöpäsolu-erityinen ilmaisu on siis tarpeen. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT) ilmentyy voimakkaasti suurimmassa kasvainkudoksissa, mutta ei normaaleissa kudoksissa. Esimerkiksi hTERT-promootterin aktiivisuus on suurempi ihmisen ja hiiren syöpäsoluja, jotka ovat peräisin paksusuoli-, maksa-, rinta-, munasarja-, ja aivojen [42] – [47]. Toisaalta, he ovat osoittaneet, että hTERT-promootterin on aktiivinen normaaleissa ihmisen fibroblasteissa [42], ja normaaleihin ihmisen epiteelisolujen henkitorven [42], rintarauhasen [47], ja munasarja [45], [48]. Siksi tutkimme rooli Tβ

10. munasarjasyöpä käyttäen rekombinantti adenovirus (Ad.TERT.Tβ

10). Ad.TERT.Tβ

10 rakennettiin insertoimalla Tβ

10 säätelyn alaisuudessa hTERT-promootterin osaksi adenoviruksen p-shuttle-plasmidin saamiseksi syöpää ilmaisu, ja sitä verrattiin Ad.TERT .LacZ kontrollina. In co-kulttuuri malli primaaristen ihmisen munasarjan syöpäsolujen ja normaalien fibroblastien, β-galaktosidaasi, jota ohjaa hTERT-promootterin on ilmaistu munasarjasyöpäsoluja ainoastaan, mutta ei normaalien fibroblastien. Sytotoksiset ja apoptoottisten morfologiset muutokset olivat poissa normaalien fibroblastien käsiteltiin 10 MOI Ad.TERT.LacZ yli 7 päivän aikana, toisin kuin munasarjasyöpä erityisiä indusoiman apoptoosin solujen käsittely 10 MOI Ad.TERT. Tβ

10 yli 10 tunnin aikana. Lisäksi olemme havainneet, että syöpä-erityinen ilmaisu Tβ

10 alkaen Ad.TERT.Tβ

10 mukana oli kohonnut ilmentyminen Fas, jolloin syöpä-erityisiä apoptoosin. Siksi katsoimme, että syövänvastainen vaikutus Ad.TERT.Tβ

10 näyttivät liittyvän yliekspressio Tβ

10 sijasta epäspesifinen virusten varalta.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että korkeatasoinen ROS on myönteinen vaikutus syövän kehitykseen ja lisääntymistä [49] – [56]. Kuitenkin olemme huomanneet, että aktiini sitominen yliekspressio Tβ

10 johtui mitokondrioiden ja ROS korkeus, jolla apoptoosin signalointi aktivoitiin. Ajatus siitä, että syöpäsolut ovat alttiita hyökkäykselle ROS tukee terapeuttiseen käyttöön laajalti hyväksytty syöpälääkkeiden, kuten taksolin ja sisplatiinin. Molemmat lääkkeet lisäävät ROS sukupolvi 2774, ja yhteiskäsittely syöpälääkkeiden kanssa Tβ

10 aiheuttaa additiivisen vaikutuksen ROS korkeus ja myöhemmin apoptoosin induktion. Näin ollen, kohtalo syöpäsolun näyttää määräytyy ROS tasapainoa. Lievä nousu ROS voi auttaa syövän kehitystä, mutta liiallinen ROS korkeus syöpäsoluissa joissakin rasituksia kuten Tβ

10 yli-ilmentymisen ja hoitoon syöpälääkkeiden näyttää stimuloida apoptoottisia signaaleja.

Lisäksi induktion apoptoosin , Tβ

10 yli-ilmentymisen voimakkaasti vähentänyt liikkuvuuden vuonna 2774 munasarjasyöpäsoluja, ja tämä vaikutus oli riippumaton apoptoosin induktio. Vuonna 2774 munasarjasyöpäsoluja, apoptoosin aiheutettiin paljon myöhemmin kuin ensisijainen munasarjasyöpäsoluja. Ad.TERT.Tβ

10 aiheuttaman apoptoosin ensisijainen munasarjasyöpäsoluja ja kuolemattomaksi syöpäsolulinjat kuten 2774, OVCAR3, ja SKOV3, tapahtui 10- ja 48-tuntia myöhemmin, vastaavasti. Koska määritykset hyökkäyksen ja muuttoliikkeen tehtiin ennen havainnointia apoptoosin, suosittelemme, että Tβ

10 yli-ilmentymisen munasarjasyöpä voi olla hyödyllinen solu-tappamisen vaikutukset ensisijaisen kasvainsolujen sekä metastaattisen soluja.

meidän tulokset osoittavat, että syövän vastaisen aktiivisuuden Tβ

10 voi johtua ROS: n syntyminen. Lisäksi Tβ

10 ja syöpälääkkeet, kuten taksolin ja sisplatiinin, oli synergistinen vaikutus syöpäsolun kuoleman. Olemme myös havainneet, että syöpää erityisiä yliekspressio Tβ

10 ohjaa hTERT promoottori johti syöpään selektiivinen apoptoosin kautta monistamisen FAS signalointi. Tutkimus tarjoaa tietoa taustalla oleva mekanismi syöpälääkkeen vaikutuksia Tβ

10 munasarja, joka voi osoittautua hyödylliseksi kehittää tehokkaita munasarjasyöpä hoitomuotoja ilman haittavaikutuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

työt käyttämällä ihmisen näytettä saatiin kirjallinen suostumus potilaan ja hyväksymä Korean Association of Institutional Review Board (KAIRB).

Solulinjat ja Ensisijainen Cell Culture

ihmisen munasarjasyövän solulinja 2774 saatiin American Type Culture Collection (ATCC), ja primaarisista ihmisen munasarjasyöpä ja fibroblastisoluja eristettiin potilaista, joilla oli asteen III endomet- adenokarsinooma (syöpä) ja co-viljelty lasipinnat. Soluja kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA), ja 100 U /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (Invitrogen ).

virusvektorit

rekombinantti adenovirus, ”Ad.TERT.Tβ

10″, on rakennettu standardin menettelyä käytetään AdEasy ™ Adenoviral Vector System (Stratagene, La Jolla, CA, USA).