Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aikaisemmin on raportoitu, että retigeric happoa B (RB), luonnollinen pentasyklisestä triterpenic happo eristettiin jäkälää, esti solujen kasvua ja aiheutti apoptoosia androgeenista riippumaton eturauhassyöpä (PCA) soluja. Kuitenkin vaikutusmekanismi RB on edelleen epäselvä. Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että käyttämällä PC3 ja DU145 soluja malleina, RB esti fosforylaation tasoja IκBα ja p65-alayksikkö NF-KB on aika- ja annostus riippuvaisella tavalla. Yksityiskohtainen tutkimus paljasti, että RB esti tumaansiirtymiseen p65 ja proteiinin DNA, joka korreloi tukahduttaminen NF-KB-säänneltyjen proteiinien kuten Bcl-2, Bcl-x

L, sykliini D1 ja surviviinin. NF-KB-reportterimääritys viittasi siihen, että RB-kykeni inhiboimaan sekä konstitutiivista aktivoitua NF-KB: n ja LPS: ää (lipopolysakkaridi) aiheuttaman NF-KB: n. Yliekspressio RelA /p65 pelastettiin RB-solukuolema, kun taas pudotus RelA /p65 edistänyt merkittävästi RB-välitteisen estävä vaikutus solujen lisääntymistä, mikä viittaa ratkaisevan tärkeä osallistuminen NF-KB-reitin tähän tapahtumaan. Olemme lisäksi analysoitu antituumorivaikutuksen RB

in vivo

tutkimuksessa. C57BL /6-hiirissä, joissa RM-1 homografts, RB inhiboi kasvaimen kasvua ja laukaisee apoptoosin pääasiassa tukahduttaa NF-KB: n aktiivisuuden kasvainkudoksissa. Lisäksi DNA-siru paljastivat maailmanlaajuinen muutoksia geenien ilmentyminen liittyy solujen lisääntymistä, apoptoosin, invaasio ja etäpesäkkeiden vastauksena RB hoitoon. Näin ollen meidän havainnot ehdottivat, että RB kohdistuu sen kasvaimen vastaisen vaikutuksen kohdistamalla NF-KB-reitin PCA-soluissa, ja tämä voi olla yleinen mekanismi kasvainten vastaisen vaikutuksen RB muiden syöpien samoin.

Citation: Liu YQ, Hu XY, Lu T, Cheng YN, Young CYF, Yuan HQ, et al. (2012) Retigeric Acid B Näytteillä antituumorivaikutus kautta tukahduttaminen Nuclear Factor-KB Signaling eturauhassyöpäsoluissa

in vitro

ja

Vivo

. PLoS ONE 7 (5): e38000. doi: 10,1371 /journal.pone.0038000

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 joulukuu 2011; Hyväksytty: 28 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 29, 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (30973551, 30925038), ja Shandong Scientific Technology Program (2008GG10002042). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCa) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia miehillä [1]. Se lähtee lokalisoitu, androgeeniriippuvainen taudin invasiivisen ja metastaattisen hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä (HRPC), ilman merkittävää ennustetekijöiden etu perinteisiin antituumoriaineista [2]. Siksi uudet strategiat kohdistaminen molekyylitason Eturauhassyövän eteneminen tarvitaan pikaisesti.

Keskeinen Nukleaaritekijä KB (NF-KB), joka on hyvin dokumentoitu transkription tekijä, on ratkaisevan tärkeää hallita solujen lisääntymisen nisäkkäillä. Klassisessa koulutusjakson, tyypillinen NF-KB-dimeerit (p50 /p65) yleensä erottautuvat sitoutumalla IκBα sytoplasmassa. IκBα alayksikkö fosforyloituu seriinitähteiksi 32 ja 36, ​​joita IKK, ja sitten hajoaminen läpi proteosomal reitin, p50-p65-IκBα heterotrimeerissä muuttumassa p50-p65-heterodimeeri. Lokalisoituminen tumaan signaalit NF-KB-proteiinin altistuvat ja p65-alayksikkö on fosforyloituu, mikä tumaansiirtymiseen ja transkription aktivaation mahdollisia, ja lopuksi indusoi ilmentymisen suuren määrän kohdegeenien. [3], [4] Pakottava näyttö on osoitettu, että poikkeava NF-KB: n asetus liittyy taudin alkamisen ja etenemisen eri ihmisen syövän, mukaan lukien PCa, säätelemällä geenien ilmentymistä tärkeää monia vaiheita kasvaimen ja etenemisen [2]. Esimerkiksi, tyypillinen NF-KB: n geenien Bcl-2 ja surviviini, korreloi solujen eloonjäämistä; sykliini D1, korreloi leviämisen; syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), korreloi tulehdus; matriksimetalloproteinaasi-9 (MMP-9) ja adheesiomolekyylien (ICAM), korreloi invaasio; verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) ja plasminogeeniaktivaattori urokinaasi (Plau), korreloi angiogeneesin [3], [4], [5]. On havaittu, että ydinvoiman lokalisointi NF-KB p65 in primaarikasvainten näytteissä [6], [7], mikä viittaa siihen, että konstitutiivinen NF-KB ehkä varhainen tapahtuma PCa kehittämiseen ja on ennustetekijöitä merkitys primaarikasvaimia. Siksi sieppaaminen NF-KB signalointi voisi olla houkutteleva antituumorivaikutuksen lähestymistapaa [4], [5], [8], [9]. Suppressio NF-KB: n aktiivisuus on osoitettu tukahduttaa kasvua erilaisten syöpäsolujen sekä

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi anti-apoptoottista aktiivisuutta NF-KB: n: lla on rooli tuumorisolujen resistenssiin kemoterapeuttisia reagenssien ja sädehoidon [8]. In solunsalpaajaresistentti androgeenista riippumaton PCa soluja, NF-KB on konstitutiivisesti aktivoitunut konstitutiivisen IKB kinaasi (IKK) aktiivisuus [4], [5].

Edellisessä tutkimuksessa on osoitettu, että retigeric happoa B (RB) luonnollinen pentasyklinen triterpenic happo, hänellä on kyky estää solujen kasvua ja indusoivat apoptoosia useissa solulinjoissa, mukaan lukien Eturauhassyövän soluihin [10]. Down-regulation ilmentymisen Bcl-2, joka on yksi NF-KB-riippuvaisia ​​geenejä, ja kaspaasi signaloinnin havaitaan RB-käsiteltyjen PC3-solujen [10], [11]. Lisäksi, samanlainen rakenne RB, muut kasveista peräisin olevat triterpenoids mukaan lukien asetyyli-11-keto-β-boswellic happo (AKBA), ursolic ja betuliinihappoa, on raportoitu häiritä NF-KB-reitin [12] [13], [14]. Nämä havainnot sai meidät testata hypoteesia, jonka mukaan RB voi aiheuttaa sen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista PCA kautta modulaatio NF-KB: n signalointi. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että RB alassäädetty p65 fosforylaation ja tumaansiirtymiseen, ja esti konstitutiivisen NF-KB: n signalointi androgeeni-riippumaton PC3 ja DU145 soluissa ja C56BL /6 homografts hiirillä.

tulokset

RB näyttelyitä estovaikutus p65 fosforylaation karsinoomasoluja

aloitti tutkimuksen testata, onko RB laukaista apoptoosin kautta estämällä ilmaisun ja NF-KB: PC3 ja DU145 solut, joissa NF-KB signalointi konstitutiivisesti aktivoitu ja osaltaan niiden vastustuskykyä apoptoosin vuoksi ilmentymistä NF-KB-moduloidun antiapoptoottisten proteiineja. Kuten kuviossa 1A ja 1B, RB osoitti estää heikosti ilmentymistä koko p65-alayksikön NF-KB: PC3 ja DU145 soluja (1.1~1.3-kertainen pieneneminen korkein annos), kun taas merkittävästi alassäädetty fosforylaatiota p65 -Ser536 oli sekä annoksesta ja ajasta riippuva (4~6-kertainen pieneneminen korkeimman annoksen tai 48 h). Samanlainen havaintoja proteiinin veren kokonaiskolesterolia p65, kvantitatiivinen PCR data paljasti, että mRNA-tasolla p65 inhiboi RB hoito on maltillisesti (kuvio 1 C, 1D). Hoito PC3 ja DU145-solujen kanssa 10 uM RB 24 tuntia johti ~35% lasku mRNA-tasolla p65 verrattuna vehikkelikontrolliin (kuvio 1C, 1D).

(A) ja (B ) RB hieman esti ilmentymistä p65 PC3 ja DU145 soluja, kun taas merkittävästi Ser-536 fosforylaatioon p65 (

p-p65

), sekä annostus riippuvia ja aikariippuvainen tavalla. Lysaatit kokonaisia ​​soluja käsiteltiin RB eri pitoisuuksilla 24 h (A) tai 10 uM RB osoitetaan kertaa käytettiin western blot (B). GAPDH toimi latauskontrollina. Proteiini määrä normalisoitui määrään GAPDH, ja kvantitoitiin densitometrialla X-ray elokuvia. Tulokset yhdestä vähintään kolmen itsenäisen kokeen on esitetty. (C) ja (D) RB kohtalaisen alassäädetty p65 mRNA tasolla PC3 ja DU145 solujen havaitaan QRT-PCR. Menetelmä suoritettiin, kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

. Esitetyt tulokset ovat edustajia kolmesta itsenäisestä kokeesta, p 0,05 (*), versus RB-hoitamattomaan verrokkiryhmään vastaavasti.

laajentaa havainto laski fosfori-p65 PCA soluissa, havaitsimme tasot koko p65 ja fosfori-p65 muissa syöpäsolulinjoissa. Tulokset paljastivat, että RB pystyi vähentämään p65 fosforylaatiota paneelia sinoomasolulinjoja myös Human maksan hepatosellulaarista solut HepG2-soluissa, ihmisen myeloidileukemiasolulinjassa K562-solut ja adriamysiini kestävä K562 /AO2 solujen osoitettuun annoksena, kun taas vähäinen vaikutus ihmisten munasarjasyöpä SKOV3 ja ihmisen keuhkojen A549-solut (kuva S1). Yhdessä tiedot osoittivat, että RB ollut suuri vaikutus tukahduttaminen p65 fosforylaation, erityisesti PCA soluissa.

RB vaimentaa tumaansiirtymiseen ja NF-KB: n PCA soluissa

sitten testattu onko RB välittämää tukahduttaminen fosfori-p65 alensi ydin- lokalisaatio p65 PC3-soluissa, joka on välttämätön NF-KB aktivoida kohdegeenin transkription. Kuten kuviossa 2A on esitetty, RB dramaattisesti vähentää runsaasti fosfori-p65 tumassa annoksesta riippuvalla tavalla, ja alentuneet fosfori-p65, jossain määrin havaittiin sytoplasmassa samoin. Immunofluoresenssikokeisiin Tulokset Kuviossa 2B edelleen vahvisti, että samanlainen Western blot-määrityksessä merkittävästi vähentynyt tumakertymään p65 havaittiin selvästi, kun taas p65 on diffuusisti esitetty koko sytosoliin ja ytimen käsittelemättömissä soluissa.

( A) RB annos-riippuvasti esti tumaanohjaussignaali p65 Lysaatit sytoplasmassa ja tumassa vastaavasti käsittelyn jälkeen PC3-solujen RB 24 h käytettiin western blot. GAPDH ja H1 vastaavasti toimi latauskontrollina. (B) Immunofluoresenssianalyysi estävä ydinvoiman lokalisointi p65 RB-hoito 12 tuntia PC3-soluissa. Sillä konfokaalimikroskopia, α-tubuliinin ja p-p65 immunovärjättiin, jossa ytimet värjättiin DAPI. (Scale bar, 10 pm). (C) esikäsittely PC3-solujen RB inhiboivat tumauutteiden ja NF-KB-sitoutumiskohdan, kuten havaitaan elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä. Lysaatit ytimet jälkeen hoitoon PC3 solujen RB 24 tuntia käytettiin EMSA. (D), (E) ja (F) RB laski NF-KB: n aktivaation PC3 ja DU145-solut, ja se esti LPS-indusoidun NF-KB: n aktivaation LNCaP-soluissa. Inhibitio oli merkittävä, kun PNF-KB-Luciferase ja RELA ekspressiovektori transfektoitiin. Lyhytaikaisesti transfektoidut solut esi-inkuboitiin RB 24 tuntia. Lusiferaasimääritys suoritettiin kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

. In (D) – (F), tulokset ovat keskiarvo ± S.E. kolmen itsenäisen kokeen, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. p 0,05 (*), p 0,01 (**), p 0,001 (***) versus RB-hoitamattomaan verrokkiryhmään vastaavasti.

elektroforeettinen liikkuvuus shift (EMSA) oli seuraava tehty testata, onko RB vaikuttaa NF-KB: n DNA: ta sitova kyky PC3-soluissa. Vahva band shift havaittiin, kun ydin- uute käsittelemätön kontrolli-solujen (kaista 4 kuviossa 2C), kun taas sitova komplekseja huomattavasti vähennetty RB-käsitellyissä soluissa annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 2C, kaistat 5 ja 6). Spesifisyyden NF-KB: n sitoutuminen todettiin kilpailun kokeissa 100-kertainen molaarinen ylimäärä leimaamatonta NF-KB: n (kuvio 2C, kaista 2). AKBA, toimi positiivisena kontrollina, vähensi sitoutumisen aktiivisuutta NF-KB: n sekä (kuvio 2C, kaista 3).

yrittää selvittää, onko RB vastaavasti inhiboi NF-KB: n transkriptionaalisen aktiivisuuden, teimme ohimenevä transfektiokokeissa käyttäen reportteri plasmidi, joka sisältää 4 tandem-KB: n sitoutumiskohdat ylävirtaan lusiferaasigeenin. Kuten kuviossa 2D on esitetty, RB aiheutti merkittävän laskun (p 0,05) NF-KB: n reportteri aktiivisuuden PC3-soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kohdunulkoinen ilmentymistä p65 (RELA) sai aikaan merkitsevän säätely ylöspäin NF-KB lusiferaasivaikutusta, joka voi olla myös huomattavasti vähentynyt (p 0,001) käsittelyn jälkeen RB (kuvio 2D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin DU145-soluissa samoissa koeolosuhteissa (kuvio 2E).

tutkimiseksi, että RB oli mahdollisuus estää indusoituvan NF-KB: n aktiivisuuden, suoritimme NF-KB: n reportterimääritystä LNCaP-soluissa. Toisin PC3 tai DU145 soluja, LNCaP tiedetään olevan alhainen NF-KB: n aktiivisuutta. Kuten kuviossa 2F, NF-KB-riippuvaisia ​​reportteri aktiivisuus lisääntyi hieman käsittelyn jälkeen NF-KB-indusoivan tekijän pelkästään LPS: llä. Kuitenkin lusiferaasin tuotantoa syvästi vahvistunut soluissa yli-ilmentyminen p65 (RELA). Aktiivisuus NF-KB edelleen dramaattisesti vähentynyt altistuneiden solujen RB. Nämä tiedot osoittivat, että RB tukahdutti sekä indusoituva (LPS) ja konstitutiivinen NF-KB: n aktiivisuuden PCA soluissa, mahdollisesti RB-välitteinen säätely alaspäin fosforylaation, tumaansiirtymiseen ja DNA: ta sitova kyky NF-KB: n.

RB estää IκBα fosforylaation ja sen hajoamistuotteet

sen tutkimiseksi, onko RB-välitteinen inaktivaatio NF-KB: n katsottiin johtuvan inhibitioon IκBα hajoamisen, tutkimme muutos IκBα vastauksena RB western blot -analyysillä. Kuten kuviossa 3A on esitetty, hoito kohonneet pitoisuudet RB johti yli-ilmentyminen yhteensä IκBα sekä PC3 ja DU145-soluissa. Vastaavasti vähennetään IκBα fosforylaatio todettiin hoidon jälkeen 10-20 uM RB näissä kahdessa solulinjassa. Aika kineettiset tutkimukset paljastivat, että RB sääteli ilmentymistä koko IκBα, ja vähensi fosforylaation IκBα välillä -12 h PC3-soluissa (kuvio 3B). Samanlainen vaikutus havaittiin DU145-soluissa sen jälkeen, kun pidempi (24 h) käsittelemällä RB kuin että PC3-soluissa (kuvio 3B). Proteasomiaktiivisuuden määritys paljasti, että RB ei aiheuttanut estävää vaikutusta rekombinantin 20S-proteasomin entsyymin (kuvio 3C), joka tarvitaan phosphorylatoin riippuvainen IκBα hajoamista. Tällöin tiedot osoittivat, että alassäädetty of IκBα hajoamisen ja p65 fosforylaation saattaa johtua tehokas tukahduttaminen IKK aktivaation RB, joka lopulta johtaa NF-KB: n aktiivisuutta.

(A) Western blot analyysi ilmentymisen yhteensä IκBα ja fosfori-IκBα (

p-IκBα,

Ser32 /36) p-IκBα. PC3 ja DU145-soluja käsiteltiin RB eri annosten kuten on osoitettu. (B) Western blot -analyysi ilmentymisen yhteensä IκBα ja p-IκBα. PC3 ja DU145-soluja käsiteltiin RB eri aikoina kuten on osoitettu. (A) ja (B), yhtäläinen proteiini lastaus arvioitiin GAPDH. Proteiini määrä normalisoitui määrään GAPDH, ja kvantitoitiin densitometrialla X-ray elokuvia. Tulokset yhdestä vähintään kolmen itsenäisen kokeen on esitetty. (C) vaikutus RB on puhdistettu 20S-proteasomin

in vitro

. MG132 toimi positiivisena kontrollina. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, p 0,05 (*), p 0,01 (**), verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään vastaavasti.

RB tukahduttaa ilmentymistä NF-κB- geenien, indusoi apoptoosia, ja vähentää solujen läpi kulkeutumista NF-KB-reitin

Koska NF-KB säätelee useita geenejä, jotka osallistuvat solun kasvuun, apoptoosin, angiogeneesin ja metastaasin kasvainsolujen, me tutkimme, NF-KB: n aktiivisuuden RB voisi transkriptionaalisesti johtaa modulaatiota näiden geenituotteiden. Hoito RB merkittävästi vähentynyt ilmentyminen Bcl-x

L, Bcl-2, surviviini, ja sykliini D1 sekä mRNA: ta (kuvio 4A) ja proteiinin tasot (kuvio 4B) joko PC3 tai DU145 solujen annos-riippuvainen tavalla. Surviviinista, tunnettu antiapoptoottisten proteiinia, oli myös huomattavasti pienempi RB-käsitellyissä soluissa, kuten on esitetty kuviossa 4B.

(A) RB annos-riippuvasti inhiboi mRNA: n ilmentymisen ja Bcl-x

L, Bcl- 2 surviviiniperäiset, ja sykliini D1 analysoituna QRT-PCR. GAPDH käytettiin normalisointi. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. p 0,05 (*), p 0,01 (**), p 0,001 (***) versus RB-hoitamattomaan verrokkiryhmään vastaavasti. (B) RB annos-riippuvasti inhiboi Bcl-x

L, Bcl-2, surviviini, ja sykliini D. tulokset Western blot-analyysi kokosolulysaateista päässä PC3-soluja käsiteltiin eri annoksilla RB esitettiin; GAPDH sisällytettiin latauskontrollina. (C) RB esti hyökkäyksen Eturauhassyövän soluja pitoisuutena riippuvalla tavalla havaita transwell määritystä (asteikko bar, 100 m). Menettely on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

. (D) määrä soluja, jotka hyökkäävät läpi matrigeeliä.

NF-KB: n RB johti meidät analysoimaan edelleen vaikutuksia RB solujen invaasiota. Kuten on esitetty kuviossa 4C, invasiivisuus kautta matrigeeliä oli konsentraatiosta riippuvaa laskua RB-käsitelty PC3 ja DU145-soluja verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin. Kuten esitetty kuviossa 4D, RB-hoito johti merkittävään korttelin soluvaelluksen annos-riippuvaisella tavalla. Nämä tulokset osoittivat, että alentunut NF-KB: n RB olennaisesti tukahdutti NF-KB-riippuvaisia ​​antiapoptoottisten ja invasiivisia proteiineja, mikä johtaa laskuun kasvainsolujen invaasion.

arvioimiseksi muutosten globaalin geenin ilmentymisen PC3-soluissa hoidon jälkeen RB, Affymetrix GeneChip- Human Genome U133 Plus 2.0 array, joka sisälsi noin 39000 tunnettu ihmisen geenejä, käytettiin suorittamaan kokeen. Yhteensä 855 geenien ilmentyminen lisääntyy yli kaksinkertaiseksi muutos, ja 763-geenien vaimentua RB-käsiteltyjen PC3-soluissa verrattuna kontrollisoluihin. Tulokset täydentävät tiedot (taulukko S1) paljasti, että mRNA-tasot NF-KB: n perheen ja NF-KB: n liittyvien geenien, lisäksi muita solun proliferation- ja eloonjääminen liittyvien geenien ja apoptoottisten säätelygeenejä esitetään tietenkin muutos ( = 1,5-kertainen). Nämä tulokset ovat enimmäkseen linjassa kuvatut tiedot. Monet tyypillinen geenejä, kuten Bcl-x

L, sykliini D1, P27, P21, jne. Olivat säädellä vähentävästi RB käsitellyssä näytteessä (kuva S2), siis vahvistivat lisäksi RB estää NF-KB signalointi ja sen loppupään tavoite geenin ilmentymistä.

Sen määrittämiseksi, onko p65: n (RELA) on tärkeä rooli RB-jäseneksi apoptoosin PCa soluissa, testasimme vaikutus RB solun elinkelpoisuuden soluissa, jotka ovat joko yli-ilmennetään tai ablatoitu varten p65 siRNA. Havaittiin, että p65 ekspressioplasmidin todellakin parannettu ilmaisua ja fosforylaation tasoja p65 yli-tasojen (kuvio 5A), ja johti osittaiseen pelastamiseen seuraukset RB-solukuolema sekä PC3 ja DU145 soluja (kuvio 5B) osoittaen, että p65 siirrettävä solun resistentiksi indusoiman apoptoosin RB.

(a) ja (B) RELA yliekspressio transfektoimalla on RELA ekspressiovektorin osittain poistetun sytotoksisuutta PC3 ja DU145-soluissa. Solut transfektoitiin siRNA RelA (RELAi) tai negatiivinen kontrolli siRNA (NCI), käyttämällä 50 nmol /l lopullinen siRNA pitoisuus. 48 tunnin jälkeen transfektion RELA yli-ilmentymisen vaikutus RB on p65: n, p-p65, ja PARP ilmentyminen RELA transfektoiduissa soluissa määritettiin western blot; Solujen elinkelpoisuus määritettiin myös sen jälkeen, kun altistus 24 h RB. (C) ja (D) vaiennettu RELA ilmentymisen siRNA lisääntynyt sytotoksisuus aiheuttama RB. Samanlaisia ​​menettely suoritettiin varten tutkimuksia RELA. Yksityiskohdat kuvataan

Materiaalit ja menetelmät

. (A) ja (C), proteiinin tasoja p65 ja p-p65 normalisoitiin kanssa GAPDH. Esitetyt tulokset ovat edustajia kolmen erillisen kokeen. In (B) ja (D), p 0,05 (*), p 0,01 (**), p 0,001 (***) versus RB-hoitamattomaan verrokkiryhmään, vastaavasti.

siRNA- kokeessa, päätimme yksi p65-kohdistaminen siRNA, joka kohdistuu voimakas aktiivisuus heikentävistä p65 ilmentymisen arviointiin solujen eloonjäämistä (tietoja ei esitetty). Kuten kuviossa 5C, ilmaisu ja fosforylaatiota p65 oli selvästi poistettiin transfektoiduissa soluissa p65 kohdistamisen siRNA, verrattuna ryntäily siRNA. Knockdown p65 merkittävästi tukahdutti solujen kasvua (kuvio 5D), ja RB-hoito johti huomattavasti alempi fosfori-p65 ja PARP (116 kDa) in p65-köyhdytettyä solujen ja (kuvio 5C), joka johtaa selvempi estoa solussa elinkelpoisuus. Näin ollen, nämä tulokset osoittivat, että NF-KB: n p65 oli välttämätöntä RB-solukuolema.

RB kykenee sen antituumorivaikutuksen kautta suppression p65 fosforylaation tuumorikudokseen hiirten

ottaa osoitti tehoa RB estämiseksi NF-KB signalointi PCA viljeltyjen solujen tutkimme seuraavaksi sen mahdollinen antituumorivaikutus hiirillä. Erityisesti olemme suoritettiin tutkimuksia ilmentymisen tutkimiseksi ja aktivointi p65 kasvainkudoksissa hiirillä. Ensin tarkasteltiin sytotoksista aktiivisuutta RB ja AKBA. RB ja AKBA vähensi huomattavasti RM-1 solujen kasvun (dataa ei näytetty). Vielä tärkeämpää on, RB ja AKBA merkittävästi tukahdutti fosforylaatiota p65 RM-1-soluja haluttuun pitoisuuksina (kuvio 6A). Siten tämä solulinja vastaa sen ihmisen kollegansa ja käytettiin perustamiseen PCa homografts in C57BL /6-hiiristä. Istutuksen jälkeen RM-1-solut subkutaanisesti C57BL /6-hiiriä, me käsitellyillä hiirillä päivittäin injektoimalla intraperitoneaalisesti 25 mg /kg RB alkoi 7 päivää sen jälkeen, kun solujen inokulaation ja jatkettiin vielä 18 päivää. Ryhmä hoito 25 mg /kg AKBA toimi positiivisena kontrollina. Vastaanottaminen on vehikkelikontrolliryhmään, RB- tai AKBA-hoito vähensi merkittävästi keskimääräistä kasvaimen tilavuus jälkeen kuudes, 12. ja 18.

th hoitopäivän RB ryhmä näkyy tehokkaampi vaikutus (kuvio 6B ja 6C). Tulokset taulukossa 1 kävi ilmi, että tuumorit punnittiin myös vähentynyt merkittävästi RB ja AKBA ryhmiä verrattuna vehikkelikontrolliryhmään (p 0,001). Esto hinnat kasvaimen painon RB ja AKBA ryhmät olivat 49,60% ja 30,01%, tässä järjestyksessä. TUNEL värjäys osoitti, että, toisin kuin tuumorikudokset vastaanottaa ajoneuvon, yhä useammat TUNEL positiivista värjättiin apoptoottisia soluja havaittiin kasvaimen kudoksissa RB tai AKBA käsiteltyihin hiiriin (kuvio 6D, oikea paneeli). Nämä apoptoottisia soluja kirjattiin kokonaisuudessaan osassa kasvaimen asioita käsitellään kemikaaleilla. Histologinen H keskiarvo ± SD; p 0,05 (*), p 0,01 (**), p 0,001 (***) verrattuna keskipitkän kontrolliryhmään, vastaavasti. (C) edustaja kasvaimia kolmesta ryhmästä on esitetty. (D) H nämä tulokset osoittavat, että luonnollinen pentasyklisestä triterpenic hapot voivat olla laaja estäjät NF-KB: n aktivaation.

Kuitenkin, suppressio joidenkin geenituotteiden pentasyklisestä triterpenic happojen näyttää olevan selektiivinen Meidän tiedot osoittivat, että VEGF: n ja COX-2-ilmaisujen pysyi muuttumattomana PC3 altistuneiden solujen RB (tietoja ei esitetty). Muut ryhmät ”tutkimusten mukaan AKBA estää VEGF ilmentymisen plasmasytooma- U266-soluissa [18], ja estää COX-2 mRNA: n ilmentymisen indusoima TNF KBM-5-soluissa [19]. Mukaisesti AKBA, ursolic ja betuliinihappo myös laukaista vähentäminen VEGF: n ja COX-2-tason muissa solulinjoissa, mukaan lukien ihmisen leukemian solulinjassa Jurkat, ihmisen epiteelisolulinjaa HCT116, keuhkosyövän solulinjat A549, H3255 ja Calu-6, ihmisen PCa solulinjassa PC3, ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa RKO ja SW480. [13], [14], [20], [21]. Vaikutukset kasviperäisiä pentasyklisestä triterpenic hapot NF-KB signalointireitistä voi vaihdella johtuen eri substituoituihin ryhmiin pentasyklisestä triterpenes, ja /tai riippuvaista solutyypistä.

Yhdessä meidän havainnot viittaavat, että RB edistää apoptoosia tukahduttaminen NF-KB: n aktivaation ja NF-KB: n riippuvaisen antiapoptoottisten geenien ilmentyminen in PCa soluissa ja eläinmalleissa, ja NF-KB: n signalointireitin on tärkeä molekyylitasolla syövän vastaista aktiivisuutta RB.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

Retigeric happoa B (RB) eristettiin lichen

L. kurokawae

, ja sen puhtaus ja rakenne määritys on kuvattu aikaisemmin [22]. Asetyyli-11-keto-β-boswellic happo (AKBA) eristettiin ja puhdistettiin käänteisfaasi korkean erotuskyvyn nestekromatografialla, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Yhdisteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) 10 mM kantaliuoksina säilytettiin -20 ° C: ssa ja laimennettiin mukaan kokeellisiin vaatimukset, kun käytetään. Soveltamisen RB on homograftuvasteeseen malleissa olemme kehittäneet liuotinta, joka koostuu fysiologista suolaliuosta /DMSO /etanoli /Tween 80 (75:10:10:5, v /v).

Soluviljelmä ja Homografts

Ihmisen PCa LNCaP (American Type Culture Collection, Rockville, MD), PC3, DU145 soluja, ja hiiren PCa RM-1-soluja (Cell Bank of Kiinan tiedeakatemia, Shanghai) viljeltiin RPMI 1640 -alustassa (HyClone), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (HyClone). Ihmisen keuhkojen A549-soluja viljeltiin Hamin /F-12 (HyClone), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (HyClone). Ihmisen maksan maksasolujen solut HepG2, ihmisen munasarjan syöpäsolujen SKOV3, ihmisen myeloidinen leukemia K562 ja adriamysiini kestävä K562 /AO2, viljeltiin RPMI 1640-alustassa (HyClone), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (HyClone).

RM-1-solut C57BL hiiren eturauhasen kasvaimia androgen riippumaton ja voidaan istuttaa osaksi hiirissä liuottaa homotransplantation, joka sopii simuloi ihmisen PCa.