Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kliiniset tutkimukset viittaavat siihen, että vastaukset HPV16 E6E7L2 fuusioproteiinia (TA-CIN) pelkästään rokotuksen ovat vaatimattomia, ja GPI-0100 on hyvin siedetty, voimakas adjuvantti. Täällä pyrimme optimoimaan sekä immunogeenisyyttä TA-CIN kautta formulaation GPI-0100 ja hoitoon HPV16 + syövän rokotuksen jälkeen sisplatiinia kemoterapiaa. HPV16 neutraloiva seerumin vasta-ainetiittereitä, CD4 + T-solujen proliferatiiviset ja E6 /E7-spesifisten CD8 + T-solujen vasteet olivat merkittävästi parantunut, kun hiiret rokotettiin subkutaanisesti (s.c.) tai lihakseen (i.m.), jossa TA-CIN muotoiltu GPI-0100. Rokotus testattiin hoito hiirillä syngeenisten HPV16 E6 /E7 + kasvaimet (TC-1) joko keuhkoissa tai ihon alle. Hiiret käsiteltiin TA-CIN /GPI-0100 rokotuksen näytteillä vankka E7-spesifisten CD8 + T-soluvasteiden, joita liittyy alentunut tuumorikuorma keuhkoissa, kun taas hiiret, jotka saivat joko komponentti yksin olivat kaltainen. Koska rokotus ei yksin riitä parannuskeinoa, hiirillä s.c. TC-1 kasvaimen käsiteltiin ensin kaksi annosta sisplatiinin ja sitten rokotettu. Rokottaminen TA-CIN /GPI-0100 i.m. oleellisesti hidastunut kasvaimen kasvua ja laajennettu selviytymisen jälkeen sisplatiinihoidon. Injektio TA-CIN yksin, mutta ei GPI-0100, kasvaimeen (i.t.) oli samalla tehokas jälkeen sisplatiinihoidossa, mutta hiiret lopulta menehtyivät. Kuitenkin kasvaimen regressio ja laajennettu remissio havaittiin 80% hiiristä sisplatiinia ja tämän jälkeen sisäisen kasvaimen TA-CIN /GPI-0100 rokotuksen. Nämä hiiret oli myös vankka E7-spesifisten CD8 + T-solujen ja HPV16 ainevasteet. Näin muotoilu TA-CIN kanssa GPI-0100 ja sisäisen kasvaimen toimituksen jälkeen sisplatiinihoitoon saa aikaan voimakkaita terapeuttisia vasteita hiirimallissa HPV16 + syöpä.

Citation: Peng S, Wang JW, Karanam B, Wang C, huh WK, Alvarez RD, et al. (2015) Sequential sisplatiinihoidossa ja rokottaminen HPV16 E6E7L2 Fuusioproteiinin saponiiniadjuvantissa GPI-0100 hoitoon Model HPV16 + Cancer. PLoS ONE 10 (1): e116389. doi: 10,1371 /journal.pone.0116389

Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 15 elokuu 2014; Hyväksytty: 08 joulukuu 2014; Julkaistu: 05 tammikuu 2015

Copyright: © 2015 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tutkimuksen rahoittivat avustusta V säätiö (www.jimmyv.org) SP ja RBSR, ja Public Health Service (avustukset. nih.gov) myöntää P50 CA098252 on TCW, RO1 CA133749 on YDLKWDPLQHQ, ja CA118790 on RBSR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: RBSR on keksijä L2 liittyviä patentteja (US sovellus 20090047301 papilloomaviruksen L2 N- Terminal peptidit varten induktio Laajasti Cross neutraloivat vasta-aineet ja US sovellus 20130177585 papilloomaviruksen L2 N-terminaalisia peptidejä induktioon LAAJAN CROSS neutraloivat vasta-aineet) lisensoitu Shantha Biotekniikan Ltd., GlaxoSmithKline, PaxVax, Inc. ja Acambis, Inc. RBSR ja TCW ovat perustajat Papivax LLC ja tieteelliset neuvonantajat Papivax Biotech Inc. ehdot näiden järjestelyjen hallitaan Johns Hopkins University mukaisesti eturistiriitoja politiikkaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

”Korkean riskin” ihmisen papilloomavirusten (hrHPV) aiheuttavat 5,2% kaikista syövistä maailmanlaajuisesti [ ,,,0],1]. Kun taas pysyviä hrHPV infektio on välttämätön syy syövän, suurin osa tartunnoista spontaanisti tyhjentää isännän immuniteetin. Sekundaaripreventio kautta cytologic ja HPV seulonta ja interventio-ohjelmia ovat vähentäneet taakkaa kohdunkaulan syövän arviolta 80% kehittyneissä maissa ja nyt kaksi ennaltaehkäisevä HPV-rokotteiden kohdistaa yleisimpiä 14 hrHPV tyyppejä, HPV16 ja HPV18. HPV16 on genotyypin läsnä 50-60% kohdunkaulan syövän, 87% HPV + nielun karsinoomat [2], 55% ja 76% HPV + invasiivisia emättimen ja vulvan karsinoomien [3] ja 73% peräaukon syöpä [ ,,,0],4]. Huomattava tehoa ja turvallisuutta lisensoitu HPV-rokotteiden ehkäisyyn uusien HPV16 ja HPV18-infektiot on dokumentoitu hyvin [5]. Kuitenkin suoja näiden kaupallisesti saatavilla rokotteita yleensä alustyyppi [6], ja rokotuksen hinnat valitettavasti edelleen alhainen kehitysmaissa. Mikä tärkeintä, nämä rokotteet ole terapeuttista toimintaa niille potilaille, joilla pysyviä HPV-infektio ja HPV liittyviä kohdunkaulan dysplasiaa [7], terapeuttinen HPV-rokotteen on potentiaalia lisätä tehoa tavanomaisten epäspesifisiä, kirurgisten ja ablatiivi hoitoja korkealaatuisesta neoplasia, tai jopa chemoradiation terapia invasiivisen HPV + syöpiä. Käytöstä huolimatta sisplatiinin ja /tai sädehoitoa [8], viiden vuoden eloonjääminen kehittyneiden kohdunkaulan syövän potilaille jää 30%. Siten kohdennettuja hoitostrategioiden, kuten terapeuttinen HPV-rokotteen, tarvitaan tulosten parantamiseksi potilailla, joilla on edennyt kohdunkaulansyöpä [9].

Ehdokas terapeuttinen HPV-rokote TA-CIN on rekombinantti proteiini, joka käsittää fuusio HPV16 onkoproteiineja E6, E7 ja vähäinen kapsidiproteiini L2, joka puhdistetaan

E. coli

[10]. E6 ja E7 virusperäisen onkoproteiineja ovat lupaavia kohteita immunoterapiaa, ilmaistaan ​​kaikki tartunnan saaneiden solujen, joita tarvitaan elinkelpoisuuden HPV + syöpäsolujen ja poissa normaalista isäntäsoluissa. Vähäinen kapsidiproteiini L2 ei ole havaittavasti ilmaistaan ​​HPV + syöpäsoluja, mutta se on potentiaalinen terapeuttinen antigeenin esiasteleesioita [11], [12], [13]. Lisäksi L2 sisältää konservoituneita neutraloivia epitooppeja ja on potentiaalia laajasti profylaktinen HPV-antigeeni [14]. Kolme kuukausittain immunisointia terveiden vapaaehtoisten TA-CIN ilman adjuvanttia, aikaansai L2-neutraloivien seerumin vasta-aineiden ja T-solujen kasvuresponssit annosriippuvaisesti [15]. E6 ja E7-spesifisten CD8 T-solujen immuniteetin havaittiin IFNy-ELISPOT 8 11 arvioidusta koehenkilöstä suurimmalla annoksella, vaikka E6 oli hallitseva antigeeni. Kuitenkin yleinen reaktio oli vaatimatonta, mikä viittaa siihen, että tarvitaan adjuvanttia [16], [17] tai heterologinen tehosteannoksen rekombinanttivirusvektorin [18], [19], [20].

Proteiini-pohjainen rokotus ilman adjuvanttia tyypillisesti indusoi heikon immuunivasteen. GPI-0100 on voimakas adjuvantti johdettu muokkaamalla valittu luonnollinen saponins [21] poistamaan suhteellisen myrkyllisiä ja epävakaa asyyliosista, ja ottamalla käyttöön lipofiilinen osa [22], [23]. Annokset 100 ug 5000 ug GPI-0100 on testattu useita antigeenejä varhaisessa vaiheessa kliinisissä tutkimuksissa ja ne olivat hyvin siedettyjä [21], [24]. Rokottaminen makakien TA-CIN yhdessä adjuvantin GPI-0100 (TA-CIN /GPI-0100) oli myös hyvin siedetty ja herättivät vankka neutraloiva vasta-ainetiitterit HPV16, jossa vähemmän vasteita muut HPV-tyypit testattu, ja T-soluvasteiden HPV16 E6- ja E7-[16]. Formulointi TA-CIN kanssa GPI-0100 syvästi parannettu neutraloiva vasta-ainevaste ja suojasi hiiriä kokeellisista iho haaste HPV16 pseudovirions jotka tuottavat lusiferaasireport-. Inclusion of GPI-0100 myös tehosti E7-spesifisten CD8 T-solujen vaste TA-CIN rokotusta ja suojasi hiiriä altistukselta kanssa TC-1-solulinja, joka on HPV16 E6 /E7 + hiiren kasvainmuoto [16]. Kuitenkin sen terapeuttista aktiivisuutta vastaan ​​muodostuneen kasvaimen ei testattu.

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että paikallinen immunisointi on tärkeää saada aikaan soluvälitteisen immuunivasteen, että kodeissa takaisin asiaan päällä ja että kemoterapia voi parantaa immuunivastetta osittain kutistuu tautikuormituksesta vapauttaen kasvaimen antigeenejä ja ohimenevästi muuttamalla immuunijärjestelmän microenvironment sisällä kasvain [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]. Sisplatiinihoidolle ja /tai pienten säteilyannosten voi parantaa tehoa terapeuttisen HPV-rokotteiden hiirimalleissa [32], [33], [34]. Samanaikainen hoito sisplatiinilla ja kasvaimeen injektiota (it) E7-peptidin C57BL /6-hiirillä, joilla on E6 /E7-ilmentävät TC-1 kasvainten syntyy huomattavasti enemmän E7-spesifisiä IFN-γ-erittävien CD8

+ T-soluissa ja voi parantaa monia hiiret, kun taas käsiteltiin joko hoito yksinään ei tuottanut samankaltaisia ​​kasvaimen kasvua ohjaus. Tärkeää on, ihon alle ja E7 kontrolloitu kasvaimen kasvua vähemmän tehokkaasti kuin kasvaimeen annon, joka osoittaa, että toimittaminen antigeenin kasvaimen mikroympäris- parantaa esikäsittely kasvaimen antigeeni-spesifinen CD8 + T-solujen immuunivastetta kemoterapian jälkeen [34]. Sisplatiinihoitoon myös ohimenevästi indusoi merkittävää kerääntymistä dendriittisolujen (DC) kasvaimen mikroympäristössä. Lisäksi kasvaimensisäistä injektio antigeenisen peptidin johti ottoa E7-peptidin että CD 11 c + DC ja kulkeutumista E7-peptidi-ladattu DC että tyhjennys imusolmukkeisiin [34]. E7-peptidi-ladattu DC on imusolmukkeiden voisi aktivoida E7-spesifisten CD8 + T-soluja. Tärkeää on, tämä on merkitty parantamiseksi E7-spesifisten CD8 + T-solujen liikkeessä ja antituumorivaikutukset havaittiin myös, kun TC-1 tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin sisplatiinin ja kasvaimensisäisenä TA-CIN rokotusta [35].

ennen hiirillä ja makakiapinoilla tukemaan turvallisuutta ja tehoa GPI-0100 adjuvanttina TA-CIN, mutta ei ole tutkinut sen vaikutus terapeuttinen vaikutus [16]. Täällä verrattiin rokotuksen yksin ja sisplatiini seurasi kasvaimensisäisenä tai lihakseen rokotus TA-CIN muotoiltu GPI-0100 adjuvantti hoitoon vakiintuneiden TC-1 kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

ihmisen-solulinjaa 293TT käytetään tässä tutkimuksessa. Tämä solulinja on aikaisemmin kuvattu [37], [38]. Eläinkokeet suoritettiin suositusten mukaisesti oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health ja kanssa ennakkohyväksyntää Animal Care ja käyttö komitean Johns Hopkins University (MO14M43). Hiiriä seurattiin vähintään kolme kertaa viikossa, ja inhimillinen päätepisteet käytettiin selviytymisen tutkimuksissa; hiiret lopetettiin heti ylimääräisen kasvaintaakkaa (≥2 cm halkaisijaltaan tai haavaumat), tai ensimmäinen todiste ahdistuksen kuten painonlasku (≥10%), uneliaisuus, huono turkin laatu, valonarkuus, pesiä tai naarmuja. Hiiret nukutettiin isofluraanilla hengitysteitse, lopetettiin hiilidioksidilla tukehduttamalla ja kuoleman varmistaa kaula sijoiltaan.

Hiiret

5~8 viikon ikäisiä C57BL /6 tai BALB /c-hiiriä ostettiin National Cancer Institute (Frederick, MD) ja majoittaa vähintään viikkoa ennen tutkimukseen. Kaikki hiiret pidettiin Johns Hopkins University School of Medicine (Baltimore, MD) syöpä keskus eläinpalvelussa erityisissä-taudinaiheuttajista vapaa olosuhteissa. Hiiriä pidettiin 5 kohti mikroisolaattorihäkkeihin häkki steriiliä ruokaa ja vuodevaatteet, vaihdetaan kerran viikossa, ja satunnaistettu häkki.

peptidit, vasta-aineet ja reagenssit

H-2K

b-rajoitettu HPV16 E6aa50-57 peptidi, YDFAFRDL, ja H-2D

b-rajoitettu HPV16 E7aa49-57 peptidi, RAHYNIVTF syntetisoitiin Makromolekulaariset Resources (Denver, CO), jonka puhtaus ≥80%. FITC tai PE-konjugoidulla anti-hiiri-CD4 (klooni RM4-5) ja CD8a (klooni 53.6.7) ja FITC-konjugoitua anti-hiiri-IFN-γ: n (klooni XMG1.2) vasta-aineet hankittiin BD Pharmingen (San Diego, CA). PE-konjugoitu, HPV16 E7aa49-57 peptidi ladattu H2-D

b tetrameerejä saatiin National Institute of Allergy and Infectious Diseases tetrameeriä Facility. Medroksiprogesteroniasetaatti ostettiin Greenstone LLC (Peapack, NJ), ja 4% Nonoxynol-9 (N-9) hankittiin Revive kosmetiikka yritys (Madison, NJ). Sisplatiini, Tween-40 ja mannitolia hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO).

Solut

HPV-16 E6 ja E7-ilmentävät TC-1-soluja tuotettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [ ,,,0],36]. CT26 koolonkarsinoomasoluja saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Soluja ylläpidettiin RPMI 2 mM glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 100IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS). 293TT-soluja viljeltiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 2 mM glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 100IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% FBS: ää [37].

Vaccine ja formulaation

TA-CIN on kuvattu aiemmin ja sen ystävällisesti Cancer Research Technology, UK [15]. GPI-0100 oli jalomielinen lahjoitus Hawaii Biotech Inc. (Aiea, HI). Rokottamiseen tutkimukset, TA-CIN (31,25 ug /ml) formuloitiin GPI-0100 (250 ug /ml), yksin tai yhdessä joko Tween-40 (4 mg /ml), tai mannitolin (50,7 mg /ml) 0,025 M natriumfosfaattipuskuria (pH 7,2). Valmistaa rokotteen sisäisen kasvaimen injektio, TA-CIN (312,5 ug /ml) formuloitiin GPI-0100 (2500 ug /ml) yhdessä mannitolin (50,7 mg /ml) 0,025 M natriumfosfaattipuskuria (pH 7,2). Formuloitu rokote inkuboitiin yön yli kevyesti ravistelijalla 4 ° C: ssa ennen käyttöä. Jäätynyt muotoilu TA-CIN /GPI-0100 mukana mannitoli, ja sen jälkeen yön yli inkuboinnin se jaettiin eriin ja jäädytettiin kuivajää /isopropanolia. Erät säilytettiin sitten -80 ° C: ssa käyttöön asti.

valmistus HPV16 ja HPV58 pseudovirus ja neutralisaatiomenetelmään

Pseudoviruses (PSV) tuotettiin kotransfektoimalla 293TT soluihin [37] [38] plasmidien kanssa, jotka koodaavat HPV L1 ja L2, ja reportteriplasmidilla, joka joko eritettyä alkalista fosfataasia (SEAP) tai tulikärpäsen lusiferaasi [39], [40]. SEAP-pohjainen pseudovirus neutralointi määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [38]. Lyhyesti, HPV16 SEAP PSVS inkuboitiin titrattiin hiiren seerumia (aloittaen laimennus 1:50) tai 4 ui positiivista kontrollia monoklonaalinen vasta-aine RG-1 (1,1 mg /ml) 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa ennen lisäämistä 293TT soluihin. Sitten soluja inkuboitiin 72 tunnin ajan, ja supernatantit kerättiin. SEAP-aktiivisuus mitattiin kautta kolorimetristä menetelmää. Seerumineutralointi tiitterit määriteltiin suurimpana laimennus, joka johti vähintään 50%: n vähennys SEAP-aktiivisuus verrattuna viruksen vasta tartunnan ehkäiseminen.

Solunsisäinen sytokiinien värjäys ja virtaussytometria analyysi

havaitsemiseksi HPV16 E6 tai E7-spesifisten CD8

+ T-soluvasteita IFN-γ solunsisäistä värjäystä, pernasoluja stimuloitiin joko HPV16 E6aa50-57 tai E7aa49-57 peptidin (1 ug /ml) läsnä ollessa GolgiPlug (BD Pharmingen, San Diego , CA) 37 ° C: ssa yön yli. Havaitsemiseksi TA-CIN-CD4

+ ja CD8

+ T-soluvasteita, pernasoluja stimuloitiin 10 ug /ml TA-CIN proteiinia 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. GolgiPlug lisättiin sitten soluihin ja inkuboitiin edelleen yön yli 37 ° C: ssa. Kun CT26-solut transfektoitiin HPV16 L2 käytettiin, CT26-solut transfektoitiin ensin plasmidilla, joka koodaa kodonioptimoitu HPV16 L2: [41] käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pernasoluja sitten viljeltiin yhdessä HPV16 L2 transfektoitu CT26 solujen E:T suhde 10:01 on läsnä GolgiPlug 37 ° C: ssa yön yli. Stimuloitu pernasolut pestiin sitten kerran PBS: llä, joka sisälsi 0,5% BSA: ta ja värjättiin joko PE-konjugoitu anti-hiiri-CD4- tai CD8-vasta-aine. Solut tehtiin läpäiseviksi ja kiinnitetään Cytofix /Cytoperm kit mukaan valmistajan ohjeiden (BD Pharmingen, San Diego, CA). Solunsisäisen IFN-γ värjättiin FITC-konjugoidulla rotan anti-hiiri-IFN-γ. Virtaussytometrianalyysi suoritettiin käyttäen FACSCalibur virtaussytometriä kanssa CellQuest ohjelmisto (BD Biosciences, Mountain View, CA).

Tetrameerivärjäys

tetrameerivärjäyksellä, PBMC hiiriltä värjättiin puhdistetulla anti- hiiren CD16 /32 (Fc lohko, BD Pharmingen, San Diego, CA) ensin, ja sitten värjättiin anti-hiiri-CD8-FITC, PE-konjugoitu, HPV16 E7aa49-57 peptidi, RAHYNIVTF ladattu H2-D

b tetrameerin at 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen solut värjättiin 7-AAD ennen virtaussytometria-analyysi jättää kuolleita soluja. Solut hankittu FACSCalibur -virtaussytometrillä ja analysoitiin CellQuest ohjelmisto.

Passive siirron hiiren tai macacque sera ja emättimen HPV PSV haaste

passiivinen siirto tutkimuksia, BALB /c-hiirten (n = 5) injektoitiin 3 mg: n medroksiprogesteroniase- ihon alle neljä päivää ennen emättimen PSV haaste. Yksi päivä ennen emättimen haaste, 90 ui seerumia kustakin ohjaus- tai TA-CIN rokotettu BALB /c-hiiriä yhdistettiin niiden ryhmien lisäksi 150 ui PBS: ää (kokonaistilavuus 600 ui). Positiivisena kontrollina, hiiren monoklonaalinen vasta-aine RG-1 käytettiin kolmessa erillisessä doses- korkea (50 ug /hiiri), Medium (25 ug /hiiri) ja matala (12,5 ug /hiiri). Sen jälkeen, 100 ui kunkin seerumiseos tai RG-1 annokset ruiskutettiin sitten i.p. kuhunkin hiiri vastaavan ryhmän. 24 tunnin kuluttua passiivisesta siirto, emättimen haaste HPV PSV suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [42] käyttämällä -10

8 virusgenomin vastaava (VGE) yksikköä /hiiri. Kolmen päivän kuluttua HPV PSV haaste, lusiferaasin ilmentymistä emättimen holvi oli hankittu Xenogen IVIS 100 (Caliper Life Science, Hopkinton MA) lämpökamera ja analysoitiin Living Image 2.5 ohjelmisto. Samat vaiheet tehtiin passiivista siirtoa tehtyjen tutkimusten seerumit 3 makakit (ID: stä 746, 811 tai 831) joko ennen tai post Kolmas rokotus TA-CIN + GPI-0100 tuotettaisiin ennen tutkimuksen [16]. 100 ui preimmuuniseerumeilla (laimennus = 1:200, joka perustuu hiiren veren tilavuus arvio 2 ml) tai rokotettiin seerumit titrattiin laimennusalueen 1:200-1:2000 passiivisesti siirretty i.p. ryhmiin naiivien hiiriä (n = 5). Seuraavana päivänä hiiret altistettiin emättimensisäisesti HPV58 PSV ja kuvattiin 72 tuntia tämän jälkeen arvioida tarttuvuuden.

hoito tutkimukset hematogeneosuly leviäminen TC-1 kasvainsolujen

C57BL /6-hiiriin injektoitiin 5 x 10

4 TC-1-soluja laskimoon. Testata antituumorivaikutuksen indusoitu rokotuksella, 3 päivää myöhemmin hiiret rokotettiin kolme kertaa ilmoitetun hoito. Kun käsittelemättömiä hiiriä osoitti merkkejä sairaudesta (ks etiikka selvitys), kaikki hiiret tapettiin, ja pernasolut valmistettiin havaitsemiseksi HPV16 E6- tai E7 tai TA-CIN-CD4

+ ja CD8

+ T-soluvasteita. Keuhkot kerättiin tarkistaa kasvaimen kasvua. Vaihtoehtoisesti PBMC: t ja seerumit kerättiin hiiristä analysointia varten HPV16 E7-spesifisten CD8

+ T-soluvasteiden tetrameerivärjäyksellä tai HPV16-spesifinen neutraloiva vasta-ainetiitteri HPV16-SEAP PSV vastaavasti.

Hoito tutkimuksissa ihon alle TC-1 kasvaimen

1 x 10

5 TC-1-kasvainsoluja injektoidaan ihonalaisesti C57BL /6-hiiristä. Päivänä 5 ja 12 sen jälkeen, kun kasvainsolujen haastetta, hiiriin injektoitiin 5 mg /kg sisplatiinia tai suolaliuosta intraperitoneaalisesti. Yhden päivän kuluttua sisplatiinin tai suolaliuosta injektiota, hiiret jäivät joko hoitamatta tai rokotettu GPI-0100 vain, tai TA-CIN vain, tai TA-CIN plus GPI-0100 kasvaimen. Yksi ryhmä Sisplatiinin käsiteltyjen hiirten rokotettiin TA-CIN plus GPI-0100 lihakseen. Tilavuus 200 ui käytettiin rokottaminen tutkimuksissa paitsi 20 ui varten kasvaimeen rokotuksesta. Hiiret kasvattivat kahdesti saman annoksen. Kasvaimen kasvua seurattiin silmämääräisesti ja mittaus kasvaimen halkaisija jarrusatulat kahdesti viikossa. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa [suurin halkaisija x (kohtisuorassa halkaisija)

2] x π /6. Kasvaimen selviytyminen kirjattiin joko luonnollisen kuoleman tai kasvaimen halkaisija on suurempi kuin 2 cm.

Tilastollinen

soluvälitteinen immuniteetti tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). Vertailut ryhmien välillä käyttää Opiskelijan

t

testiä. Elossapysymisaikajakaumat hiiriä eri ryhmissä arvioitiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin log-rank-testi. Passiivista siirto kokeissa data ilmaistiin keskimääräisen prosenttiosuuden infektion ± keskivirhe (SE). P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Moninaisuus oikaisu ei pidetty, koska tunnustelevia luonteesta tietojen analysointi.

Tulokset

GPI-0100 parantaa merkittävästi HPV16 E7-spesifisten CD8 + T-soluvasteiden ja kasvaimen hoidon aiheuttama TA-CIN

Olemme aiemmin osoittaneet, että muotoilu TA-CIN kanssa GPI-0100 parantaa merkittävästi sekä HPV16-spesifinen neutraloiva seerumin vasta-ainetiittereitä ja E7-spesifisten CD8 + T-solu vasteita ihonalaisen rokotuksen naiivien hiirten [16]. Sen testaamiseksi, onko eri erien GPI-0100 ja TA-CIN voi tuottaa vastaavia tietoja, me rokotettu naiivi C57BL /6-hiirissä, joilla on kaksi eri cGMP erissä TA-CIN (0847FP ja 0861FP) muotoiltu kolmella eri cGMP eriä GPI-0100 ( 0400806, 0400306R ja 0400106R) ihon alle. Ei havaittu merkitsevää eroa sekä HPV16-spesifinen neutraloiva vasta-ainetiitteri ja E6 /E7-spesifisten CD8 + T-solujen vasteita (dataa ei esitetty). Koska rokotus reitti voi mahdollisesti vaikuttaa immuunivasteen, myös immunogeenisuutta verrattiin TA-CIN muotoiltu GPI-0100, joka annettiin joko ihonalainen (s.c.) tai lihakseen (i.m.). Ei havaittu merkitsevää eroa joko HPV16-spesifinen neutraloiva seerumin vasta-ainetiitteri tai E6 /E7-spesifisten CD8 + T-solujen vasteita (S1 kuvio.).

Aikaisemmassa tutkimuksessa, rokotus TA-CIN muotoiltu GPI- 0100 täysin suojattu hiiriä myöhempää ihonalainen haaste kanssa HPV16 E6 /E7-ilmentävien TC-1 kasvainmuoto [16], mutta hoito ennestään ja metastaattinen TC-1 kasvainta ei testattu. Injektio TC-1-solujen häntälaskimoon (i.v.) johtaa niiden perustamista keuhkoissa, joka tarjoaa mallin keuhkojen metastasoituneen HPV16 + syöpä [43]. Siksi testasimme muotoilussa TA-CIN kanssa GPI-0100 vaikuttaa terapeuttista vaikutusta vastaan ​​TC-1 kasvain implantit keuhkoihin. TC-1-kasvainsoluja injektoidaan häntälaskimoon ja C57BL6-hiirten ja 3 päivää myöhemmin, tuumoreita kantavaa hiirtä rokotettiin ihonalaisesti joko pienellä annoksella (6,25 ug /hiiri) TA-CIN yksin tai formuloituna 50 ug GPI -0100, jota seuraa kaksi vahvistimet viikon välein. Keuhkot kerättiin Kymmenen päivää myöhemmin arvioida kasvaimen kasvua (Fig. 1A). Kumpikaan rokotus TA-CIN yksin, eikä GPI-0100 yksin esti TC-1 kasvaimen kasvua keuhkoissa. Vuonna sijaan rokotetut hiiret TA-CIN muotoiltu GPI-0100 oli merkittävästi vähemmän keuhkojen kasvain kyhmyjä ja siksi alempi keuhkojen paino verrattuna rokottamattomiin hiiriin (Fig. 1 B ja C ja S2A Fig.). Kuitenkin tuumorin koko pieneni vain, ei poistunut täysin. Kun HPV16 E6 /E7-spesifisten CD8 + T-soluvasteiden analysoitiin, havaittiin, että TC-1 tuumoreita kantavaa hiirtä rokotettiin TA-CIN muotoiltu GPI-0100 indusoi merkittävästi suurempi E7-spesifisten CD8 + T-solu-vasteita kuin kumpikaan TA-CIN tai GPI-0100 vain (Kuva. 1D ja S2B Fig.). Vaikka TA-CIN sisältää myös E6 CD8 + T-solu-epitoopin, vain heikkoa E6-spesifisten CD8 + T-solujen vaste havaittiin E7 on hallitseva antigeeni C57BL /6-hiirissä (Fig. 1 D ja S2B kuviossa.). Formulaatio, Tween-40 on ehdotettu lisätä adjuvanttia vaikutusta GPI-0100 [44]. Kuitenkin yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen naiivi hiirillä [16], sisällyttäminen Tween-40 TA-CIN /GPI-0100 muotoilu ei vaikuta merkittävästi antituumorivaikutuksen tai E6 /E7-spesifisten CD8 + T-solujen vasteita (kuvio. 1D ja S2B Fig.). Yhdessä nämä tulokset ovat laajentaneet aiempaan toteamukseen GPI-0100 pystyy merkittävästi parantaa immunogeenisyyttä TA-CIN lukien E7-spesifisten CD8 + T-solujen vaste ja tässä osoitettava mahdollisuudet terapeuttista aktiivisuutta vastaan ​​HPV16-transformoituja kasvain C57BL6 hiirillä.

. Kaaviokuva Kokeen suunnittelu. Lyhyesti, 5~8 viikkoa vanhoja naaraspuolisia C57BL /6-hiiriä (10 hiirtä /ryhmä) injektoitiin 5 x 10

4 TC-1-soluja intravenoosisti päivänä 0. Päivänä 3, hiiret rokotettiin joko 6,25 ug /hiiri TA-CIN, tai muotoiltu 50 ug GPI-0100 tai muotoiltu 50 ug GPI-0100 800 ug Tween-40 pistoksena ihon alle. Hiiret kasvattivat kahdesti saman annoksen. Päivänä 27 hiiret tapettiin sadonkorjuun keuhkot ja pernat. B. Yhteenveto määrä TC-1 etäpesäke kyhmyjä keuhkoissa kunkin hiiren (ja valokuvia keuhkoihin on esitetty S2A kuviossa.). C. Yhteenveto painosta keuhkoihin. D. Yhteenveto virtaussytometria-analyysi HPV16 E6 ja E7-spesifisten CD8

+ T-soluvasteita analysoitiin IFN-γ solunsisäistä värjäystä. Tiedot hankittiin FACSCalibur, analysoitiin CellQuest- ja edustavia tietoja esitetään S2B Fig.

immunogeenisyys TA-CIN muotoiltu GPI-0100 in mannitolia ja jäädytetty

Mukavuuden ja parantunut vakaus, se on mahdollisesti hyödyllistä muotoilla suuren erän TA-CIN /GPI-0100 rokotteen ja näyte sen kertakäyttöisiä annoksia, jotka voidaan pakastaa pitkäaikaiseen varastointiin. Koska sen dodekyyliryhmä, GPI-0100 on enemmän hydrofobisia kuin sen

Quillaja

saponiinia edeltäjän ja välttäminen korkean ionivahvuuden puskurit ja valmistetta 5% (isotoninen) mannitoli on edullinen. Siksi meidän muotoiltu TA-CIN kanssa GPI-0100 sekoittamalla sitä yön yli 5% mannitolia ratkaisu. Annokset pakastettiin ja varastoitiin -80 ° C: ssa, kunnes niitä tarvittiin antamista varten. Testata, onko yksittäisen pakastus /sulatus sykli vaikuttaa immuunivasteen, me rokotettu naiivi BALB /c-hiiriä joko juuri muotoiltu TA-CIN /GPI-0100 tai TA-CIN muotoiltu GPI-0100 5% mannitolia ja pakastettiin – 80 ° C: ssa varastointia varten ennen käyttöä. Hiirille annettiin tehoste kaksi kertaa, kuten kuviossa. 2A. Kaksi viikkoa viimeisen rokotuksen jälkeen pernasoluja ja seerumit kerättiin havaitsemiseksi HPV16-spesifisten T-solujen vasteita (Fig. 2B-D, S3A ja C kuviossa.) Ja neutraloivaa vasta-ainetta (kuvio. 2E), vastaavasti. Rokottaminen TA-CIN /GPI-0100 indusoi neutraloivan vasta vastaan ​​HPV16, kun taas TA-CIN yksin tai GPI-0100 ei laukaista havaittavan (tiitteri ≥50) neutraloivan vasta-aineen vastaan ​​HPV16 (Fig. 2E). Mitä tulee solujen immuniteetti, rokotus TA-CIN yksin pystyi tuottamaan sekä TA-CIN-CD4

+ ja CD8

+ T-soluvasteita (Fig. 2B-D, S3A ja C Kuva.). Kuitenkin muotoilussa TA-CIN kanssa GPI-0100 parannettu huomattavasti molempien T-soluvasteita, erityisesti TA-CIN-CD4

+ T-soluvasteita 7-kertaiseksi (Fig. 2B, S3A ja C Kuva.). Tämä CD4

+ T-soluvaste on ainakin osittain L2-erityinen, koska HPV16 L2, mutta ei valetransfektoituja, CT26-solut pystyivät aktivoimaan CD4

+ T-solujen rokotettujen hiirten tuottamiseksi IFN-γ (Fig. 2C, S3B Fig.). Testasimme myös, onko CD4 + -T-soluvasteen HPV16 E7 käyttämällä peptidin, joka sisältää aiemmin raportoitu CD4-T-soluepitoopin [45] ja ei löytynyt yhtään havaittavaa vastetta (S4 kuvassa.). Tärkeää on, hiiret rokotettiin TA-CIN muotoiltu GPI-0100 mannitolia liuokseen ja säilytettiin -80 ° C: ssa syntyy samanlainen TA-CIN-CD4

+, CD8

+ T-solujen ja HPV16-spesifinen neutraloiva vasta-ainevasteita tuoreeltaan muotoiltu TA-CIN kanssa GPI-0100 (kuvio. 2). Nämä tiedot viittaavat siihen, että TA-CIN muotoiltu GPI-0100 in mannitoliliuoksella voidaan pakastaa ja varastoida -80 ° C: ssa pitkään (teho säilyi ajassa 11 kuukauden varastoinnin, pisimpään testattu tähän mennessä), vaarantamatta immunogeenisyyttä .

. Kaaviokuva kokeellista protokollaa. Lyhyesti, 5~8 viikon ikäisiä naaras BALB /c-hiiriä (5 hiirtä /ryhmä) rokotettiin ihonalaisesti joko 6,25 ug /hiiri TA-CIN, tai formuloida 50 ug GPI-0100, tai formuloida 50 ug GPI-0100 in 50,7 mg /ml mannitolia ja suoritetaan yksi jäädytys /sulatus sykli. Hiiret kasvattivat kahdesti saman annoksen kanssa 2 viikon välein. Kaksi viikkoa viimeisen rokotuksen, seerumit ja pernasolut korjattu. B. Yhteenveto virtaussytometrianalyysin TA-CIN-CD4

+ T-soluvasteita analysoitiin IFN-γ solunsisäistä värjäystä (ja edustavia tietoja esitetään S3A kuvassa.). C. Yhteenveto virtaussytometria-analyysi tutkii HPV16-CD4

+ T-soluvasteita aiheuttama TA-CIN muotoiltu GPI-0100 in mannitolia ja jäädytetty /sulatettiin kerran. Pernasolut korjattu rokotuksen jälkeen ja stimuloitiin joko TA-CIN tai HPV16 L2 transfektoiduista CT26-solut (ja edustavia tietoja esitetään S3B kuvassa.). D. Yhteenveto virtaussytometria analyysi TA-CIN-CD8

+ T-soluvasteita analysoitiin IFN-γ solunsisäistä värjäystä. Tiedot hankittiin FACSCalibur ja analysoitiin CellQuest (ja edustavia tietoja esitetään S3C kuvassa.). E. Yhteenveto HPV16 L2-erityisiä neutraloiva vasta-ainetiitteri analysoitiin HPV16-SEAP pseudovirus perustuvaan neutralisaatiomenetelmään.

edelleen testata, onko jäädytetty seos säilyttää immunogeenisuuden kerta jäädytys /sulatus sykli, C57BL /6 hiirillä TC-1 kasvain keuhkoissa annettiin joko TA-CIN juuri muotoiltu GPI-0100 tai TA-CIN muotoiltu GPI-0100 in mannitoliliuoksella, säilytetään -80 ° C: ssa ja sulatettiin juuri ennen käyttöä. Hiirille annettiin tehoste kaksi kertaa, kuten kuviossa. 3A, ja 4 päivää viimeisen rokotuksen, keuhkot ja pernasolut korjattu havaitsemaan kasvaimen kasvua ja T-soluvasteita. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, C ja S5a kuviossa.), Hiiret, joita käsiteltiin GPI-0100 yksinään ei estänyt TC-1 kasvaimen kasvua, ja hiiret rokotettiin TA-CIN yksinään osoitti hieman antituumorivaikutus verrattuna käsittelemättömiin hiiriin. Sitä vastoin hiirillä rokotettu TA-CIN /GPI-0100 suuresti esti kasvaimen kasvua verrattuna TA-CIN tai GPI-0100 yksin käsitellyissä hiirissä, ja vastaus oli samanlainen tuoreiden ja pakastettujen /sulatettu muotoiluja. Seuraavaksi analysoimme CD8

+ T-solu vasteita HPV16 E6 /E7 aikaansaama rokotuksen (Fig. 4A ja S5B Fig.). Mikään ryhmistä osoittivat merkittäviä E6-CD8

+ T-soluvasteita. TA-CIN-rokotetuista hiiristä syntyy heikko E7-spesifisten CD8

+ T-soluvasteita (0,074 ± 0,065% verrattuna 0,013 ± 0,008% hoitamattomassa ja 0,027 ± 0,024% of GPI-0100 käsitelty). Sen sijaan, rokotetut hiiret juuri muotoiltu TA-CIN /GPI-0100 syntyy 25-kertaisesti enemmän (1,888 ± 1,679%, p = 0,003) ja jäädytetyn seoksen osuus 27-kertaisesti enemmän (2,049 ± 2,078%, p = 0,008) E7- CD8

+ T-soluja. E7-spesifisten CD8

+ T-solujen tuottama tuore tai jäädytetty muotoiluun TA-CIN /GPI-0100 olivat vertailukelpoisia (p = 0,851).

. Kaaviokuva kokeellista protokollaa. Lyhyesti, 5~8 viikon ikäisiä C57BL /6-hiiriä (10 hiirtä /ryhmä) injektoitiin 5 x 10

4 TC-1-soluja intravenoosisti päivänä 0. Päivänä 3, hiiret rokotettiin s.c. joko 6,25 ug /hiiri TA-CIN, tai muotoiltu 50 ug GPI-0100 tai muotoiltu 50 ug GPI-0100 in 50,7 mg /ml mannitolia ja jäädytetty /sulatettiin kerran. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.