Krooninen sairaus

tiivistelmä

simvastatiini ja lovastatiini ovat statiinit perinteisesti käytetään alentaa seerumin kolesterolitasoa . On kuitenkin olemassa näyttöä siitä, niiden potentiaali kemoterapeuttisen ominaisuuksia syövän. Tässä tutkimuksessa käytimme bioinformatiikan analyysi julkisesti saatavilla, jotta systemaattisesti tunnistaa osallistuvien geenien resistenssiä sytotoksisia vaikutuksia näiden kahden lääkkeiden NCI60 solulinjassa paneeli. Käytimme farmakologinen tietoja kaikista NCI60 solulinjat luokittelemaan simvastatiinin tai lovastatiinin resistenttien ja herkkien solulinjoissa, vastaavasti. Seuraavaksi suoritimme koko genomin single merkki tapaus-verrokki yhdistyksen testit lovastatiinin ja simvastatiinin resistenttien ja herkkien solujen käyttäen julkisesti saatavilla Affymetrix 125K SNP genomista tietoa. Tuloksia arvioitiin sitten käyttäen RNAi menetelmiä. Korjauksen jälkeen

p

arvot useille testaus käyttäen False Discovery Luokittele, tuloksemme tunnistettu kolme geeniä (

NRP1

,

COL13A1

,

MRPS31

) ja kuusi geeniä (

EAF2

,

ANK2

,

AKAP7

,

STEAP2

,

LPIN2

,

PARVB

) liittyy vastustuskykyä simvastatiinin ja lovastatiinin, vastaavasti. Toiminnallinen validointi käyttäen RNAi vahvisti, että hiljentäminen

EAF2

ilmaisu moduloitu vaste HCT-116 koolonsyöpäsoluihin molemmille statiineja. Yhteenvetona, olemme menestyksellisesti käyttäneet julkisesti saatavilla tietoja NCI60 solulinjoissa suorittamaan koko genomin yhdistys tutkimukset simvastatiinin ja lovastatiinin. Tuloksemme osoitti geenien soluvasteen näitä statiineja ja siRNA tutkimukset vahvistivat roolista

EAF2

vastauksena Näiden lääkkeiden HCT-116 koolonsyöpäsoluihin.

Citation: Savas S , Azorsa DO, Jarjanazi H, Ibrahim-Zada I, Gonzales IM, Arora S, et al. (2011) NCI60 tasyöpäsolulinja Panel Data ja RNAi analyysi auttaa tunnistamaan EAF2 kuin modulaattori simvastatiinin ja lovastatiinin Response in HCT-116 solut. PLoS ONE 6 (4): e18306. doi: 10,1371 /journal.pone.0018306

Editor: Eric Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2011; Julkaistu: 04 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Savas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat TGen institutionaalisten tutkimusrahoitusta ja apurahan eturauhassyövän perusta (H. Ozcelik). Y. H. Choi tukee apurahan Kanadan Breast Cancer Foundation – Ontario luku. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

simvastatiini ja lovastatiini ovat kaksi statiinit perinteisesti käytetty alentaa seerumin kolesterolitasoja. Statiinit ovat palautuvia inhibiittoreita mikrosomaalisten entsyymien HMG-CoA-reduktaasin, joka muuttaa HMG-CoA: n mevalonaatiksi. Tämä on varhainen nopeutta rajoittava vaihe kolesterolin biosynteesissä. Ihmisissä, HMG-CoA-reduktaasin by statiinien vähentää solunsisäisen kolesterolin biosynteesin, mikä puolestaan ​​johtaa transkriptionaalisesti ilmen- tymisen lisääntymisen tuotannon mikrosomaalisten HMG-CoA-reduktaasin ja solun pinnan LDL-reseptorien. Kuitenkin simvastatiini ja lovastatiini eroavat joitakin tärkeitä näkökohtia aineenvaihdunnan aste ja määrä aktiivisia ja inaktiivisia metaboliitteja [1]. Viime aikoina statiinit ovat saavuttaneet merkittävän varoitusajalla syöpälääkkeiden perustuu prekliinisissä näyttöä niiden antiproliferatiivinen, proapoptoottiset, anti-invasiivisia ja sädeherkistävä ominaisuudet [2], [3], [4], [5], [6]. Rooli statiinien kolesteroliaineenvaihduntaa voivat selittää niiden mahdollinen sytotoksinen ominaisuudet.

Kolesteroli on keskeinen lipidi kerääntyvä kalvo mikro-verkkotunnuksia kutsutaan Lipidilauttojen. Lipidilauttojen tärkeä rooli signaalinvälityksessä, joka laukaisee solujen kasvua, selviytymistä ja monet muut prosessit, jotka korreloivat syöpä. Kolesteroli kertyminen kasvaimissa on osoitettu useissa tutkimuksissa aiemmin [7], [8], [9], [10]. Kolesterolin kasaantuminen lipidilautan mikro-verkkotunnuksia solukalvon voi olla rooli stimuloiva signaalitransduktioreitteihin. Freeman ja Solomon (2004) ovat esittäneet, että lisäys kolesterolin eturauhaskasvainsolun kalvo, joka voi johtua kasvusta verenkierrossa tai vapauttamisen endogeenisen synteesin synnyttävät yhtyminen lauttaa verkkotunnusten [7]. Tämä puolestaan ​​saattaa vaikuttaa erottelu positiivisten säätelijöitä onkogeenisten signaloinnin sisällä lautat, pitäen alipaineensäätöventtiileillä nesteessä mosaiikki membraanifraktio [7]. Edelleen ehdotetaan, että tutkimus toiminta lipidilauttoihin eturauhassyövän soluissa voisi antaa yksityiskohtaista tietoa roolista kiertävän kolesterolin pahanlaatuisten kasvainten ja mahdollisesta suhteesta ruokavalion ja aggressiivinen tauti. Siksi luonnehdinta proteiinien runsaasti kolesterolia mikro domeenit voivat palvella paremmin selventää signalointireittejä, joka johtaa tunnistamiseen uusien biomarkkereiden sairauden etenemisen ja uusia tavoitteita syöpähoitoa.

Muuttuva lääkekäsittelyyn , kuten vastus, on vakava terveysongelma. Useat tekijät, kuten ikä ja ruokavalio ovat sekaantuneet kemoterapeuttisten vastarintaa vaikuttamalla lääkkeen adsorptiota, kuljetus, aineenvaihdunta, ja niiden fysiologisia vaikutuksia. Geneettiset tekijät ovat mukana myös lääkeresistenssin. Esimerkiksi geneettiset vaihtelut, jotka aiheuttavat muutoksia geenien toiminnan ja ilme ovat sekaantuneet lääkeresistenssin [11], [12]. Siksi optimaalista hoidon tehokkuutta, meidän on tiedettävä liittyvien geenien lääkeresistenssi sekä niiden profiilit jokaiselle potilaalle (henkilökohtaisen lääketieteen). Tältä osin NCI60 solulinja paneelissa muodostaa lupaava työkalu löytää uusia syöpälääkkeitä. NCI60 solulinja paneeli on perustettu useista kasvaimia, jotta voidaan tunnistaa yhdisteitä, jotka voivat tappaa syöpäsoluja [13]. Toistaiseksi tämä solulinja paneelissa on altistunut yli 100000 erilaisia ​​yhdisteitä ja soluvasteiden muodossa kasvuluvut on mitattu. Käyttäen NCI60 solulinjat, L-asparaginaasi todettiin tehokas tappamaan osajoukko munasarjakarsinoomat [14]. Tämä paneeli on käytetty myös kehitettäessä bortetsomibia myelooman hoitoa varten [13].

Koetulokset saatuna NCI60 solulinjoissa kootaan tällä Developmental Therapeutics Program (DTP) verkkosivuilla [13]. Lisäksi farmakologisten edellä mainitut tiedot, muut tiedot NCI60 solulinjoja on saatavilla DTP verkkosivuilla, kuten genotyypin Affymetrix 125K sirun yhden emäksen monimuotoisuus (SNP). Affymetrix 125K SNP sirun alustan on tiheä joukko SNP (~124,000) ja sitä käytetään tunnistamaan genomialuetta, jotka liittyvät tautiin alttius ja vaihteleva hoitovastetta. Aiemmin olemme käyttäneet NCI60 solulinjan data tutkia lääkeresistenssin geenien ihmisen genomin [15], [16], [17]. Tässä tutkimuksessa olemme käytti sekä käytettävissä farmakologiset ja genomista tietoa NCI60 solulinjojen tunnistamiseen liittyvien geenien sytotoksisten vastustuskykyä simvastatiinin ja lovastatiinin ja suoritettiin funktionaalisia tutkimuksia käyttämällä siRNA vahvistaa

EAF2

kuin modulaattorin statiinin aktiivisuuden.

Materiaalit ja menetelmät

lovastatiinin ja simvastatiinin Kestää ja Sensitive NCI60 Solulinjat

Olemme seuranneet aiemmin kehitetty lähestymistapa suorittamaan koko genomin tapaus-verrokki yhdistys tutkimus [15], [16], [17]. Lyhyesti, olemme hyödyntäneet julkisesti saatavilla tietoja NCI60 solulinjassa paneeli posted Developmental Therapeutics Program (DTP) verkkosivuilla NCI /NIH (https://dtp.nci.nih.gov/index.html). Ensin ladannut GI

50 data (määrä lääkkeitä tarvitaan inhiboimaan kasvua 50%) on 10

-4,5 M annos solulinjat. Seuraavaksi luokiteltu solut suhteellisen resistenttejä tai herkkiä normalisoinnin jälkeen loki

10 GI

50 saamiseksi keskiarvo on nolla ja keskihajonta yhden aikaisemmin kuvatulla [15], [16], [17] . Standardoitu GI

50-arvot analysoitiin sitten SAS 9,1 (PROC yhden muuttujan) ei-parametrinen jakelu testi (tiheys ytimen arvio) arvioitu kaistalla 0,2476 ja 0,2896 sekä asymptoottinen keskiarvo integroidut virheiden neliöiden (AMISE) ja 0,0224 ja 0,0172, ja simvastatiinin ja lovastatiinin, vastaavasti. Visuaalinen antimodes käytettiin raja-arvo -0,2 simvastatiinia ja -0,3 lovastatiinin määrittää herkkien (valvonta) ja resistenttejä (tapaukset) NCI60 soluja (kuvio 1). Siinä tapauksessa, simvastatiinin, oli 19 herkkiä ja 32 resistenttien solulinjojen paneelin (taulukko S1). Oli 16 herkkiä ja 41 resistenttien solulinjojen NCI60 paneelissa lovastatiinin (taulukko S2).

tiheysfunktio havaittiin kaksi suuret tilat kullekin lääkkeelle. Visuaalinen antimodes käytettiin raja-arvo -0,2 simvastatiinia ja -0,3 lovastatiinin määritellä herkkiä ja resistenttejä NCI60 solulinjoissa.

Whole-Genome Case-Control Association Study

ladataan Affymetrix 125K SNP dataa (joka oli noin 124000 SNP välimatkan mediaani intermarker etäisyydellä 8,5 kiloemästä) päässä DTP verkkosivuilla (https://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html) [ ,,,0],18]. Koko genomin single merkki tapaus-verrokki yhdistyksen testit lovastatiinin ja simvastatiinin kestäviä ja herkkien solujen suoritti Plink ohjelmisto [19] käyttämällä standardia chi-neliö testi. Vain SNP, joka on genotyyppi on vähintään 75% soluista ja oli pienin pieni alleelin taajuus 2% (n = 79622) sisällytettiin tähän tutkimukseen ja käytettiin yhdistyksen testaus. Jotta vähentää mahdollisuus väärien positiivisten yhdistysten, korjaus useita testejä,

so

. False Discovery Rate (FDR) ehdottama Benjamini ja Hochberg (FDR_BH) [20] Myös suorittaa Plink ohjelmisto. Tulokset

p

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä.

liittyvät tiedot genomista paikkoihin (aiheuttavaa

versus

geenien välinen) ja SNP: tä joko noutaa dbSNP tietokannasta [21 ] tai räjäyttämällä SNP-reunustavat sekvenssit vastaan ​​ihmisen genomin ja visualisoimalla käyttämällä NCBI Map Viewer vaihtoehto [22].

epistasia (SNP-SNP Interaction) Analysis

regressiomalli mallit olivat käytetään analysoida kaksisuuntaisia ​​yhteisvaikutuksia keskuudessa SNP kytkeytyvät simvastatiinin tai lovastatiinin kanssa vastus, olettaen lisäainetta malli jokaiselle SNP. Testaukseen SNP-SNP vuorovaikutuksia, käytimme uskottavuusosamäärä lähestymistapaa vertaamalla sovitus kaksi mallia, joista toisessa SNP tärkeimmät vaikutukset vain ja toinen tärkeimmät vaikutukset ja kaksisuuntainen vuorovaikutus vaikutus. Vastaava p-arvot säädettiin useita testausta FDR_BH [20] menetelmää.

Cell Culture

Ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjaa HCT-116 ja HT-29 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). HCT-116 on kasvaimia kolorektaalikarsinoomasolulinjaa perustetaan primaarikasvain [23]. HT-29 on koolonadenokarsinooma luokan II solulinja perustetaan primäärikasvain soluista [24]. Soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 100 IU /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Kaikki media reagenssit saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Solulinjoja rutiininomaisesti pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä.

Toiminnallinen validointi lovastatiinin ja simvastatiinin herkistymistä

siRNA ja huumeiden tutkimuksissa soluja transfektoitiin siRNA käänteisfaasi transfektiolla 384-kuoppalevyillä, kuten on aiemmin kuvattu [25]. Lyhyesti, siRNA painettiin päälle 384-kuoppalevyille 2 ul: n tilavuudessa. Laimennettu siLentFect reagenssia (BioRad, Hercules, CA) OptiMEM (Invitrogen), lisättiin kuoppiin ja annettiin monimutkainen siRNA 30 min huoneen lämpötilassa. HCT-116 tai HT-29-solut suspendoitiin uudelleen elatusaineeseen ilman antibiootteja ja lisättiin levyille loppukonsentraatioon 1000 solua /kuoppa. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. 24 tunnin kuluttua, vaihtelevia pitoisuuksia välillä 12 nM 667 uM joko lovastatiinin tai simvastatiinin lisättiin määrityksen levyille ja inkuboitiin vielä 72 tunnin ajan. Yhteensä elinkelpoisten solujen määrä määritettiin lisäämällä Cell Titer Glo (Promega, Madison, WI) ja suhteellinen luminesenssi yksiköt (RLU) mitattiin käyttämällä EnVision levylukijaa (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Lääkkeen vaikutuksen laskettiin jakamalla keskiarvo RLU-arvot lääkkeellä käsiteltyjen kuoppien keskiarvo RLU-arvot vehikkelillä käsiteltyihin kuoppiin. GI

50-arvot määritettiin käyttäen GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) ja arvot on esitetty laskettuna GI

50 +/- 95%: n luottamusväli. Tilastollinen analyysi tiedoista tehtiin käyttämällä kaksisuuntaisia ​​pariksi Opiskelijan

t

testiä.

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

validointi geenien kvantitatiivisella Reaaliaikainen PCR (qPCR) B

Yhteensä RNA solulinjoista eristettiin käyttämällä Qiagen n RNeasy QIAGEN Inc. (Valencia, CA). RNA-pitoisuus määritettiin käyttäen NanoDrop-1000 mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad Inc. (Hercules, CA) käytettiin cDNA: n valmistamiseen 500 ng kutakin näytettä. Suhteellinen mRNA ilmentyminen mitattiin TaqMan Gene Expression Analyysit ABI Inc. (Foster City, CA) alle valmistajan suosittelemaa ehtoja Opticon 2 PCR System (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Suhteellinen kvantitointi geenin ilmentyminen suoritettiin kolmena kappaleena. qPCR reaktioita valmistettiin 96-formatoitu qPCR levyt Bio-Rad (Hercules, CA). Reaktiot valmistettiin singleplexes, kolmena rinnakkaisena kustakin näytteestä triplikaatit endogeenisen valvontaa, ja ei-templaattikontrollien (NTC). Normalisointi tehtiin, kun läsnä on viite-geenin, GAPDH, ja suhteellinen kvantifiointi geenin ilmentymisen muutoksia analysoitiin käyttämällä ΔΔCt menetelmällä [26], [27].

Tulokset

Genome laaja yhdistysten tutkimukset NCI60 paneelin lovastatiinin ja simvastatiinin vastaus

Käyttämällä NCI60 syöpäseulontaohjelmien tiedot simvastatiinin ja lovastatiinin, solulinjoja luokiteltiin suhteellisen herkkä tai resistentti (kuvio 1). Saadut tulokset koko genomin tapaus-verrokki-yhdistyksen tutkimuksia varten simvastatiinin ja lovastatiinin esitetään yhteenveto taulukoissa 1 ja 2, vastaavasti. Kahdeksan SNP liittyi vastustuskyvyn simvastatiinin. Nämä SNP sijaitsivat kromosomeissa 8q, 9p (kaksi SNP), 10p, 10q, 13q (kaksi SNP) ja 14p. Viisi SNP sijaitsivat geenien välisen alueilla, kun taas loput kolme SNP sijaitsivat intronit tunnettuja geenejä (taulukko 3), nimittäin, introni 6

NRP1

(neurophilin), introni 37

COL13A1

(tyyppi XIII kollageeni, alfa 1), ja introni 6

MRPS31

(mitokondrion ribosomaalinen proteiini S31). Kaksi geenien välisen SNP, rs4129864 ja rs1343844 sijaitsivat hyvin lähellä (7387 emäsparia päässä toisistaan), mikä viittaa siihen, ne todennäköisesti sidoksissa toisiinsa.

Kun kyseessä lovastatiinin, yhteensä 25 SNP liittyivät sen kestävyys. Kuusi näistä SNP sijaitsivat tunnettu tai ennustettu geenejä (taulukot 2 ja 3): in introni 5

EAF2

(ELL liittyvä tekijä 2), in intronin 2

ANK2

(hermostoputken ankyriiniproteiinista 2), in introni 1

AKAP7

(proteiinikinaasi A: ankkuri proteiini 7), intronissa 4

LPIN2

(Lipin 2), in intronin 2

STEAP2

(kuusi transmembraaninen epiteelin antigeeni eturauhasen 2) ja intronin 11

PARVB

(Parvin beta).

lisäksi tutkittiin mahdollisen SNP-SNP vuorovaikutusta varten simvastatiinin ja lovastatiinin vastus SNP sarjojen regressioanalyysimme ja ei havainnut tilastollisesti merkittävää geneettistä vuorovaikutus olettaen lisäaine geneettinen malli jälkeen FDR_BH säädöt. Kun kuitenkin otetaan huomioon pieni otoskoko, se myös syytä huomata, että tutkimuksemme ei ole riittävästi virtaa, joten nämä tulokset on tulkittava varovasti. Pathway analyysi ei yksilöinyt suoraa vuorovaikutukset proteiinin tuotteiden geenien simvastatiinin tai lovastatiinin luetteloita.

Funktionaaliset tutkimukset tunnistaa EAF2 moduloijaksi lovastatiinin ja simvastatiinin

Jotta oikeellisuuden positiivisen GWAS tuloksia, teimme toiminnallinen tutkimuksia. Olemme keskittyneet SNP sijaitsee (introni alueilla) liittyvien geenien simvastatiini (3 SNP) ja lovastatiini (6 SNP) vastus (taulukot 1 ja 2). Laaja kirjallisuudesta ei paljastanut tunnettua toiminnallista seurauksia näillä SNP geenien ilmentymisen tai proteiinin toimintaan. Täten suoraa biologista suhteita näiden SNP ja kestävyys simvastatiinin ja lovastatiinin jäi tuntemattomaksi. Koska meidän GWAS tulokset ovat osoittaneet yhdistyksen näistä geeneistä resistenttejä simvastatiinin tai lovastatiinin, me arveltu, että toiminnot näiden geenien jotenkin liittyy lääkeresistenssi. Tämän hypoteesin mukaisesti, alas säätely geenin ilmentymisen kääntää havaitun vastuksen ja tekee nämä solut ovat herkkiä näiden lääkkeiden uudelleen, mikä lisää solutoksisuuteen ja syöttämällä (kuvio 2). Siksi teimme lääkevaste ja geenien avulla RNAi menetelmiä tutkimuksia kahdella koolonsyöpäsolulinjaa HCT-116 ja HT-29, joka valittiin, koska ne on sisällytetty NCI60 asetettu sekä hyvästä transfektion tehokkuutta ja niiden vaste kaksi statiineja. Perustuen DTP lääkevaste data, analyysimme luokiteltu HCT-116 suhteellisen resistenttejä simvastatiinin (taulukko S1); kuitenkin, lovastatiini tietoja ei ollut saatavilla tämän solulinjan. Toisaalta, HT-29: n havaittiin olevan suhteellisen resistenttejä sekä simvastatiinin ja lovastatiinin (taulukot S1 ja S2). Aluksi molemmat solulinjat käsiteltiin siRNA kohdistaminen tunnistettujen geenien meidän analyysillä, jota seuraa käsittely, jossa on kaksi pienillä annoksilla joko simvastatiinin tai lovastatiinin, joka osoitti neljä geeneistä,

MRPS31

,

COL13A

EAF2

,

AKAP7

mahdollisina modulaattoreina lääkkeen vastetta (tietoja ei esitetty).

o biologinen suhde lääkeresistenssin ja geenien /SNP: tunnistettu GWAS tutkimus aiemmin tunnistettu. Näin ollen, tässä oletamme, että jos toiminnot näiden geenien tarvitaan vastuksen näille lääkkeille, sitten nakutuksen alas niiden geenin ilmentymistä käyttämällä siRNA: t on häiritä toimintaa geenien, joka kääntää vastuksen ja tekee solut herkkiä näitä lääkkeitä uudelleen. (EN) tuumorisolulinja kestää altistuttuaan lääkettä. (B) käsittelemällä siRNA ehdokkaaksi geenikohteet lisäksi huumeiden, me ennustaa, että kasvain solulinja tulisi herkistyneet huumeiden mikä lisää solukuolemaa. Tämä malli perustuu olettamukseen, että tietyn geenin toiminnan tarvitaan lääkeresistenssin.

Lisäksi huumeiden annosvastekokeessa tehtiin käyttäen siRNA-dupleksit kohdistaminen

MRPS31

ja

COL13A

, jotka liittyvät vastustuskyvyn simvastatiinin, ja

EAF2

ja

AKAP7

, jotka liittyvät vastustuskyvyn lovastatiinin. Nämä geenit vaiennetaan siRNA ja käsiteltiin vaihtelevilla annoksilla joko simvastatiinin tai lovastatiinin vaihteli 12 nM 667 uM. Hiljentäminen

MRPS31

,

AKAP7

ja

COL13A

ei vaikuttanut vastaus joko huumeiden koeolosuhteissa sovellettu (tuloksia ei ole esitetty), kun taas hiljentäminen on

EAF2

vähensi GI

50 simvastatiinin ja lovastatiinin käsitellyn HCT-116-solut, ja siten vähentää vastus tämän solulinjan nämä lääkkeet (kuvio 3). Sillä HCT-116-solujen simvastatiinia ja siRNA, GI

50 (95%: n luotettavuusrajat) siirtynyt 8,6 +/- 0,3 gM ei-hiljentäminen siRNA (negatiivinen kontrolli) 2,5 +/- 0,2 gM ja 3,3 +/- 0,3 uM EAF2_1 ja EAF2_4 siRNA, vastaavasti. Vastaavasti HCT-116-solut käsiteltiin lovastatiinin GI

50 siirtynyt 20,1 +/- 0,9 gM ei-hiljentäminen siRNA 4,3 +/- 0,5 gM ja 6,5 ​​+/- 0,5 uM EAF2_1 ja EAF2_4 siRNA, vastaavasti . Lisäksi tehokas siRNA transfektio osoitettu sekä solulinjoissa, koska ohjaus tappava siRNA vähentää elinkelpoisuus on suurempi kuin 98% kaikissa määrityksissä (kuvio S1). Kuitenkin hiljentäminen on

EAF2

ei herkistä HT-29-solujen joko simvastatiinia tai lovastatiinia (kuvio 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että down-regulation

EAF2

ilmentymistä voidaan moduloida soluvasteen sekä kolesterolia alentavien lääkkeiden HCT-116 paksusuolen syöpäsoluissa.

HCT-116-solut (A B) tai lovastatiinin (C 0,0002

sekä EAF2_1 ja EAF2_4 siRNA osoittama *) annoksilla 2,7 uM ja 8,2 uM.

teho geenien mukaan siRNA: t EAF2_1 ja EAF2_4 vahvistettiin käyttäen qPCR kokeita ja on esitetty kuviossa 4A. Vaikka HCT-116-solut osoittivat herkistymistä yhdistelmä

EAF2

hiljentämisen ja statiinin hoitoa, kun taas HT-29-solut eivät molemmat solulinjat osoittivat samanlaisia ​​ekspressiotasot

EAF2

osoittamalla, että ero vastaus ei johtunut eroa pohjapinta taso

EAF2

lauseke (kuva 4B). Lisäksi siRNA vaimentaminen

EAF2

molemmissa soluissa linjat oli vain vähäinen vaikutus solujen elinkykyyn verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin ja ei-hiljentäminen siRNA ohjaus (kuva 5). Yhdessä tämä data ja muutos annos-vaste käyrät tuotetaan

EAF2

hiljentäminen HCT-116-solut osoittavat, että hiljentäminen

EAF2

voimistaa vaikutusta statiinin aiheuttama sytotoksisuuden.

(A) Kokonais-RNA eristettiin HCT-116-solut transfektoitiin 48 tuntia siRNA kohdistus

EAF2

(EAF2_1 ja EAF2_4), ei-hiljentäminen siRNA tai käsittelemättömät solut. Suhteelliset kertainen erot

EAF2

mRNA-tasot verrattuna käsittelemättömiin ja ei-hiljentäminen siRNA käsitellyt solut näytetään. (B) qPCR suhteellinen ekspressio analyysi EAF2 HCT-116 ja HT-29-solut on esitetty vastaava ilmaisu.

HCT-116-soluja ja HT-29-soluja (1000 solua /kuoppa) reverse transfektoitiin ohjaus siRNA ja

EAF2

kohdistaminen siRNA. Solujen elinkelpoisuus määritettiin 96 tuntia käyttäen Cell Titer Glo ja lukea luminesenssi. Tiedot edustettuina prosenttia elinkelpoisuus verrattuna ei siRNA käsiteltyihin soluihin.

Keskustelu

Tutkimuksemme on ensimmäinen systemaattinen ja koko genomin pohjainen yhdistys tutkimus simvastatiinin ja lovastatiinin, kaksi statiinit ovat lupaavia ehdokkaita sytostaattien syövässä. Tässä tutkimuksessa olemme käytti vapaasti käytettävissä ja kattava farmakologiset ja geneettiset tiedot NCI60 solulinjassa paneeli tunnistaa ehdokas geenejä, jotka liittyvät vastustuskyvyn simvastatiinin ja lovastatiinin ihmisen genomissa. Tuloksemme osoittivat yhdistyksen erillisten sarjaa geenejä resistenssin näille kahta lääkettä. Olemme edelleen toiminnallisesti validoitu yksi kohdegeenin,

EAF2

käyttämällä siRNA osoittaa, että sen ilmentymistä voidaan mukauttaa soluvastetta näihin kahteen lääkkeiden HCT-116-solulinjassa.

Koko genomin SNP -pohjainen yhdistys tutkimuksessa tunnistettu kolme geeniä liittyy simvastatiinin vastus (taulukko 3). Yksi näistä geeneistä,

NRP1

koodaa membraaniin sitoutuneen reseptorin, joka on roolit angiogeneesissä, aksoniohjauksen, solujen selviytymisen, muuttoliike, invaasion ja immuunivastetta. NRP1 sitoutuu myös SEMA3, joiden toiminta moduloidaan Lipidilauttojen [28]. Toinen geeni, joka liittyy simvastatiinin vastus oli

COL13A1

, joka koodaa alfa-ketju ei-kuituinen kollageeni sijaitsee solukalvon. Vaikka sen tarkkaa biologinen rooli ei ole selvitetty vielä, COL13A1 proteiini sijaitsee liima rakenteita kudosten ja uskotaan liittyi solun tarttumiseen, muuttoliike ja luuston kehityksen [29]. Lopuksi,

MRPS31

koodaa mitokondrion ribosomaalinen proteiini, joka on mukana proteiinisynteesiä mitokondrioissa ja se liittyy tyypin I diabetes [30].

Siinä tapauksessa, lovastatiinin vastus, analyysimme osoitti yhdistyksen kuuden geenin (taulukko 3). Yksi näistä geeneistä oli

EAF2

, joka on androgeeni-vasteen liittyvän geenin transkription elongaatiotekijä MEN /ELL, ja se on tarpeen erilaisten solun toimintojen, kuten silmän kehityksen ja kasvun hidastuminen ja apoptoosin [31], [32]. Äskettäin

Eaf2

knockout hiirimallissa on liittynyt kasvain ja keuhkojen, maksan ja eturauhasen sekä B-solujen lymfooma [33]. Mielenkiintoista, tuloksemme osoittavat selvästi, että hiljentäminen on

EAF2

pienentää GI

50-arvot HCT-116 koolonsyöpäsoluihin paitsi lovastatiinin, vaan myös simvastatiini. Tätä vaikutusta ei nähty muilla koolonisyöpäsolulinja HT-29, ja tämä saattaa johtua siitä, että geneettinen heterogeenisyys välillä solulinjoja. Toinen geeni, joka liittyy lovastatiinin vastus oli

ANK2,

joka koodaa yksi kolmesta ankyriinit, jotka ovat mukana lokalisointi proteiinien kalvon.

ANK2

on kriittinen normaalille sydämen toimintaa ja sen mutaatiot ovat yksi syy synnynnäisten rytmihäiriöitä [34].

AKAP7

koodaa jäsen A-kinaasi ankkurointi proteiini (AKAP) perhe, joka ankkuroi cAMP-riippuvaisen proteiinikinaasi A erityinen subsellulaaristen [35]. Toisaalta,

LPIN2

on yksi kolmesta Lipin geenejä. Lpin 1 osallistuu rasvakudoksessa kehittämiseen [36]. Vaikka tarkkaa biologisen roolin tämän geenin ei tiedetä, kun mutatoitu, tämä geeni aiheuttaa Majeed oireyhtymä, joka on autoinflammatorisen häiriö [37]. Lisäksi,

STEAP2

, joka koodaa multi-pass kalvon proteiini, joka paikantuu Golgin monimutkainen, solukalvon ja vesicular putkimaisen rakenteiden sytosoliin, liittyi myös resistenssin lovastatiinin tutkimuksessamme. Äskettäin kupari-reduktaasin ja ferrireductase rooli STEAP2 proteiinia raportoitu [38]. Tämä geeni on myös osallisena eturauhassyövän [39]. Lopuksi,

PARVB

, jäsenenä fokaalisen adheesion proteiinin perheen [40], joka sitoutuu integriinin-sitoutuvan kinaasin [41] on myös yhteydessä esiintyvistä lovastatiinin vastus. On mielenkiintoista huomata, että kaksi luetteloa geenejä hyvin erilaisia ​​kahden statiinit, jotka ovat HMG-CoA-reduktaasin estäjät. Kuitenkin kaksi lääkkeet eivät ole samanlaisia ​​ja eroavat niiden aineenvaihduntatuotteiden [42], ja niiden sytotoksisia vaikutuksia [43], [44], mikä voi selittää nämä tulokset. Sytotoksista vaikutusta, jota välittää statiinien voi liittyä tavoitteet, muut kuin HMG-CoA-reduktaasin, kuten luun morfogeeninen proteiini (BMP), reitti, kuten ovat kuvanneet Kodach ja kollegat [43].

suoritettiin geenien ja niiden vaste kokeet oikeellisuuden meidän GWAS tuloksia. Kun kyseessä on kolme geeniä,

MRPS31

,

COL13A

, ja

AKAP7

tuloksemme ei vahvistanut, että niiden biologiset toiminnot liittyvät suoraan vastustuskyky simvastatiinin ja lovastatiinin alle hypoteesia ja koeolosuhteissa sovellettu. Tämä ristiriita GWAS ja toiminnalliset tutkimukset voidaan selittää se mahdollisuus, että nämä geenit voivat edustaa vääriä positiivisia tuloksia GWAS analyysin, tai ehdot ja hypoteesin sovellettu eivät olleet optimaaliset havaita toivottuja vaikutuksia. Vaihtoehtoisesti, nämä SNP: itä voidaan sijaitsee genomin alueella, joka vaikuttaa toiminto kaukaisten geenejä, joita ei voida testata käyttämällä lähestymistapaa. Toisaalta, meidän genomin laajuinen yhdistys osoitti yhdistyksen

EAF2

merkki 1840275 (rs2332056, rs4339143) resistenssi vasta lovastatiinin korjauksen jälkeen kanssa FDR. Kun kyseessä on simvastatiinin, tämä markkeri liittyi sen vastus (oikaisemattomat

p

0,01), mutta korjauksen jälkeen useita testejä, tämä merkitys oli menetetty. Silti meidän toiminnallinen arviointi käyttämällä siRNA osoitti, että hiljentäminen on

EAF2

ollut vain kykenee moduloimaan vastauksena lovastatiinin myös simvastatiinin HCT-116 koolonisyöpäsolulinja koeolosuhteissa sovellettu (kuva 3). Tämä ristiriita tulosten genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa ja toiminnallinen arviointi kokeita voidaan selittää joko vääriä negatiivisia yhdistys

EAF2

markkeri simvastatiinin asetettu, tai hyödyntäminen erilaisissa koeolosuhteissa (esimerkiksi lääkkeen annostus) in meidän siRNA kokeiluja. Lisäksi tuloksemme osoittivat myös, että

EAF2

hiljentäminen ei herkistä toisen paksusuolen syöpäsolu, HT-29 (joka pidettiin suhteellisen resistenttejä sekä simvastatiini ja lovastatiini), mikä viittaa siihen, että läsnä on mahdollista heterogeenisyyttä geneettisiä ja molekyylitason mekanismeja vastustuskykyä statiineja. Mielenkiintoista, HCT-116 tiedetään kantavan

K-RAS

mutaatio, kun taas HT-29 ei [45]. Koska statiinit ovat HMG-CoA-reduktaasin, joka voi johtaa estää farneslyation K-RAS ja siten K-RAS aktivointi, on mahdollista, että kantaa mutantin

K-RAS

voivat auttaa tekemään HCT-116 solut alttiimpia yhdistelmä

EAF2

hiljentämisen ja statiinin hoitoon. Lisätutkimuksia tarvitaan käsittelemään tätä mahdollisuutta.

luokittelu sekä HT-29 ja HCT-116 on suhteellisen resistentti on vertailun perusteella kaikkien solulinjojen NCI60 paneelissa. Aikaisemmat tutkimukset vastauksena simvastatiinin ja lovastatiinin ja useita NCI60 solulinjojen on raportoitu. HL-60–leukemiasolulinjan aiemmin havaittu olevan suhteellisen resistenttejä Simvastatiinihoidon (annoksesta riippuvalla tavalla) kuin all-trans-retinoiinihappo fenikoliresistenttiin solulinja, HL-60-R2 [46]. Lisäksi Martirosyan

et. al.

osoittivat, että munasarjasyövän solulinja, SKOV-3, kun käsitellään Lovastatiini osoitti vastausta, mutta ei niin paljon kuin muut solulinjat sisältyy opinnoissaan, mikä viittaa siihen, että tämä solulinja ei ole kovin herkkä lovastatiinin hoitoon edellytyksin soveltaa [47], joka on yhtä mieltä tuloksemme. Lopuksi Kodach

et.